Summary
في هذا العمل ، تم تطوير طريقة كشف سريعة وحساسة ومحمولة ل Candidatus Liberibacter asiaticus على أساس تضخيم بوليميراز recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a.
Abstract
يسهل الكشف المبكر عن Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) من قبل مزارعي الحمضيات التدخل المبكر ويمنع انتشار المرض. يتم تقديم طريقة بسيطة لتشخيص Huanglongbing (HLB) السريع والمحمول هنا والتي تجمع بين تضخيم بوليميراز recombinase ومراسل الفلورسنت باستخدام نشاط النيوكلياز لنظام التكرارات القصيرة المتباعدة بانتظام / 12a المرتبط ب CRISPR (CRISPR-Cas12a). حساسية هذه التقنية أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه الطريقة نتائج مماثلة ل qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas التقليدية ، يمكن إكمال طريقة الكشف المعروضة هنا في 90 دقيقة وتعمل في حالة متساوية الحرارة لا تتطلب استخدام أجهزة PCR. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور النتائج من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان.
Introduction
Huanglongbing (HLB) هي واحدة من أكثر أمراض الحمضيات إشكالية في جميع أنحاء العالم1. يحدث HLB بسبب البكتيريا المستعمرة لللحاء والحساسية Candidatus Liberibacter spp. ، بما في ذلك Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) و Ca. L. africanus و Ca. L. americanus2. أكثر الأنواع المرتبطة ب HLB انتشارا في الصين والولايات المتحدة الأمريكية هي CLas ، والتي تنتقل عن طريق سيلليدات الحمضيات الآسيوية (Diaphorina citri) أو من خلال التطعيم3. بعد الإصابة ب CLas ، تظهر أشجار الحمضيات انخفاضا في النمو حتى الموت2. الأعراض الشائعة لأوراق الحمضيات المصابة ب CLas هي بقع مرقطة ، وجزر خضراء (نقاط خضراء داكنة دائرية صغيرة) ، وعروق فلينية مرتفعة على أوراق سميكة وجلدية ، وبراعم اصفرار غير منتظمة2. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الثمار المصابة ب CLas صغيرة وغير متوازنة2.
نظرا لعدم وجود نوع من الحمضيات مقاوم ل HLB ولا يوجد علاج علاجي ل HLB ، فإن الوقاية من HLB تتطلب الحجر الصحي وعزل أشجار الحمضيات الإيجابيةCLas 2,3. لذلك ، يعد الاكتشاف المبكر أمرا بالغ الأهمية للمراقبة والحجر الصحي لمنع انتشار CLas وتقليل الخسائر الاقتصادية3. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى اكتشاف CLas الحساس بسبب انخفاض عيار CLas في النباتات خلال المرحلة المبكرة من العدوى3. في الصين ، عادة ما يتم إجراء اكتشاف CLas بواسطة بعض مراكز الاختبار المعتمدة. ومع ذلك ، فإن عملية الكشف عادة ما تستغرق ما لا يقل عن 1 أسبوع ، ورسوم الكشف باهظة الثمن. لذلك ، للمساعدة في مراقبة حدوث HLB
تم تطبيق تقنيات مختلفة لتشخيص HLB4،5،6،7،8،9. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) و PCR الكمي (qPCR) هما الأداتان الأكثر استخداما للكشف عن CLas نظرا لحساسيتهما العالية ونوعيتهما 4,5. غير أن هذه التكنولوجيات تعتمد اعتمادا كبيرا على أدوات باهظة الثمن وموظفين ذوي مهارات عالية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير العديد من طرق التضخيم متساوي الحرارة ، مثل التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) ، كبدائل جذابة لطرق تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية نظرا لبساطتها وسرعتها وتكلفتها المنخفضة8،9،10. ومع ذلك ، من الصعب تطبيقها للكشف بدقة عن CLas بسبب إشارات التضخيم غير المحددة ، والتي قد تسبب نتائج إيجابية خاطئة.
