Summary
プロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤の灌流による血管化ブタフラップの外科的調達とその後の脱細胞化について説明しています。
Abstract
大量の軟部組織の欠陥は機能障害につながり、患者の生活の質に大きな影響を与える可能性があります。外科的再建は、自家遊離皮弁移植または血管新生複合同種移植(VCA)を用いて行うことができるが、そのような方法には欠点もある。ドナー部位の罹患率や組織の利用可能性などの問題は、自家の自由皮弁移植を制限しますが、免疫抑制はVCAの重要な制限です。脱細胞化/再細胞化法を用いた再建手術における人工組織は、可能な解決策を表しています。脱細胞化組織は、基礎となる細胞外マトリックス(ECM)マイクロアーキテクチャを維持しながら、天然の細胞物質を除去する方法を使用して生成されます。これらの無細胞足場は、その後、レシピエント特異的細胞で再細胞化することができる。
このプロトコルは、ブタモデルで無細胞足場を達成するために使用される調達および脱細胞化方法を詳述している。さらに、灌流バイオリアクターの設計とセットアップの説明も提供します。フラップには、ブタ大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕が含まれます。脱細胞化は、低濃度ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤の ex vivo 灌流とそれに続くDNase酵素処理およびカスタマイズされた灌流バイオリアクターでの過酢酸滅菌によって行われます。
成功した組織脱細胞化は、巨視的にフラップの白色不透明な外観によって特徴付けられる。無細胞フラップは、組織学的染色で核が存在しないこと、およびDNA含有量の有意な減少を示す。このプロトコルは、ECMおよび血管マイクロアーキテクチャが保存された脱細胞化軟部組織足場を生成するために効率的に使用できます。このような足場は、その後の再細胞化研究に使用することができ、再建手術における臨床翻訳の可能性を秘めています。
Introduction
外傷性損傷および腫瘍除去は、大きくて複雑な軟部組織の欠陥を引き起こす可能性があります。これらの欠陥は、患者の生活の質を損ない、機能の喪失を引き起こし、永続的な障害を引き起こす可能性があります。自家組織フラップ移植などの技術が一般的に実施されてきましたが、フラップの利用可能性とドナー部位の罹患率に関する問題は大きな制限です1、2、3。血管化複合同種移植(VCA)は、筋肉、皮膚、血管系などの複合組織を単一のユニットとしてレシピエントに移す有望な代替手段です。しかし、VCAは長期的な免疫抑制を必要とし、それは薬物毒性、日和見感染、および悪性腫瘍につながります4,5,6。
組織工学的無細胞足場は、これらの制限に対する潜在的な解決策です7。非細胞組織足場は、基礎となる細胞外マトリックス(ECM)マイクロアーキテクチャを維持しながら、天然組織から細胞物質を除去する脱細胞化法を使用して得ることができる。組織工学における合成材料の使用とは対照的に、生物学的に誘導された足場の使用は、生体適合性および臨床翻訳の可能性を可能にする生体模倣ECM基質を提供する8。脱細胞化に続いて、レシピエント特異的細胞を用いた足場のその後の再細胞化は、免疫原性がほとんどまたはまったくない機能的な血管新生組織を生成することができる9,10,11。灌流脱細胞化技術を使用して無細胞組織を得るための効果的なプロトコルを開発することにより、幅広い組織タイプを操作できます。次に、この技術に基づいて構築することで、より複雑な組織への適用が可能になります。これまでに、げっ歯類12、ブタ13、ヒトモデル14の全層筋膜皮膚皮弁などの単純な血管新生組織、ならびにブタ腹直筋骨格筋15を用いて、血管化軟組織の灌流脱細胞化が研究されてきた。さらに、複雑な血管新生組織は、ブタおよびヒト耳16、17モデルおよびヒト全面移植モデル18において実証されるように灌流脱細胞化もされている。
ここでは、プロトコルは、生物学的に誘導されたECM足場を用いた血管化遊離フラップの脱細胞化を記載する。臨床的に関連する3つのフラップの脱細胞化を提示します:1)大網、2)テンソル筋膜ラタ、および3)橈骨前腕、これらはすべて再建手術で日常的に使用される主力フラップの代表であり、組織脱細胞化の文脈の中で動物実験で以前に調べられていませんでした。これらのバイオエンジニアリングフラップは、汎用性が高く、すぐに利用できるプラットフォームを提供し、大きな軟部組織の欠陥の修復と再建の分野で使用するための臨床応用の可能性を秘めています。
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Protocol
