Summary
प्रोटोकॉल एक अनुकूलित छिड़काव बायोरिएक्टर में फ्लैप वास्कुलचर के माध्यम से सोडियम डोडेसिल सल्फेट डिटर्जेंट के छिड़काव द्वारा संवहनी पोर्सिन फ्लैप की सर्जिकल खरीद और बाद में डीसेल्युलराइजेशन का वर्णन करता है।
Abstract
बड़ी मात्रा में नरम ऊतक दोष कार्यात्मक घाटे का कारण बनते हैं और रोगी के जीवन की गुणवत्ता को बहुत प्रभावित कर सकते हैं। यद्यपि सर्जिकल पुनर्निर्माण ऑटोलॉगस फ्री फ्लैप ट्रांसफर या संवहनी समग्र एलोट्रांसप्लांटेशन (वीसीए) का उपयोग करके किया जा सकता है, ऐसे तरीकों के नुकसान भी हैं। दाता साइट रुग्णता और ऊतक उपलब्धता जैसे मुद्दे ऑटोलॉगस मुक्त फ्लैप हस्तांतरण को सीमित करते हैं, जबकि इम्यूनोसप्रेशन वीसीए की एक महत्वपूर्ण सीमा है। पुनर्कोशिकीयकरण विधियों का उपयोग करके पुनर्निर्माण सर्जरी में इंजीनियर ऊतक एक संभावित समाधान का प्रतिनिधित्व करते हैं। डीसेल्यूलराइज्ड ऊतक उन तरीकों का उपयोग करके उत्पन्न होते हैं जो अंतर्निहित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) माइक्रोआर्किटेक्चर को संरक्षित करते हुए देशी सेलुलर सामग्री को हटा देते हैं। इन अकोशिकीय मचानों को बाद में प्राप्तकर्ता-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ पुन: कोशिकीय किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल सुअर मॉडल में एककोशिकीय मचानों को प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली खरीद और डीसेल्युलराइजेशन विधियों का विवरण देता है। इसके अलावा, यह छिड़काव बायोरिएक्टर डिजाइन और सेटअप का विवरण भी प्रदान करता है। फ्लैप में पोर्सिन ओमेंटम, टेंसर प्रावरणी लता और रेडियल अग्रभाग शामिल हैं। डीसेल्यूलराइजेशन कम सांद्रता सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) डिटर्जेंट के पूर्व विवो छिड़काव के माध्यम से किया जाता है, जिसके बाद एक अनुकूलित छिड़काव बायोरिएक्टर में डीएनएस एंजाइम उपचार और पेरासिटिक एसिड नसबंदी होती है।
सफल ऊतक विकोशिकीयकरण को मैक्रोस्कोपिक रूप से फ्लैप की सफेद-अपारदर्शी उपस्थिति की विशेषता है। एककोशिकीय फ्लैप हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन पर नाभिक की अनुपस्थिति और डीएनए सामग्री में महत्वपूर्ण कमी दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग संरक्षित ईसीएम और संवहनी माइक्रोआर्किटेक्चर के साथ डीसेल्यूलराइज्ड नरम ऊतक मचानों को उत्पन्न करने के लिए कुशलतापूर्वक किया जा सकता है। इस तरह के मचानों का उपयोग बाद के पुनर्कोशिकीय अध्ययनों में किया जा सकता है और पुनर्निर्माण सर्जरी में नैदानिक अनुवाद की क्षमता है।
Introduction
दर्दनाक चोट और ट्यूमर हटाने से बड़े और जटिल नरम ऊतक दोष हो सकते हैं। ये दोष रोगी के जीवन की गुणवत्ता को खराब कर सकते हैं, कार्य की हानि का कारण बन सकते हैं, और इसके परिणामस्वरूप स्थायी विकलांगता हो सकती है। जबकि ऑटोलॉगस ऊतक फ्लैप ट्रांसफर जैसी तकनीकों का आमतौर पर अभ्यास किया गया है, फ्लैप उपलब्धता और दाता साइट रुग्णता के साथ मुद्दे प्रमुख सीमाएं 1,2,3 हैं। संवहनी समग्र एलोट्रांसप्लांटेशन (वीसीए) एक आशाजनक विकल्प है जो प्राप्तकर्ताओं को एकल इकाई के रूप में समग्र ऊतकों, जैसे, मांसपेशियों, त्वचा, वाहिका को स्थानांतरित करता है। हालांकि, वीसीए को दीर्घकालिक इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता होती है, जो दवा विषाक्तता, अवसरवादी संक्रमण और दुर्भावनाओं 4,5,6 की ओर जाता है।
ऊतक-इंजीनियर एसेलुलर मचान इन सीमाओं का एक संभावित समाधानहैं। एककोशिकीय ऊतक मचानों को डीसेल्युलराइजेशन विधियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो अंतर्निहित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) माइक्रोआर्किटेक्चर को संरक्षित करते हुए देशी ऊतकों से सेलुलर सामग्री को हटा देते हैं। ऊतक इंजीनियरिंग में सिंथेटिक सामग्री के उपयोग के विपरीत, जैविक रूप से व्युत्पन्न मचानों का उपयोग एक बायोमिमेटिक ईसीएम सब्सट्रेट प्रदान करता है जो जैव-रासायनिकता और नैदानिक अनुवाद की क्षमता की अनुमति देताहै। डीसेलुलराइजेशन के बाद, प्राप्तकर्ता-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ मचानों का बाद में पुनर्कोशिकीयकरण कार्यात्मक, संवहनी ऊतक उत्पन्न कर सकता है जिसमें बहुत कमइम्युनोजेनेसिटी 9,10,11 होती है। छिड़काव डीसेलुलराइजेशन तकनीकों का उपयोग करके एककोशिकीय ऊतकों को प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल विकसित करके, ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को इंजीनियर किया जा सकता है। बदले में, इस तकनीक पर निर्माण अधिक जटिल ऊतकों के लिए आवेदन की अनुमति देता है। आज तक, संवहनी नरम ऊतकों के छिड़काव डीसेल्युलराइजेशन की जांच सरल संवहनी ऊतकों का उपयोग करके की गई है जैसे कि कृंतक12, पोर्सिन13 और मानव मॉडल14 में पूर्ण मोटाई फैसिओक्यूटेनियस फ्लैप, साथ ही पोर्सिन रेक्टस एब्डोमिनिस कंकाल की मांसपेशी15। इसके अतिरिक्त, जटिल संवहनी ऊतकों को भी छिड़काव डीसेल्यूलराइज्ड किया गया है जैसा कि पोर्सिन और मानव कान16,17 मॉडल और मानव पूर्ण-चेहरे ग्राफ्ट मॉडल18 में दिखाया गया है।
यहां, प्रोटोकॉल जैविक रूप से व्युत्पन्न ईसीएम मचानों का उपयोग करके संवहनी मुक्त फ्लैप के विकोशिकीयकरण का वर्णन करता है। हम तीन चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक फ्लैप के विकोशिकीयकरण को प्रस्तुत करते हैं: 1) ओमेंटम, 2) टेन्सर प्रावरणी लता, और 3) रेडियल अग्रभाग, जिनमें से सभी पुनर्निर्माण सर्जरी में नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले वर्कहॉर्स फ्लैप के प्रतिनिधि हैं और पहले ऊतक विकोशिकीयकरण के संदर्भ में पशु अध्ययन में जांच नहीं की गई है। ये बायोइंजीनियर्ड फ्लैप एक बहुमुखी और आसानी से उपलब्ध मंच प्रदान करते हैं जिसमें बड़े नरम ऊतक दोष की मरम्मत और पुनर्निर्माण के क्षेत्र में उपयोग के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों की क्षमता है।
