Summary
Wir beschreiben die Operationstechnik und den Dezellularisierungsprozess für zusammengesetzte Rattenhinterbeine. Die Dezellularisierung erfolgt unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat mit niedriger Konzentration durch ein Ex-vivo-Maschinenperfusionssystem.
Abstract
Patienten mit schweren traumatischen Verletzungen und Gewebeverlust benötigen eine komplexe chirurgische Rekonstruktion. Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist ein sich entwickelnder rekonstruktiver Weg zum Transfer mehrerer Gewebe als zusammengesetzte Untereinheit. Trotz der vielversprechenden Natur von VCA sind die langfristigen immunsuppressiven Anforderungen aufgrund des erhöhten Risikos von Malignomen, Endorgantoxizität und opportunistischen Infektionen eine signifikante Einschränkung. Das Tissue Engineering von azellulären Kompositgerüsten ist eine mögliche Alternative zur Verringerung des Bedarfs an Immunsuppression. Hierin wird die Beschaffung eines Rattenhinterbeins und dessen anschließende Dezellularisierung unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) beschrieben. Die vorgestellte Beschaffungsstrategie basiert auf der Arteria femoralis. Ein maschinelles perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde konstruiert und zur ex vivo Dezellularisierung der Hinterbeine eingesetzt. Eine erfolgreiche Perfusionsdezellularisierung wurde durchgeführt, was zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen der Hinterbeine führte. Ein intaktes, perfusierbares, vaskuläres Netzwerk in der gesamten Hinterbeine wurde beobachtet. Histologische Analysen zeigten die Entfernung von Kerninhalten und die Erhaltung der Gewebearchitektur über alle Gewebekompartimente hinweg.
Introduction
VCA ist eine neue Option für Patienten, die eine komplexe chirurgische Rekonstruktion benötigen. Traumatische Verletzungen oder Tumorresektionen führen zu einem volumetrischen Gewebeverlust, der schwer zu rekonstruieren ist. VCA bietet die Transplantation mehrerer Gewebe wie Haut, Knochen, Muskeln, Nerven und Gefäße als zusammengesetztes Transplantat von einem Spender an einen Empfängeran 1. Trotz seiner vielversprechenden Natur ist VCA aufgrund langfristiger immunsuppressiver Therapien begrenzt. Der lebenslange Gebrauch solcher Medikamente führt zu einem erhöhten Risiko für opportunistische Infektionen, Malignome und Endorgantoxizität 1,2,3. Um die Notwendigkeit einer Immunsuppression zu reduzieren und / oder zu eliminieren, sind Tissue-Engineering-Gerüste mit Dezellularisierungsansätzen für VCA vielversprechend.
Die Dezellularisierung des Gewebes beinhaltet die Beibehaltung der extrazellulären Matrixstruktur bei gleichzeitiger Entfernung des zellulären und nukleären Inhalts. Dieses dezellularisierte Gerüst kann mit patientenspezifischen Zellen wieder bevölkert werden4. Die Erhaltung des ECM-Netzwerks aus zusammengesetzten Geweben ist jedoch eine zusätzliche Herausforderung. Dies ist auf das Vorhandensein mehrerer Gewebetypen mit unterschiedlichen Gewebedichten, Architekturen und anatomischen Positionen innerhalb eines Gerüsts zurückzuführen. Das vorliegende Protokoll bietet eine Operationstechnik und eine Dezellularisierungsmethode für eine Rattenhinterbeine. Dies ist ein Proof-of-Concept-Modell für die Anwendung dieser Tissue-Engineering-Technik auf zusammengesetzte Gewebe. Dies kann auch zu nachfolgenden Bemühungen führen, Kompositgewebe durch Rezellularisierung zu regenerieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Leichenförmige männliche Lewis-Ratten (300-430 g), die vom Toronto General Hospital Research Institute erhalten wurden, wurden für alle Experimente verwendet. Für alle chirurgischen Eingriffe wurden sterile Instrumente und Verbrauchsmaterialien verwendet, um die aseptische Technik aufrechtzuerhalten (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care Committee am Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kanada) durchgeführt. Insgesamt vier Hinterbeine waren dezellularisiert.