動物被験者が関与するすべての手順は、大学保健ネットワーク施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、大学保健ネットワーク動物資源センターのプロトコルと手順、およびカナダ動物管理ガイドライン評議会に従って実施されています。5頭のヨークシャーブタ(35〜50kg、生後約12週齢)をすべての実験に使用した。
1. 灌流バイオリアクターの作製
- 灌流バイオリアクターで使用されるすべてのコンポーネントについては 、図1 を参照してください。ティッシュチャンバーの製造には、シリコーンシールライニングを含む水密および気密蓋を備えた市販のポリプロピレンスナップロック容器を使用してください。容器がオートクレーブと互換性があることを確認してください。
- 容器の側面に沿って2つの1/4穴を開け、L / S-16プラチナコーティングされたシリコンチューブの短いセグメントに通します。1つのチューブは流入灌流液を運び、もう1つのチューブは流出用です。
- 流入チューブの場合は、組織カニューレへの接続に使用される内部部分にオスのルアーコネクタを取り付けます。流入チューブの外部端にメスのルアーコネクタを取り付け、3方向活栓に接続します。
- チャンバーの蓋に1/4インチの穴を1つ開け、L / S-16プラチナコーティングされたシリコンチューブの別の短いセグメントに糸を通します。このチューブは通気孔として機能します。
- 約50cmのL / S-16プラチナコーティングされたシリコンチューブを測定して、流入チューブと流出チューブを作成します。一方の端を黄色の3ストップポンプチューブに接続し、もう一方の端を滅菌2 mL血清学的ピペットに接続して、灌流液を界面活性剤リザーバーからバイオリアクターチャンバーに運びます。
- すべてのコンポーネント(チャンバーとチューブ)を、個別に包装された滅菌包装でオートクレーブします。
図1:灌流バイオリアクターの作製。 灌流バイオリアクターは、(A)プラスチックポリプロピレン組織チャンバー(B)で構成され、気密および水密蓋を備えた灌流チューブを収容するために開けられた側面穴があります。(C)活栓はチューブに取り付けられており、洗剤リザーバーから廃棄物に脱細胞化剤をシングルパス方式で運ぶ灌流チューブを取り付けることができます。(D)互換性のあるポンプカセットを使用して、3ストップチューブを蠕動ポンプに接続します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.脱細胞化溶液の調製
- 100 mLの生理食塩水で1.5 mLの1000 IU / mLヘパリンストック溶液を希釈することにより、ヘパリン化生理食塩水(15 IU / mL)を調製します。
- 9 gのSDS粉末を18 Lのオートクレーブ蒸留脱イオン水にゆっくりと加えて、0.05%w/vドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液を調製します。大容量のポリプロピレン(PP)カーボイを使用して、SDSソリューションに対応します。溶液は完全に溶解するとすぐに使用できます。室温で保管してください。
- DNase I作業溶液を調製します。まず、凍結乾燥したDNase Iを滅菌dH 2 O中の5 mM CaCl2で10 mg/mLのストック濃度に再構成し、再構成したストックDNase I溶液をアリコートとして-20°Cの冷凍庫に保存します。使用当日、DNase Iストックを滅菌dH 2O中のMg++(1.29 mM)およびCa++(1.98 mM)で1:100に希釈し、最終濃度0.1 mg/mLにします。
注:DNase活性は、凍結保存しない限り低下します。室温でのDNAの酵素消化には、新たに機能するDNase溶液のみを使用する必要があります。 - 10x PBSストックを滅菌オートクレーブ処理水で1:10に希釈し、PPカーボイで最終容量5 Lで調製します。室温で保管してください。
- PBSで1%抗生物質/抗真菌薬(A / A)を準備します。100x抗生物質/抗真菌薬を滅菌1x PBS溶液で1:100に希釈して最終容量1 Lにします。
- 3.13 mLのPAA + 40 mLの100%エタノール+ 956 mLの滅菌dH2Oを加えて、0.1%(v/v)過酢酸(PAA)/4%(v/v)エタノール(EtOH)を調製し、最終容量を1,000 mLにし、室温で保存します。
3. ブタフラップの調達
注: これはターミナルプロシージャです。1頭の豚を使用して3つのフラップすべてを調達しました。すべてのフラップを調達した後、動物を人道的に安楽死させます。
- 術前ケア
- 手術の少なくとも12時間前に速い豚。ケタミン(20 mg / kg筋肉内、IM)、アトロピン(0.04 mg / kg IM)、およびミダゾラム(0.3 mg / kg IM)で動物を鎮静させます。.