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Protocol
पशु विषयों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है और विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क पशु संसाधन केंद्र प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं और पशु देखभाल दिशानिर्देशों पर कनाडाई परिषद के अनुसार किया जाता है। सभी प्रयोगों के लिए पांच यॉर्कशायर सूअरों (35-50 किलोग्राम; आयु लगभग 12 सप्ताह) का उपयोग किया गया था।
1. छिड़काव बायोरिएक्टर निर्माण
- छिड़काव बायोरिएक्टर में उपयोग किए जाने वाले सभी घटकों के लिए चित्रा 1 देखें। ऊतक कक्ष के निर्माण के लिए, सिलिकॉन सील अस्तर वाले वाटरटाइट और एयरटाइट ढक्कन के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीप्रोपाइलीन स्नैप-लॉक कंटेनर का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कंटेनर आटोक्लेव संगत हैं।
- कंटेनर के किनारों के साथ छेद में दो 1/4 ड्रिल करें और एल / एस -16 प्लैटिनम-लेपित सिलिकॉन ट्यूबिंग का एक छोटा खंड पिरोएं। एक टयूबिंग प्रवाह परफ्यूसेट ले जाएगी और दूसरी बहिर्वाह के लिए है।
- इनफ्लो ट्यूबिंग के लिए, आंतरिक भाग में एक नर लुएर कनेक्टर संलग्न करें जिसका उपयोग ऊतक प्रवेशनी से जुड़ने के लिए किया जाएगा। इनफ्लो ट्यूबिंग के बाहरी छोर पर एक महिला लुएर कनेक्टर संलग्न करें जिसका उपयोग तीन-तरफा स्टॉपकॉक से कनेक्ट करने के लिए किया जाएगा।
- कक्ष के ढक्कन पर छेद में एक एकल 1/4 ड्रिल करें और एल / एस -16 प्लैटिनम-लेपित सिलिकॉन ट्यूबिंग के एक और छोटे खंड को पिरोएं। यह टयूबिंग एयर वेंट के रूप में काम करेगी।
- एल / एस -16 प्लैटिनम-लेपित सिलिकॉन ट्यूबिंग के लगभग 50 सेमी को मापकर प्रवाह और बहिर्वाह टयूबिंग बनाएं। डिटर्जेंट जलाशयों से बायोरिएक्टर कक्ष में परफ्यूसेट ले जाने के लिए एक छोर को पीले थ्री-स्टॉप पंप ट्यूबिंग से और दूसरे छोर को बाँझ 2 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट से कनेक्ट करें।
- व्यक्तिगत रूप से लपेटे गए बाँझ पैकेजिंग में सभी घटकों (कक्ष और ट्यूबिंग) को ऑटोक्लेव करें।
चित्रा 1: छिड़काव बायोरिएक्टर का निर्माण। छिड़काव बायोरिएक्टर में (ए) एक प्लास्टिक पॉलीप्रोपाइलीन ऊतक कक्ष (बी) होता है जिसमें हवा और पानी के तंग ढक्कन के साथ छिड़काव ट्यूबिंग को समायोजित करने के लिए साइड होल ड्रिल किए जाते हैं। (सी) स्टॉपकॉक को ट्यूबिंग से जोड़ा जाता है ताकि छिड़काव ट्यूबिंग के लगाव की अनुमति मिल सके जो डिटर्जेंट जलाशय से डीसेल्युलराइजेशन एजेंटों को एकल-पास फैशन में अपशिष्ट करने के लिए ले जाता है। (डी) संगत पंप कैसेट का उपयोग तीन-स्टॉप ट्यूबिंग को पेरिस्टालिक पंप से जोड़ने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
2. डीसेलुलराइजेशन समाधान की तैयारी
- 100 एमएल सामान्य खारा में 1000 आईयू/एमएल हेपरिन स्टॉक घोल के 1.5 एमएल को पतला करके हेपरिनाइज्ड सामान्य खारा घोल (15 आईयू /एमएल) तैयार करें।
- 18 लीटर ऑटोक्लेव्ड डिस्टिल्ड-विआयनीकृत पानी में धीरे-धीरे 9 ग्राम एसडीएस पाउडर जोड़कर 0.05% डब्ल्यू / वी सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) समाधान तैयार करें। एसडीएस समाधान को समायोजित करने के लिए एक बड़ी मात्रा में पॉलीप्रोपाइलीन (पीपी) कार्बोय का उपयोग करें। पूरी तरह से घुलने पर समाधान उपयोग के लिए तैयार है। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
- DNase I कार्य समाधान तैयार करें। सबसे पहले, लियोफिलाइज्ड DNase I को बाँझdH2 O में 5 mM CaCl2 के साथ 10 mg/mL की स्टॉक एकाग्रता में पुनर्गठित करें। उपयोग के दिन, पतला DNase I बाँझ dH 2 O में Mg++(1.29 mM) और Ca++(1.98 mM) के साथ 1:100 स्टॉक करता है,जो0.1 mg/mL की अंतिम सांद्रता तक होता है।
नोट: DNase गतिविधि तब तक कम हो जाएगी जब तक कि संग्रहीत जमे हुए न हों। कमरे के तापमान पर डीएनए के एंजाइमेटिक पाचन के लिए केवल ताजा काम करने वाले डीएनएस समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए। - पीपी कार्बोय में 5 एल अंतिम मात्रा में बाँझ आटोक्लेव पानी के साथ 10x PBS स्टॉक 1:10 को पतला करके 1x PBS समाधान तैयार करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
- पीबीएस में 1% एंटीबायोटिक्स / एंटीमाइकोटिक्स (ए / ए) तैयार करें। कमरे के तापमान पर 1 एल स्टोर की अंतिम मात्रा में बाँझ 1x PBS समाधान के साथ 100x एंटीबायोटिक्स / एंटीमाइकोटिक्स 1: 100 पतला करें।
- 3.13 एमएल पीएए + 100% इथेनॉल का 40 एमएल + बाँझ डीएच 2 ओ का 956 एमएल जोड़कर 0.1% (v/v) पेरासिटिक एसिड (PAA)/4% (v/v) इथेनॉल (EtOH) तैयार करें। अंतिम मात्रा को 1,000 mL पर लाएं और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
3. पोर्सिन फ्लैप की खरीद
नोट: यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है। सभी तीन फ्लैप खरीदने के लिए एक सुअर का उपयोग किया गया था। सभी फ्लैप की खरीद के बाद जानवर को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दें।
- प्रीऑपरेटिव देखभाल
- सर्जरी से कम से कम 12 घंटे पहले तेज सूअर। केटामाइन (20 मिलीग्राम / किग्रा इंट्रामस्क्युलर, आईएम), एट्रोपिन (0.04 मिलीग्राम / किग्रा आईएम), और मिडाज़ोलम (0.3 मिलीग्राम / किग्रा आईएम) के साथ जानवरों को अलग करें।
