Summary
Il protocollo descrive l'approvvigionamento chirurgico e la successiva decellularizzazione dei lembi suini vascolarizzati mediante la perfusione di detergente dodecilsolfato di sodio attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato.
Abstract
I difetti dei tessuti molli di grandi volumi portano a deficit funzionali e possono avere un grande impatto sulla qualità della vita del paziente. Sebbene la ricostruzione chirurgica possa essere eseguita utilizzando il trasferimento autologo del lembo libero o l'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA), tali metodi presentano anche degli svantaggi. Problemi come la morbilità del sito donatore e la disponibilità di tessuti limitano il trasferimento autologo del lembo libero, mentre l'immunosoppressione è una limitazione significativa della VCA. I tessuti ingegnerizzati in chirurgia ricostruttiva utilizzando metodi di decellularizzazione/ricellularizzazione rappresentano una possibile soluzione. I tessuti decellularizzati sono generati utilizzando metodi che rimuovono il materiale cellulare nativo preservando la microarchitettura della matrice extracellulare sottostante (ECM). Questi scaffold acellulari possono quindi essere successivamente ricellularizzati con cellule specifiche del ricevente.
Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi di approvvigionamento e decellularizzazione utilizzati per ottenere scaffold acellulari in un modello suino. Inoltre, fornisce anche una descrizione della progettazione e della configurazione del bioreattore di perfusione. I lembi includono l'omento suino, la fascia lata tensoriale e l'avambraccio radiale. La decellularizzazione viene eseguita tramite perfusione ex vivo di detergente a bassa concentrazione di sodio dodecilsolfato (SDS), seguita da trattamento enzimatico DNasi e sterilizzazione con acido peracetico in un bioreattore di perfusione personalizzato.
La decellularizzazione tissutale di successo è caratterizzata da un aspetto bianco-opaco dei lembi macroscopicamente. I lembi acellulari mostrano l'assenza di nuclei sulla colorazione istologica e una significativa riduzione del contenuto di DNA. Questo protocollo può essere utilizzato in modo efficiente per generare scaffold di tessuti molli decellularizzati con ECM conservata e microarchitettura vascolare. Tali scaffold possono essere utilizzati in successivi studi di ricellularizzazione e hanno il potenziale per la traduzione clinica in chirurgia ricostruttiva.
Introduction
La lesione traumatica e la rimozione del tumore possono portare a difetti dei tessuti molli grandi e complessi. Questi difetti possono compromettere la qualità della vita del paziente, causare perdita di funzione e causare disabilità permanente. Mentre tecniche come il trasferimento del lembo di tessuto autologo sono state comunemente praticate, i problemi con la disponibilità del lembo e la morbilità del sito donatore sono le principali limitazioni 1,2,3. L'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) è un'alternativa promettente che trasferisce i tessuti compositi, ad esempio muscoli, pelle, vascolarizzazione, come una singola unità ai riceventi. Tuttavia, VCA richiede immunosoppressione a lungo termine, che porta a tossicità da farmaci, infezioni opportunistiche e tumori maligni 4,5,6.
Gli scaffold acellulari di ingegneria tissutale sono una potenziale soluzione a queste limitazioni7. Gli scaffold tissutali acellulari possono essere ottenuti utilizzando metodi di decellularizzazione, che rimuovono il materiale cellulare dai tessuti nativi preservando la microarchitettura della matrice extracellulare sottostante (ECM). In contrasto con l'uso di materiali sintetici nell'ingegneria tissutale, l'uso di scaffold di derivazione biologica offre un substrato ECM biomimetico che consente la biocompatibilità e il potenziale per la traduzione clinica8. Dopo la decellularizzazione, la successiva ricellularizzazione degli scaffold con cellule specifiche del ricevente può quindi generare tessuti funzionali vascolarizzati con poca o nessuna immunogenicità 9,10,11. Sviluppando un protocollo efficace per ottenere tessuti acellulari utilizzando tecniche di decellularizzazione per perfusione, è possibile progettare un'ampia gamma di tipi di tessuto. A sua volta, la costruzione di questa tecnica consente l'applicazione a tessuti più complessi. Ad oggi, la decellularizzazione perfusionale dei tessuti molli vascolarizzati è stata studiata utilizzando semplici tessuti vascolarizzati come un lembo fasciocutaneo a tutto spessore nel roditore 12, nel suino13 e nei modelli umani 14, così come il muscolo scheletrico del retto dell'addome suino15. Inoltre, tessuti vascolarizzati complessi sono stati anche decellularizzati per perfusione, come dimostrato nei modelli di orecchio suino e umano 16,17 e nei modelli di innesto umano a pieno viso18.
Qui, il protocollo descrive la decellularizzazione di lembi liberi vascolarizzati utilizzando scaffold ECM di derivazione biologica. Presentiamo la decellularizzazione di tre lembi clinicamente rilevanti: 1) l'omento, 2) la fascia tensoriale lata e 3) l'avambraccio radiale, tutti rappresentativi dei lembi del cavallo di battaglia utilizzati di routine nella chirurgia ricostruttiva e non sono stati precedentemente esaminati negli studi sugli animali nel contesto della decellularizzazione tissutale. Questi lembi bioingegnerizzati offrono una piattaforma versatile e prontamente disponibile che ha il potenziale per applicazioni cliniche per l'uso nel campo della riparazione e ricostruzione di difetti dei tessuti molli di grandi dimensioni.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della rete sanitaria universitaria (IACUC) e vengono eseguite in conformità con il protocollo e le procedure del Centro risorse animali della rete sanitaria universitaria e le linee guida del Consiglio canadese per la cura degli animali. Cinque maiali dello Yorkshire (35-50 kg; età circa 12 settimane) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti.
