Summary
Описана хирургическая методика и процесс децеллюляризации композитных задних конечностей крыс. Децеллюляризацию проводят с использованием низкоконцентрированного додецилсульфата натрия через машинную перфузионную систему ex vivo .
Abstract
Пациентам с тяжелыми травматическими повреждениями и потерей тканей требуется сложная хирургическая реконструкция. Васкуляризированная композитная аллотрансплантация (VCA) является развивающимся реконструктивным путем для переноса нескольких тканей в качестве композитной субъединицы. Несмотря на многообещающий характер VCA, долгосрочные иммуносупрессивные требования являются значительным ограничением из-за повышенного риска злокачественных новообразований, токсичности конечных органов и оппортунистических инфекций. Тканевая инженерия бесклеточных композитных каркасов является потенциальной альтернативой в снижении потребности в иммуносупрессии. Здесь описана добыча крысиной задней конечности и ее последующая децеллюляризация с использованием додецилсульфата натрия (SDS). Представленная стратегия закупок основана на общей бедренной артерии. Была построена и использована для децеллюляризации задней конечности машинной системы на основе перфузии. Была выполнена успешная перфузионная децеллюляризация, в результате чего появился белый полупрозрачный вид задней конечности. Наблюдалась интактная, перфузируемая сосудистая сеть по всей задней конечности. Гистологические анализы показали удаление ядерного содержимого и сохранение тканевой архитектуры во всех тканевых компартментах.
Introduction
VCA является новым вариантом для пациентов, нуждающихся в сложной хирургической реконструкции. Травматические повреждения или резекции опухоли приводят к потере объемной ткани, которую может быть трудно реконструировать. VCA предлагает трансплантацию нескольких тканей, таких как кожа, кости, мышцы, нервы и сосуды, в качестве композитного трансплантата от донора к реципиенту1. Несмотря на свой многообещающий характер, VCA ограничен из-за длительных иммуносупрессивных схем. Пожизненное применение таких препаратов приводит к повышению риска оппортунистических инфекций, злокачественных новообразований и токсичности конечных органов 1,2,3. Чтобы помочь уменьшить и / или устранить потребность в иммуносупрессии, тканеинженерные каркасы, использующие подходы к децеллюляризации для VCA, показывают большие перспективы.
Децеллюляризация тканей влечет за собой сохранение структуры внеклеточного матрикса при удалении клеточного и ядерного содержимого. Этот децеллюляризованный каркас может быть повторно заселен специфическими для пациента клетками4. Однако сохранение ECM-сети композитных тканей является дополнительной проблемой. Это связано с наличием нескольких типов тканей с различной плотностью тканей, архитектурой и анатомическим расположением в каркасе. Настоящий протокол предлагает хирургическую технику и метод децеллюляризации для задних конечностей крыс. Это доказательство концепции для применения этой техники тканевой инженерии к композитным тканям. Это также может побудить к последующим усилиям по регенерации композитных тканей путем рецеллюляризации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Трупные самцы крыс Льюиса (300-430 г), полученные из Научно-исследовательского института больницы общего профиля Торонто, использовались для всех экспериментов. Для всех хирургических процедур для поддержания асептической техники использовались стерильные инструменты и расходные материалы (см. Таблицу материалов). Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными в Научно-исследовательском институте больниц общего профиля Торонто, Сеть университетского здравоохранения (Торонто, Онтарио, Канада). В общей сложности четыре задних конечности были децеллюляризированы.
1. Предоперационная подготовка
- Готовят 50 мл 5% гепаринизированного физиологического раствора. Из солевого мешка объемом 50 мл выньте 2,5 мл физиологического раствора с помощью шприца объемом 5 мл и выбросьте. Используя шприц объемом 5 мл, добавьте 2,5 мл гепарина в солевой мешок. Переверните солевой мешок, чтобы перемешать его содержимое.
- Поместите трупную крысу в лежачее положение под синей подушечкой. Побрейте заднюю конечность и область паха по окружности с помощью электробритвы и удалите волосы.
- Приведите крысу на хирургическую станцию и нанесите раствор скраба йода Повидона марлей на заднюю конечность и паховую область. Затем нанесите 70% изопропиловый спирт, чтобы вытереть раствор скраба марлей.