- परिधीय लाइन सम्मिलन और इंटुबैशन के लिए 22-44 एमएल/किग्रा/मिनट की प्रवाह दर पर मास्क के माध्यम से 5% आइसोफ्लुरेन की साँस लेकर संज्ञाहरण को प्रेरित करें। 22-44 एमएल/किग्रा/मिनट पर 0.5% -2% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थीसिया बनाए रखें। हेमोडायनामिक स्थिरता की जांच करके संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें और एनेस्थेटिक प्रशासित के उचित स्तर को दर्शाने के लिए अनुपस्थित पैल्पेब्रल / पेडल वापसी सजगता या जबड़े की मांसपेशियों की टोन पर ध्यान दें। एनाल्जेसिया के लिए सर्जरी के दौरान अंतःशिरा रेमिफेन्टैनिल (10-20 μg / kg / h) निरंतर दर जलसेक का प्रशासन करें।
- सुअर को एक उपयुक्त एंडोट्राचेल ट्यूब (7-8 मिमी) के साथ इंजेक्ट करें और ट्यूब को 8 एमएल / किलोग्राम की ज्वारीय मात्रा, 5 सेमी एच20 के पीआईपी, 0.5 के एफआईओ2 , और 14 की श्वसन दर के लिए वेंटिलेटर सेट से कनेक्ट करें।
- कान की नस में 22 ग्राम एंजियोकैथ कैथेटर डालें। एक बार अंतःशिरा (IV) पहुंच प्राप्त हो जाने के बाद, 60 mmHg और 90 mmHg के बीच औसत धमनी दबाव बनाए रखने के लिए पूरी प्रक्रिया में 5-10 mL / kg / घंटा पर गर्म 0.9% सामान्य खारा डालें।
- हृदय गति, पल्स ऑक्सीमेट्री और अंत-ज्वारीय सीओ2 की लगातार निगरानी करें। हर 5 मिनट में रक्तचाप और शरीर के तापमान का आकलन करें।
- संज्ञाहरण के तहत ओकुलर सूखापन को रोकने के लिए आंखों का मलहम लागू करें। पोविडोन-आयोडीन के साथ पूरे सर्जिकल क्षेत्र को तैयार करें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र को बाँझ तौलिए से लपेटें।
- ओमेंटल फ्लैप
- सुअर को लापरवाह स्थिति में रखें और एक xypho-नाभि लैप्रोटॉमी करें।
- पेट में प्रवेश करने पर, अधिक ओमेंटम की कल्पना करने के लिए पेट के सेफलाड को जुटाएं। ओमेंटम को सावधानीपूर्वक ऑपरेटिव क्षेत्र में रखें और पेट की अधिक वक्रता के साथ चलने वाले गैस्ट्रो-एपिप्लोइक वाहिकाओं की पहचान करें (चित्रा 2 ए)।
- अधिक वक्रता के बाएं पहलू से शुरू करें जहां बाईं गैस्ट्रो-एपिप्लोइक धमनी स्प्लेनिक धमनी से जुड़ती है। सीधे स्टीवंस टेनोटॉमी कैंची का उपयोग करके, बाएं गैस्ट्रो-एपिप्लोइक धमनी और नस दोनों को कंकाल करें। लिगेट फिर सर्जिकल टाई या क्लिप का उपयोग करके दोनों को अलग-अलग विभाजित करता है।
- पेट की अधिक वक्रता के साथ बाएं से दाएं आगे बढ़ें। पेट की अधिक वक्रता की आपूर्ति करने वाले ओमेंटम से उत्पन्न होने वाली छोटी संवहनी शाखाओं को लिपेट और विभाजित करें। इस चरण के दौरान ओमेंटम के मुख्य गैस्ट्रोएपिप्लोइक पेडिकल को घायल न करने का ध्यान रखें।
- जब तक सही गैस्ट्रो-एपिप्लोइक वाहिकाओं और गैस्ट्रोडोडोडेनल धमनी के जंक्शन का सामना नहीं होता है, तब तक अधिक ओमेंटम की लामबंदी जारी रखें। क्लिप या टाई के साथ, लिगेट फिर ओमेंटल फ्लैप को मुक्त करने के लिए दाईं गैस्ट्रोएपिप्लोइक धमनी और नसों को अलग-अलग विभाजित करता है।
- एक बार मुक्त होने के बाद, ओमेंटम को मध्य के साथ दो हिस्सों में विभाजित किया जा सकता है, जिसमें प्रत्येक आधा एक संबंधित गैस्ट्रो-एपिप्लोइक धमनी और नस के साथ होता है। यह एक पशु ऑपरेशन से दो ओमेंटल फ्री फ्लैप की खरीद की अनुमति देता है। व्यक्तिगत रूप से गैस्ट्रो-एपिप्लोइक वाहिकाओं को 20-22 जी कैनुला के साथ कैनुला करें और फिर 3-0 रेशम टाई के साथ सुरक्षित करें।
- गैस्ट्रो-एपिप्लोइक धमनी प्रवेशनी में हेपरिनाइज्ड खारा (15 आईयू / एमएल) फ्लश जब तक कि एक स्पष्ट शिरापरक बहिर्वाह नहीं देखा जाता है।
- Tensor fascia lata flap
नोट: प्रोटोकॉल हौघे एट अल.19 द्वारा पोर्सिन टेन्सर प्रावरणी लता फ्लैप के पिछले विवरण पर आधारित है। टेन्सर प्रावरणी लता फ्लैप के केवल प्रावरणी भाग को अलग करने के लिए संशोधन किया जाता है।- सुअर को पार्श्व डेक्युबिटस स्थिति में रखें और पूरे ऊपरी हिंदलिम्ब को द्विपक्षीय रूप से शेव करें। सामान्य बाँझ प्रक्रियाओं का उपयोग करके तैयार करें और लपेटें।
- फ्लैप की पूर्ववर्ती सीमा को एक रेखा के साथ चिह्नित करें जो पूर्ववर्ती सुपीरियर इलियाक स्पाइन (एएसआईएस) से पार्श्व पेटेला की ओर फैली हुई है। पेडिकल का स्थान इस रेखा के साथ एएसआईएस से लगभग 6-8 सेमी है।
- फ्लैप की चौड़ाई को शामिल करने के लिए फीमर की धुरी के साथ पूर्ववर्ती चीरा से लगभग 8 सेमी से 10 सेमी तक एक समानांतर पीछे की रेखा को चिह्नित करें। पार्श्व पेटेला पर फ्लैप के बाहरी किनारे को चिह्नित करें।
- स्केलपेल का उपयोग करके त्वचा के तेज चीरे के साथ पेटेला में डिस्टल मार्जिन पर विच्छेदन शुरू करें। चमड़े के नीचे के ऊतकों के माध्यम से त्वचा के चीरे को तब तक गहरा करें जब तक कि रेक्टस फेमोरिस के ऊपर प्रावरणी का सामना न हो।
- ऊपर वर्णित चिह्नित पूर्ववर्ती और पीछे की सीमाओं के साथ एएसआईएस की ओर त्वचा के चीरे जारी रखें। अकेले प्रावरणी फ्लैप को अलग करने के लिए, अंतर्निहित प्रावरणी परत से ऊपरी त्वचा घटक को हटा दें। त्वचा पर किसी भी छोटे परफोरेटर वाहिकाओं को लिपेट या कैटराइज करें।
- फ्लैप की बाहरी सीमा पर लौटें और अंतर्निहित वास्टस लेटरिस मांसपेशी को जुटाने की अनुमति देने के लिए गहरी प्रावरणी को इंजेक्ट करें। प्रावरणी को एएसआईएस की ओर जुटाएं।
- लामबंदी के दौरान, वास्टस लेटरलिस और रेक्टस फेमोरिस मांसपेशियों के बीच से उभरने वाले संवहनी पेडिकल की पहचान करें (चित्रा 2 बी)। अत्यधिक कर्षण से बचने के लिए ध्यान रखें ताकि पेडिकल वाहिकाओं को चोट न पहुंचे।
- संवहनी पेडिकल की रक्षा करते हुए एएसआईएस से समीपस्थ पहलू का विच्छेदन करें। तब तक विच्छेदन करें जब तक कि फ्लैप अपने पेडिकल के बारे में पर्याप्त रूप से संगठित न हो जाए।
- गहरी ऊरु वाहिकाओं की ओर पेडिकल का पता लगाएं। प्रावरणी फ्लैप की आपूर्ति करने वाली पार्श्व सर्कमफ्लेक्स फेमोरल धमनी और नस दोनों को कंकालीकृत करें। लिगेट तब दोनों जहाजों को समीपस्थ रूप से विभाजित करता है जहां वे गहरे ऊरु वाहिकाओं में शामिल होते हैं।
