Summary
Vi beskriver den kirurgiska tekniken och decellulariseringsprocessen för sammansatta råtta bakben. Decellularisering utförs med användning av natriumdodecylsulfat med låg koncentration genom ett ex vivo-maskinperfusionssystem.
Abstract
Patienter med allvarliga traumatiska skador och vävnadsförlust kräver komplex kirurgisk rekonstruktion. Vaskulariserad sammansatt allotransplantation (VCA) är en utvecklande rekonstruktiv väg för överföring av flera vävnader som en sammansatt underenhet. Trots VCA: s lovande karaktär är de långsiktiga immunsuppressiva kraven en signifikant begränsning på grund av den ökade risken för maligniteter, slutorgantoxicitet och opportunistiska infektioner. Vävnadsteknik av acellulära kompositställningar är ett potentiellt alternativ för att minska behovet av immunsuppression. Häri beskrivs upphandlingen av en råtta bakben och dess efterföljande decellularisering med användning av natriumdodecylsulfat (SDS). Den upphandlingsstrategi som presenteras bygger på den gemensamma lårbensartären. Ett maskinperfusionsbaserat bioreaktorsystem konstruerades och användes för ex vivo-decellularisering av bakbenet. Framgångsrik perfusionsdecellularisering utfördes, vilket resulterade i ett vitt genomskinligt utseende av bakbenet. Ett intakt, perfusable, vaskulärt nätverk i hela bakbenet observerades. Histologiska analyser visade avlägsnande av kärninnehåll och bevarande av vävnadsarkitektur i alla vävnadsfack.
Introduction
VCA är ett framväxande alternativ för patienter som behöver komplex kirurgisk rekonstruktion. Traumatiska skador eller tumörresektioner resulterar i volymetrisk vävnadsförlust som kan vara svår att rekonstruera. VCA erbjuder transplantation av flera vävnader som hud, ben, muskler, nerver och kärl som ett sammansatt transplantat från en givare till en mottagare1. Trots sin lovande natur är VCA begränsad på grund av långsiktiga immunsuppressiva regimer. Livslång användning av sådana läkemedel resulterar i ökad risk för opportunistiska infektioner, maligniteter och slutorgantoxicitet 1,2,3. För att minska och/eller eliminera behovet av immunsuppression visar vävnadstekniska byggnadsställningar som använder decellulariseringsmetoder för VCA stort löfte.
Vävnadsdecellularisering innebär att man behåller den extracellulära matrisstrukturen samtidigt som cellulärt och kärninnehåll avlägsnas. Denna decellulariserade byggnadsställning kan återbefolkas med patientspecifika celler4. Att bevara ECM-nätverket av sammansatta vävnader är dock en extra utmaning. Detta beror på närvaron av flera vävnadstyper med varierande vävnadstäthet, arkitekturer och anatomiska platser inom en byggnadsställning. Detta protokoll erbjuder en kirurgisk teknik och en decellulariseringsmetod för en råtta bakben. Detta är en proof-of-concept-modell för att tillämpa denna vävnadsteknikteknik på sammansatta vävnader. Detta kan också leda till efterföljande ansträngningar för att regenerera sammansatta vävnader genom recellularisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cadaveric manliga Lewis råttor (300-430 g) erhållna från Toronto General Hospital Research Institute användes för alla experiment. För alla kirurgiska ingrepp användes sterila instrument och förnödenheter för att upprätthålla aseptisk teknik (se materialförteckningen). Alla procedurer utfördes i enlighet med riktlinjer från djurvårdskommittén vid Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kanada). Totalt fyra bakben decellulariserades.
1. Prekirurgisk beredning
- Förbered 50 ml 5% hepariniserad saltlösning. Från en 50 ml saltlösningspåse, ta ut 2,5 ml saltlösning med en 5 ml spruta och kassera. Använd en 5 ml spruta och tillsätt 2,5 ml heparin till saltlösningspåsen. Vänd saltlösningspåsen för att blanda innehållet.
- Placera en kadaverisk råtta i ryggläge under en blå kudde. Raka bakbenet och ljumskområdet omkrets med en elektrisk rakapparat och ta bort håret.