- Отбросьте синюю прокладку с шага 1.2 и переодевайте в новые, стерильные перчатки.
2. Заготовка задних конечностей крыс
- Сделайте разрез кожи с помощью хирургического лезвия No 10 и лезвия No 3 вдоль уровня паховой связки, двигаясь от бокового к медиальному направлению (рисунок 1A). Используйте щипцы Adson, чтобы удерживать окружающую кожу, чтобы обеспечить гладкий разрез.
- Когда основной жир обнажается, используйте тупое рассечение, чтобы тщательно рассечь жир. Найдите верхние эпигастральные сосуды.
- Используйте микроциссоры для проксимального рассечения и обнажения подлежащего бедренного нерва, артерии и вены на уровне паховой связки.
- Под рассеченным микроскопом идентифицируют бедренные сосуды и рассекают артерию и вену проксимально с помощью тонких щипцов для получения достаточной длины от точек бифуркации артериальной сети (рисунок 1B).
- Обжигайте бедренную артерию и вену отдельно с помощью 6-0 швов.
- Проводят окружное рассечение вокруг остальной части заднего сгиба, не нарушая перевязанные бедренные сосуды.
- Трансекция бедренной кости средней длины с помощью костяного резака.
- Чтобы полностью изолировать задний край, перерефектируйте перевязанные бедренные сосуды ниже лигатур с помощью микросублиц.
- Каннулировать бедренную артерию с помощью ангиокатетера 24 Г под рассеченным микроскопом. Используйте тонкие щипцы, чтобы аккуратно вставить канюлю. Промывайте гепаринизированным физиологическим раствором до тех пор, пока не будет наблюдаться прозрачный отток из бедренной вены.
- Закрепите канюлю, завязав один шов вокруг канюлированного сосуда и еще один шов дистально вокруг самой канюли. Убедитесь, что канюля расположена проксимально, чтобы предотвратить блокирование точек бифуркации.
- Погружайте полученные задние конечности в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) до децеллюляризации.
Рисунок 1: Закупка задних конечностей крыс. (А) Маркировка разреза кожи на уровне паховой связки от латеральной до медиальной. (B) Вид бедренной вены и бедренной артерии, которые были рассечены проксимально к паховой связке, обозначенной пунктирной линией. Сокращения: L = латеральный; M = медиальный; FV = бедренная вена; ФА = бедренная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Приготовление растворов
- В стеклянной колбе объемом 6 л приготовьте 5-литровый резервуар моющего средства с 0,25% додецилсульфата натрия (SDS), растворив 12,5 г порошка SDS в 5 л сверхчистой дистиллированной воды. Накройте отверстие колбы парапленкой, чтобы запечатать ее.
- В стеклянной банке объемом 1 л приготовить 1 л 0,25% раствора SDS отдельно, растворив 2,5 г SDS в 1 л сверхчистой дистиллированной воды. Добавьте перемешивание, чтобы перемешать раствор на магнитной мешалке, пока все SDS не растворится.
- Приготовьте 1 л 1 промывочного раствора PBS с 1% раствором антибиотика-антимикотика (АА). В колбу объемом 1 л добавьте 990 мл 1 раствора PBS и 10 мл АА.
- Отдельно в стеклянной банке объемом 500 мл снова приготовьте 1x PBS + 1% раствор AA, используя 495 мл 1x раствора PBS и 5 мл AA.
- Приготовьте 200 мл 1% раствора перуксусной кислоты (PAA)/4% этанола (EtOH). Приготовьте этот раствор под вытяжным кожухом.
4. Построение биореактора и перфузионного контура
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация биореактора и перфузионного контура на всех перечисленных этапах приведена на рисунке 2 .
- В камере объемом 500 мл (пластиковый контейнер) просверлите три отверстия (1/4 дюйма) в маркированных местах на рисунке 2: Порт A - это впускная линия, Порт B - линия пополнения, а Порт C - выходная линия. Удалите и выбросьте лишний пластик. Распылите и протрите камеру 70% этанолом.
- Вырежьте три силиконовые трубки длиной 5 см и вставьте по одной наполовину в каждый порт камеры. Соедините разъем Luer на отверстии порта A, обращенном к внутренней части камеры, и женский разъем Luer на другом конце трубки снаружи камеры.