- 20 जी से 24 जी एंजियोकैथेटर के साथ व्यक्तिगत रूप से पेडिकल वाहिकाओं को कैनुलाट करें, 3-0 रेशम टाई के साथ सुरक्षित। फ्लैप धमनी प्रवेशनी में हेपरिनाइज्ड सेलाइन (15 आईयू / एमएल) फ्लश करें जब तक कि एक स्पष्ट शिरापरक बहिर्वाह नहीं देखा जाता है।
- रेडियल अग्रभाग फ्लैप
नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल खाचात्रियन एट अल.20 द्वारा पोर्सिन रेडियल अग्रभाग फ्लैप मॉडल के प्रकाशित विवरण पर आधारित है।- सुअर को ऑपरेटिंग टेबल पर पार्श्व डेक्युबिटस स्थिति में रखें। ऑपरेटिव क्षेत्र के भीतर आश्रित अग्रभाग को रखें।
- रेडियल अग्रभाग पर लगभग 3 सेमी x 3 सेमी त्वचा फ्लैप वर्ग चिह्नित करें। रेडियल धमनी पेडिकल के अनुमानित पाठ्यक्रम को निरूपित करने के लिए समीपस्थ फ्लैप मार्जिन और एंटीक्यूबिटल फोसा के मध्य बिंदु के बीच एक रेखा खींचें। धड़कन के साथ धमनी पाठ्यक्रम की पुष्टि करें।
नोट: पोर्सिन मॉडल में, रेडियल वाहिकाएं मनुष्यों की तुलना में अपेक्षाकृत गहरी स्थित हैं। उनका स्थान फ्लेक्सर कार्पी रेडियलिस और ब्राचियोराडियालिस के बीच है। - एंटेब्रैकियल प्रावरणी तक की गहराई के साथ डिस्टल पहलू पर स्केलपेल का उपयोग करके त्वचा को संक्रमित करें। ब्लंट को टेनोटॉमी कैंची के साथ तब तक विच्छेदन करें जब तक कि डिस्टल रेडियल धमनी और इसके दो वेने कोमिटेंट का सामना न हो जाए। धमनी और नसों को व्यक्तिगत रूप से शल्य चिकित्सा के साथ लपेटें और विभाजित करें।
- चिह्नित त्वचा वर्ग के रेडियल और उलनार मार्जिन पर त्वचा के चीरे जारी रखें। अंतर्निहित रेडियल हड्डी से फ्लैप को एक सर्जिकल ब्लेड के साथ एक रेडियल से उलनार दिशा में आगे बढ़ाते हुए फ्लैप को इकट्ठा करें, जबकि त्वचा के फ्लैप को एंटीक्यूबिटल फोसा की ओर समीपस्थ रूप से ऊपर उठाएं।
नोट: रेडियल धमनी पेडिकल को ऊपरी त्वचीय परत से जुड़े रहने के लिए एक सबफेशियल विच्छेदन विमान बनाए रखें। - समीपस्थ मार्जिन पर, समीपस्थ रेडियल धमनी और इसके वेने कोमिटेंट्स को उजागर करने के लिए स्व-बनाए रखने वाले रिट्रेक्टर के साथ ब्राचियोराडियालिस और फ्लेक्सर कार्पी रेडियलिस के बीच की जगह को वापस लें (चित्रा 2 सी)।
- टेनोटॉमी कैंची का उपयोग करके, रेडियल धमनी और वेने कोमिटेंट को एंटीक्यूबिटल फोसा पर समीपस्थ रूप से कंकालीकृत करें जहां वे क्रमशः ब्रैकियल धमनी और नसों में शामिल होते हैं। लगभग 5-6 सेमी की पर्याप्त पेडिकल लंबाई प्राप्त करने के लिए आसपास के फाइब्रोफैटी ऊतकों से वाहिकाओं को विच्छेदित करें। रेडियल अग्रभाग फ्लैप को मुक्त करने के लिए धमनी और वेने को अलग-अलग विभाजित करें।
- 20 जी से 24 जी एंजियोकैथेटर के साथ पेडिकल जहाजों को कैनुलाट करें, 3-0 रेशम टाई के साथ सुरक्षित। फ्लैप धमनी प्रवेशनी में हेपरिनाइज्ड खारा (15 आईयू / एमएल) फ्लश करें जब तक कि एक स्पष्ट शिरापरक बहिर्वाह नहीं देखा जाता है।
- फ्लैप खरीद के बाद, फ्लैप को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडे खारे में रखें जब तक कि डीसेलुलराइजेशन के लिए तैयार न हो। गहरे आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत, पोटेशियम क्लोराइड (100 मिलीग्राम / किग्रा IV) के अंतःशिरा इंजेक्शन के साथ जानवरों को इच्छामृत्यु करें। महत्वपूर्ण संकेतों की अनुपस्थिति से मृत्यु की पुष्टि करें।
चित्र 2: तीन पोर्सिन संवहनी फ्लैप की खरीद। दाएं (i) और बाएं (ii) गैस्ट्रोएपिप्लोइक धमनियों को ओमेंटल फ्लैप (iii) में प्रवेशित किया जाता है। (बी) टेंसर प्रावरणी लता। फ्लैप (iv) का पेडिकल पार्श्व ऊरु सर्कमफ्लेक्स धमनी (v) की आरोही शाखा है। (सी) रेडियल अग्रभाग फ्लैप। रेडियल अग्रभाग फ्लैप (vi) की खरीद रेडियल धमनी पर आधारित है और संवहनी पेडिकल के रूप में वेना कॉमिटेंट (vii) (नोट: ड्रेप्स को प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए छोड़ दिया गया था)। स्केल पट्टियाँ: 3 सेमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. डीसेलुलराइजेशन सिस्टम की स्थापना
- लामिनार प्रवाह जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में फ्लैप के साथ ऊतक कक्ष को इकट्ठा करें।
- बायोरिएक्टर के प्रवाह और बहिर्वाह बंदरगाहों दोनों के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक संलग्न करें। ऊतक कक्ष ढक्कन पर एयर वेंट पोर्ट पर 0.2 μm फ़िल्टर संलग्न करें। हवा के बुलबुले को खत्म करने के लिए बाँझ हेपरिनाइज्ड खारा के साथ प्रवाह ट्यूबिंग को प्राइम करें।
- फ्लैप को कक्ष में रखें। बाँझ हेमोस्टैट्स का उपयोग करके, फ्लैप को पुरुष लुएर कनेक्टर का उपयोग करके इनफ्लो ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। प्रत्येक फ्लैप के संबंधित धमनी प्रवेशनी को पुरुष लुएर पर स्क्रू करें और एक तंग सील सुनिश्चित करें।
- फ्लश हेपरिनाइज्ड खारा स्टॉपकॉक के माध्यम से यह जांचने के लिए कि लुएर कनेक्शन लीक के बिना है और फ्लैप को शिरापरक बहिर्वाह के सबूत के साथ संक्रमित किया जा सकता है। ऊतक कक्ष ढक्कन बंद करें।
- ऊतक कक्ष के इनफ्लो स्टॉपकॉक के लिए पीले तीन-स्टॉप पंप ट्यूबिंग के साथ इनफ्लो ट्यूबिंग को कनेक्ट करें। इसके अलावा, छिड़काव दबाव निगरानी की अनुमति देने के लिए इनफ्लो थ्री-वे स्टॉपकॉक में एक इनलाइन दबाव सेंसर ट्रांसड्यूसर संलग्न करें।
- इनफ्लो पेरिस्टालिक पंप चालू करें। प्रारंभिक स्क्रीन पर, टयूबिंग आईडी को 1.85 मिमी पर सेट करने के लिए तीर कुंजी का उपयोग करके तीसरे टैब पर आगे बढ़ें। इसके बाद, छिड़काव दर सेट करने के लिए दूसरे टैब पर आगे बढ़ें। डिलीवरी के मोड के रूप में इनपुट दर और 2 एमएल / मिनट पर सेट करें। सुनिश्चित करें कि प्रवाह की दिशा सही है जैसा कि स्क्रीन पर प्रदर्शित होता है। एक संगत कैसेट के साथ पेरिस्टाल्टिक पंप पर तीन-स्टॉप पंप टयूबिंग लोड करें।