1. Präoperative Vorbereitung
- Bereiten Sie 50 ml 5% heparinisierte Kochsalzlösung vor. Aus einem 50-ml-Kochsalzbeutel 2,5 ml Kochsalzlösung mit einer 5-ml-Spritze entnehmen und entsorgen. Geben Sie mit einer 5-ml-Spritze 2,5 ml Heparin in den Kochsalzbeutel. Drehen Sie den Kochsalzbeutel um, um den Inhalt zu mischen.
- Legen Sie eine Leichenratte in Rückenlage unter ein blaues Pad. Rasieren Sie die Hinterbeine und die Leistengegend umlaufend mit einem Elektrorasierer und entfernen Sie Haare.
- Bringen Sie die Ratte zur chirurgischen Station und tragen Sie Povidone Jodpeelinglösung mit einer Gaze auf die Hinterbeine und die Leistengegend auf. Anschließend 70% Isopropylalkohol auftragen, um die Peelinglösung mit Gaze abzuwischen.
- Entsorgen Sie das blaue Pad aus Schritt 1.2 und wechseln Sie in neue, sterile Handschuhe.
2. Beschaffung der Hinterbeine der Ratte
- Machen Sie einen Hautschnitt mit einer chirurgischen Klinge # 10 und einem Klingenläufer # 3 entlang der Leistenbandebene und bewegen Sie sich von einer lateralen in eine mediale Richtung (Abbildung 1A). Verwenden Sie Adson-Pinzetten, um die umgebende Haut zu halten, um einen glatten Schnitt zu gewährleisten.
- Wenn das darunter liegende Fett freigelegt ist, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Fett vorsichtig zu sezieren. Lokalisieren Sie die oberen epigastrischen Gefäße.
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um in der Nähe zu sezieren und den darunter liegenden Oberschenkelnerv, die Arterie und die Vene auf der Ebene des Leistenbandes freizulegen.
- Identifizieren Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Femurgefäße und sezieren Sie Arterie und Vene proximal mit feinen Pinzetten, um eine ausreichende Länge von den Bifurkationspunkten des arteriellen Netzwerks zu erhalten (Abbildung 1B).
- Ligieren Sie die Oberschenkelarterie und die Vene separat mit 6-0-Nähten.
- Führen Sie eine umlaufende Dissektion um den Rest der Hinterbeine durch, ohne die ligierten Femurgefäße zu stören.
- Transektieren Sie den Oberschenkelknochen in der Mitte mit einem Knochenschneider.
- Um die Hinterbeine vollständig zu isolieren, transektieren Sie die ligierten Femurgefäße unterhalb der Ligaturen mit einer Mikroschere.
- Cannulatieren Sie die Oberschenkelarterie mit einem 24 G Angiokatheter unter dem Dissektionsmikroskop. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Kanüle vorsichtig einzuführen. Mit heparinisierter Kochsalzlösung spülen, bis ein deutlicher Abfluss aus der Oberschenkelvene beobachtet wird.
- Sichern Sie die Kanüle, indem Sie eine Naht um das kanülierte Gefäß und eine andere Naht distal um die Kanüle selbst binden. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle proximal platziert ist, um eine Blockierung der Gabelungspunkte zu vermeiden.
- Tauchen Sie die beschafften Hinterbeine bis zur Dezellularisierung in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
Abbildung 1: Beschaffung der Hinterbeine der Ratte. (A) Markierung des Hautschnitts auf der Ebene des Leistenbandes von lateral nach medial. (B) Blick auf die Vena femoralis und die Arteria femoralis, die in der Nähe des Leistenbandes seziert wurden, angezeigt durch die gestrichelte Linie. Abkürzungen: L = lateral; M = medial; FV = Vena femoralis; FA = Arteria femoralis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Vorbereitung von Lösungen
- In einem 6-L-Glaskolben wird ein 5-L-Waschmittelreservoir mit 0,25%igem Natriumdodecylsulfat (SDS) hergestellt, indem 12,5 g SDS-Pulver in 5 l hochreinem destilliertem Wasser gelöst werden. Decken Sie die Öffnung des Kolbens mit Parafilm ab, um ihn zu verschließen.