- 末梢ラインの挿入と挿管のために、22-44 mL / kg / minの流速でマスクを通して5%イソフルランを吸入することにより麻酔を誘発します。0.5%〜2%イソフルランで22〜44 mL / kg /分で麻酔を維持します。.血行力学的安定性をチェックし、眼瞼/ペダル離脱反射または顎の筋緊張がないことに注意して、投与された麻酔薬の適切なレベルを示すことにより、適切な麻酔深度を確保します。.鎮痛手術中にレミフェンタニル(10-20μg / kg / h)の連続注入を静脈内投与します。.
- 適切な気管内チューブ(7〜8 mm)でブタに挿管し、チューブを8 mL / kg、PEEPが5 cm H 2 0、FiO2が0.5、呼吸数が14に設定された人工呼吸器に接続します。
- 22 Gの血管カテーテルを耳静脈に挿入します。静脈内(IV)アクセスが得られたら、手順全体を通して5-10 mL / kg / hで温かい0.9%生理食塩水を注入し、平均動脈圧を60 mmHg〜90 mmHgに維持します。.
- 心拍数、パルスオキシメトリ、潮汐終末CO2を継続的に監視します。5分ごとに血圧と体温を評価します。
- 麻酔下での眼の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗ります。ポビドンヨードで手術野全体を準備します。滅菌タオルで手術野を覆います。
- オメンタルフラップ
- ブタを仰臥位に置き、剣状臍帯開腹術を行います。
- 腹部に入ったら、胃頭筋を動員して大網を視覚化します。大網を術野に注意深く配置し、胃のより大きな湾曲に沿って走る胃上皮血管を特定します(図2A)。
- 左胃上皮動脈が脾動脈に加わる大湾曲の左側から始めます。まっすぐなスティーブンス腱切開はさみを使用して、左胃上過球動脈と静脈の両方を骨格化します。次に、結紮糸は外科用タイまたはクリップを使用して両方を別々に分割します。
- 左から右に胃のより大きな湾曲に沿って進みます。大網から生じる短い血管枝を結睭化して分割し、胃のより大きな湾曲を供給する。このステップの間に大網の主な胃大網茎を傷つけないように注意してください。
- 右胃 - 上陰血管と胃十二指腸動脈の接合部が遭遇するまで、大網の動員を続ける。クリップまたはネクタイを使用して、結紮してから右胃大網動脈と静脈を別々に分割して、大網フラップを解放します。
- 解放されると、大網は中央に沿って2つの半分に分けることができ、各半分にはそれぞれの胃上過球動脈と静脈が伴います。これにより、1回の動物操作から2つの大網フリーフラップを調達することができます。胃エピプロイック血管を20〜22 Gのカニューレで個別にカニューレし、3〜0個のシルクタイで固定します。
- 明確な静脈流出が観察されるまで、ヘパリン化生理食塩水(15 IU / mL)を胃上包動脈カニューレに洗い流します。.
- テンソル筋膜ラタフラップ
注:このプロトコルは、Haugheyらによるブタテンソル筋膜ラタフラップの以前の説明に基づいています19。テンソル筋膜ラタフラップの筋膜部分のみを分離するように変更が行われます。- 豚を外側褥瘡位置に置き、上肢全体を両側に剃ります。通常の滅菌手順を使用して準備し、ドレープします。
- フラップの前縁を、上腸骨前棘(ASIS)から外側膝蓋骨に向かって伸びる線でマークします。茎の位置は、この線に沿ってASISから約6〜8 cmです。
- 大腿骨の軸に沿って前切開から約8cmから10cmの平行な後線をマークして、フラップの幅を含めます。外側膝蓋骨のフラップの遠位端をマークします。
- 膝蓋骨の遠位縁で、メスを使用して皮膚を鋭く切開して解剖を開始します。大腿直筋を覆う筋膜に遭遇するまで、皮下組織を通して焼灼で皮膚切開を深めます。
- 上記のマークされた前後の境界に沿ってASISに向かって皮膚切開を続けます。筋膜フラップのみを分離するには、下にある筋膜層から上にある皮膚成分を取り除きます。小さな穿孔器の血管を皮膚に結灘または焼灼します。
- フラップの遠位境界に戻り、深部筋膜を切開して、下にある外側広筋の動員を可能にします。筋膜をASISに向かって動員します。
- 動員中に、外側広筋と大腿直筋の間から出てくる血管茎を特定します(図2B)。椎弓根血管を傷つけないように、過度の牽引を避けるように注意してください。
- 血管茎を保護しながら、ASISから近位側を解剖します。フラップがその茎の周りに十分に動員されるまで解剖します。
- 椎弓根を大腿骨深部血管に向かってたどります。外側回旋大腿動脈と筋膜フラップを供給する静脈の両方を骨格化します。次に、Ligateは両方の血管を近位に分割し、そこで大腿骨深部血管に結合します。
- 椎弓根血管を20G〜24Gの血管カテーテルで個別にカニュレ挿入し、3-0の絹のネクタイで固定します。ヘパリン化生理食塩水(15 IU / mL)を、明確な静脈流出が観察されるまでフラップ動脈カニューレに流します。.