- Ta råttan till kirurgiska stationen och applicera Povidone jodskrubblösning med en gasbindning till bakbenet och ljumskområdet. Applicera därefter 70% isopropylalkohol för att torka av skrubblösningen med gasbindning.
- Kasta den blå dynan från steg 1.2 och byt till nya, sterila handskar.
2. Tillvaratagande av råttans bakben
- Gör ett hudsnitt med ett kirurgiskt blad #10 och en #3-bladlöpare längs inguinal ligamentnivån, som rör sig från en lateral till en medial riktning (figur 1A). Använd Adson-tångar för att hålla den omgivande huden för att säkerställa ett smidigt snitt.
- När det underliggande fettet exponeras, använd trubbig dissektion för att försiktigt dissekera genom fettet. Leta reda på de överlägsna epigastriska kärlen.
- Använd mikroscissorer för att dissekera proximalt och exponera den underliggande lårbensnerven, artären och venen på inguinal ligamentnivå.
- Under ett dissektionsmikroskop identifierar du lårbenskärlen och dissekerar artären och venen proximalt med hjälp av fina pincett för att erhålla tillräcklig längd från bifurkationspunkterna i artärnätverket (figur 1B).
- Ligate lårbensartären och venen separat med 6-0 suturer.
- Utför omkretsdissektion runt resten av bakbenet utan att störa de ligerade lårbenskärlen.
- Transect lårbensbenet i mitten av längden med hjälp av en benskärare.
- För att helt isolera bakbenet, transektera de ligerade lårbenskärlen under ligaturerna med hjälp av mikroscissorer.
- Kannulatera lårbensartären med hjälp av en 24 G angiokateter under dissektionsmikroskopet. Använd fina pincett för att sätta in kanylen försiktigt. Spola med hepariniserad saltlösning tills tydligt utflöde observeras från lårbenen.
- Säkra kanylen genom att binda en sutur runt det kannulerade kärlet och en annan sutur distalt runt själva kanylen. Se till att kanylen placeras proximalt för att förhindra att bifurkationspunkterna blockeras.
- Sänk ner de anskaffade bakbenen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tills decellularisering.
Figur 1: Upphandling av råttans bakben. (A) Märkning av hudsnitt på ljumskledsnivå från lateral till medial. (B) Vy över lårbensvenen och lårbensartären, som har dissekerats proximalt mot ljumskbandet, indikerat av den streckade linjen. Förkortningar: L = lateral; M = medial; FV = lårbensven; FA = lårbensartär. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Beredning av lösningar
- I en 6 L glaskolv, förbered en 5 L tvättmedelsbehållare med 0,25% natriumdodecylsulfat (SDS) genom att lösa 12,5 g SDS-pulver i 5 liter ultrarent destillerat vatten. Täck kolvens öppning med parafilm för att försegla den.
- I en 1 L glasburk, förbered 1 L 0,25% SDS-lösning separat genom att lösa 2,5 g SDS i 1 liter ultrarent destillerat vatten. Tillsätt en omrörningsstång för att blanda lösningen på en magnetomrörare tills allt SDS är upplöst.
- Förbered 1 liter 1x PBS-tvättlösning med 1% antibiotika-antimykotisk (AA) lösning. Tillsätt 990 ml 1x PBS-lösning och 10 ml AA i en 1 liter kolv.
- Separat, i en 500 ml glasburk, förbered 1x PBS + 1% AA-lösning igen med 495 ml 1x PBS-lösning och 5 ml AA.
- Förbered 200 ml 1% perättiksyra (PAA) / 4% etanol (EtOH) lösning. Förbered denna lösning under en rökhuv.
4. Bioreaktor- och perfusionskretskonstruktion
OBS: Se figur 2 för konfigurationen av bioreaktorn och perfusionskretsen i de listade stegen.
- I en 500 ml kammare (plastbehållare), borra tre hål (1/4 tum) på de märkta platserna i figur 2: Port A är inloppslinjen, port B är påfyllningslinjen och port C är utloppslinjen. Ta bort och kassera överflödig plast. Spraya och torka av kammaren med 70% etanol.
- Skär tre 5 cm långa silikonrör och sätt in ett halvvägs i varje port i kammaren. Anslut en Luer-kontakt på hankontakten på öppningen av port A som vetter mot kammarens insida och en Luer-honkontakt i den andra änden av röret utanför kammaren.