1. Fabbricazione di bioreattori di perfusione
- Vedere la Figura 1 per tutti i componenti utilizzati nel bioreattore a perfusione. Per la fabbricazione della camera di tessuto, utilizzare contenitori a scatto in polipropilene disponibili in commercio con coperchi stagni e ermetici contenenti un rivestimento di tenuta in silicone. Assicurarsi che i contenitori siano compatibili con l'autoclave.
- Praticare due fori da 1/4 lungo i lati del contenitore e infilare un segmento corto di tubi in silicone rivestiti di platino L / S-16. Un tubo trasporterà il perfusato di afflusso e l'altro è per il deflusso.
- Per il tubo di afflusso, collegare un connettore Luer maschio alla parte interna che verrà utilizzato per il collegamento alla cannula di tessuto. Collegare un connettore Luer femmina all'estremità esterna del tubo di afflusso che verrà utilizzato per il collegamento a un rubinetto di arresto a tre vie.
- Praticare un singolo foro da 1/4 di pollice sul coperchio della camera e infilare un altro segmento corto di tubi in silicone rivestiti di platino L / S-16. Questo tubo fungerà da presa d'aria.
- Realizzare i tubi di afflusso e deflusso misurando circa 50 cm di tubo in silicone rivestito di platino L/S-16. Collegare un'estremità a un tubo giallo a tre arresti della pompa e l'altra estremità a una pipetta sierologica sterile da 2 ml per trasportare il perfusato dai serbatoi del detergente nella camera del bioreattore.
- Autoclavare tutti i componenti (camera e tubi) in imballaggi sterili confezionati singolarmente.
Figura 1: Fabbricazione del bioreattore di perfusione. Il bioreattore di perfusione è costituito da (A) una camera di tessuto plastico in polipropilene (B) con fori laterali praticati per ospitare tubi di perfusione con coperchio a tenuta d'aria e d'acqua. (C) I rubinetti di arresto sono fissati ai tubi per consentire il fissaggio del tubo di perfusione che trasporta gli agenti di decellularizzazione dal serbatoio del detergente ai rifiuti in modo a passaggio singolo. (D) Le cassette della pompa compatibili sono utilizzate per collegare il tubo a tre stop alla pompa peristaltica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Preparazione di soluzioni di decellularizzazione
- Preparare la soluzione salina normale eparinizzata (15 UI/ml) diluendo 1,5 mL di 1000 U.I./mL di soluzione madre di eparina in 100 mL di soluzione salina normale.
- Preparare la soluzione di sodio dodecilsolfato (SDS) allo 0,05% p/v aggiungendo lentamente 9 g di polvere SDS a 18 L di acqua distillata-deionizzata in autoclave. Utilizzare una carboy in polipropilene (PP) di grande volume per ospitare la soluzione SDS. La soluzione è pronta per l'uso quando completamente disciolta. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di lavoro DNase I. In primo luogo, ricostituire la DNasi I liofilizzata ad una concentrazione madre di 10 mg/ml con 5 mM CaCl 2 in dH2 O. Conservare la soluzione madrericostituita di DNasi I come aliquote in un congelatore a -20 °C fino al momento dell'uso. Il giorno dell'uso, diluire lo stock di DNasi I 1:100 con Mg++ (1,29 mM) e Ca++(1,98 mM) in dH2O sterile fino a una concentrazione finale di 0,1 mg/ml.
NOTA: l'attività della DNasi si degrada a meno che non venga conservata in modo congelato. Solo la soluzione di DNasi fresca deve essere utilizzata per la digestione enzimatica del DNA a temperatura ambiente. - Preparare 1x soluzione PBS diluendo 10x PBS stock 1:10 con acqua sterile autoclavata in un volume finale di 5 L in un carboile PP. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare l'1% di antibiotici / antimicotici (A / A) in PBS. Diluire 100x antibiotici/antimicotici 1:100 con soluzione sterile 1x PBS ad un volume finale di 1 L. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare lo 0,1% (v/v) di acido peracetico (PAA)/4% (v/v) di etanolo (EtOH) aggiungendo 3,13 ml di PAA + 40 ml di etanolo al 100% + 956 ml di dH2O. Portare il volume finale a 1.000 ml e conservare a temperatura ambiente.
3. Approvvigionamento di lembi suini
NOTA: questa è una procedura terminale. Un maiale è stato usato per procurarsi tutti e tre i lembi. Eutanasia umana dell'animale dopo l'approvvigionamento di tutti i lembi.
- Cure preoperatorie
- Maiali veloci almeno 12 ore prima dell'intervento. Sedare gli animali con ketamina (20 mg/kg per via intramuscolare, IM), atropina (0,04 mg/kg IM) e midazolam (0,3 mg/kg IM).
- Indurre l'anestesia per inalazione di isoflurano al 5% attraverso una maschera ad una portata di 22-44 ml/kg/min per l'inserimento e l'intubazione della linea periferica. Mantenere l'anestesia con isoflurano allo 0,5%-2% a 22-44 ml/kg/min. Garantire un'adeguata profondità dell'anestesia controllando la stabilità emodinamica e annotare l'assenza di riflessi di ritiro palpebrale/pedale o del tono muscolare della mascella per indicare un livello appropriato di anestetico somministrato. Somministrare remifentanil per via endovenosa (10-20 μg/kg/h) infusione continua a velocità durante l'intervento chirurgico per analgesia.