- 放射状前腕フラップ
注:以下のプロトコルは、Khachatryanらによるブタ放射状前腕フラップモデルの公開された説明に基づいています20。- 豚を外側褥瘡位置の手術台に置きます。従属前肢を術野内に配置します。
- 橈骨前腕に約3 cm x 3 cmのスキンフラップの正方形をマークします。近位フラップマージンの中点と肘前窩の間に線を引き、橈骨動脈茎のおおよその経過を示します。触診で動脈の経過を確認します。
注:ブタモデルでは、放射状の血管は人間よりも比較的深い位置にあります。それらの位置は、屈筋手根橈骨と腕橈骨の間です。 - 前腕筋膜までの深さで遠位側でメスを使用して皮膚を切開します。遠位橈骨動脈とその2つの大静脈コミタントに遭遇するまで、腱切開ハサミで鈍く解剖します。動脈と静脈を外科的結びつきで個別に結束し、分割します。
- マークされた皮膚の正方形の橈骨および尺骨縁の皮膚切開を続けます。橈骨から尺骨方向に進行する手術刃で下にある橈骨からフラップを動員し、同時に皮膚フラップを肘前窩に向かって近位に持ち上げます。
注:橈骨動脈茎が上にある皮膚層に関連付けられたままであることを確認するために、筋膜下解離面を維持します。 - 近位縁で、腕橈骨と橈骨屈筋の間のスペースを自己保持リトラクターで引っ込めて、近位橈骨動脈とその大静脈コミタントを露出させます(図2C)。
- 腱切開ハサミを使用して、橈骨動脈と大静脈を肘前窩で近位に骨格化し、それぞれ上腕動脈と静脈に結合します。周囲の線維脂肪組織から血管を解剖して、約5〜6cmの十分な茎長を達成する。動脈と大静脈を別々に結睭化して分割し、橈骨前腕フラップを解放します。
- 3-0の絹のネクタイで固定された20Gから24Gの血管カテーテルで椎弓根血管をカニューレします。明確な静脈流出が観察されるまで、ヘパリン化生理食塩水(15 IU / mL)をフラップ動脈カニューレに洗い流します。.
- フラップの調達後、脱細胞化の準備ができるまでフラップを4°Cの冷生理食塩水に保ちます。深いイソフルラン麻酔下で、塩化カリウム(100 mg / kg IV)の静脈内注射で動物を安楽死させます。.バイタルサインがないことで死亡を確認します。
図2:3つのブタ血管化フラップの調達 。 (A)大網。右(i)および左(ii)の胃上過球動脈は、大網皮弁(iii)でカニューレ挿入されている。(B)テンソル筋膜ラタ。フラップの茎(iv)は、外側大腿回旋動脈(v)の上行枝です。(C)橈骨前腕フラップ。橈骨前腕フラップ(vi)の調達は、橈骨動脈と大静脈コミタント(vii)を血管茎として基づいています(注:ドレープはデモンストレーションの目的で省略されました)。スケールバー:3 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. 脱細胞化システムのセットアップ
- 層流バイオセーフティキャビネット内で無菌条件下でフラップ付きの組織チャンバーを組み立てます。
- バイオリアクターの流入ポートと流出ポートの両方に三方活栓を取り付けます。ティッシュチャンバー蓋のエアベントポートに0.2μmフィルターを取り付けます。気泡を除去するために、滅菌ヘパリン処理生理食塩水で流入チューブをプライミングします。
- フラップをチャンバーに配置します。滅菌止血剤を使用して、オスのルアーコネクタを使用してフラップを流入チューブに接続します。各フラップのそれぞれの動脈カニューレをオスのルアーにねじ込み、しっかりと密閉します。
- ヘパリン処理生理食塩水を活栓を通して洗い流して、ルアー接続に漏れがないこと、およびフラップに静脈流出の証拠を灌流できることを確認します。ティッシュチャンバーの蓋を閉じます。
- 黄色の3ストップポンプチューブを備えた流入チューブをティッシュチャンバーの流入活栓に接続します。また、インライン圧力センサートランスデューサを流入三方活栓に取り付けて、灌流圧力の監視を可能にします。
- 流入蠕動ポンプをオンにします。初期画面で、矢印キーを使用して3番目のタブに進み、チューブIDを1.85 mmに設定します。次に、2番目のタブに進み、灌流率を設定します。送達モードとして入力レートを使用し、2 mL/分に設定します。画面に表示されている流れの方向が正しいことを確認します。互換性のあるカセットを使用して、3ストップポンプチューブを蠕動ポンプにロードします。
- 上記と同様の流出蠕動ポンプの手順を繰り返します。流出ポンプの設定を4mL / minの速度に設定します。黄色の3ストップポンプチューブを備えた流出チューブをティッシュチャンバーの流出活栓に接続します。互換性のあるカセットを使用して、3ストップポンプチューブを蠕動ポンプにロードします。 電源 ボタンを押して、両方のポンプのフローを開始します。