- उपरोक्त के समान बहिर्वाह पेरिस्टालिक पंप के लिए प्रक्रिया दोहराएं। बहिर्वाह पंप सेटिंग को 4 एमएल /मिनट पर रेट करने के लिए सेट करें। ऊतक कक्ष के बहिर्वाह स्टॉपकॉक के लिए पीले तीन-स्टॉप पंप टयूबिंग के साथ बहिर्वाह टयूबिंग को कनेक्ट करें। एक संगत कैसेट के साथ पेरिस्टाल्टिक पंप पर तीन-स्टॉप पंप टयूबिंग लोड करें। पावर बटन दबाकर दोनों पंपों के लिए प्रवाह प्रारंभ करें।
नोट: बहिर्वाह पंप की उच्च दर ऊतक कक्ष के अतिप्रवाह को रोकने के लिए एक महत्वपूर्ण सुरक्षा उपाय है, यह सुनिश्चित करते हुए कि डीसेलुलराइजेशन के दौरान चैंबर बहिर्वाह हमेशा प्रवाह से अधिक हो। पूरे इकट्ठे डीसेलुलराइजेशन सेटअप को चित्रा 3 में दर्शाया गया है।
चित्र 3: इकट्ठे छिड़काव डीसेलुलराइजेशन सिस्टम। (ए) छिड़काव डीसेलुलराइजेशन सिस्टम का योजनाबद्ध। इनफ्लो ट्यूबिंग दबाव सेंसर निगरानी के साथ एकल-पास फैशन में डिटर्जेंट जलाशय से ऊतक कक्ष में परफ्यूसेट ले जाती है। बहिर्वाह टयूबिंग ऊतक कक्ष से अपशिष्ट कंटेनर में सक्रिय रूप से परफ्यूसेट को हटा देता है। काले तीर छिड़काव प्रवाह की दिशा को दर्शाते हैं। प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए बाएं पंप के साथ एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग किया जाता है। बहिर्वाह को संबंधित टयूबिंग के माध्यम से दूसरे पेरिस्टालिक पंप का उपयोग करके सक्रिय रूप से हटा दिया जाता है। चित्र BioRender.com के साथ बनाया गया है। (बी) फ्लोरफ्लो पेरिस्टालिक पंप (i) ऊतक कक्षों से जुड़े प्रवाह पेरिस्टालिक पंप (ii) और फिर बहिर्वाह पेरिस्टालिक पंप (iii) के साथ बेंचटॉप पर इकट्ठे छिड़काव डीसेल्यूलराइजेशन सिस्टम की तस्वीर। ऊतक कक्ष में प्रवेश करने से पहले इनफ्लो परफ्यूसेट दबाव की निगरानी इन-लाइन दबाव सेंसर (iv) के साथ की जाती है। यहां, तीन फ्लैप समानांतर में डीसेलुलराइज्ड होते हैं। डिटर्जेंट और अपशिष्ट जलाशय दोनों बेंचटॉप के नीचे हैं और फोटो नहीं खींचे गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
5. पोर्सिन फ्लैप का विकोशिकीयकरण
- कमरे के तापमान पर छिड़काव डीसेलुलराइजेशन के लिए निम्नलिखित सभी चरणों को पूरा करें। छिड़काव दर और अवधि के सारांश के लिए, तालिका 1 देखें। एक पेरिस्टालिक पंप का उपयोग करके 2 एमएल / मिनट पर हेपरिनाइज्ड खारा का छिड़काव शुरू करें और किसी भी बरकरार रक्त के थक्कों को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए ऊतक कक्ष में हेपरिनाइज्ड खारा के साथ फ्लैप को इंजेक्ट करें।
- हेपरिनाइज्ड खारा छिड़काव के पूरा होने पर, ऊतक कक्ष में एस्पिरेटेड अवशिष्ट खारा। फ्लैप को पर्याप्त रूप से जलमग्न करने के लिए ऊतक कक्ष को लगभग 500 एमएल एसडीएस डीसेलुलराइजेशन समाधान से भरें।
- इनफ्लो ट्यूबिंग को एसडीएस डीसेलुलराइजेशन समाधान में स्थानांतरित करें और ऊतक को 2 एमएल / मिनट पर इंजेक्ट करें। छिड़काव की अवधि फ्लैप के आधार पर भिन्न होती है; ओमेंटम के लिए 2 दिनों के लिए एसडीएस, टेन्सर प्रावरणी के लिए 3 दिन और रेडियल अग्रभाग फासियो-त्वचीय फ्लैप के लिए 5 दिन।
- एसडीएस डीसेल्यूलराइजेशन के पूरा होने पर, ऊतक कक्ष के भीतर निहित मौजूदा एसडीएस परफ्यूसेट को एस्पिरेट करें। इनफ्लो ट्यूबिंग को 1x PBS घोल में स्थानांतरित करें और फ्लैप को 1 दिन के लिए 2 mL/min पर डालें।
- पिछले पीबीएस समाधान को हटा दें और इनफ्लो ट्यूबिंग को डीनेस वर्किंग समाधान में स्थानांतरित करें। 2 मिनट पर 2 घंटे के लिए तैयार रहें। ऊतक कक्ष से DNase समाधान निकालें और 1x PBS समाधान में प्रवाह ट्यूबिंग रखें। कक्ष में 1x PBS घोल के साथ ऊतकों को डुबोएं और 1x PBS घोल को 1 दिन के लिए 2 mL/min पर डालें।
- पीएए / ईटीओएच समाधान के साथ फ्लैप को निष्फल करें। डीएच2ओ समाधान में पीएए / ईटीओएच में इनफ्लो ट्यूबिंग को स्थानांतरित करें और ऊतकों को उसी समाधान में डुबोएं। 3 घंटे के लिए 2 एमएल / मिनट पर पीएए / ईटीओएच का उपयोग करें। एक बार पीएए / ईटीओएच नसबंदी पूरी हो जाने के बाद, ट्यूबिंग को तीन-तरफा स्टॉपकॉक से डिस्कनेक्ट करें।
- सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके फ्लैप को हटा दें और बाँझ उपकरणों को पीबीएस में रखें जिसमें 1% एंटीबायोटिक्स / एंटीमाइकोटिक्स (ए / ए) होते हैं। अवशिष्ट एसिड को पूरी तरह से बेअसर करने के लिए दो अलग-अलग वॉश में 15 मिनट के लिए पीबीएस + 1% ए / ए के साथ फ्लैप को डुबोएं। पीबीएस + 1% ए / ए में फ्लैप को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि पुनर्कोशिकीयकरण के लिए तैयार न हो।
- आगर प्लेटों पर स्वैब कल्चर करके मचानों की बाँझपन की पुष्टि करें और माइक्रोबियल विकास की जांच करें। प्रत्येक फ्लैप सतह से लिए गए स्वैब के साथ आगर प्लेटों को टीका लगाएं। 2 सप्ताह तक 37 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेटों को कल्चर करें। बाँझपन माइक्रोबियल कॉलोनी विकास की अनुपस्थिति से प्रदर्शित होता है।
तालिका 1: छिड़काव-डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल मापदंडों का सारांश। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
6. विकोशिकीयकरण का मूल्यांकन
- पंच बायोप्सी का उपयोग करके, फ्लैप से 3 मिमी से 10 मिमी मोटाई के नमूने प्राप्त करें।
- हिस्टोलॉजी के लिए, कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए सामान्य बफर्ड फॉर्मेलिन में हिस्टोलॉजिकल कैसेट में बायोप्सी तय करें।
- बायोप्सी कैसेट को पानी या पीबीएस में 15 मिनट के लिए धोएं, फिर उन्हें ऊतक प्रसंस्करण के लिए तैयार होने तक 70% इथेनॉल में रखें। मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ऊतक प्रोसेसर में कैसेट को संसाधित करें।