- Подключите гнездовой разъем Luer в порту B и порту C на концах труб, выходящих из камеры.
- В герметичной крышке для пластикового контейнера просверлите одно отверстие на поверхности крышки.
- Вырежьте силиконовую трубку размером 3 см и вставьте ее в отверстие крышки. Убедитесь, что приблизительно 2 см трубки расположено из крышки, как показано на рисунке 2.
- Стерилизуйте камеру и крышку трубкой.
- Вырежьте две силиконовые трубки по 30 см ножницами. Подключите 1/16 дюйма к разъему 1/8 дюйма на одном конце каждой трубки.
- Отдельно вырежьте две силиконовые трубки по 12 см ножницами. Подключите 1/16 дюйма к разъему 1/8 дюйма на одном конце обеих трубок. Подключите разъем Luer на другом конце одной трубки и женский разъем Luer к другой трубке.
- Стерилизуйте весь трубчатый материал на стадии 4.7 и стадии 4.8. Включите в стерилизацию две 3-ступенчатые насосные трубки (1,85 мм).
- Подготовьте три 3-позиционных запорных крана, один шприцевой фильтр, две серологические пипетки 1 мл и один шприц 10 мл для установки децеллюляризации. Снимите фильтр с серологических пипеток объемом 1 мл.
Рисунок 2: Подготовка биореактора и построение перфузионного контура. Показана аппаратура перфузионного контура, включающая (А) перистальтический насос и (В) соответствующие кассеты как для впускных, так и для выпускных линий. (С, Г) Силиконовые трубки размером 12 см и 30 см также показаны с соответствующими разъемами. (E) Трубки для перистальтического насоса (1,85 мм). Камера биореактора с маркированными отверстиями для притока (F), (G) пополнения порта и (H) оттока. I) Крышка биореактора с вентиляционным отверстием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5. Децеллюляризация задних конечностей крыс
- Поместите стерилизованную камеру и винт на три одноразовых 3-ходовых запорных крана на входной, выходной и пополняющей линиях. Убедитесь, что запорный кран для порта пополнения закрыт в оставшихся двух портах, чтобы предотвратить утечку.
- Прикрепите трубы, выполненные на шаге 4.8, к запорным кранам на входной и выходной линиях.
- Подключите перистальтические трубки к трубкам на шаге выше. Закрепите кассету на перистальтической трубке и поместите ее на перистальтический насос. Пока не закрепляйте кассеты с трубкой на месте.
- Подключите одну трубку от стадии 4.7 к концу перистальтической трубки выпускной линии от шага выше. Подключите серологическую пипетку объемом 1 мл на другом конце. Подвешивайте конец, прикрепленный серологической пипеткой в колбе резервуара для отходов.
- Повторите шаг 4.7 для входной линии. Подвесьте конец трубки, прикрепленной к серологической пипетке, в резервуар для моющего средства. Немедленно запечатайте отверстие колбы резервуара моющего средства парапленкой. Смотрите рисунок 3A,B для обзора схемы децеллюляризации.
- Добавьте 0,25% SDS из стеклянной банки объемом 1 л (этап 3.2) в камеру биореактора на половине уровня.
- Возьмите закупленный задний налим с помощью щипцов Adson и осторожно подвешивайте его в камере биореактора.
- Используйте две пары щипцов Adson, чтобы направить канюлированную часть задней конечности к входной линии. Удерживая канюлю одной парой щипцов, используйте другую пару щипцов, чтобы закрутить и закрепить впускную линию к канюле. Убедитесь, что канюля не вытягивается и не скручивается, чтобы предотвратить деканнуляцию.
- После закрепления добавьте еще 0,25% SDS из стеклянной банки объемом 1 л, чтобы полностью погрузить конечность, по мере необходимости. Убедитесь, что выходной порт также погружен в резервуар биореактора, чтобы обеспечить поддержание постоянного оттока (рисунок 3C).
- Прикрепите одноразовый шприцевой фильтр к вентиляционному отверстию на крышке камеры биореактора, ссылаясь на этапы 4.4 и 4.5.