注:流出ポンプのより高い速度は、ティッシュチャンバーのオーバーフローを防ぐための重要な安全対策であり、チャンバーの流出が脱細胞化の過程で常に流入を超えることを保証します。組み立てられた脱細胞化セットアップ全体を 図3に示します。
図3:組み立てられた灌流脱細胞化システム 。 (a)灌流脱細胞化システムの概略図。流入チューブは、圧力センサーの監視により、洗剤リザーバーからティッシュチャンバーに灌流液をシングルパス方式で運びます。流出チューブは、組織チャンバーから廃棄物容器に灌流液を積極的に除去します。黒い矢印は灌流の方向を示します。蠕動ポンプは、流入を制御するために左側のポンプで使用されます。流出は、それぞれのチューブを通る第2の蠕動ポンプを使用して積極的に除去される。BioRender.com で作成された図。(B)流入蠕動ポンプ(i)を組織室(ii)に接続し、次に流出蠕動ポンプ(iii)を接続してベンチトップに組み立てた灌流脱細胞化システムの写真。流入灌流液圧力は、組織チャンバーに入る前にインライン圧力センサー(iv)で監視されます。ここでは、3つのフラップが並行して脱細胞化されています。洗剤と廃棄物の貯留層はどちらもベンチトップの下にあり、写真には写っていません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5.ブタフラップの脱細胞化
- 室温での灌流脱細胞化のために以下のすべてのステップを実行します。灌流率と期間の概要については、 表1を参照してください。蠕動ポンプを使用して2 mL /分でヘパリン化生理食塩水の灌流を開始し、組織チャンバー内でヘパリン化生理食塩水でフラップを15分間灌流して、残っている血栓を取り除きます。
- ヘパリン化生理食塩水灌流が完了したら、組織室内に残留生理食塩水を吸引する。組織チャンバーに約500 mLのSDS脱細胞化溶液を満たし、フラップを十分に沈めます。
- 流入チューブをSDS脱細胞化溶液に移し、2 mL/分で組織を灌流します。灌流の持続時間はフラップによって異なります。SDSを大網に2日間、テンソル筋膜で3日間、橈骨前腕筋膜皮膚フラップに5日間灌流します。
- SDS脱細胞化が完了したら、組織チャンバー内に含まれる既存のSDS灌流液を吸引します。流入チューブを1x PBS溶液に移し、フラップを2 mL/minで1日間灌流します。
- 以前のPBS溶液を取り外し、流入チューブをDNase作業溶液に移します。2 mL /分で2時間灌流します。DNase溶液をティッシュチャンバーから取り出し、流入チューブを1x PBS溶液に入れます。組織をチャンバー内の1x PBS溶液に浸し、1x PBS溶液を2 mL / minで1日間灌流します。
- フラップをPAA/EtOH溶液で滅菌します。流入チューブをdH2O溶液中のPAA / EtOHに移し、組織を同じ溶液に沈めます。PAA / EtOHを2 mL /分で3時間灌流します。PAA / EtOH滅菌が完了したら、チューブを三方活栓から外します。
- 無菌技術を使用してフラップを取り外し、滅菌器具を1%抗生物質/抗真菌剤(A / A)を含むPBSに入れます。フラップをPBS + 1%A / Aで15分間2回の別々の洗浄に浸し、残留酸を完全に中和します。フラップをPBS + 1% A/Aで4°Cに保ち、再セル化の準備が整うまで保持します。
- 寒天プレート上で綿棒培養を行うことで足場の無菌性を確認し、微生物の増殖を調べます。寒天プレートに各フラップ表面から採取した綿棒を接種します。寒天プレートを37°Cで最大2週間培養します。不妊性は、微生物コロニーの増殖がないことによって実証される。
表1:灌流-脱細胞化プロトコルパラメータの要約。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
6. 脱細胞化の評価
- パンチ生検を使用して、フラップから厚さ3mmから10mmのサンプルを調達します。
- 組織学の場合、組織学的カセットの生検を通常の緩衝ホルマリンで室温で24時間固定します。
- 生検カセットを水またはPBSで15分間洗浄し、組織処理の準備ができるまで70%エタノールに入れます。ティッシュプロセッサー内のカセットを標準プロトコルに従って処理します。
- 生検をパラフィンに埋め込み、ワックスをコールドプレート上で10〜15分間固化させます。パラフィンブロックをミクロトーム上で5 μmの厚さに切断します。標準プロトコルに従って、スライドをヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色します。光学顕微鏡でスライドした組織を画像化します。