تم تطوير الكشف عن الحمض النووي النووي القائم على نوكلياز الداخلية الموجه بالحمض النووي الريبي (مجمعة بشكل منتظم بين التكرارات القصيرة المتباعدة / المرتبطة بكريسبر) كتقنية تشخيص جزيئي من الجيل التالي نظرا لحساسيتها العالية وخصوصيتها وموثوقيتها11،12،13،14. تعتمد تقنيات تشخيص CRISPR / Cas هذه على نشاط النيوكلياز الجانبي لبروتينات Cas لشق الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) المعدل باستخدام مراسل فلوري ومطفأ مضان في كل طرف من أطراف قليل النيوكليوتيدات ، بالإضافة إلى جهاز الكشف عن التألق لالتقاط المراسل الفلوري الذي تم إصداره11,12 . يمكن أن يؤدي نشاط النيوكلياز للعديد من مستجيبات Cas التي يتم تنشيطها بواسطة الازدواج المستهدف CRISPR RNA (crRNA) إلى شق ssDNA11 المحيط غير المستهدف بشكل عشوائي. يوضح CRISPR-Cas12a (ويسمى أيضا Cpf 1) ، وهو نظام V-A CRISPR / CAS من الفئة 2 ، العديد من المزايا مقارنة ب Cas9 ، مثل انخفاض تحمل عدم التطابق وخصوصية أكبر13. تم تطبيق نظام Cas12a / crRNA للكشف الحساس والمحدد للأحماض النووية لمسببات الأمراض البشرية ومسببات الأمراض النباتية14،15،16،17،18. لذلك ، فإن استخدام نظام Cas12a / crRNA يجب أن يتيح الكشف الدقيق والحساس للحمض النووي ل CLas.
Cas12a وحده ليس حساسا من الناحية النظرية بما يكفي للكشف عن مستويات منخفضة من الأحماض النووية. لذلك ، لتحسين حساسية الكشف ، يتم عادة دمج اكتشاف CRISPR-Cas12a مع خطوة تضخيم متساوي الحرارة14,15. يتيح تضخيم البوليميراز المعاد تجميعه (RPA) تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة الحساس والسريع في نطاق درجة حرارة من 37 درجة مئوية إلى 42 درجة مئوية19.
تم مؤخرا ابتكار منصة كشف تسمى DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) التي تجمع بين نشاط DNase ل Cas12a و RPA وقراءة مضان12 وقد ثبت أنها تكتشف الحمض النووي بحساسية أعلى20. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة إشارة التألق المنبعثة من العينات الإيجابية من خلال جهاز كشف مضان محمول باليد في الميدان.
نظرا لأننا قمنا بتضخيم الحمض النووي باستخدام RPA ، وصممنا crRNA الذي يستهدف الجين المكون من خمس نسخ nrdB (اختزال الريبونوكليوتيد β الوحدة الفرعية) الخاص ب CLas21 ، واستخدمنا نشاط DNase لبروتين Cas12a ، أطلقنا على طريقة الكشف عن CLas هذه CLas-DETECTR. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas الحالية ، فإن CLas-DETECTR سريع ودقيق وحساس وقابل للنشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بناء كاشف CLas
ملاحظة: بناء CLas-DETECTR هو عملية من أربع خطوات: تحضير المحلول ، وعزل الحمض النووي الكلي للحمضيات ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، وتصور النتائج. يوضح الشكل 1 أ الرسم التخطيطي لمقايسة CLas-DETECTR.
- إعداد الحل
- تحضير المخزن المؤقت A: 20 mM NaOH في 6٪ PEG 200. للحصول على 100 مل ، أضف 113 مجم من هيدروكسيد الصوديوم و 6 جم من PEG 200 إلى 80 مل من H2O في زجاجة. احتضان الزجاجة في حمام مائي على حرارة 60 درجة مئوية حتى يذوب كل PEG 200. ثم أضف H2O إلى حجم 100 مل.
- تحضير الحل B: لكل تفاعل ، أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت RPA ، و 0.8 ميكرولتر من F-RPA-RNRf ، و 0.8 ميكرولتر من R-RPA-RNRr ، و 3.9 ميكرولتر من ddH2O إلى الحجم النهائي 15.5 ميكرولتر.