- In einem 1-l-Glasgefäß 1 l 0,25%ige SDS-Lösung separat vorbereiten, indem 2,5 g SDS in 1 L hochreines destilliertes Wasser gelöst werden. Fügen Sie einen Rührbalken hinzu, um die Lösung auf einem Magnetrührer zu mischen, bis sich das gesamte SDB aufgelöst hat.
- Bereiten Sie 1 L 1x PBS-Waschlösung mit 1% iger Antibiotika-Antimykotikum (AA) -Lösung vor. In einem 1-L-Kolben werden 990 ml 1x PBS-Lösung und 10 ml AA hinzugefügt.
- Separat in einem 500-ml-Glasgefäß 1x PBS + 1% AA-Lösung erneut mit 495 ml 1x PBS-Lösung und 5 ml AA zubereiten.
- Bereiten Sie 200 ml 1% Peressigsäure (PAA)/4% Ethanol (EtOH) Lösung vor. Bereiten Sie diese Lösung unter einem Abzug vor.
4. Aufbau von Bioreaktor und Perfusionskreislauf
HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie die Konfiguration des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs während der aufgeführten Schritte.
- Bohren Sie in einer 500-ml-Kammer (Kunststoffbehälter) drei Löcher (1/4 Zoll) an den in Abbildung 2 gekennzeichneten Stellen: Anschluss A ist die Einlassleitung, Anschluss B ist die Nachfüllleitung und Anschluss C ist die Auslassleitung. Entfernen und entsorgen Sie überschüssiges Plastik. Besprühen und wischen Sie die Kammer mit 70% Ethanol ab.
- Schneiden Sie drei 5 cm lange Silikonschläuche ab und führen Sie einen halb in jeden Port der Kammer ein. Schließen Sie einen Luer-Stecker an der Öffnung von Port A zur Innenseite der Kammer und eine Luer-Buchse am anderen Ende der Röhre außerhalb der Kammer an.
- Schließen Sie eine Luer-Buchse an Port B und Port C an den Enden der Röhren an, die aus der Kammer zeigen.
- Bohren Sie in einem luftdichten Deckel für den Kunststoffbehälter ein Loch auf die Oberfläche des Deckels.
- Schneiden Sie einen 3 cm langen Silikonschlauch und führen Sie ihn in das Loch des Deckels ein. Stellen Sie sicher, dass sich etwa 2 cm des Röhrchens außerhalb des Deckels befinden, wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Sterilisieren Sie sowohl die Kammer als auch den Deckel mit dem Schlauch.
- Schneiden Sie zwei 30 cm Silikonschläuche mit einer Schere ab. Schließen Sie einen 1/16-Zoll-Anschluss an einem Ende jeder Röhre an einen 1/8-Zoll-Anschluss an.
- Schneiden Sie separat zwei 12 cm Silikonschläuche mit einer Schere ab. Schließen Sie einen 1/16-Zoll-Anschluss an einen 1/8-Zoll-Stecker an einem Ende beider Röhren an. Schließen Sie einen Luer-Stecker am anderen Ende einer Röhre und eine Luer-Buchse an die andere Röhre an.
- Sterilisieren Sie das gesamte Schlauchmaterial aus Schritt 4.7 und Schritt 4.8. Schließen Sie zwei 3-Stufen-Pumpenschläuche (1,85 mm) in die Sterilisation ein.
- Bereiten Sie drei 3-Wege-Absperrhähne, einen Spritzenfilter, zwei serologische 1-ml-Pipetten und eine 10-ml-Spritze für den Dezellularisierungsaufbau vor. Entfernen Sie den Filter von den 1-ml-serologischen Pipetten.