- Закрепите крышку биореактора и убедитесь, что камера герметизирована со всех сторон (рисунок 3B).
- Чтобы удалить воздух из трубки и загрунтовать перфузионный контур, используйте новый одноразовый шприц объемом 10 мл для извлечения моющего средства из резервуара моющего средства с помощью 3-позиционного запорного крана на входной линии.
- После рисования используйте ту же жидкость для вставки в 3-полосный запорный кран на выходной линии. Убедитесь, что моющее средство присутствует по всей трубке как на входной, так и на выходной линиях.
- Прижмите и закрепите кассеты трубкой в перистальтическом насосе. Включите перистальтический насос с помощью кнопки питания.
- На экране перистальтического насоса перейдите ко второй вкладке с помощью клавиши со стрелкой, чтобы установить скорость перфузии для первого канала. Входной расход как способ подачи и установить скорость перфузии на уровне 1 мл/мин. Убедитесь, что направление потока правильное в соответствии с настройкой аппарата. Повторите для второго канала.
- Откалибруйте перистальтический насос, чтобы убедиться, что количество жидкости, подаваемой через впускную линию и/или взятой из выходной линии, течет с постоянной скоростью между ними. Убедитесь, что для идентификатора трубки установлено значение 1,85 мм.
- Начните децеллюляризацию с помощью перфузии машины со скоростью 1 мл /мин для входной и выходной линий, нажав кнопку питания на клавиатуре. Контролируйте и убедитесь, что поток является последовательным и непрерывным как на входной, так и на выходной линиях.
- Продолжайте децеллюляризацию и ежедневно контролируйте. Используйте 1 л 0,25% SDS (шаг 3.2) для пополнения резервуара биореактора через порт пополнения по мере необходимости. Ищите белый, полупрозрачный вид ткани, который появится к 5 дню, что указывает на децеллюляризацию задних конечностей крысы.
Рисунок 3: Обзор схемы перфузионной децеллюляризации биореактора задних конечностей крыс. (А) Схематическое изображение перфузионной схемы биореактора. Синие стрелки указывают направление потока моющих средств и отходов. (B) Обзор схемы децеллюляризации с биореактором, содержащим заднюю конечность крыс. Резервуар SDS (левая колба) ведет в перистальтический насос и во впускную трубку биореактора. Отток подключается к резервуару для отходов (правая колба) через перистальтический насос. (C)(I) Биореактор, содержащий заднюю конечность крыс с впускной трубкой, соединенной с канюлярной бедренной артерией. II) Порт пополнения, расположенный в углу для перфузионного моющего средства. III) Трубы для оттока, подвешенные в суспензионном резервуаре. Аббревиатура: SDS = додецилсульфат натрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
6. Постдецеллюлярная промывка и стерилизация
- После подтверждения децеллюляризации замените резервуар моющего средства резервуаром 1x PBS + 1% AA резервуар. Запечатайте отверстие колбы парапленкой. Начинают 1x PBS + 1% перфузию АА при 1 мл/мин и продолжают в течение 2 дней.
- Замените резервуар 1x PBS + 1% AA на 200 мл 0,1% PAA/4% EtOH резервуара и начните перфузию со скоростью 1 мл/мин в течение 2 ч.
- Отсоедините заднюю конечность от входной линии, используя две пары стерильных щипцов Адсона, причем одна пара щипцов скручивает впускную линию, а другая удерживает канюлю. Убедитесь, что канюля не вытягивается, чтобы предотвратить деканнуляцию.
- Храните конечность в стеклянной банке объемом 500 мл, содержащей 1x PBS + 1% AA при 4 °C до дальнейшего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол закупок был успешным в изоляции и каннулировании общих бедренных артерий для последующих этапов перфузии. Репрезентативные изображения рассечения на рисунке 1A,B показывают расположение разреза и экспозицию бедренных сосудов на достаточном расстоянии от точек бифуркации. На фиг.2 показано устройство, необходимое для подготовки биореактора и перфузионного контура. Конечную точку децеллюляризации определяли путем наблюдения за белым, полупрозрачным видом ткани. Машинная перфузионная система ex vivo была успешной в перфузионной децеллюляризации задней конечности крысы. Поддерживалась однопроходная замкнутая системная схема (рисунок 3). Грубая морфология нативной задней конечности изменилась на белый, бледный вид через 5 дней перфузии SDS 0,25% (рисунок 4).