- Anslut en kvinnlig Luer-kontakt vid port B och port C på ändarna av rören som vetter ut ur kammaren.
- Borra ett hål på lockets yta i ett lufttätt lock för plastbehållaren.
- Skär ett 3 cm silikonrör och sätt in det i lockets hål. Se till att cirka 2 cm av röret är placerat ur locket, som visas i figur 2.
- Sterilisera både kammaren och locket med slangen.
- Skär två 30 cm silikonrör med sax. Anslut en 1/16 tum till en 1/8-tums kontakt i ena änden av varje rör.
- Skär separat två 12 cm silikonrör med sax. Anslut en 1/16 in till en 1/8 tum kontakt i ena änden av båda rören. Anslut en manlig Luer-kontakt i den andra änden av ett rör och en kvinnlig Luer-kontakt till det andra röret.
- Sterilisera allt slangmaterial från steg 4.7 och steg 4.8. Inkludera två 3-stopps pumpslangar (1,85 mm) i steriliseringen.
- Förbered tre 3-vägs stoppkranar, ett sprutfilter, två 1 ml serologiska pipetter och en 10 ml spruta för decellulariseringsinställningen. Ta bort filtret från de 1 ml serologiska pipetterna.
Figur 2: Beredning av bioreaktor- och perfusionskretskonstruktion. Utrustning som visas för perfusionskretsen inklusive (A) peristaltisk pump och (B) motsvarande kassetter för både inlopps- och utloppsledningar. (C, D) Silikonslangar på 12 cm och 30 cm visas också med respektive kontakter. E) Slangar för peristaltisk pump (1,85 mm). Bioreaktorkammare med märkta portar för (F) inflöde, (G) påfyllningsport och (H) utflöde. (I) Bioreaktorlock visas med ventilationsport. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Decellularisering av råtta bakben
- Placera den steriliserade kammaren och skruva på tre 3-vägs stoppkranar för engångsbruk vid inlopps-, utlopps- och påfyllningslinjerna. Se till att stoppkranen för påfyllningsporten är begränsad vid de återstående två portarna för att förhindra läckage.
- Fäst rören i steg 4.8 på stoppkranarna vid inlopps- och utloppsledningarna.
- Anslut peristaltisk slang till rören i steget ovan. Säkra kassetten på den peristaltiska slangen och placera den på den peristaltiska pumpen. Säkra inte kassetterna med slangen på plats ännu.
- Anslut ett rör från steg 4.7 till slutet av utloppsledningens peristaltiska slang från steget ovan. Anslut en 1 ml serologisk pipett i andra änden. Häng upp änden fäst med en serologisk pipett i avfallsbehållarens kolv.
- Upprepa steg 4.7 för inloppslinjen. Häng upp änden av röret som är fäst vid den serologiska pipetten i tvättmedelsbehållaren. Försegla tvättmedelsbehållarens öppning med parafilm omedelbart. Se figur 3A,B för en översikt över decellulariseringskretsen.
- Tillsätt 0,25% SDS från 1 L glasburk (steg 3.2) i bioreaktorkammaren på halvvägsnivå.
- Ta den anskaffade bakbenet med Adson-pincett och häng upp det försiktigt i bioreaktorkammaren.
- Använd två par Adson-tångar för att styra den kannulerade delen av bakbenet till inloppslinjen. Medan du håller kanylen med ett par pincett, använd det andra tångparet för att vrida och säkra inloppslinjen till kanylen. Se till att kanylen inte dras eller vrids för att förhindra dekumulering.
- När du är säkrad, lägg till mer 0,25% SDS från 1 L glasburken för att helt sänka lemmen efter behov. Se till att utloppsporten också är nedsänkt i bioreaktorbehållaren för att säkerställa att konsekvent utflöde bibehålls (figur 3C).
- Fäst ett sprutfilter för engångsbruk på ventilationsporten på locket till bioreaktorkammaren, med hänvisning till steg 4.4 och steg 4.5.
- Säkra locket på bioreaktorn och se till att kammaren är förseglad från alla sidor (figur 3B).