- DNA含量の定量のために、60°Cのオーブン中で一晩組織を乾燥させた後の組織生検の乾燥重量を求める。 サンプルをパパイン抽出バッファーで65°Cで一晩消化します。消化したサンプルを10,000 x g で遠心分離し、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。製造元の指示に従って、市販のDNA抽出キットを使用してDNA含有量をアッセイします。
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Representative Results
血管化されたブタフラップを脱細胞化するためのこのプロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したイオンベースの洗剤SDSの灌流に依存しています。脱細胞化に先立ち,ブタ模型の3つの血管化フラップを調達し,主供給容器に従ってカニューレ挿入した。フラップは、特許、灌流可能な血管系を維持するために、調達後すぐにフラッシュされ、脱細胞化が成功しました。気密スナップ蓋容器を使用して、カスタマイズされたバイオリアクターは、密閉された環境内でフラップ灌流を可能にするように設計されました。バイオリアクター内のフラップの灌流は、組織チャンバーに接続された2つの蠕動ポンプを使用してシングルパス方式で達成されました。灌流圧力はインライン圧力センサーで監視した。
脱細胞化中、SDS曝露の持続時間は、処理される組織の種類に依存していた。記載された灌流脱細胞化技術を用いて、大網、テンソル筋膜、および橈骨前腕フラップを、それぞれ0.05%SDSで2日間、3日間、および5日間脱細胞化した。脱細胞化後の滅菌の成功は、フラップを拭き取り、寒天プレート上で綿棒を14日間培養した後、微生物コロニーの増殖がないことによって実証されました。灌流圧力は2 mL / minの流速で監視され、3つのフラップすべての脱細胞化のすべての段階で20〜60 mmHgの範囲でした。脱細胞化の終了時に、フラップは手動制御下でフラッシュされ、自由排液に残された静脈カニューレからの流出の証拠を示しました(補足ビデオ1、補足ビデオ2、補足ビデオ3)。
合計15個のフラップが脱細胞化され、3つの組織タイプのそれぞれについて5回の反復が行われた。調べると、天然組織の肉眼的形態はピンク色に見えましたが(図4A、E、I)、脱細胞化組織は特徴的に白/不透明の外観でした(図4C、G、K)。H&Eによる天然組織の組織学的検査は、青い核の存在を示しています(図4B、F、J)。脱細胞化フラップでは、H&E染色は青色核染色の不在下で細胞物質の喪失を示し(図4D、H、L)、無細胞組織の足場を示した。5回の反復におけるDNA含有量の追加定量は、各フラップに対するスチューデントのt検定によって、天然組織と比較して無細胞足場のDNAの統計的に有意な減少を示しました(図5)。大網では、DNAは天然皮弁の460 ng / mgから124 ng / mgの乾燥組織±、脱細胞化皮弁の25.8 ng / mg±5.90 ng / mgの乾燥組織に減少しました(n = 5、p < 0.05)。テンソル筋膜ラタでは、天然フラップと脱細胞化フラップの間でDNAがそれぞれ297 ng / mgから68.2 ng / mg±58.3 ng / mg±13.5 ng / mgに減少しました(n = 5、p < 0.05)。橈骨前腕フラップは、天然フラップの1180 ng / mgから241 ng / mg±脱細胞化フラップの162 ng / mg±34.9 ng / mgへのDNA減少を示しました(n = 5、p < 0.05)。
図4:3つのブタフラップの脱細胞化。 (A)在来大網、(E)テンソル筋膜ラタ、および(I)橈骨前腕フラップの肉眼検査は、調達直後のフラップのピンク色の外観を示しています。天然組織の組織学的染色は、H&E(B、F、J)による細胞核の明確なヘマトキシリン染色を示しています。脱細胞化後、(C)大網、(G)テンソル筋膜、および(K)橈骨前腕はひどく白く不透明に見えます。組織学的には、3つの脱細胞化フラップはH&E(D、H、L)による核染色の欠如を示しています。スケールバー:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:無細胞足場におけるDNA含量の定量。 値は、乾燥足場質量のmgに正規化されます。天然の非脱細胞化組織(n = 5)および脱細胞化組織(n = 5)からの新鮮な組織サンプルを乾燥させ、定量化する前にパパインで一晩消化する前に重量を測定しました。統計的検定では、p値<0.05として定義された有意水準(**)を持つスチューデントのt検定を使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1. 