ملاحظة: F-RPA-RNRf و R-RPA-RNRr هي البادئات المستخدمة في الفحص ضد جين NRDB . انظر الجدول 1 للاطلاع على التسلسل. - تحضير المحلول C: لكل تفاعل ، أضف 1 ميكرولتر من مراسل ssDNA ، و 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت NEB 3.1 ، و 1 ميكرولتر من crRNA ، و 4 ميكرولتر من Cas12a ، و 11 ميكرولتر من ddH2O إلى الحجم النهائي 20 ميكرولتر.
ملاحظة: إذا كان هناك العديد من العينات التي يجب اكتشافها ، فقم بعمل كمية كبيرة من المحلول B والمحلول C ، واحصل على القسمة لاحقا.
- عزل الحمض النووي الكلي للحمضيات
ملاحظة: لتوفير الوقت وجعل هذه الطريقة مناسبة للكشف عن CLas الميداني ، تم استخدام النهج القائم على البولي إيثيلين جلايكول القلوي (PEG) للحصول على مستخلصات نباتية خام لتضخيم الحمض النووي22,23- تم استخدام أوراق الحمضيات في هذا البروتوكول. أولا ، لكمة خمسة أقراص ورقة من ورقة. بعد ذلك ، ضع أقراص الأوراق في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.
ملاحظة: في الحقل ، نظف الأوراق أولا إذا كان هناك غبار يغطيها. يمكن قص أقراص الأوراق باستخدام غطاء الأنبوب سعة 1.5 مل لتجنب التلوث المتبادل. يمكن أيضا استخدام أنسجة الحمضيات الأخرى ، مثل الجذور والسيقان والفواكه والزهور ، في هذا البروتوكول. - قم بطحن أقراص الأوراق يدويا حتى تصبح ناعمة بقضيب بلاستيكي.
- اترك الأنبوب دون إزعاج لمدة 10 دقائق. ثم استخدم المادة الطافية لتضخيم الحمض النووي.
ملاحظة: يمكن إيقاف الفحص مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين المستخلصات النباتية الخام التي تم استخراجها بواسطة طريقة PEG القلوية عند -20 درجة مئوية لمدة 1 سنة على الأقل. نمت أشجار البرتقال الحلو في نيوهول (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) الموضحة في الفيديو في وعاء مملوء بمزيج من 9/3/1 (v / v / v) تربة الخث / الفيرميكوليت / البيرلايت وتم الاحتفاظ بها في بيت زجاجي يقع في حرم جامعة Gannan Normal ، جيانغشي ، الصين. تم تلقيح الأشجار المصابة ب HLB عن طريق التطعيم ببراعم نيوهول الإيجابية CLas. تم تأكيد الأشجار المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم اكتشاف CLas باستخدام زوج التمهيدي (F-RPA-RNRf / R-RPA-RNRr) الذي يستهدف جين العلامة الخاص ب CLas nrdB. على الجانب الآخر ، يمكن العثور على أعراض HLB المميزة ، وتبقع البقع ، والأوراق الصفراء على CLas-positive ولكن ليس على الأشجار السلبية CLas.
- تم استخدام أوراق الحمضيات في هذا البروتوكول. أولا ، لكمة خمسة أقراص ورقة من ورقة. بعد ذلك ، ضع أقراص الأوراق في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.
- تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة
- أضف 1 ميكرولتر من المادة الطافية من الخطوة 1.2.3 و 1 ميكرولتر من MgOAc (تركيز نهائي 14 mM) إلى المحلول B واخلطه جيدا.
- في المختبر ، احتضنها في حاضنة بسيطة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: في الميدان ، أمسك الأنابيب في متناول اليد لمدة 15 دقيقة. يقترح أيضا احتضان الأنابيب في حاضنة بسيطة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إذا سمحت الظروف بذلك.
- تصور النتائج
- أضف 10 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 1.3.2 إلى المحلول C واخلطه جيدا.
- احتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- ارتد نظارات واقية وراقب إشارة التألق الخضراء الصادرة من مراسل ssDNA المسمى 5' 6-Fluorescein عند 5' ومخمد التألق عند 3 'من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد (الطول الموجي للإثارة: 440 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 500 نانومتر).