- För att avlägsna luft från slangen och primera perfusionskretsen, använd en ny 10 ml spruta för engångsbruk för att dra tvättmedel från tvättmedelsbehållaren med hjälp av 3-vägs stoppkranen vid inloppslinjen.
- När du har dragit, använd samma vätska för att sätta in i 3-vägs stoppkranen vid utloppslinjen. Se till att det finns tvättmedel i hela slangen vid både inlopps- och utloppsledningarna.
- Tryck ner och säkra kassetterna med slangen i den peristaltiska pumpen. Slå på den peristaltiska pumpen med strömbrytaren.
- På den peristaltiska pumpskärmen fortsätter du till den andra fliken med piltangenten för att ställa in perfusionshastigheten för den första kanalen. Inmatningsflöde som leveranssätt och ställ in perfusionshastigheten på 1 ml/min. Se till att flödesriktningen är korrekt enligt apparatens inställning. Upprepa för den andra kanalen.
- Kalibrera den peristaltiska pumpen för att säkerställa att mängden vätska som tillförs genom inloppsledningen och/eller tas från utloppsledningen flyter med en jämn hastighet mellan de två. Se till att slang-ID är inställt på 1,85 mm.
- Börja decellularisering via maskinperfusion vid 1 ml / min för både inlopps- och utloppsledningarna genom att trycka på strömbrytaren på knappsatsen. Övervaka och se till att flödet är konsekvent och pågående vid både inlopps- och utloppsledningarna.
- Fortsätt decellularisering och övervaka dagligen. Använd 1 L på 0,25% SDS (steg 3.2) för att fylla på bioreaktorbehållaren genom påfyllningsporten, efter behov. Leta efter ett vitt, genomskinligt utseende av vävnaden, som kommer att visas vid dag 5, vilket indikerar decellularisering av råttans bakben.
Figur 3: Översikt över perfusionsdecellulariseringsbioreaktorkretsen hos råttans bakben . (A) Schematisk representation av bioreaktorperfusionskrets. Blå pilar anger riktningen för tvättmedel och avfallsflöde. (B) Översikt över decellulariseringskretsen med bioreaktor som innehåller råtta bakben. SDS-behållaren (vänster kolv) leder in i den peristaltiska pumpen och in i bioreaktorns inloppsslang. Utflödet är anslutet till avfallsbehållaren (höger kolv) genom den peristaltiska pumpen. C) (I) Bioreaktor som innehåller råttans bakben med inloppsslangar anslutna till den kannulerade lårbensartären. (II) Påfyllningsport i hörnet för perfusing tvättmedel. III) Utflödesslangar upphängda i upphängningsbehållaren. Förkortning: SDS = natriumdodecylsulfat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Tvätt och sterilisering efter decellularisering
- Efter bekräftelse av decellularisering, byt ut tvättmedelsbehållaren med 1x PBS + 1% AA-behållaren. Försegla kolvens öppning med parafilm. Börja 1x PBS + 1% AA perfusion vid 1 ml / min och fortsätt i 2 dagar.
- Byt ut 1x PBS + 1% AA-behållaren med 200 ml 0,1% PAA / 4% EtOH-reservoar och börja perfusion vid 1 ml / min i 2 timmar.
- Koppla bort bakbenet från inloppslinjen med två par sterila Adson-pincett, med ett par pincett för att vrida inloppslinjen och den andra som håller kanylen. Se till att kanylen inte dras för att förhindra decannulation.
- Förvara lemmen i en 500 ml glasburk som innehåller 1x PBS + 1% AA vid 4 °C tills vidare användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Upphandlingsprotokollet lyckades isolera och kannulera de gemensamma lårbensartärerna för efterföljande perfusionssteg. De representativa dissektionsbilderna i figur 1A,B visar snittets placering och exponering av lårbenskärlen med tillräckligt avstånd från bifurkationspunkterna. Figur 2 visar den apparat som krävs för att förbereda bioreaktorn och perfusionskretsen. Slutpunkten för decellularisering bestämdes genom att observera ett vitt, genomskinligt utseende av vävnaden. Ex vivo-maskinens perfusionssystem var framgångsrikt i perfusionsdecellulariseringen av råttans bakben. En krets med ett enda pass och slutet system upprätthölls (figur 3). Den ursprungliga bakbenets bruttomorfologi förändrades till ett vitt, blekt utseende efter 5 dagar med 0,25% SDS-perfusion (figur 4).