Abbildung 2: Vorbereitung der Konstruktion des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs. Gezeigte Vorrichtung des Perfusionskreislaufs einschließlich (A) Schlauchpumpe und (B) entsprechender Kassetten für Einlass- und Auslassleitungen. (C, D) Silikonschläuche von 12 cm und 30 cm werden ebenfalls mit entsprechenden Verbindern gezeigt. (E) Schlauch für Schlauchpumpe (1,85 mm). Bioreaktorkammer mit beschrifteten Anschlüssen für (F) Zufluss, (G) Nachschuböffnung und (H) Abfluss. (I) Bioreaktordeckel mit Lüftungsöffnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. Dezellularisierung der Hinterbeine von Ratten
- Platzieren Sie die sterilisierte Kammer und schrauben Sie drei Einweg-3-Wege-Absperrhähne an den Einlass-, Auslass- und Nachfüllleitungen. Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn für den Nachschubanschluss an den verbleibenden zwei Anschlüssen verschlossen ist, um ein Auslaufen zu verhindern.
- Befestigen Sie die in Schritt 4.8 hergestellten Rohre an den Absperrhähnen an den Ein- und Auslassleitungen.
- Verbinden Sie den Schlauch mit den Schläuchen im obigen Schritt. Befestigen Sie die Kassette am Schlauch und legen Sie sie auf die Schlauchpumpe. Sichern Sie die Kassetten noch nicht mit einem Schlauch.
- Verbinden Sie ein Rohr von Schritt 4.7 mit dem Ende des Schlauchs der Auslassleitung aus dem obigen Schritt. Schließen Sie am anderen Ende eine 1-ml-serologische Pipette an. Hängen Sie das mit einer serologischen Pipette befestigte Ende in den Abfallbehälterkolben.
- Wiederholen Sie Schritt 4.7 für die Einlassleitung. Hängen Sie das Ende des Röhrchens, das an der serologischen Pipette befestigt ist, in den Waschmittelbehälter auf. Verschließen Sie die Öffnung des Waschmittelbehälterkolbens sofort mit Parafilm. Siehe Abbildung 3A,B für eine Übersicht über den Dezellularisierungskreislauf.
- 0,25% SDS aus dem 1-Liter-Glas (Schritt 3.2) auf halber Höhe in die Bioreaktorkammer geben.
- Nehmen Sie das beschaffte Hinterbein mit einer Adson-Pinzette und hängen Sie es vorsichtig in die Bioreaktorkammer.
- Verwenden Sie zwei Paar Adson-Pinzetten, um den kanülierten Teil der Hinterbeine zur Einlasslinie zu führen. Während Sie die Kanüle mit einer Pinzette halten, verwenden Sie die andere Pinzette, um die Einlassleitung an der Kanüle zu drehen und zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht gezogen oder verdreht wird, um eine Dekanülierung zu verhindern.
- Nach dem Sichern fügen Sie weitere 0,25% SDS aus dem 1-Liter-Glasgefäß hinzu, um die Extremität nach Bedarf vollständig einzutauchen. Stellen Sie sicher, dass der Auslassanschluss ebenfalls in den Bioreaktorbehälter eingetaucht ist, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiger Abfluss aufrechterhalten wird (Abbildung 3C).
- Befestigen Sie einen Einwegspritzenfilter an der Belüftungsöffnung am Deckel der Bioreaktorkammer unter Bezugnahme auf Schritt 4.4 und Schritt 4.5.
- Befestigen Sie den Deckel am Bioreaktor, und stellen Sie sicher, dass die Kammer von allen Seiten abgedichtet ist (Abbildung 3B).
- Um Luft aus dem Schlauch zu entfernen und den Perfusionskreislauf anzusaugen, verwenden Sie eine neue 10-ml-Einwegspritze, um das Reinigungsmittel mit dem 3-Wege-Absperrhahn an der Einlassleitung aus dem Waschmittelbehälter zu ziehen.