- Intubare il maiale con un tubo endotracheale appropriato (7-8 mm) e collegare il tubo a un ventilatore impostato su un volume corrente di 8 ml/kg, PEEP di 5 cm H 2 0, FiO2di 0,5 e frequenza respiratoria di 14.
- Inserire un catetere angiocath da 22 G nella vena dell'orecchio. Una volta ottenuto l'accesso endovenoso (IV), infondere soluzione salina normale calda allo 0,9% a 5-10 ml / kg / h durante la procedura per mantenere la pressione arteriosa media tra 60 mmHg e 90 mmHg.
- Monitorare continuamente la frequenza cardiaca, la pulsossimetria e la CO2 di fine marea. Valutare la pressione sanguigna e la temperatura corporea ogni 5 minuti.
- Applicare unguento oculare per prevenire la secchezza oculare durante l'anestesia. Preparare l'intero campo chirurgico con povidone-iodio. Coprire il campo chirurgico con asciugamani sterili.
- Lembo omentale
- Posizionare il maiale in posizione supina ed eseguire una laparotomia xypho-ombelical.
- Entrando nell'addome, mobilitare lo stomaco cefalo per visualizzare l'omento maggiore. Posizionare con cautela l'omento nel campo operatorio e identificare i vasi gastroepiploici che corrono lungo la maggiore curvatura dello stomaco (Figura 2A).
- Inizia dall'aspetto sinistro della curvatura maggiore dove l'arteria gastroepiploica sinistra si unisce all'arteria splenica. Usando le forbici per tenotomia di Stevens dritte, scheletrizzare sia l'arteria gastroepiploica sinistra che la vena. Ligate quindi divide entrambi separatamente usando fascette chirurgiche o clip.
- Procedere lungo la maggiore curvatura dello stomaco da sinistra a destra. Legare e dividere i brevi rami vascolari derivanti dall'omento fornendo la maggiore curvatura dello stomaco. Fare attenzione a non ferire il peduncolo gastroepiploico principale dell'omento durante questa fase.
- Continuare la mobilizzazione dell'omento maggiore fino a quando non si incontra la giunzione dei vasi gastroepiploici destro e dell'arteria gastroduodenale. Con clip o cravatte, ligate quindi dividere separatamente l'arteria gastroepiploica destra e le vene per liberare il lembo omentale.
- Una volta liberato, l'omento può essere diviso lungo il centro in due metà, ciascuna delle quali è accompagnata da una rispettiva arteria e vena gastroepiploica. Ciò consente l'approvvigionamento di due lembi liberi da un'operazione animale. Cannulare singolarmente i vasi gastroepiploici con una cannula da 20-22 G quindi fissare con cravatte di seta 3-0.
- Lavare la soluzione salina eparinizzata (15 U.I./ml) nella cannula arteriosa gastroepiploica fino a quando non si osserva un chiaro deflusso venoso.
- Lembo tensoriale della fascia lata
NOTA: Il protocollo si basa su una precedente descrizione del lembo della fascia lata tensoriale suina di Haughey et al.19. La modifica viene effettuata per isolare solo la porzione fasciale del lembo tensoriale della fascia lata.- Posizionare il maiale nella posizione del decubito laterale e radere bilateralmente l'intero arto posteriore superiore. Preparare e coprire utilizzando le solite procedure sterili.
- Segnare il bordo anteriore del lembo con una linea che si estende dalla spina iliaca superiore anteriore (ASIS) verso la rotula laterale. La posizione del peduncolo è di circa 6-8 cm dall'ASIS lungo questa linea.
- Segnare una linea posteriore parallela a circa 8 cm a 10 cm dall'incisione anteriore lungo l'asse del femore per includere la larghezza del lembo. Segna il bordo distale del lembo sulla rotula laterale.
- Inizia la dissezione al margine distale della rotula con una forte incisione della pelle usando un bisturi. Approfondire l'incisione cutanea con cauterizzazione attraverso il tessuto sottocutaneo fino a quando non si incontra la fascia sovrastante il retto femorale.
- Continuare le incisioni cutanee verso l'ASIS lungo i confini anteriori e posteriori marcati sopra descritti. Per isolare il lembo fasciale da solo, rimuovere la componente cutanea sovrastante dallo strato fasciale sottostante. Ligate o cauterizzare eventuali piccoli vasi perforatori sulla pelle.
- Tornare al bordo distale del lembo e incidere la fascia profonda per consentire la mobilizzazione del muscolo vasto laterale sottostante. Mobilitare la fascia verso l'ASIS.
- Durante la mobilizzazione, identificare il peduncolo vascolare che emerge tra i muscoli del vasto laterale e del retto femorale (Figura 2B). Fare attenzione ad evitare una trazione eccessiva per non ferire i vasi peduncolari.
- Sezionare l'aspetto prossimale dall'ASIS proteggendo il peduncolo vascolare. Sezionare fino a quando il lembo è sufficientemente mobilitato attorno al suo peduncolo.
- Traccia il peduncolo verso i vasi femorali profondi. Scheletrizzare sia l'arteria femorale circonflessa laterale che la vena che fornisce il lembo fasciale. Ligate quindi divide entrambi i vasi prossimalmente dove si uniscono ai vasi femorali profondi.