0.05%ドデシル硫酸ナトリウムを用いた大網の灌流・脱細胞化の進行を肉眼検査(スケールバー=3cm)およびH&E組織像(スケールバー=200μm)による5日間にわたる経時的検討。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2. 0.05%ドデシル硫酸ナトリウムを用いたテンソル筋膜ラタの灌流・脱細胞化の進行を肉眼検査(スケールバー=3cm)およびH&E組織像(スケールバー=200μm)により5日間にわたって経時的に検討した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3. 0.05%ドデシル硫酸ナトリウムを用いた橈骨前腕フラップの灌流・脱細胞化の進行を肉眼検査(スケールバー=3cm)およびH&E組織像(スケールバー=200μm)による5日間経時的検討。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ 1. 動脈カニューレ を介した 脱細胞化大網フラップの代表的な手動灌流(ピンク)は、自由に排出される静脈カニューレ(黄色)からの流出を示しています。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画 2.動脈カニューレ(ピンク)を介した脱細胞化テンソル筋膜ラタフラップの代表的な手動灌流は、自由に排出される静脈カニューレ ( 青)からの流出を示しています。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画 3.動脈カニューレ を介した 脱細胞化橈骨前腕フラップの代表的な手動灌流(青)は、自由に排出される静脈カニューレ(黄色)からの流出を示す。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提案されたプロトコルは、低濃度SDSの灌流を使用して、ブタ由来のフラップの範囲を脱細胞化します。この手順により、低濃度SDSを支持するプロトコルを使用して、無細胞大網、テンソル筋膜ラタ、および橈骨前腕フラップを正常に脱細胞化できます。予備的な最適化実験により、2日から5日の間の低濃度(0.05%)のSDSは、組織学的手法で分析した場合、大網、大動脈筋膜、および橈骨前腕皮弁の細胞物質を除去できることがわかりました(補足図1、補足図2、補足図3)。この方法は、短期間でリーズナブルなコストで脱細胞化を達成する簡単なアプローチを提供します。私たちの経験では、ブタフラップの脱細胞化と滅菌には2〜5日かかり、密度の高い組織(例:.、5日の前腕皮膚対2日の大網)には、より長い期間の脱細胞化が必要です。さらに、このプロトコルで使用される低濃度のSDSは、0.05%の低濃度のSDSがSDSの臨界ミセル濃度(約0.2%21)を下回り、したがって界面活性剤が重要な生理活性ECM成分をそのまま残しながら細胞膜を効果的に可溶化できるという理論的根拠に基づいて選択されました。このプロトコルにおける低濃度SDSの使用は、以前の著者によって報告された血管化筋膜皮膚フラップの灌流-脱細胞化のための比較的高濃度のSDS(例えば、1%)の使用とは対照的である13,22。高濃度のSDSは、脱細胞化に効果的ですが、GAGや成長因子の枯渇、コラーゲンやビメンチンなどのタンパク質の変性など、ECM足場に有害な影響を与えるという犠牲を払っています23,24。実際、ブタ血管化フラップの灌流-脱細胞化における将来の研究は、構造レベルおよび分子レベルでのECMに対する脱細胞化剤の効果と、下流の再細胞化への影響を調べるための追加の特性評価研究から恩恵を受けるでしょう25,26,27.コラーゲン、エラスチン、GAG含有量などのECM成分のアッセイを使用して、脱細胞化後のECMの変化を定量的に評価できます。さらに、機械的強度試験は、脱細胞化後の生体力学的特性の変化を研究するための有用なモダリティです。最後に、血管造影またはマイクロCTスキャンなどの技術を用いた血管性の評価は、灌流性血管化フラップを生成するための必要条件として全身レベルで血管構造を特徴付けるのにも役立ちます28。