- Verwenden Sie nach dem Ziehen die gleiche Flüssigkeit, um sie in den 3-Wege-Absperrhahn an der Auslassleitung einzuführen. Stellen Sie sicher, dass sich im gesamten Schlauch sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen Reinigungsmittel befindet.
- Drücken Sie die Kassetten nach unten und befestigen Sie sie mit dem Schlauch in der Schlauchpumpe. Schalten Sie die Schlauchpumpe mit dem Netzschalter ein.
- Fahren Sie auf dem Bildschirm der Schlauchpumpe mit der Pfeiltaste zur zweiten Registerkarte fort, um die Perfusionsrate für den ersten Kanal einzustellen. Eingangsdurchfluss als Lieferart und Einstellung der Perfusionsrate auf 1 ml/min. Stellen Sie sicher, dass die Strömungsrichtung entsprechend der Geräteeinrichtung korrekt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Kanal.
- Kalibrieren Sie die Schlauchpumpe, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsmenge, die durch die Einlassleitung abgegeben und/oder aus der Auslassleitung entnommen wird, mit einer konsistenten Rate zwischen den beiden fließt. Stellen Sie sicher, dass die Schlauch-ID auf 1,85 mm eingestellt ist.
- Beginnen Sie mit der Dezellularisierung über die Maschinenperfusion bei 1 ml / min sowohl für die Einlass- als auch für die Ausgangsleitungen, indem Sie den Netzschalter auf der Tastatur drücken. Überwachen und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss sowohl an den Einlass- als auch an den Auslassleitungen konsistent und kontinuierlich ist.
- Setzen Sie die Dezellularisierung fort und überwachen Sie sie täglich. Verwenden Sie den 1 L 0,25% SDS (Schritt 3.2), um das Bioreaktorreservoir nach Bedarf durch den Nachfüllanschluss aufzufüllen. Suchen Sie nach einem weißen, durchscheinenden Aussehen des Gewebes, das am Tag 5 erscheint, was auf eine Dezellularisierung der Hinterbeine der Ratte hinweist.
Abbildung 3: Überblick über den Perfusionsdezellularisierungs-Bioreaktorkreislauf der Rattenhinterbeine . (A) Schematische Darstellung des Bioreaktor-Perfusionskreislaufs. Blaue Pfeile zeigen die Richtung des Waschmittel- und Abfallflusses an. (B) Überblick über den Dezellularisierungskreislauf mit Bioreaktor mit Rattenhinterbein. Das SDS-Reservoir (linker Kolben) führt in die Schlauchpumpe und in den Einlassschlauch des Bioreaktors. Der Abfluss wird durch die Schlauchpumpe mit dem Abfallbehälter (rechter Kolben) verbunden. (C) (I) Bioreaktor mit Rattenhinterbein mit Einlassschläuchen, die mit der Kanülenarterie femoralisiert verbunden sind. (II) Auffüllen des Anschlusses in der Ecke für die Perfusion von Reinigungsmittel. (III) Abflussrohre, die im Aufhängungsbehälter aufgehängt sind. Abkürzung: SDS = Natriumdodecylsulfat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
6. Waschen und Sterilisieren nach der Dezellularisierung
- Nach der Bestätigung der Dezellularisierung ersetzen Sie den Waschmittelbehälter durch den 1x PBS + 1% AA-Behälter. Die Öffnung des Kolbens wird mit Parafilm verschlossen. Beginnen Sie 1x PBS + 1% AA Perfusion bei 1 ml / min und fahren Sie für 2 Tage fort.
- Ersetzen Sie das 1x PBS + 1% AA-Reservoir durch 200 ml 0,1% PAA/4% EtOH-Reservoir und beginnen Sie mit der Perfusion bei 1 ml/min für 2 h.
- Trennen Sie die Hinterbeine von der Einlassleitung mit zwei Paaren steriler Adson-Pinzetten, wobei eine Pinzette die Einlasslinie dreht und die andere die Kanüle hält. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht gezogen wird, um eine Dekanülierung zu verhindern.