- Cannulare i vasi peduncolari individualmente con angiocateteri da 20 G a 24 G, fissati con fascette di seta 3-0. Lavare la soluzione salina eparinizzata (15 U.I./ml) nella cannula arteriosa del lembo fino a quando non si osserva un chiaro deflusso venoso.
- Lembo radiale dell'avambraccio
NOTA: Il protocollo seguente si basa su una descrizione pubblicata del modello di lembo radiale dell'avambraccio suino di Khachatryan et al.20.- Posizionare il maiale sul tavolo operatorio nella posizione del decubito laterale. Posizionare l'arto anteriore dipendente all'interno del campo operatorio.
- Segnare un lembo di pelle di circa 3 cm x 3 cm quadrato sull'avambraccio radiale. Tracciare una linea tra il punto medio del margine del lembo prossimale e la fossa antecubitale per indicare il decorso approssimativo del peduncolo dell'arteria radiale. Confermare il decorso arterioso con la palpazione.
NOTA: Nel modello suino, i vasi radiali si trovano relativamente più in profondità rispetto agli esseri umani. La loro posizione è tra il flessore carpi radialis e il brachioradialis. - Incidere la pelle usando un bisturi all'aspetto distale con una profondità fino alla fascia antebrachiale. Sezionare smussata con forbici per tenotomia fino a quando non si incontrano l'arteria radiale distale e le sue due vene comitanti. Ligare l'arteria e le vene con legami chirurgici individualmente e dividere.
- Continuare le incisioni cutanee sui margini radiale e ulnare del quadrato cutaneo marcato. Mobilitare il lembo dall'osso radiale sottostante con una lama chirurgica che procede da una direzione radiale a ulnare, sollevando anche il lembo cutaneo prossimalmente verso la fossa antecubitale.
NOTA: Mantenere un piano di dissezione sottofasciale per garantire che il peduncolo dell'arteria radiale rimanga associato allo strato cutaneo sovrastante. - Al margine prossimale, ritrarre lo spazio tra il brachioradiale e il flessore carpi radialis con un divaricatore auto-ritenente per esporre l'arteria radiale prossimale e le sue vene comitantes (Figura 2C).
- Usando le forbici per tenotomia, scheletrizzare l'arteria radiale e le vene comitantes prossimalmente alla fossa antecubitale dove si uniscono rispettivamente all'arteria brachiale e alle vene. Sezionare i vasi dai tessuti fibrograssi circostanti per ottenere una lunghezza peduncolare sufficiente di circa 5-6 cm. Ligare e dividere l'arteria e le vene separatamente per liberare il lembo radiale dell'avambraccio.
- Cannulare i vasi peduncolari con angiocatori da 20 G a 24 G, fissati con cravatte di seta 3-0. Lavare la soluzione salina eparinizzata (15 UI/ml) nella cannula arteriosa del lembo fino a quando non si osserva un chiaro deflusso venoso.
- Dopo l'approvvigionamento del lembo, conservare i lembi in soluzione salina fredda a 4 °C fino al momento della decellularizzazione. In anestesia profonda con isoflurano, eutanasia gli animali con un'iniezione endovenosa di cloruro di potassio (100 mg/kg IV). Conferma la morte per assenza di segni vitali.
Figura 2: Approvvigionamento di tre lembi vascolarizzati suini . (A) Omento. Le arterie gastroepiploiche destra (i) e sinistra (ii) sono incannulate nel lembo omentale (iii). (B) Tensore della fascia lata. Il peduncolo del lembo (iv) è il ramo ascendente dell'arteria circonflessa femorale laterale (v). (C) Lembo radiale dell'avambraccio. L'approvvigionamento del lembo radiale dell'avambraccio (vi) si basa sull'arteria radiale e sulla vena comitantes (vii) come peduncolo vascolare (NOTA: i teli sono stati omessi a scopo dimostrativo). Barre della scala: 3 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Messa a punto del sistema di decellularizzazione
- Assemblare la camera tissutale con lembi in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza a flusso laminare.
- Collegare un rubinetto di arresto a tre vie alle porte di afflusso e deflusso del bioreattore. Collegare un filtro da 0,2 μm alla porta di sfiato dell'aria sul coperchio della camera del tessuto. Innescare il tubo di afflusso con soluzione salina eparinizzata sterile per eliminare le bolle d'aria.
- Posizionare i lembi nella camera. Utilizzando emostatici sterili, collegare i lembi al tubo di afflusso utilizzando il connettore Luer maschio. Avvitare la rispettiva cannula arteriosa di ciascun lembo sul Luer maschio e assicurarsi una tenuta ermetica.
- Lavare la soluzione salina eparinizzata attraverso il rubinetto di arresto per verificare che la connessione Luer sia priva di perdite e che i lembi possano essere perfusi con evidenza di deflusso venoso. Chiudere il coperchio della camera di tessuto.
- Collegare il tubo di afflusso con un tubo giallo della pompa a tre stop al rubinetto di arresto dell'afflusso della camera tissutale. Inoltre, collegare un trasduttore del sensore di pressione in linea al rubinetto di arresto a tre vie di afflusso per consentire il monitoraggio della pressione di perfusione.
- Accendere la pompa peristaltica di afflusso. Nella schermata iniziale, passare alla terza scheda utilizzando il tasto freccia per impostare l'ID del tubo su 1,85 mm. Quindi, passare alla seconda scheda per impostare la velocità di perfusione. Velocità di ingresso come modalità di erogazione e impostata su 2 ml/min. Assicurarsi che la direzione del flusso sia corretta come visualizzata sullo schermo. Caricare il tubo della pompa a tre stop sulla pompa peristaltica con una cassetta compatibile.