ملاحظة: يمكن أن تستمر إشارة التألق الخضراء عدة أيام ، فمن الأفضل
تنبيه: الضوء المنبعث من جهاز الكشف عن التألق ضار بالعينين. تأكد من ارتداء نظارات واقية قبل مراقبة النتائج.
2. اختبار الخصوصية
ملاحظة: لاختبار خصوصية CLas-DETECTR ، خضعت بكتيريا الجذور Agrobacterium tumefaciens GV3101 و Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) وسلالة Burkholderia stabilis 1440 المعزولة في المختبر24 لاختبار CLas-DETECTR.
ملاحظة: المبيضات ليبيريباكتر (CLas) لا يمكن استزراعها. يمكن للمرء فقط الحصول على الحمض النووي CLas من استخراج الحمض النووي الجينومي من أنسجة الحمضيات المصابة ب CLas. Xcc هو العامل المسبب لمرض حمضيات مهم آخر ، تقرح الحمضيات. سلالة Burkholderia stabilis 1440 هي بكتيريا مضادة ل Xcc معزولة في المختبر. لذلك ، تم استخدام سلالات نقية لجميع هذه البكتيريا الثلاثة
- استخرج الحمض النووي الجينومي البكتيري (gDNA) باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. استخدم الماء كعنصر تحكم سلبي.
- قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام شرائط أنبوب PCR سعة 0.2 مل مع أغطية بصرية في خليط تفاعل 25 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكرولتر من F-RPA-RNRf ، و 1 ميكرولتر من R-RPA-RNRr ، و 12.5 ميكرولتر من Ex Taq الإصدار 2.0 بالإضافة إلى الصبغة ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 9.5 ميكرولتر من H2O.
- استخدم ظروف تفاعل الدورة الحرارية التالية: 1 دقيقة عند 98 درجة مئوية ؛ تليها 35 دورة من 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 55 درجة مئوية ، 15 ثانية عند 72 درجة مئوية ؛ ثم 10 دقائق عند 72 درجة مئوية ؛ وعقد عند 16 درجة مئوية.
- قم بتشغيل منتجات PCR على 1٪ هلام الأغاروز عند 120 فولت لمدة 15 دقيقة.
- قم بإجراء qPCR في خليط تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 0.8 ميكرولتر من F-RPA-RNRf ، و 0.8 ميكرولتر من R-RPA-RNRr ، و 10 ميكرولتر من 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 7.4 ميكرولتر من H2O.
- استخدم ظروف تفاعل الدورة الحرارية التالية: 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ؛ تليها 45 دورة من 5 ثوان عند 95 درجة مئوية و 32 ثانية عند 60 درجة مئوية ؛ ثم مرحلة منحنى الذوبان 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية ، و 15 ثانية عند 95 درجة مئوية.
- قم بتضمين ثلاثة تكرارات فنية في كل تكرار.
- قم بتنفيذ طريقة CLas-DETECTR باتباع الخطوات 1.1-1.4.
3. مقارنة الحساسية
- لاختبار حساسية كاشف CLas ، اكتشف سلسلة من تخفيفات شظايا الحمض النووي CLas باستخدام PCR و CLas-DETECTR و qPCR ، كما هو موضح أعلاه.
- تضخيم مقطع الحمض النووي بطول 1060 نقطة أساس من nrdB باستخدام مجموعة التمهيدي F-RNR و R-RNR في خليط تفاعل 100 ميكرولتر يحتوي على 4 ميكرولتر من F-RNR ، و 4 ميكرولتر من R-RNR ، و 50 ميكرولتر من PrimeSTAR Max Premix ، و 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 40 ميكرولتر من H2O ، وفقا لظروف تفاعل الدورة الحرارية (30 ثانية عند 98 درجة مئوية ؛ تليها 35 دورة من 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، 15 ثانية عند 55 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 72 درجة مئوية ؛ ثم 10 دقائق عند 72 درجة مئوية ؛ وعقد عند 16 درجة مئوية).