- Lagern Sie die Extremität bis zur weiteren Verwendung in einem 500 ml Glasgefäß mit 1x PBS + 1% AA bei 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das Beschaffungsprotokoll war erfolgreich bei der Isolierung und Kanülierung der gemeinsamen Oberschenkelarterien für nachfolgende Perfusionsschritte. Die repräsentativen Dissektionsbilder in Abbildung 1A,B zeigen die Inzisionslage und Exposition der Femurgefäße mit ausreichendem Abstand zu den Bifurkationspunkten. Abbildung 2 zeigt die Apparatur, die für die Vorbereitung des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs erforderlich ist. Der Endpunkt der Dezellularisierung wurde durch Beobachtung eines weißen, durchscheinenden Aussehens des Gewebes bestimmt. Das Ex-vivo-Maschinenperfusionssystem war erfolgreich bei der Perfusionsdezellularisierung der Rattenhinterbeine. Ein geschlossener Single-Pass-Kreislauf wurde beibehalten (Abbildung 3). Die grobe Morphologie der nativen Hinterbeine verwandelte sich nach 5 Tagen mit 0,25% SDS-Perfusion in ein weißes, blasses Aussehen (Abbildung 4).
Die Entfernung von zellulärem Inhalt wurde beobachtet, wenn mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) in den Femurgefäßen, Haut, Nerven, Knochen und Muskeln gefärbt wurde, wo keine Kerne gefunden wurden. Die Strukturen jeder Gewebestruktur wurden relativ zum nativen Gewebe analysiert. Sowohl die dezellularisierte Oberschenkelarterie als auch die Vene zeigten einen Verlust des Kerngehalts in allen Schichten und im umgebenden Bindegewebe, da es keine blau gefärbten Kerne gab, die sonst in den nativen Gefäßen vorhanden waren (Abbildung 5A, B und Abbildung 5D, E). Die Tunica intima, media und adventitia sowohl der Oberschenkelvene als auch der Arterien wurden in den dezellularisierten Gefäßen aufrechterhalten (Abbildung 5D, E). Der Femurnerv zeigte eine Erhaltung der Gewebestruktur, einschließlich des Endoneuriums (Abbildung 5C und Abbildung 5F). Der Knochen behielt seine gesamte Gewebestruktur nach der Dezellularisierung, mit einem beobachtbaren Verlust von gefärbten Kernen von Osteozyten aus dem Knochen und aus den umgebenden Endost- und Periostschichten (Abbildung 5G und Abbildung 5J). Die Haut zeigte einen Zellverlust aus Epidermis und Dermis. Die Dermis zeigte zurückgehaltene Kollagenfasern, ähnlich wie natives Hautgewebe (Abbildung 5H und Abbildung 5K). Schließlich zeigte die Queransicht der Skelettmuskulatur den Verlust von Kernen, die sich sonst in den Peripherien des Endomysiums befinden. Der Myofasergehalt blieb nach der Dezellularisierung in den jeweiligen Faszikeln erhalten (Abbildung 5I und Abbildung 5L). Eine DNA-Quantifizierung mit Picogreen wurde ebenfalls durchgeführt, bei der der DNA-Gehalt in den Femurgefäßen, Nerven, Haut, Muskeln und Knochen signifikant reduziert wurde (Abbildung 6).