- Ripetere la procedura per la pompa peristaltica di deflusso simile a sopra. Impostare l'impostazione della pompa di deflusso su velocità a 4 ml/min. Collegare il tubo di deflusso con un tubo giallo a tre stop della pompa al rubinetto di arresto del deflusso della camera tissutale. Caricare il tubo della pompa a tre stop sulla pompa peristaltica con una cassetta compatibile. Avviare il flusso per entrambe le pompe premendo il pulsante di accensione .
NOTA: La maggiore velocità della pompa di deflusso è una misura di sicurezza cruciale per prevenire il trabocco della camera tissutale, assicurando che il deflusso della camera superi sempre l'afflusso durante il corso della decellularizzazione. L'intera configurazione di decellularizzazione assemblata è illustrata nella Figura 3.
Figura 3: Sistema di decellularizzazione a perfusione assemblato. (A) Schema del sistema di decellularizzazione a perfusione. Il tubo di afflusso trasporta il perfulato dal serbatoio del detergente nella camera del tessuto in modo a passaggio singolo con monitoraggio del sensore di pressione. Il tubo di deflusso rimuove attivamente il perfusato dalla camera del tessuto nel contenitore dei rifiuti. Le frecce nere indicano la direzione del flusso di perfusione. Una pompa peristaltica viene utilizzata con la pompa sinistra per controllare l'afflusso. Il deflusso viene rimosso attivamente utilizzando una seconda pompa peristaltica attraverso i rispettivi tubi. Figura creata con BioRender.com. (B) Fotografia del sistema di decellularizzazione della perfusione montato sul piano di lavoro con la pompa peristaltica di afflusso (i) collegata alle camere tissutali (ii) e quindi la pompa peristaltica di deflusso (iii). La pressione di afflusso del perfusato viene monitorata con un sensore di pressione in linea (iv) prima di entrare nella camera tissutale. Qui, tre lembi sono decellularizzati in parallelo. Sia i serbatoi di detersivo che quelli di scarico sono sotto il piano di lavoro e non fotografati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
5. Decellularizzazione dei lembi suini
- Eseguire tutti i seguenti passaggi per la decellularizzazione della perfusione a temperatura ambiente. Per un riepilogo dei tassi di perfusione e della durata, vedere la tabella 1. Iniziare la perfusione di soluzione salina eparinizzata a 2 ml / min utilizzando una pompa peristaltica e perfondere i lembi con soluzione salina eparinizzata nella camera tissutale per 15 minuti per rimuovere eventuali coaguli di sangue trattenuti.
- Al termine della perfusione salina eparinizzata, aspirare la soluzione salina residua nella camera tissutale. Riempire la camera tissutale con circa 500 ml di soluzione di decellularizzazione SDS per immergere sufficientemente il lembo.
- Trasferire il tubo di afflusso alla soluzione di decellularizzazione SDS e perfondere il tessuto a 2 ml/min. La durata della perfusione varia a seconda del lembo; perfuse SDS per 2 giorni per omento, 3 giorni per fascia tensoriale e 5 giorni per lembo fascio-cutaneo dell'avambraccio radiale.
- Al completamento della decellularizzazione della SDS, aspirare il perfusato SDS esistente contenuto all'interno della camera tissutale. Trasferire il tubo di afflusso in 1x soluzione PBS e perfondere i lembi per 1 giorno a 2 mL/min.
- Rimuovere la soluzione PBS precedente e trasferire il tubo di afflusso nella soluzione di lavoro DNase. Lasciare in infusione per 2 ore a 2 ml/min. Rimuovere la soluzione di DNasi dalla camera tissutale e posizionare il tubo di afflusso in 1x soluzione PBS. Immergere i tessuti con 1x soluzione di PBS nella camera e perfondere 1x soluzione PBS per 1 giorno a 2 ml/min.
- Sterilizzare i lembi con la soluzione PAA/EtOH. Trasferire il tubo di afflusso in PAA/EtOH in soluzione di dH2O e immergere i tessuti nella stessa soluzione. Perfuse PAA/EtOH a 2 mL/min per 3 ore. Una volta completata la sterilizzazione PAA/EtOH, scollegare il tubo dai rubinetti a tre vie.
- Rimuovere i lembi con una tecnica asettica e posizionare gli strumenti sterili in PBS contenente l'1% di antibiotici/antimicotici (A/A). Immergere i lembi con PBS + 1% A/A per 15 minuti in due lavaggi separati per neutralizzare completamente l'acido residuo. Mantenere i lembi in PBS + 1% A/A a 4 °C fino al momento della ricellularizzazione.
- Verificare la sterilità degli scaffold eseguendo una coltura tampone su piastre di agar ed esaminare la crescita microbica. Inoculare le piastre di agar con tamponi prelevati da ciascuna superficie del lembo. Coltivare le piastre di agar a 37 °C per un massimo di 2 settimane. La sterilità è dimostrata dall'assenza di crescita di colonie microbiche.
Tabella 1: Riepilogo dei parametri del protocollo di perfusione-decellularizzazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
6. Valutazione della decellularizzazione
- Utilizzando una biopsia del punch, procurarsi campioni da 3 mm a 10 mm di spessore dai lembi.
- Per l'istologia, fissare le biopsie in cassette istologiche in formalina tamponata normale per 24 ore a temperatura ambiente.