Avlägsnandet av cellulärt innehåll observerades vid färgning med hematoxylin och eosin (H&E) i lårbenskärlen, huden, nerven, benet och muskeln där inga kärnor hittades. Strukturerna för varje vävnadsstruktur analyserades i förhållande till naturlig vävnad. Både decellulariserad lårbensartär och ven visade förlust av kärninnehåll över alla lager och omgivande bindväv, med tanke på bristen på blåfärgade kärnor, som annars finns i de inhemska kärlen (figur 5A, B och figur 5D, E). Tunica intima, media och adventitia i både lårbensvenen och artärerna upprätthölls i de decellulariserade kärlen (figur 5D,E). Lårbensnerven visade bevarande av vävnadsstrukturen, inklusive endoneurium (figur 5C och figur 5F). Benet behöll sin övergripande vävnadsstruktur efter decellularisering, med en observerbar förlust av färgade kärnor av osteocyter från benet och från omgivande endosteum- och periosteumskikt (figur 5G och figur 5J). Huden visade en förlust av celler från epidermis och dermis. Dermis visade kvarhållna kollagenfibrer, liknande inhemsk hudvävnad (figur 5H och figur 5K). Slutligen visade den tvärgående vyn av skelettmuskeln förlust av kärnor som annars ligger i endomysiumets periferier. Myofiberhalten förblev kvar inom respektive fasciklar efter decellularisering (figur 5I och figur 5L). DNA-kvantifiering med Picogreen utfördes också, där DNA-halten reducerades signifikant över lårbenskärlen, nerven, huden, muskeln och benet (figur 6).
Figur 4: Bruttomorfologi hos inhemska och decellulariserade råttbakben. (A) Lårbensartär hos den ursprungliga bakbenet kannulerad med en 24 G angiokateter efter tillvaratagande. (B) Vitt, genomskinligt utseende av bakbenet efter 5 dagars decellularisering med 0,25% SDS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Histologisk färgning av råtta bakbensvävnader med hematoxylin och eosin. H&E-färgad infödd (övre panel) och decellulariserad (bottenpanel) (A, D) lårbensven och (B, E) artär, (C, F) nerv, (G, J) ben, (H, K) hud och (I, L) muskel. Förlust av kärnor och cellulärt innehåll synligt i alla decellulariserade prover. Skalstänger = 200 μm (kärl, nerv, ben) och 300 μm (hud, muskel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: DNA-kvantifiering av inhemska och decellulariserade råtta bakbensvävnader. DNA-halten reduceras över inhemska och decellulariserade kärl, nerv, muskler, hud och ben, uttryckt i ng/mg torrvikt. Vävnader torkades och smältes i papain över natten vid 65 °C. DNA detekterades fluorescerande med PicoGreen. Flera oparade t-tester utfördes. Data presenteras som medelvärde ± SD. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Förkortningar: N = infödd; D = decellularized. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Råtta bakben är användbara som experimentella modeller i VCA5. Vävnadsteknik av acellulära byggnadsställningar representerar det första steget i att ta itu med bristerna i långsiktiga immunsuppressionsregimer associerade med VCA. Användningen av komposittransplantat utgör en extra utmaning med tanke på närvaron av flera vävnader, var och en med unika funktionella, immunogena och strukturella egenskaper. Detta protokoll visar en framgångsrik metod för att erhålla acellulära sammansatta råtta bakben. Dessa ställningar kan recellulariseras ytterligare och representerar en proof-of-concept-modell för VCA.
För att säkerställa framgångsrik upphandling och decellularisering finns det olika kritiska steg i de kirurgiska och decellulariseringsfaserna. För att säkerställa systemisk fördelning av tvättmedlet och sterillösningen genom den ursprungliga vaskulaturen innefattar de kritiska stegen ligering av de epigastriska kärlen, samt att erhålla tillräckligt avstånd från bifurkationspunkterna i det arteriovenösa nätverket före ligeringen av lårbenskärlen. Det beskrivna steriliseringsförfarandet hjälper till att minska biobelastningen för recellulariseringsexperiment där en steril miljö krävs för cellfästning, överlevnad och tillväxt6.