このプロトコルでは、いくつかの技術的な考慮事項に注意する必要があります。第一に、 ex vivo 設定でのリカニュレーションは比較的困難であるため、フラップの取り扱いおよびバイオリアクターの組み立て中に、偶発的なデカニュレーションを防ぐために細心の注意を払う必要があります。第二に、フラップの調達中に、灌流可能で無傷の血管茎を有する無傷のフラップを得ることは、脱細胞化を成功させるために重要である。調達中は、足場の遠位リークポイントがクリップされているか、手で結ばれていることを確認するように注意する必要があります。これは、フラップ血管系を通る溶液の不完全な灌流を引き起こす可能性がある漏れを減らすのに役立ちます。調達後のヘパリン化生理食塩水による最初の灌流期間は、血栓の保持を防ぎ、静脈灌流液の流出によって証明されるように灌流可能な血管系を検証します。脱細胞化組織は、脱細胞化の完了時に再度フラッシュして、フラップ灌流性を妨げる可能性のある潜在的な血管内閉塞(細胞破片/空気塞栓など)をチェックすることもできます。.私たちの経験では、脱細胞化フラップは、このプロトコルに従って注射器のフラッシングに対して血管内抵抗を示さなかったが、フラッシング後に脱細胞化フラップから静脈流出が再び観察された(補足ビデオ1、補足ビデオ2、補足ビデオ3)。これは、灌流可能な接続毛細血管を有する特許動脈から静脈への血管ループを示していた。
脱細胞化中の灌流パラメータに関して別の考慮がなされる。このプロトコルでは、ブタ皮弁組織の以前に発表された脱細胞化研究で使用された操作流量の範囲内であった2mL / minの目標流量で一定流量灌流が選択されました13,29。さらに、当社の脱細胞化システムには、灌流の過程で血管内抵抗の潜在的な変動を監視するために、リアルタイムのインライン圧力モニタリング機能が組み込まれています。この方法は、微小血管ECMを損傷する可能性のある血管内閉塞から生じる高い灌流圧力を回避するのに役立ちます。
最後に、結果として生じる足場の滅菌は、別の重要な技術的考慮事項です。脱細胞化プロトコルの最終ステップとして滅菌段階を組み込んで、脱細胞化中に発生する可能性のある偶発的な環境汚染に対処しました。フラップの無菌性は、フラップを将来再細胞化に使用できるようにするために特に重要です。滅菌剤としての0.1%過酢酸/ 4%EtOHの灌流は、無細胞足場を滅菌するためのグループによって以前に報告されており30,31、このプロトコルでも有効であることがわかっています。不妊性は、寒天プレート上のフラップスワブ培養を調べ、14日間のインキュベーション後に成長がないことを指摘することによって検証されました。
実験用に設計されたカスタマイズされた灌流バイオリアクターは、比較的費用対効果が高く、簡単かつ迅速に組み立てることができます。さらに、この灌流バイオリアクターのすべてのコンポーネントはオートクレーブ可能で、フラップの無菌性を維持しながら再細胞化作業に適応できます。カスタマイズされたバイオリアクター回路は、細胞播種実験後に再細胞化された足場を通して細胞培養培地を循環させることができる開回路灌流を可能にするように簡単に変更することができます。それにもかかわらず、バイオリアクターシステムのいくつかの制限は言及する価値があります。第一に、2つの市販ポンプの使用は、特に大量の灌流液が使用される場合、システムの不注意なオーバーフローを防ぐために必要であるが、灌流セットアップのそうでなければ低コストを損なう。さらに、現在の灌流バイオリアクターシステムのスループットが低いため、多数の実験反復を並行して実行する必要がある場合に、ロジスティック上の課題が生じる可能性があります。ブタの腎臓脱細胞化のために開発された比較的高いスループットシステム32は、これらのロジスティック上の課題を軽減するために、いつの日かブタの皮弁脱細胞化に適応するかもしれません。最後に、開発されたバイオリアクターはセットアップが簡単ですが、システムの誤動作が発生しないように、人間の監視と手動操作が定期的かつ頻繁に必要です。将来の灌流-脱細胞化バイオリアクター技術を進歩させるために、最小限のまたはまったく人間の介入なしにバイオリアクターの性能を監視および再調整できる自動化機能を組み込んだバイオリアクターへの変更を追求することができます33,34。
脱細胞化フラップの主な用途は、血管系を再生することができる細胞集団を有するこれらの無細胞足場のその後の再細胞化を可能にすることである。機能的で生存可能な血管新生組織を再生するための適切な細胞数、集団、播種戦略、およびバイオリアクター条件を決定するには、多くの将来の研究が必要ですが、このプロトコルは、この目標に向けた最初の基礎作業を表しています。将来の再細胞化の方法は、無傷の灌流可能な血管ネットワークを備えた軟部組織フラップを設計するための戦略を確立するのに役立ち、四肢や顔面同種移植片などのより複雑な複合組織の再生に貢献する可能性があります。これらの足場は、大規模な軟部組織再建を受けている患者のドナー部位の罹患率と免疫抑制をいつの日か回避し、それによって臨床転帰と生活の質を改善することができます。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
何一つ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
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