- बायोप्सी को पैराफिन में एम्बेड करें, जिससे मोम को ठंडी प्लेट पर 10-15 मिनट के लिए जमने की अनुमति मिलती है। सेक्शन पैराफिन एक माइक्रोटोम पर 5 μm मोटाई तक ब्लॉक करता है। मानक प्रोटोकॉल के अनुसार हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ स्लाइड को दाग दें। प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ ऊतक स्लाइड की छवि।
- डीएनए सामग्री परिमाणीकरण के लिए, 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रात भर ऊतक सुखाने के बाद ऊतक बायोप्सी का सूखा वजन प्राप्त करें। नमूनों को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर पपैन निष्कर्षण बफर में पचाएं। 10,000 x g पर पचे हुए नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को एक ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट के साथ डीएनए सामग्री की परख करें।
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Representative Results
संवहनी पोर्सिन फ्लैप को डीसेल्युलर करने के लिए यह प्रोटोकॉल एक अनुकूलित छिड़काव बायोरिएक्टर में फ्लैप वास्कुलचर के माध्यम से एक आयनिक-आधारित डिटर्जेंट, एसडीएस के छिड़काव पर निर्भर करता है। डीसेलुलराइजेशन से पहले, पोर्सिन मॉडल में तीन संवहनी फ्लैप खरीदे गए थे और उनके मुख्य आपूर्ति जहाजों के अनुसार प्रवेशित किए गए थे। सफल डीसेल्यूलराइजेशन की अनुमति देने के लिए पेटेंट, परफ्यूजेबल वास्कुलचर को बनाए रखने के लिए खरीद के बाद फ्लैप को तुरंत फ्लश किया गया था। एयरटाइट स्नैप-ढक्कन कंटेनरों का उपयोग करते हुए, एक अनुकूलित बायोरिएक्टर को एक संलग्न वातावरण के भीतर फ्लैप छिड़काव की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया था। बायोरिएक्टर के भीतर फ्लैप का छिड़काव ऊतक कक्ष से जुड़े दो पेरिस्टालिक पंपों का उपयोग करके एकल-पास फैशन में हासिल किया गया था। छिड़काव दबाव की निगरानी इन-लाइन दबाव सेंसर के साथ की गई थी।
डीसेलुलराइजेशन के दौरान, एसडीएस एक्सपोजर की अवधि संसाधित किए जा रहे ऊतक के प्रकार पर निर्भर थी। वर्णित छिड़काव डीसेल्युलराइजेशन तकनीक के साथ, ओमेंटम, टेन्सर प्रावरणी और रेडियल अग्रभाग फ्लैप को क्रमशः 2 दिन, 3 दिन और 5 दिनों के लिए 0.05% एसडीएस के साथ डीसेल्यूलराइज्ड किया गया था। डीसेल्यूलराइजेशन के बाद सफल नसबंदी 14 दिनों के लिए फ्लैप को स्वैब करने और आगर प्लेटों पर स्वैब की खेती के बाद माइक्रोबियल कॉलोनी के विकास की अनुपस्थिति से प्रदर्शित हुई थी। छिड़काव दबाव की निगरानी 2 एमएल / मिनट प्रवाह दर पर की गई थी और सभी तीन फ्लैप के लिए डीसेलुलराइजेशन के सभी चरणों के दौरान 20-60 मिमीएचजी के बीच थी। डीसेल्युलराइजेशन के समापन पर, फ्लैप को मैन्युअल नियंत्रण में फ्लश किया गया था और मुक्त जल निकासी के लिए छोड़े गए शिरापरक प्रवेशनी से बहिर्वाह के सबूत का प्रदर्शन किया गया था (पूरक वीडियो 1, पूरक वीडियो 2, पूरक वीडियो 3)।
कुल 15 फ्लैप को डीसेल्यूलराइज्ड किया गया था, जिसमें तीन ऊतक प्रकारों में से प्रत्येक के लिए पांच प्रतिकृतियां थीं। परीक्षण करने पर, देशी ऊतकों की सकल आकृति विज्ञान गुलाबी रंग (चित्रा 4 ए, ई, आई) दिखाई दिया, जबकि विकोशिकीय ऊतक दिखने में विशिष्ट रूप से सफेद / अपारदर्शी थे (चित्रा 4 सी, जी, के)। एच एंड ई के साथ देशी ऊतकों की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा नीले नाभिक की उपस्थिति को दर्शाती है (चित्रा 4 बी, एफ, जे)। डीसेल्यूलराइज्ड फ्लैप में, एच एंड ई धुंधलापन ने नीले परमाणु धुंधलापन (चित्रा 4 डी, एच, एल) की अनुपस्थिति के साथ सेलुलर सामग्री का नुकसान दिखाया, जो एक अकोशिकीय ऊतक मचान का संकेत देता है। पांच प्रतिकृतियों में डीएनए सामग्री की अतिरिक्त मात्रा ने प्रत्येक फ्लैप के लिए छात्र के टी-टेस्ट द्वारा देशी ऊतकों की तुलना में एककोशिकीय मचानों में डीएनए में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी दिखाई (चित्रा 5)। ओमेंटम में, डीएनए देशी फ्लैप में 460 एनजी / मिलीग्राम ± 124 एनजी / मिलीग्राम सूखे ऊतक से घटकर 25.8 एनजी / मिलीग्राम ± डीसेलुलर फ्लैप में 5.90 एनजी / मिलीग्राम शुष्क ऊतक (एन = 5, पी < 0.05) हो गया। टेन्सर प्रावरणी लता में, डीएनए क्रमशः देशी और डीसेलुलर फ्लैप के बीच 297 एनजी / मिलीग्राम ± 68.2 एनजी / मिलीग्राम से 58.3 एनजी / मिलीग्राम ± 13.5 एनजी / मिलीग्राम तक कम हो गया (एन = 5, पी < 0.05)। रेडियल अग्रभाग फ्लैप ने देशी फ्लैप में 1180 एनजी / मिलीग्राम ± 241 एनजी / मिलीग्राम से 162 एनजी / मिलीग्राम ± डीसेलुलराइज्ड फ्लैप में 34.9 एनजी / मिलीग्राम (एन = 5, पी < 0.05) तक डीएनए की कमी दिखाई।
चित्रा 4: तीन पोर्सिन फ्लैप का विकोशिकीयकरण। (ए) देशी ओमेंटम, (ई) टेंसर प्रावरणी लता, और (आई) रेडियल अग्रभाग फ्लैप की सकल परीक्षा खरीद के तुरंत बाद फ्लैप की गुलाबी उपस्थिति को प्रदर्शित करती है। देशी ऊतकों का हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन एच एंड ई (बी, एफ, जे) के साथ सेलुलर नाभिक के स्पष्ट हेमेटॉक्सिलिन धुंधलापन को दर्शाता है। डीसेलुलराइजेशन के बाद, (सी) ओमेंटम, (जी) टेंसर प्रावरणी लता, और (के) रेडियल अग्रभाग पूरी तरह से सफेद और अपारदर्शी दिखाई देते हैं। हिस्टोलॉजिकल रूप से, तीन डीसेल्यूलराइज्ड फ्लैप एच एंड ई (डी, एच, एल) के साथ परमाणु धुंधलापन की अनुपस्थिति दिखाते हैं। स्केल पट्टियाँ: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 5: एककोशिकीय मचानों में डीएनए सामग्री का परिमाणीकरण। मूल्यों को शुष्क मचान द्रव्यमान के मिलीग्राम के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। देशी, गैर-विकोशिकीय ऊतकों (एन = 5) और डीसेल्यूलराइज्ड ऊतकों (एन = 5) से ताजा ऊतक के नमूने सूखे गए थे और परिमाणीकरण से पहले पपैन में रात भर पाचन से पहले वजन किया गया था। सांख्यिकीय परीक्षण ने 0.05 के पी-वैल्यू के रूप में परिभाषित महत्व (**) स्तर के साथ छात्र के टी-टेस्ट < उपयोग किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्र 1. सकल परीक्षा (स्केल बार = 3 सेमी) और एच एंड ई हिस्टोलॉजी (स्केल बार = 200 μm) द्वारा 5 दिनों में 0.05% सोडियम डोडेसिल सल्फेट का उपयोग करके ओमेंटम के छिड़काव-डीसेल्युलराइजेशन की प्रगति की समय-पाठ्यक्रम परीक्षा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्र 2. सकल परीक्षा (स्केल बार = 3 सेमी) और एच एंड ई हिस्टोलॉजी (स्केल बार = 200 μm) द्वारा 5 दिनों में 0.05% सोडियम डोडेसिल सल्फेट का उपयोग करके टेंसर प्रावरणी लता के छिड़काव-डीसेल्युलराइजेशन की प्रगति की समय-पाठ्यक्रम परीक्षा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्र 3. सकल परीक्षा (स्केल बार = 3 सेमी) और एच एंड ई हिस्टोलॉजी (स्केल बार = 200 μm) द्वारा 5 दिनों में 0.05% सोडियम डोडेसिल सल्फेट का उपयोग करके रेडियल अग्रभाग फ्लैप के छिड़काव-डीसेल्युलराइजेशन की प्रगति की समय-पाठ्यक्रम परीक्षा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक वीडियो 1. धमनी कैनुला (गुलाबी) के माध्यम से डीसेल्यूलराइज्ड ओमेंटम फ्लैप का प्रतिनिधि मैनुअल छिड़काव स्वतंत्र रूप से शिरापरक प्रवेशनी (पीला) से बहिर्वाह का प्रदर्शन करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो 2. धमनी प्रवेशनी (गुलाबी) के माध्यम से डीसेल्यूलराइज्ड टेन्सर प्रावरणी लता फ्लैप का प्रतिनिधि मैनुअल छिड़काव स्वतंत्र रूप से शिरापरक प्रवेशनी (नीला) से बहिर्वाह का प्रदर्शन करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक वीडियो 3. धमनी प्रवेशनी (नीला) के माध्यम से डीसेल्यूलराइज्ड रेडियल अग्रभाग फ्लैप का प्रतिनिधि मैनुअल छिड़काव स्वतंत्र रूप से शिरापरक प्रवेशनी (पीला) से बहिर्वाह का प्रदर्शन करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रस्तावित प्रोटोकॉल पोर्सिन-व्युत्पन्न फ्लैप की एक श्रृंखला को डीसेल्यूलराइज करने के लिए कम सांद्रता एसडीएस के छिड़काव का उपयोग करता है। इस प्रक्रिया के साथ, एककोशिकीय ओमेंटम, टेंसर प्रावरणी लता, और रेडियल अग्रभाग फ्लैप को कम सांद्रता वाले एसडीएस का समर्थन करने वाले प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफलतापूर्वक डीसेल्यूलराइज्ड किया जा सकता है। प्रारंभिक अनुकूलन प्रयोगों ने निर्धारित किया है कि 2 दिनों से 5 दिनों के बीच कम सांद्रता (0.05%) पर एसडीएस हिस्टोलॉजिकल तकनीकों (पूरक चित्रा 1, पूरक चित्रा 2, पूरक चित्रा 3) के साथ विश्लेषण किए जाने पर ओमेंटम, टेंसर प्रावरणी लता और रेडियल अग्रभाग फ्लैप के लिए सेलुलर सामग्री को हटाने में सक्षम है। यह विधि एक सीधा दृष्टिकोण प्रदान करती है जो कम समय सीमा के भीतर और उचित लागत पर डीसेलुलराइजेशन प्राप्त करती है। हमारे अनुभव में, पोर्सिन फ्लैप के डीसेल्यूलराइजेशन और नसबंदी में 2-5 दिन लगते हैं, जिसमें अधिक घनत्व वाले ऊतकों के लिए लंबी अवधि की डीसेल्यूलराइजेशन की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, 5 दिनों में अग्रभाग की त्वचा बनाम 2 दिन में ओमेंटम)। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एसडीएस की कम सांद्रता का चयन इस तर्क के आधार पर किया गया था कि 0.05% पर एसडीएस की कम सांद्रता एसडीएस की महत्वपूर्ण माइसेलर एकाग्रता (लगभग 0.2% 21 पर) से नीचे आती है और इस प्रकार, सर्फेक्टेंट को महत्वपूर्ण बायोएक्टिव ईसीएम घटकों को बरकरार रखते हुए सेल झिल्ली को प्रभावी ढंग से घुलनशील करने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में कम सांद्रता वाले एसडीएस का उपयोग संवहनी फैसियो-त्वचीय फ्लैप के छिड़काव-विकोशिकीयकरण के लिए एसडीएस की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (जैसे, 1%) के उपयोग के विपरीत है, जैसा कि पिछले लेखकों द्वारा रिपोर्ट किया गयाहै। एसडीएस की उच्च सांद्रता, जबकि डीसेलुलराइजेशन में प्रभावी है, ईसीएम पाड़ पर हानिकारक प्रभाव डालने की कीमत पर आती है, जैसे कि जीएजी और विकास कारक की कमी, साथ ही कोलेजन और विमेंटिन23,24 जैसे प्रोटीन का विकृतीकरण। दरअसल, पोर्सिन संवहनी फ्लैप के छिड़काव-डीसेल्युलराइजेशन में भविष्य के काम से संरचनात्मक और आणविक स्तरों पर ईसीएम पर डीसेल्युलराइजेशन एजेंट के प्रभावों की जांच करने के लिए अतिरिक्त लक्षण वर्णन अध्ययनों से लाभ होगा और डाउनस्ट्रीम रीसेलुलराइजेशन 25,26,27 के लिए उनके निहितार्थ . कोलेजन, इलास्टिन, या जीएजी सामग्री जैसे ईसीएम घटकों के लिए परख का उपयोग डीसेलुलराइजेशन के बाद ईसीएम में परिवर्तन का मात्रात्मक आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, यांत्रिक शक्ति परीक्षण डीसेल्यूलराइजेशन के बाद बायोमेकेनिकल गुणों में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी साधन है। अंत में, एंजियोग्राफी या माइक्रोसीटी स्कैनिंग जैसी तकनीकों का उपयोग करके संवहनीता का आकलन भी प्रणालीगत स्तर पर संवहनी वास्तुकला को चिह्नित करने में मददकरेगा।