ملاحظة: الجين nrdB (اختزال الريبونوكليوتيد β- وحدة فرعية) خاص ب CLas21. يمكن للمرء بسهولة الحصول على أمبليكون nrdB من الحمض النووي للحمضيات الموجبة CLas باستخدام مجموعة التمهيدي F-RNR و R-RNR. تعمل مجموعة التمهيدي F-RNR و R-RNR على تضخيم جزء nrdB بمقدار 1,060 نقطة أساس ، بينما تعمل مجموعة التمهيدي F-RPA-RNR و R-RPA-RNR على تضخيم جزء 104 bp من جين nrdB ، وهو جزء من جزء nrdB 1,060 bp. - قم بتنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي باتباع دليل الشركة المصنعة.
- تمييع منتجات PCR التي تحتوي على أمبليكون nrdB مع ddH2O المعقم.
- احسب رقم نسخة جين nrdB باستخدام رقم نسخة الحمض النووي المتاح تجاريا عبر الإنترنت وحاسبة التخفيف.
- تحضير تخفيفات الحمض النووي التي تحتوي على 2.01 × 106 نسخ / ميكرولتر ، 2.01 × 105 نسخ / ميكرولتر ، 2.01 × 104 نسخ / ميكرولتر ، 2.01 × 103 نسخ / ميكرولتر ، 2.01 × 10نسختان / ميكرولتر ، 2.01 × 101 نسخة / ميكرولتر ، 2.01 × 100 نسخة / ميكرولتر ، و 2.01 × 10−1 نسخة / ميكرولتر من شظية الحمض النووي CLas.
4. الكشف عن العينة
ملاحظة: بعد اختبار الخصوصية والحساسية ، تم استخدام طريقة CLas-DETECTR للكشف عن وجود CLas في عينات أوراق الحقل التي تم جمعها من أشجار البرتقال الحلو في نيوهول المزروعة في مشتل موارد الأصول الوراثية في حرم جامعة Gannan Normal ، Jiangxi ، الصين. تم إجراء qPCR للتحقق من النتائج.
- اختبر ما مجموعه 15 شجرة. استخدم الماء كعنصر تحكم سلبي.
- قم بتنفيذ طرق CLas-DETECTR و qPCR كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: نظرا لخصائص التوزيع غير المتكافئ ل CLas في الحمضيات ، تم جمع الأوراق التي تظهر أعراض HLB كأولوية. إذا بدت الشجرة صحية ، تم جمع الأوراق بشكل عشوائييعمل نظام CLas-DETECTR بشكل صحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، وصفنا منصة محمولة ، CLas-DETECTR ، تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a لتشخيص HLB في الميدان. مخطط CLas-DETECTR موضح في الشكل 1A.
عندما خضعت عينات الأوراق من أشجار نيوهول المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB (الشكل 1B) ، والتي تم تأكيد وجود CLas لها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 1C) ، لاختبار CLas-DETECTR ، شوهدت إشارة مضان خضراء في العينة المصابة ب HLB ولكن ليس في العينة غير المصابة ب HLB والتحكم السلبي (الشكل 1D).
حددنا خصوصية CLas-DETECTR باستخدام الأحماض النووية المستخرجة من البكتيريا الأخرى. تم استخدام مجموعة التمهيدي من F-RPA-RNRf و R-RPA-RNRr المستخدمة في مقايسة CLas-DETECTR أيضا في PCR و qPCR. يمكن رؤية شريط في الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز عند تضخيمه باستخدام gDNA لأوراق الحمضيات الموجبة CLas ولكن ليس gDNA البكتيرية الأخرى في فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 2 أ). في مقايسات qPCR ، كان متوسط قيمة دورة العتبة (Ct) ل CLas 24 ± 0.7 ، في حين أن متوسط قيم Ct لسلالة A. tumefaciens GV3101 و Xcc و B. stabilis 1440 كانت 38 ± 0.7 و 39 ± 1.4 و 39 ± 0.7 على التوالي (الشكل 2B). عادة ، تعتبر النتيجة سلبية عندما تكون قيمة Ct أعلى من 38. توضح هذه النتائج أن زوج التمهيدي F-RPA-RNRf و R-RPA-RNRr خاص ب CLas. في مقايسة CLas-DETECTR ، أظهر CLas gDNA فقط إشارات مضان خضراء. لم يفعل gDNA المستخرج من سلالة A. tumefaciens GV3101 و Xcc و B. stabilis 1440 (الشكل 2C) ، مما يعني أن CLas-DETECTR يمكنه اكتشاف CLas على وجه التحديد.