- Lavare le cassette per biopsia in acqua o PBS per 15 minuti, quindi metterle in etanolo al 70% fino al momento della lavorazione dei tessuti. Elaborare le cassette in un processore di tessuti secondo protocolli standard.
- Incorporare le biopsie in paraffina, permettendo alla cera di solidificarsi per 10-15 minuti su una piastra fredda. Sezione blocchi di paraffina su un microtomo a 5 μm di spessore. Colorare i vetrini con ematossilina ed eosina (H&E) secondo protocolli standard. Immagina i vetrini del tessuto con la microscopia ottica.
- Per la quantificazione del contenuto di DNA, ottenere il peso secco delle biopsie tissutali dopo l'essiccazione notturna dei tessuti in un forno a 60 °C. Digerire i campioni in un tampone di estrazione della papaina a 65 °C durante la notte. Centrifugare i campioni digeriti a 10.000 x g e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca. Analizzare il contenuto di DNA con un kit di estrazione del DNA commerciale secondo le istruzioni del produttore.
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Representative Results
Questo protocollo per decellularizzare i lembi suini vascolarizzati si basa sulla perfusione di un detergente a base ionica, SDS, attraverso la vascolarizzazione del lembo in un bioreattore di perfusione personalizzato. Prima della decellularizzazione, tre lembi vascolarizzati in un modello suino sono stati acquistati e incannulati in base ai loro principali vasi di alimentazione. I lembi sono stati immediatamente lavati dopo l'approvvigionamento al fine di mantenere una vascolarizzazione brevettata e perfusibile per consentire una decellularizzazione di successo. Utilizzando contenitori ermetici con coperchio a scatto, è stato progettato un bioreattore personalizzato per consentire la perfusione dei lembi all'interno di un ambiente chiuso. La perfusione dei lembi all'interno del bioreattore è stata ottenuta in modo a passaggio singolo utilizzando due pompe peristaltiche collegate alla camera tissutale. La pressione di perfusione è stata monitorata con un sensore di pressione in linea.
Durante la decellularizzazione, la durata dell'esposizione alla SDS dipendeva dal tipo di tessuto in lavorazione. Con la tecnica di decellularizzazione della perfusione descritta, l'omento, la fascia tensoriale e i lembi radiali dell'avambraccio sono stati decellularizzati con SDS allo 0,05% per 2 giorni, 3 giorni e 5 giorni, rispettivamente. Il successo della sterilizzazione dopo la decellularizzazione è stato dimostrato dall'assenza di crescita di colonie microbiche dopo tamponare i lembi e coltivare i tamponi su piastre di agar per 14 giorni. Le pressioni di perfusione sono state monitorate a una portata di 2 ml/min e variavano tra 20-60 mmHg durante tutte le fasi di decellularizzazione per tutti e tre i lembi. Al termine della decellularizzazione, i lembi sono stati lavati sotto controllo manuale e hanno dimostrato evidenza di deflusso da una cannula venosa lasciata al drenaggio libero (Video supplementare 1, Video supplementare 2, Video supplementare 3).
Un totale di 15 lembi sono stati decellularizzati, con cinque repliche per ciascuno dei tre tipi di tessuto. All'esame, la morfologia grossolana dei tessuti nativi appariva di colore rosa (Figura 4A,E,I), mentre i tessuti decellularizzati erano tipicamente bianchi/opachi nell'aspetto (Figura 4C,G, K). L'esame istologico dei tessuti nativi con H&E mostra la presenza di nuclei blu (Figura 4B,F,J). Nei lembi decellularizzati, la colorazione H&E ha mostrato una perdita di materiale cellulare con l'assenza di colorazione nucleare blu (Figura 4D, H, L), indicando un'impalcatura di tessuto acellulare. Un'ulteriore quantificazione del contenuto di DNA nelle cinque repliche ha mostrato una diminuzione statisticamente significativa del DNA negli scaffold acellulari rispetto ai tessuti nativi mediante un t-test di Student per ciascun lembo (Figura 5). Nell'omento, il DNA è diminuito da 460 ng / mg ± 124 ng / mg tessuto secco nel lembo nativo a 25,8 ng / mg ± 5,90 ng / mg tessuto secco nel lembo decellularizzato (n = 5, p < 0,05). Nella fascia lata tensoriale, il DNA è diminuito da 297 ng / mg ± 68,2 ng / mg a 58,3 ng / mg ± 13,5 ng / mg tra lembi nativi e decellularizzati, rispettivamente (n = 5, p < 0,05). Il lembo radiale dell'avambraccio ha mostrato una diminuzione del DNA da 1180 ng / mg ± 241 ng / mg nel lembo nativo a 162 ng / mg ± 34,9 ng / mg nel lembo decellularizzato (n = 5, p < 0,05).