Vi presenterar också ett perfusionsbioreaktorsystem som utformades för att implementera decellularisering. Kritiska komponenter inkluderar förmågan till kontinuerlig perfusion med hjälp av en peristaltisk pump och möjliggör enkelpassperfusion av tvättmedlet och sterilt medel genom den kannulerade artären. Den peristaltiska pumpen var också inställd på ett pulserande flöde, liknande fysiologiska förhållanden. Slutligen inkluderades en påfyllningsport för att fylla på upphängningsbehållaren i bioreaktorn utan att utsätta bakbenet för den yttre miljön. Detta bioreaktorsystem är därför fördelaktigt eftersom det kan decellularisera och sterilisera en råtta bakben ex vivo på ett slutet system, enkelpass-sätt. Komponenterna i kretsen är autoklaverbara och kan steriliseras före varje decellulariseringscykel. Med tanke på densiteten och relativt stor närvaro av muskler i bakbenet införlivades både tvättmedelsperfusion och nedsänkningsmetoder i utformningen av denna ex vivo-krets för att hjälpa till att komma åt och decellularisera muskeln.
Även om bioreaktorkammaren och decellulariseringskretsen var noggrant utformade och skräddarsydda för råttans bakben, har den en reproducerbar design som kan modifieras vid anpassning av detta protokoll för andra vävnader. Ytterligare modifieringar kan inkludera införlivande av en bubbelfälla i perfusionskretsen för att säkerställa att flödeshastigheten inte störs på grund av luftbubblor 7,8. Vidare införlivade vi inte ett tryckövervakningssystem för att övervaka perfusionstrycket under hela decellulariseringen. Det är möjligt för perfusionstryck att fluktuera på grund av intraluminalt cellulärt skräp. rapporterade tillfälligt fluktuationer i perfusionstrycket under SDS-perfusion i ett tillvägagångssätt för att generera vaskulär chimerism i råttans bakben, med hjälp av en liknande målflödeshastighet på 1-2 ml / min. Perfusionstrycket stabiliserades efter behandling för potentiella träskor9. För framtida perfusionssystemdesignändringar för det nuvarande protokollet kan införlivandet av en tryckmonitor vara informativ om alla intraluminala ocklusioner och indikera behovet av behandling för att förhindra skador på kärlen.
I denna modell observerades utflödet under och efter decellularisering. För att säkerställa ställningarnas livskraft och funktionalitet krävs vaskulär patency för tillförsel av syre och näringsämnen till olika vävnader i ett sammansatt transplantat10. Med potentialen för detta decellulariseringsprotokoll som utvidgas till ytterligare recellulariseringsstudier är observationen av utflödet kritisk så att det decellulariserade vaskulära trädet kan återbefolkas och refunctionaliseras under recellularisering. Vaskulär avbildning kan användas efter decellularisering för att bekräfta vaskulär patency.
Hittills har få studier utförts på decellularisering av råttans bakben, med begränsade resultat på framgången över vart och ett av vävnadsfacken 9,11. De representativa resultaten i den aktuella studien visar effekten av decellularisering över alla vävnadsfack som finns i bakbenet. Den kirurgiska metoden upprätthåller också stora mängder muskler och hud som kan seriebiopsieras och användas för vidare analyser. Dessutom föreslår detta protokoll en mindre giftig decellulariseringsmetod genom att använda en lägre SDS-koncentration än vad som vanligtvis används i decellulariseringsprotokoll för sammansatta och isolerade vävnader12. Det föreslagna ex vivo-bioreaktorsystemet kan också anpassas för andra vävnader och modeller.
Sammanfattningsvis erbjuder det föreslagna protokollet en pålitlig och reproducerbar kirurgisk teknik och decellulariseringsmetod för råtta bakben med hjälp av ett ex vivo-maskinperfusionssystem. Framtida tillämpningar inkluderar att återbefolka denna byggnadsställning med vävnadsspecifika celler och undersöka vägar för att regenerera funktionell kapacitet i vävnader som ben, muskler och nerv. Framtida studier kan också karakterisera den extracellulära matrisen, kvarhållandet av den ursprungliga vaskulaturen och biokemiska egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Figur 3A skapades i BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