اختبرنا أيضا حساسية CLas-DETECTR باستخدام سلسلة من تخفيفات الحمض النووي CLas. يمكن أن يكتشف تفاعل البوليميراز المتسلسل 2.01 × 102 نسخة / ميكرولتر (الشكل 3 أ). من ناحية أخرى ، يمكن ل CLas-DETECTR اكتشاف 2.01 × 100 نسخة / ميكرولتر ، مما يشير إلى أن هذا قابل للتطبيق كتشخيص ميداني حساس (الشكل 3B). يمكن أن يكتشف qPCR 2.01 × 10−1 نسخة / ميكرولتر ، لكن قيمة Ct كانت أعلى من 36 (الشكل 3C). لذلك ، فإن CLas-DETECTR هو أمران من حيث الحجم أكثر حساسية من PCR التقليدي وترتيب واحد من حيث الحجم أقل حساسية من qPCR عند استخدام الأمبليكونات المخففة (الشكل 3).
أخيرا ، درسنا جدوى CLas-DETECTR للعينات الميدانية وقارنا حساسيته مع qPCR ، وهو نهج راسخ وحساس للكشف عن الحمض النووي21. عادة ، تعني قيمة Ct لاكتشاف CLas بواسطة qPCR أعلى من 36 أن تركيز CLas أقل من 2.01 × 10−1 نسخة / ميكرولتر ، وهو تركيز منخفض جدا (الشكل 3C). من بين العينات ال 15 ، كانت قيمة التصوير المقطعي للعينات 1 و 2 و 3 و 4 و 8 و 10 و 13 و 14 التي تم اكتشافها بواسطة qPCR أقل من 36 ، ولوحظت إشارات مضان خضراء واضحة (الشكل 4). من ناحية أخرى ، عندما لم يتم تحديد قيم Ct للعينات 6 و 7 و 9 و 12 و 15 التي تم اكتشافها بواسطة qPCR ، لم تلاحظ أي إشارات مضان خضراء (الشكل 4). علاوة على ذلك ، لوحظت إشارات مضان خضراء ضعيفة عندما كانت قيم Ct للعينة 5 والعينة 11 المكتشفة بواسطة qPCR أعلى من 36 (الشكل 4). تشير النتائج إلى أن منصتنا هي أداة سريعة وقوية وحساسة لتشخيص HLB في هذا المجال.
| لا | اسم | التسلسل (5 'إلى 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrArGrUrUrArGrUrGrUrUrGrUrGrUrCrUrGrCrUrUrCrUrGrUrGrUrUrGrCrUrCrUrGrCrUrGrCrUrUr | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | إف-آر إن آر | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
الجدول 1: الحمض النووي المستخدم في هذه الدراسة. SSDNA-FQ عبارة عن حمض نووي أحادي الشريط يحمل علامة 5 '6-FAM (فلوريسين) عند 5 'ومخمد الثقب الأسود الفلوري Quencher 1 (BHQ1) عند 3 '. الاختصارات: F = مراسل فلورسنت ؛ Q = مخمد مضان.