Abbildung 4: Bruttomorphologie der Hinterbeine von einheimischen und dezellularisierten Ratten . (A) Oberschenkelarterie der nativen Hinterbeine, die nach der Kontraktion mit einem 24-G-Angiokatheter kanüliert wird. (B) Weißes, durchscheinendes Aussehen der Hinterbeine nach 5 Tagen Dezellularisierung mit 0,25% SDS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Histologische Färbung von Ratten-Hintergliedmaßengeweben mit Hämatoxylin und Eosin. H & E-gefärbte native (obere Platte) und dezellularisierte (untere Platte) (A, D) Oberschenkelvene und (B, E) Arterie, (C, F) Nerv, (G, J) Knochen, (H, K) Haut und (I, L) Muskel. Verlust von Kernen und zellulärem Inhalt, sichtbar in allen dezellularisierten Proben. Maßstabsbalken = 200 μm (Gefäße, Nerven, Knochen) und 300 μm (Haut, Muskel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: DNA-Quantifizierung von nativem und dezellularisiertem Ratten-Hintergliedmaßengewebe. Der DNA-Gehalt wird über native und dezellularisierte Gefäße, Nerven, Muskeln, Haut und Knochen reduziert, ausgedrückt in ng / mg Trockengewicht. Das Gewebe wurde getrocknet und in Papain über Nacht bei 65 °C verdaut. DNA wurde mit PicoGreen fluoreszierend nachgewiesen. Es wurden mehrere ungepaarte t-Tests durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abkürzungen: N = nativ; D = dezellularisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rattenhinterbeine sind als experimentelle Modelle in VCA5 nützlich. Das Tissue Engineering von azellulären Gerüsten stellt den ersten Schritt dar, um die Mängel langfristiger Immunsuppressionsregime im Zusammenhang mit VCA zu beheben. Die Verwendung von Komposittransplantaten stellt eine zusätzliche Herausforderung dar, da mehrere Gewebe vorhanden sind, von denen jedes einzigartige funktionelle, immunogene und strukturelle Eigenschaften aufweist. Das vorliegende Protokoll zeigt eine erfolgreiche Methode zur Gewinnung von azellulären zusammengesetzten Rattenhintergliedmaßen. Diese Gerüste können weiter rezellularisiert werden und stellen ein Proof-of-Concept-Modell für VCA dar.
Um eine erfolgreiche Beschaffung und Dezellularisierung zu gewährleisten, gibt es verschiedene kritische Schritte in der chirurgischen und Dezellularisierungsphase. Um eine systemische Verteilung des Waschmittels und der Sterilisationslösung im gesamten nativen Gefäßsystem zu gewährleisten, umfassen die kritischen Schritte die Ligatur der Oberbauchgefäße sowie das Erreichen eines ausreichenden Abstands von den Bifurkationspunkten des arteriovenösen Netzwerks vor der Ligatur der Femurgefäße. Das beschriebene Sterilisationsverfahren hilft, die Keimbelastung für Rezellularisierungsexperimente zu verringern, bei denen eine sterile Umgebung für die Zellanheftung, das Überleben und das Wachstum erforderlich ist6.
Wir präsentieren auch ein Perfusionsbioreaktorsystem, das zur Implementierung der Dezellularisierung entwickelt wurde. Zu den kritischen Komponenten gehören die Fähigkeit der kontinuierlichen Perfusion mit einer Schlauchpumpe und die Ermöglichung einer Single-Pass-Perfusion des Reinigungsmittels und des Sterilmittels durch die kanülierte Arterie. Die Schlauchpumpe wurde ebenfalls auf einen pulsatilen Fluss eingestellt, ähnlich den physiologischen Bedingungen. Schließlich wurde ein Nachschubanschluss zum Auffüllen des Suspensionsreservoirs im Bioreaktor hinzugefügt, ohne das Hinterbein der äußeren Umgebung auszusetzen. Dieses Bioreaktorsystem ist daher vorteilhaft, da es eine Rattenhinterbein ex vivo in einem geschlossenen System in einem Single-Pass-Verfahren dezellularisieren und sterilisieren kann. Die Komponenten des Kreislaufs sind autoklavierbar und können vor jedem Dezellularisierungszyklus sterilisiert werden. Angesichts der Dichte und des relativ großen Vorhandenseins von Muskeln in den Hinterbeinen wurden sowohl Waschmittelperfusions- als auch Tauchmethoden in das Design dieser Ex-vivo-Schaltung integriert, um den Zugang zu und die Dezellularisierung des Muskels zu erleichtern.