Figura 4: Decellularizzazione di tre lembi suini. L'esame macroscopico dei lembi (A) nativi dell'omento, della fascia tensoriale (E) e dei lembi radiali dell'avambraccio (I) dimostra l'aspetto rosa dei lembi immediatamente dopo l'approvvigionamento. La colorazione istologica dei tessuti nativi dimostra una chiara colorazione dell'ematossilina dei nuclei cellulari con H & E (B, F, J). Dopo la decellularizzazione, l'omento (C), la fascia latica tensoriale (G) e l'avambraccio radiale (K) appaiono grossolanamente bianchi e opachi. Istologicamente, i tre lembi decellularizzati mostrano un'assenza di colorazione nucleare con H&E (D,H,L). Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Quantificazione del contenuto di DNA negli scaffold acellulari. I valori sono normalizzati a mg di massa secca dell'impalcatura. Campioni di tessuto fresco da tessuti nativi non decellularizzati (n = 5) e tessuti decellularizzati (n = 5) sono stati essiccati e pesati prima della digestione notturna in papaina prima della quantificazione. I test statistici hanno utilizzato i test t di Student con un livello di significatività (**) definito come un valore p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1. Esame a tempo della progressione della perfusione-decellularizzazione dell'omento utilizzando lo 0,05% di sodio dodecilsolfato in 5 giorni mediante esame macroscopico (barre della scala = 3 cm) e istologia H&E (barre della scala = 200 μm). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2. Esame a tempo della progressione della perfusione-decellularizzazione della fascia tensoriale lata utilizzando lo 0,05% di sodio dodecilsolfato in 5 giorni mediante esame grossolano (barre della scala = 3 cm) e istologia H&E (barre della scala = 200 μm). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3. Esame a tempo della progressione della perfusione-decellularizzazione del lembo radiale dell'avambraccio utilizzando lo 0,05% di sodio dodecilsolfato nell'arco di 5 giorni mediante esame grossolano (barre della scala = 3 cm) e istologia H&E (barre della scala = 200 μm). Clicca qui per scaricare questo file.
Video supplementare 1. Perfusione manuale rappresentativa del lembo dell'omento decellularizzato attraverso la cannula arteriosa (rosa) che dimostra il deflusso dalla cannula venosa liberamente drenante (giallo). Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2. Perfusione manuale rappresentativa del lembo decellularizzato della fascia lata tensoriale attraverso la cannula arteriosa (rosa) che mostra il deflusso dalla cannula venosa liberamente drenante (blu). Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 3. Perfusione manuale rappresentativa del lembo radiale dell'avambraccio decellularizzato attraverso la cannula arteriosa (blu) che dimostra il deflusso dalla cannula venosa liberamente drenante (giallo). Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Il protocollo proposto utilizza la perfusione di SDS a bassa concentrazione per decellularizzare una gamma di lembi derivati dal maiale. Con questa procedura, l'omento acellulare, la fascia tensoriale lata e i lembi radiali dell'avambraccio possono essere decellularizzati con successo utilizzando un protocollo che favorisce la SDS a bassa concentrazione. Esperimenti preliminari di ottimizzazione hanno determinato che la SDS a bassa concentrazione (0,05%) tra 2 giorni e 5 giorni è in grado di rimuovere materiale cellulare per l'omento, la fascia tensoriale lata e il lembo radiale dell'avambraccio quando analizzato con tecniche istologiche (Figura supplementare 1, Figura supplementare 2, Figura supplementare 3). Questo metodo offre un approccio diretto che raggiunge la decellularizzazione in un breve lasso di tempo e ad un costo ragionevole. Nella nostra esperienza, la decellularizzazione e la sterilizzazione dei lembi suini richiedono tra 2-5 giorni, con una decellularizzazione di durata maggiore necessaria per i tessuti con maggiore densità (ad esempio, pelle dell'avambraccio a 5 giorni vs. omento a 2 giorni). Inoltre, la bassa concentrazione di SDS utilizzata in questo protocollo è stata selezionata sulla base della logica che una bassa concentrazione di SDS allo 0,05% scende al di sotto della concentrazione micellare critica di SDS (approssimativamente allo 0,2%21) e, quindi, consente al tensioattivo di solubilizzare efficacemente le membrane cellulari lasciando intatti importanti componenti bioattivi della ECM. L'uso di SDS a bassa concentrazione in questo protocollo contrasta con l'uso di concentrazioni relativamente più elevate di SDS (ad esempio, 1%) per la perfusione-decellularizzazione di lembi fascio-cutanei vascolarizzati come riportato dagli autori precedenti13,22. Alte concentrazioni di SDS, sebbene efficaci nella decellularizzazione, hanno il costo di incorrere in effetti dannosi sullo scaffold ECM, come GAG e deplezione del fattore di crescita, nonché la denaturazione di proteine come collagene e vimentina23,24. Infatti, il lavoro futuro nella perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini beneficerà di ulteriori studi di caratterizzazione per esaminare gli effetti dell'agente di decellularizzazione sulla ECM a livello strutturale e molecolare e le loro implicazioni per la ricellularizzazione a valle25,26,27 . I saggi per i componenti della ECM come il collagene, l'elastina o il contenuto di GAG possono essere utilizzati per valutare quantitativamente le modifiche all'ECM dopo la decellularizzazione. Inoltre, il test di resistenza meccanica è una modalità utile per studiare le modifiche alle proprietà biomeccaniche dopo la decellularizzazione. Infine, la valutazione della vascolarizzazione mediante tecniche quali angiografia o microTC aiuterà anche a caratterizzare l'architettura vascolare a livello sistemico come requisito per generare lembi vascolarizzati perfusibili28.