Удаление клеточного содержимого наблюдалось при окрашивании гематоксилином и эозином (H&E) в бедренные сосуды, кожу, нервы, кости и мышцы, где не было обнаружено ядер. Структуры каждой тканевой структуры были проанализированы относительно нативной ткани. Как децеллюляризированная бедренная артерия, так и вена показали потерю ядерного содержимого во всех слоях и окружающей соединительной ткани, учитывая отсутствие окрашенных синим цветом ядер, в противном случае присутствующих в нативных сосудах (рисунок 5A, B и рисунок 5D, E). Оболочка интима, среда и адвентиция как бедренной вены, так и артерий поддерживались в децеллюляризированных сосудах (рисунок 5D, E). Бедренный нерв показал сохранение структуры ткани, включая эндоневрий (рисунок 5C и рисунок 5F). Кость сохранила свою общую структуру ткани после децеллюляризации, с наблюдаемой потерей окрашенных ядер остеоцитов из кости и из окружающих слоев эндостеума и надкостницы (рисунок 5G и рисунок 5J). Кожа показала потерю клеток из эпидермиса и дермы. Дерма показала сохраненные коллагеновые волокна, похожие на нативные ткани кожи (рисунок 5H и рисунок 5K). Наконец, поперечный вид скелетных мышц показал потерю ядер, расположенных на периферии эндомизия. Содержание миофибры оставалось сохраненным в соответствующих фасцикулах после децеллюляризации (рисунок 5I и рисунок 5L). Также была проведена количественная оценка ДНК с использованием Picogreen, где содержание ДНК было значительно снижено в бедренных сосудах, нервах, коже, мышцах и костях (рисунок 6).
Рисунок 4: Грубая морфология нативных и децеллюляризованных задних конечностей крыс. (А) Бедренная артерия нативного заднего сцепления с ангиокатетером 24 G после закупки. (B) Белый, полупрозрачный вид задних конечностей после 5 дней децеллюляризации с 0,25% SDS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистологическое окрашивание тканей задних конечностей крыс с использованием гематоксилина и эозина. H&E-окрашенная нативная (верхняя панель) и децеллюляризированная (нижняя панель) (A, D) бедренная вена и (B, E) артерия, (C, F) нерв, (G, J) кость, (H, K) кожа и (I, L) мышца. Потеря ядер и клеточного содержимого видна во всех децеллюляризованных образцах. Шкала стержней = 200 мкм (сосуды, нервы, кости) и 300 мкм (кожа, мышцы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Количественная оценка ДНК нативных и децеллюляризованных тканей задних конечностей крыс. Содержание ДНК снижается в нативных и децеллюляризованных сосудах, нервах, мышцах, коже и костях, выражаясь в сухом весе нг/мг. Ткани сушили и переваривали в папаине в течение ночи при 65 °C. ДНК была флуоресцентно обнаружена с помощью PicoGreen. Было проведено несколько непарных Т-тестов. Данные представлены в виде среднего значения ± SD. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Сокращения: N = родной; D = децеллюляризированный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Задние конечности крыс полезны в качестве экспериментальных моделей в VCA5. Тканевая инженерия бесклеточных каркасов представляет собой первый шаг в устранении недостатков долгосрочных режимов иммуносупрессии, связанных с VCA. Использование композитных трансплантатов представляет собой дополнительную проблему, учитывая наличие нескольких тканей, каждая из которых обладает уникальными функциональными, иммуногенными и структурными свойствами. Настоящий протокол показывает успешный метод получения бесклеточных композитных задних конечностей крыс. Эти каркасы могут быть дополнительно рецеллюляризированы и представляют собой экспериментальную модель для VCA.
Чтобы обеспечить успешную закупку и децеллюляризацию, существуют различные критические этапы на хирургических и децеллюляризационных этапах. Для обеспечения системного распределения моющего средства и стерилизованного раствора по всей нативной сосудистой системе критические этапы включают перевязку эпигастральных сосудов, а также получение достаточного расстояния от точек бифуркации артериовенозной сети до перевязки бедренных сосудов. Описанная процедура стерилизации помогает уменьшить бионагрузку для экспериментов по рецеллюляризации, где для прикрепления, выживания и роста клеток требуется стерильная среда6.