الشكل 1: تصميم كاشف CLas والتحقق من صحته. (أ) رسم تخطيطي لمقايسة كاشف CLas. الخطوة 1: تحضير المخزن المؤقت A الذي يحتوي على 20 mM NaOH في 6٪ PEG 200 لاستخراج gDNA بسرعة ؛ المحلول B الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت RPA ، و 0.8 ميكرولتر من F-RPA-RNRf ، و 0.8 ميكرولتر من F-RPA-RNRr ، و 3.9 ميكرولتر من ddH2O في كل تفاعل لتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ؛ يحتوي المحلول C على 1 ميكرولتر من مراسل ssDNA ، و 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت NEB 3.1 ، و 1 ميكرولتر من crRNA الذي يستهدف nrdB ، و 4 ميكرولتر من Cas12a ، و 11 ميكرولتر من ddH2O في كل تفاعل لإطلاق المراسل الفلوري. الخطوة 2: تم استخدام خمسة أقراص أوراق مثقوبة من الأوراق لاستخراج الحمض النووي الكلي للحمضيات مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت A. الخطوة 3: تم تضخيم الأحماض النووية الخاصة ب CLas باستخدام البادئات F-RPA-RNRf و R-RPA-RNRr التي تستهدف جين العلامة الخاص ب CLas nrdB في المحلول B مع 1 ميكرولتر من المادة الطافية من الخطوة 2 و 1 ميكرولتر من MgOAc عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الخطوة 4: تم تحضين المحلول C مع 10 ميكرولتر من الخليط من الخطوة 3 عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، ولوحظت إشارة التألق الخضراء من خلال جهاز كشف الفلورسنت المحمول باليد. تم تصنيف ssDNA-FQ ب 5 '6-FAM (فلوريسين) عند 5 'ومخمد مضان الثقب الأسود Quencher 1 (BHQ1) عند 3 '. الاختصارات: F = مراسل فلورسنت ؛ Q = مخمد مضان. (ب) الشجرة المصابة ب HLB (يسار) تظهر بقع مرقطة وأوراقا صفراء، لكن الشجرة غير المصابة ب HLB (يمين) تبدو خضراء. (ج) تم تأكيد وجود CLas باستخدام زوج التمهيدي F-RPA-RNRf و R-RPA-RNRr. (د) توضح العينة المصابة ب HLB إشارات مضان خضراء ، في حين أن العينة المصابة ب HLB و H2O لا تظهر في مقايسة CLas-DETECTR. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: اختبار خصوصية كاشف CLas. (أ) الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز لنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، (ب) قيمة التصوير المقطعي لنتائج qPCR ، و (ج) نتائج كاشف CLas المضخمة باستخدام زوج التمهيدي من F-RPA-RNRf و R-RPA-RNRr باستخدام gDNA المستخرج من أوراق نيوهول الإيجابية CLas وثلاثة بكتيريا أخرى. مرة أخرى ، كان H2O بمثابة عنصر تحكم سلبي. M: سلم الحمض النووي. gDNA المستخرج من أوراق نيوهول إيجابية CLas (1) ، Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2) ، Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc ، 3) ، وسلالة Burkholderia stabilis 1440 المعزولة في مختبرنا (4). تمثل قيمة Ct متوسط قيمة Ct لثلاثة تكرارات فنية ± خطأ قياسي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مقارنة حساسية كاشف CLas مع PCR و qPCR. تحليل الكشف عن سلسلة من تخفيفات أمبليكون الحمض النووي CLas المحددة باستخدام (A) PCR و (B) CLas-DETECTR و (C) qPCR. (أ) من 25 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم تحميل 5 ميكرولتر في الجل. (ب) تم التقاط الصور بكاميرا الهاتف الذكي من خلال نظارات واقية تحت الضوء المنبعث من جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد (الطول الموجي للإثارة: 440 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاثات: 500 نانومتر). تم استخدام نفس الاشعال في جميع المقايسات. تم تخفيف منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى بطول 1060 نقطة أساس مع مجموعة التمهيدي F-RNR و R-RNR التي تستهدف جين nrdB الخاص ب CLas باستخدام H2O إلى تركيزات 2.01 × 106 نسخة / ميكرولتر (1) ، 2.01 × 105 نسخة / ميكرولتر (2) ، 2.01 × 104 نسخة / ميكرولتر (3) ، 2.01 × 103 نسخة / ميكرولتر (4) ، 2.01 × 102 نسخة / ميكرولتر (5) ، 2.01 × 101 نسخة / ميكرولتر (6) ، 2.01 × 100 نسخة / ميكرولتر (7) ، و 2.01 × 10−1 نسخة / ميكرولتر (8). H2O بمثابة عنصر تحكم سلبي. م: سلم الحمض النووي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: الكشف عن CLas باستخدام عينات ميدانية. تم اختبار CLas في 15 عينة أوراق تم جمعها من أشجار البرتقال الحلو في نيوهول بواسطة مقايسات CLas-DETECTR و qPCR الموضحة أعلاه. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة ومحمولة للكشف عن CLas تسمى CLas-DETECTR ، والتي تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a. يوضح الشكل 1 سير العمل. يكتشف CLas-DETECTR CLas بخصوصية وحساسية (الشكل 2 والشكل 3). علاوة على ذلك ، باستخدام عينات أوراق نيوهول ، يكتشف CLas-DETECTR CLas بنفس حساسية qPCR (الشكل 4). والجدير بالذكر أنه يمكن تصور نتائج الكشف مباشرة من خلال جهاز محمول باليد مستقل عن الأدوات القائمة على المختبر ، وهو أمر بالغ الأهمية لتشخيص HLB في الوقت الفعلي.