Diverse considerazioni tecniche dovrebbero essere annotate con questo protocollo. In primo luogo, si dovrebbe prestare estrema attenzione durante la manipolazione dei lembi e l'assemblaggio del bioreattore per prevenire la decannulazione accidentale, poiché il reannulamento in un ambiente ex vivo è relativamente più difficile. In secondo luogo, durante l'approvvigionamento del lembo, ottenere un lembo intatto con un peduncolo vascolare perfusibile e intatto è fondamentale per una decellularizzazione di successo. È necessario prestare attenzione durante l'approvvigionamento per garantire che i punti di perdita distali nell'impalcatura siano tagliati o legati a mano. Ciò contribuirà a ridurre le perdite, che possono causare una perfusione incompleta delle soluzioni attraverso la vascolarizzazione del lembo. Un periodo iniziale di perfusione con soluzione salina eparinizzata dopo l'approvvigionamento impedisce la ritenzione di coaguli di sangue e verifica una vascolarizzazione perfusibile come evidenziato dal deflusso venoso del perfuffato. I tessuti decellularizzati possono anche essere nuovamente lavati al completamento della decellularizzazione per verificare eventuali ostruzioni intravascolari (ad esempio, da detriti cellulari / emboli aerei) che possono precludere la perfusibilità del lembo. Nella nostra esperienza, i lembi decellularizzati non hanno mostrato alcuna resistenza intravascolare al lavaggio della siringa seguendo questo protocollo, mentre il deflusso venoso potrebbe essere nuovamente osservato dal lembo decellularizzato dopo il lavaggio (Video supplementare 1, Video supplementare 2, Video supplementare 3). Ciò era indicativo di un'ansa vascolare arteriosa venosa pervietta con capillari di collegamento che possono essere perfusi.
Un'altra considerazione viene fatta per quanto riguarda i parametri di perfusione durante la decellularizzazione. In questo protocollo, è stata selezionata una perfusione a portata costante con una portata target di 2 ml / min, che era all'interno dell'intervallo delle portate operative utilizzate negli studi di decellularizzazione precedentemente pubblicati dei tessuti del lembo suino13,29. Inoltre, il nostro sistema di decellularizzazione incorpora una capacità di monitoraggio della pressione in linea in tempo reale al fine di monitorare potenziali fluttuazioni della resistenza intravascolare nel corso della perfusione; questo metodo può aiutare ad evitare alte pressioni di perfusione derivanti da possibili occlusioni intravascolari che possono danneggiare la ECM microvascolare.
Infine, la sterilizzazione dell'impalcatura risultante è un'altra importante considerazione tecnica. Abbiamo incorporato una fase di sterilizzazione come ultimo passo del protocollo di decellularizzazione per affrontare la contaminazione ambientale accidentale che può verificarsi durante la decellularizzazione. La sterilità dei lembo è particolarmente importante in modo che i lembi possano essere utilizzati in futuro per la ricellularizzazione. La perfusione di 0,1% di acido peracetico/4% di EtOH come sterilizzante è stata precedentemente riportata da gruppi per la sterilizzazione di scaffold acellulari30,31 ed è stata anche trovata efficace con questo protocollo. La sterilità è stata verificata esaminando colture di tamponi di lembo su piastre di agar e notando una crescita assente dopo 14 giorni di incubazione.
Il bioreattore a perfusione personalizzato progettato per gli esperimenti è relativamente economico, semplice e veloce da assemblare. Inoltre, tutti i componenti di questo bioreattore a perfusione sono autoclavabili e adattabili per lavori di ricellularizzazione mantenendo la sterilità dei lembi. Il circuito del bioreattore personalizzato può essere facilmente modificato per consentire la perfusione a circuito aperto che può far circolare terreni di coltura cellulare attraverso un'impalcatura ricellularizzata a seguito di esperimenti di semina cellulare. Tuttavia, vale la pena menzionare alcune limitazioni del sistema del bioreattore. In primo luogo, l'uso di due pompe commerciali, sebbene necessario per prevenire il trabocco involontario del sistema, in particolare quando vengono utilizzati grandi volumi di perfuffato, riduce il costo altrimenti basso della configurazione della perfusione. Inoltre, la bassa produttività dell'attuale sistema di bioreattori a perfusione può presentare sfide logistiche quando è necessario eseguire numerose repliche sperimentali in parallelo; Sistemi di produttività relativamente più elevati sviluppati per la decellularizzazione del rene suino32 potrebbero un giorno essere adattati per la decellularizzazione del lembo suino al fine di alleviare queste sfide logistiche. Infine, mentre il bioreattore sviluppato è semplice da configurare, la supervisione umana e il funzionamento manuale sono ancora necessari regolarmente e frequentemente per garantire che non si verifichino malfunzionamenti del sistema. Le modifiche al bioreattore che incorporano capacità di automazione in grado di monitorare e riadattare le prestazioni del bioreattore con un intervento umano minimo o nullo possono essere perseguite al fine di far progredire la tecnologia del bioreattore di perfusione-decellularizzazione in futuro33,34.
L'applicazione principale dei lembi decellularizzati è quella di permettere la successiva ricellularizzazione di questi scaffold acellulari con popolazioni cellulari in grado di rigenerare la vascolarizzazione. Mentre sono necessarie molte ricerche future per determinare il numero di cellule, le popolazioni, le strategie di semina e le condizioni del bioreattore appropriati per rigenerare il tessuto vascolarizzato funzionale e vitale, questo protocollo rappresenta il lavoro fondamentale iniziale verso questo obiettivo. I futuri metodi di ricellularizzazione aiuteranno a stabilire strategie per progettare lembi dei tessuti molli con una rete vascolare perfusibile intatta e contribuiranno a rigenerare potenzialmente tessuti compositi più complessi, come gli allotrapianti delle estremità e del viso. Questi scaffold possono un giorno aggirare la morbilità e l'immunosoppressione del sito donatore per i pazienti sottoposti a ricostruzione dei tessuti molli su larga scala, migliorando così i loro risultati clinici e la qualità della vita.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
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