Obwohl die Bioreaktorkammer und der Dezellularisierungskreislauf sorgfältig entworfen und auf die Hinterbeine der Ratte zugeschnitten wurden, hat sie ein reproduzierbares Design, das modifiziert werden kann, wenn dieses Protokoll für andere Gewebe angepasst wird. Weitere Änderungen können den Einbau einer Blasenfalle in den Perfusionskreislauf umfassen, um sicherzustellen, dass die Durchflussrate nicht durch Luftblasen 7,8 gestört wird. Darüber hinaus haben wir kein Drucküberwachungssystem integriert, um den Perfusionsdruck während der gesamten Dauer der Dezellularisierung zu überwachen. Es ist möglich, dass der Perfusionsdruck aufgrund intraluminaler Zelltrümmer schwankt. Kürzlich berichteten Cohen et al. über vorübergehende Schwankungen des Perfusionsdrucks während der SDS-Perfusion in einem Ansatz zur Erzeugung von vaskulärem Chimärismus in den Hinterbeinen der Ratte unter Verwendung einer ähnlichen Zielflussrate von 1-2 ml / min. Der Perfusionsdruck wurde nach der Behandlung potenzieller Verstopfungen stabilisiert9. Für zukünftige Änderungen des Perfusionssystems für das aktuelle Protokoll kann die Integration eines Druckmonitors über intraluminale Verschlüsse informieren und auf die Notwendigkeit einer Behandlung hinweisen, um Schäden am Gefäßsystem zu vermeiden.
In diesem Modell wurde der Abfluss während und nach der Dezellularisierung beobachtet. Um die Lebensfähigkeit und Funktionalität der Gerüste zu gewährleisten, ist eine vaskuläre Durchgängigkeit für die Abgabe von Sauerstoff und Nährstoffen an verschiedene Gewebe in einem Komposittransplantat10 erforderlich. Da das Potenzial dieses Dezellularisierungsprotokolls auf weitere Rezellularisierungsstudien ausgedehnt wird, ist die Beobachtung des Abflusses von entscheidender Bedeutung, damit der dezellularisierte Gefäßbaum während der Rezellularisierung wieder besiedelt und refunktionalisiert werden kann. Die vaskuläre Bildgebung kann nach der Dezellularisierung verwendet werden, um die Gefäßdurchgängigkeit zu bestätigen.
Bisher wurden nur wenige Studien zur Dezellularisierung der Rattenhinterbeine durchgeführt, mit begrenzten Ergebnissen zum Erfolg in jedem der Gewebekompartimente 9,11. Die repräsentativen Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen die Auswirkungen der Dezellularisierung auf alle in der Hinterbeine vorhandenen Gewebekompartimente. Die chirurgische Methode erhält auch große Mengen an Muskeln und Haut, die seriell biopsiert und für weitere Analysen verwendet werden können. Darüber hinaus schlägt dieses Protokoll einen weniger toxischen Dezellularisierungsansatz vor, indem eine niedrigere SDS-Konzentration verwendet wird, als sie typischerweise in Dezellularisierungsprotokollen für zusammengesetzte und isolierte Gewebe verwendet wird12. Das vorgeschlagene Ex-vivo-Bioreaktorsystem kann auch für andere Gewebe und Modelle angepasst werden.
Zusammenfassend bietet das vorgeschlagene Protokoll eine zuverlässige und reproduzierbare Operationstechnik und Dezellularisierungsmethode für Rattenhinterbeine unter Verwendung eines Ex-vivo-Maschinenperfusionssystems . Zukünftige Anwendungen umfassen die Wiederbesiedlung dieses Gerüsts mit gewebespezifischen Zellen und die Untersuchung von Wegen zur Regeneration der Funktionsfähigkeit in Geweben wie Knochen, Muskeln und Nerven. Zukünftige Studien können auch die extrazelluläre Matrix, die Beibehaltung des nativen Gefäßsystems und biochemische Eigenschaften charakterisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Abbildung 3A wurde BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