इस प्रोटोकॉल के साथ कई तकनीकी विचारों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, आकस्मिक डिकैनुलेशन को रोकने के लिए फ्लैप हैंडलिंग और बायोरिएक्टर असेंबली के दौरान अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए, क्योंकि एक्स विवो सेटिंग में रिकैनुलेशन तुलनात्मक रूप से अधिक कठिन है। दूसरे, फ्लैप खरीद के दौरान, एक प्रभावी और बरकरार संवहनी पेडिकल के साथ एक बरकरार फ्लैप प्राप्त करना सफल डीसेलुलराइजेशन के लिए महत्वपूर्ण है। खरीद के दौरान यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि मचान में डिस्टल रिसाव बिंदु या तो फिसल गए हैं या हाथ से बंधे हुए हैं। यह रिसाव को कम करने में मदद करेगा, जो फ्लैप वास्कुलचर के माध्यम से समाधान के अपूर्ण छिड़काव का कारण बन सकता है। खरीद के बाद हेपरिनाइज्ड खारा के साथ छिड़काव की एक प्रारंभिक अवधि रक्त के थक्कों के प्रतिधारण को रोकती है और शिरापरक परफ्यूसेट बहिर्वाह द्वारा प्रमाणित एक पर्फ्यूजेबल वास्कुलचर की पुष्टि करती है। किसी भी संभावित इंट्रावैस्कुलर अवरोधों (जैसे, सेल मलबे / एयर एम्बोली से) की जांच करने के लिए डीसेल्युलराइज्ड ऊतकों को फिर से डीसेल्यूलराइजेशन के पूरा होने पर फिर से फ्लश किया जा सकता है जो फ्लैप परफ्यूजबिलिटी को रोक सकता है। हमारे अनुभव में, डीसेल्यूलराइज्ड फ्लैप ने इस प्रोटोकॉल के बाद सिरिंज फ्लशिंग के लिए कोई इंट्रावास्कुलर प्रतिरोध नहीं दिखाया, जबकि फ्लशिंग के बाद डीसेलुलर फ्लैप से शिरापरक बहिर्वाह फिर से देखा जा सकता है (पूरक वीडियो 1, पूरक वीडियो 2, पूरक वीडियो 3)। यह एक पेटेंट धमनी से शिरापरक संवहनी लूप का संकेत था जिसमें केशिकाओं को जोड़ा जा सकता था।
डीसेलुलराइजेशन के दौरान छिड़काव मापदंडों के बारे में एक और विचार किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, 2 एमएल / मिनट की लक्ष्य प्रवाह दर के साथ एक निरंतर प्रवाह दर छिड़काव का चयन किया गया था, जो पोर्सिन फ्लैप ऊतकों13,29 के पहले प्रकाशित डीसेलुलराइजेशन अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली ऑपरेटिंग प्रवाह दरों की सीमा के भीतर था। इसके अलावा, हमारे डीसेलुलराइजेशन सिस्टम में छिड़काव के दौरान इंट्रावास्कुलर प्रतिरोध में संभावित उतार-चढ़ाव की निगरानी करने के लिए एक वास्तविक समय इन-लाइन दबाव निगरानी क्षमता शामिल है; यह विधि संभावित इंट्रावास्कुलर रोड़ा से उत्पन्न उच्च छिड़काव दबाव से बचने में मदद कर सकती है जो माइक्रोवस्कुलर ईसीएम को नुकसान पहुंचा सकती है।
अंत में, परिणामी मचान की नसबंदी एक और महत्वपूर्ण तकनीकी विचार है। हमने डीसेल्यूलराइजेशन के दौरान होने वाले आकस्मिक पर्यावरणीय संदूषण को संबोधित करने के लिए डीसेलुलराइजेशन प्रोटोकॉल के अंतिम चरण के रूप में एक नसबंदी चरण को शामिल किया। फ्लैप बाँझपन विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ताकि फ्लैप का उपयोग भविष्य में पुनर्कोशिकीयकरण के लिए किया जा सके। 4% ईटीओएच का छिड़काव पहले समूहों द्वारा30,31 एसेलुलर मचानों को स्टरलाइज़ करने के लिए सूचित किया गया था और इस प्रोटोकॉल के साथ भी प्रभावी पाया गया था। अगर प्लेटों पर फ्लैप स्वैब कल्चर की जांच करके और इनक्यूबेशन के 14 दिनों के बाद अनुपस्थित वृद्धि को ध्यान में रखते हुए बाँझपन को सत्यापित किया गया था।
प्रयोगों के लिए डिज़ाइन किया गया अनुकूलित छिड़काव बायोरिएक्टर अपेक्षाकृत लागत प्रभावी होने के साथ-साथ सरल और इकट्ठा करने के लिए त्वरित है। इसके अलावा, इस छिड़काव बायोरिएक्टर के सभी घटक फ्लैप की बाँझपन को बनाए रखते हुए पुन: कोशिकीयकरण कार्य के लिए ऑटोक्लेवेबल और अनुकूलनीय हैं। अनुकूलित बायोरिएक्टर सर्किट को ओपन-सर्किट छिड़काव की अनुमति देने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है जो सेल सीडिंग प्रयोगों के बाद एक पुनर्कोशिकीय मचान के माध्यम से सेल कल्चर मीडिया को प्रसारित कर सकता है। बहरहाल, बायोरिएक्टर सिस्टम की कुछ सीमाएं उल्लेख करने योग्य हैं। सबसे पहले, दो वाणिज्यिक पंपों का उपयोग, जबकि सिस्टम के अनजाने अतिप्रवाह को रोकने के लिए आवश्यक है, खासकर जब बड़ी मात्रा में परफ्यूसेट का उपयोग किया जाता है, छिड़काव सेट-अप की अन्यथा कम लागत से अलग हो जाता है। इसके अतिरिक्त, वर्तमान छिड़काव बायोरिएक्टर सिस्टम का कम थ्रूपुट समानांतर में कई प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां चलाने की आवश्यकता होने पर तार्किक चुनौतियां पेश कर सकता है; पोर्सिन किडनी डीसेल्युलराइजेशन32 के लिए विकसित तुलनात्मक रूप से उच्च थ्रूपुट सिस्टम को एक दिन इन तार्किक चुनौतियों को कम करने के लिए पोर्सिन फ्लैप डीसेल्युलराइजेशन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, जबकि विकसित बायोरिएक्टर स्थापित करना सरल है, मानव पर्यवेक्षण और मैनुअल ऑपरेशन अभी भी नियमित रूप से और अक्सर आवश्यक है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सिस्टम की कोई खराबी न हो। स्वचालन क्षमताओं को शामिल करने वाले बायोरिएक्टर में संशोधन जो न्यूनतम या बिना किसी मानवीय हस्तक्षेप के बायोरिएक्टर प्रदर्शन की निगरानी और पुनर्समर्थन दोनों कर सकते हैं, भविष्य में छिड़काव-डीसेल्युलराइजेशन बायोरिएक्टर तकनीक को आगे बढ़ाने के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है।
विकोशिकीय फ्लैप का मुख्य अनुप्रयोग कोशिका आबादी के साथ इन अकोशिकीय मचानों के बाद के पुनर्कोशिकीयकरण की अनुमति देना है जो वाहिका को पुनर्जीवित कर सकते हैं। जबकि कार्यात्मक और व्यवहार्य संवहनी ऊतक को पुनर्जीवित करने के लिए उपयुक्त सेल संख्या, आबादी, सीडिंग रणनीतियों और बायोरिएक्टर स्थितियों को निर्धारित करने के लिए भविष्य के शोध की आवश्यकता है, यह प्रोटोकॉल इस लक्ष्य की दिशा में प्रारंभिक मूलभूत कार्य का प्रतिनिधित्व करता है। पुनर्कोशिकीयकरण के भविष्य के तरीके नरम ऊतक फ्लैप को एक बरकरार पर्फ्यूजेबल संवहनी नेटवर्क के साथ इंजीनियर करने के लिए रणनीतियों को स्थापित करने में मदद करेंगे और संभावित रूप से अधिक जटिल समग्र ऊतकों को पुनर्जीवित करने में योगदान देंगे, जैसे कि सिरा और चेहरे के एलोग्राफ्ट। ये मचान एक दिन बड़े पैमाने पर नरम ऊतक पुनर्निर्माण से गुजरने वाले रोगियों के लिए दाता साइट रुग्णता और इम्यूनोसप्रेशन को दरकिनार कर सकते हैं, जिससे उनके नैदानिक परिणामों और जीवन की गुणवत्ता में सुधार हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
कोई नहीं
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
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