Мы также представляем перфузионную биореакторную систему, которая была разработана для реализации децеллюляризации. Критические компоненты включают возможность непрерывной перфузии с использованием перистальтического насоса и возможность однопроходной перфузии моющего средства и стериланта через канюлированную артерию. Перистальтический насос также был настроен на пульсирующий поток, похожий на физиологические условия. Наконец, был включен порт пополнения для пополнения резервуара суспензии в биореакторе без воздействия задней конечности на внешнюю среду. Таким образом, эта система биореактора выгодна, поскольку она может децеллюляризировать и стерилизовать задний налим крыс ex vivo в закрытой системе, однопроходным способом. Компоненты схемы являются автоклавируемыми и могут быть стерилизованы перед каждым циклом децеллюляризации. Учитывая плотность и относительно большое присутствие мышц в задней конечности, как методы перфузии моющего средства, так и методы погружения были включены в конструкцию этой схемы ex vivo , чтобы помочь получить доступ и децеллюляризировать мышцу.
Хотя камера биореактора и схема децеллюляризации были тщательно спроектированы и адаптированы к задней конечности крысы, она имеет воспроизводимую конструкцию, которая может быть изменена при адаптации этого протокола для других тканей. Дополнительные модификации могут включать включение пузырьковой ловушки в перфузионный контур для обеспечения того, чтобы скорость потока не нарушалась из-за пузырьков воздуха 7,8. Кроме того, мы не включили систему контроля давления для мониторинга давления перфузии на протяжении всей продолжительности децеллюляризации. Перфузионное давление может колебаться из-за внутрипросветного клеточного мусора. Недавно Cohen et al. сообщили о временных колебаниях перфузионного давления во время перфузии SDS в подходе к генерации сосудистого химеризма в задней конечности крысы, используя аналогичную целевую скорость потока 1-2 мл / мин. Перфузионное давление стабилизировали после обработки потенциальных засоров9. Для будущих модификаций конструкции перфузионной системы для текущего протокола включение монитора давления может быть информативным для любых внутрипросветных окклюзий и указывать на необходимость лечения, чтобы помочь предотвратить повреждение сосудистой системы.
В этой модели отток наблюдался во время и после децеллюляризации. Для обеспечения жизнеспособности и функциональности каркасов необходима проходимость сосудов для доставки кислорода и питательных веществ к различным тканям в композитном трансплантате10. Поскольку потенциал этого протокола децеллюляризации распространяется на дальнейшие исследования рецеллюляризации, наблюдение за оттоком имеет решающее значение, чтобы децеллюляризированное сосудистое дерево можно было повторно заселить и рефункционализировать во время рецеллюляризации. Сосудистая визуализация может быть использована после децеллюляризации для подтверждения проходимости сосудов.
На сегодняшний день было проведено несколько исследований по децеллюляризации задних конечностей крыс с ограниченными результатами по успеху в каждом из тканевых компартментов 9,11. Репрезентативные результаты в настоящем исследовании показывают влияние децеллюляризации на все тканевые компартменты, присутствующие в задней конечности. Хирургический метод также поддерживает большое количество мышц и кожи, которые могут быть последовательно биопсированы и использованы для дальнейших анализов. Кроме того, этот протокол предполагает менее токсичный подход к децеллюляризации путем использования более низкой концентрации SDS, чем обычно используется в протоколах децеллюляризации для композитных и изолированных тканей12. Предлагаемая система биореактора ex vivo также может быть адаптирована для других тканей и моделей.
В заключение, предлагаемый протокол предлагает надежную и воспроизводимую хирургическую технику и метод децеллюляризации для задних конечностей крыс с использованием машинной перфузионной системы ex vivo . Будущие приложения включают повторное заполнение этого каркаса тканеспецифическими клетками и изучение путей регенерации функциональной способности в тканях, таких как кости, мышцы и нервы. Будущие исследования могут также охарактеризовать внеклеточный матрикс, сохранение нативной сосудистой системы и биохимические свойства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Рисунок 3А был создан в BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