هناك العديد من الاعتبارات المهمة للبروتوكول. أولا ، يجب تجنب التلوث المتبادل بشكل صارم في عملية أخذ العينات ، لأن CLas-DETECTR حساس مثل qPCR. يجب ألا تتعرض كواشف التفاعل لأشعة الشمس الشديدة. يجب اتباع جميع الخطوات بدقة لتحقيق أفضل النتائج. يجب تضمين عنصر تحكم إيجابي ، وهو بلازميد يحتوي على شظايا جينية خاصة ب CLas ، لضمان عمل نظام CLas-DETECTR بشكل صحيح في الميدان. أخيرا ، يجب معالجة جميع النفايات التجريبية المتعلقة ب CLas على أنها خطر بيولوجي وتعقيمها قبل التخلص منها.
إذا لم يتم الكشف عن إشارات مضان للتحكم الإيجابي ، فقد توجد مثبطات في خليط التفاعل ، ويجب تغيير الكواشف. خلاف ذلك ، إذا كان التألق ضعيفا جدا بحيث لا يمكن تمييزه ، فيمكن تمديد وقت الحضانة لفترة أطول قد يؤدي إلى إيجابيات خاطئة.
تتطلب طرق الكشف عن CLas الحالية أجهزة PCR باهظة الثمن ومواقع تشغيل ثابتة وموظفين مدربين. ومع ذلك ، فإن الطريقة المقدمة هنا تسمح بتشخيص HLB بدقة وحساسية في الحقل من قبل مجموعة واسعة من الأشخاص ، بما في ذلك مزارعي الحمضيات.
ومع ذلك ، فإن CLas-DETECTR لديه بعض القيود. أولا ، لا يمكن استخدام عينات الحمضيات مباشرة في البروتوكول ، ويجب استخراج gDNA للحمضيات. ثانيا ، هناك حاجة إلى حاضنة بسيطة ل RPA وتفعيل نشاط nuclease ل Cas12a للحصول على نتائج متسقة. ثالثا ، يجب تصور النتائج من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد. على الرغم من أنه يمكن استخدام شرائط التدفق الجانبي لإظهار النتائج مباشرة ، إلا أن هذا سيزيد
تم اختبار عينات الأوراق في هذا البروتوكول. في المستقبل ، يمكن تطبيق CLas-DETECTR للكشف عن وجود CLas في نكات البرسيم وعينات سيلليد. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال تغيير crRNA والبادئات ، يمكن أيضا استخدام تقنية التشخيص الجزيئي هذه لأمراض الحمضيات الأخرى ، مثل تقرح الحمضيات وفيروس تسوس الحمضيات وفيروس تفتيت أوراق الحمضيات. بينما نعمل على CLas-DETECTR ، تم استخدام هذا النهج أيضا للكشف عن CLas بالتوازي من قبل الآخرين25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFD1400805) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيانغشي (20194ABC28007) ، ومشاريع إدارة التعليم في جيانغشي (GJJ201449) ، والابتكار التعاوني للبحث العلمي الزراعي الحديث في مقاطعة جيانغشي (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
References
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
- Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
- Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
- Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
- Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
- Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
- Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
- Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
- Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
- Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
- Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
- Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
- Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
- Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
- Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
- Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
- Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
- Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
- Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
- Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
