Summary
本工作建立了一种基于重组酶聚合酶扩增结合CRISPR-Cas12a的快速、灵敏、便携的亚洲 自由念珠 菌检测方法。
Abstract
柑橘种植者早期发现亚洲 自由念珠 菌（CLas）有助于早期干预并防止疾病传播。本文介绍了一种用于快速便携的黄龙冰（HLB）诊断的简单方法，该方法结合了重组酶聚合酶扩增和荧光报告基因，该方法利用成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关12a（CRISPR-Cas12a）系统的核酸酶活性。该技术的灵敏度远高于PCR。此外，当使用叶样品时，该方法显示出与qPCR相似的结果。与传统的CLas检测方法相比，这里介绍的检测方法可以在90 min内完成，并且在不需要使用PCR机的等温条件下工作。此外，结果可以通过现场的手持式荧光检测设备可视化。
Introduction
黄龙病（HLB）是全球最成问题的柑橘病害之一1。HLB 由韧皮部定植和挑剔细菌 Liberibacter 属引起，包括亚洲自由念珠菌 （CLas）、非洲乳杆菌和美洲乳杆菌 2。在中国和美国，最普遍的HLB相关物种是CLas，它通过亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）或通过嫁接传播3。柑橘树被CLas感染后，生长下降直至死亡2。柑橘叶感染CLas的常见症状是斑点斑驳，绿岛（小圆形深绿色点），较厚和革质叶子上凸起的软木脉，以及芽不均匀的黄芽2。此外，感染CLas的水果显得小而不平衡2。
由于没有柑橘品种对HLB有抗性，也没有治疗HLB的方法，因此预防HLB需要检疫和分离CLas阳性的柑橘树2，3。因此，早期发现对于监测和检疫至关重要，以防止CLas的传播并最大限度地减少经济损失3。此外，由于感染早期植物中CLas的滴度较低，因此需要进行灵敏的CLas检测3。在中国，CLas检测通常由某些经过认证的测试中心进行。但是，检测过程通常至少需要1周，并且检测费用昂贵。因此，为了帮助监测HLB发病率
已经应用了各种技术来诊断HLB4，5，6，7，8，9。聚合酶链反应 （PCR） 和定量 PCR （qPCR） 因其高灵敏度和特异性而成为最常用的 CLas 检测工具4，5。然而，这些技术严重依赖昂贵的仪器和高技能人员。此外，几种等温扩增方法，如环介导等温扩增（LAMP），由于其简单、快速和低成本，已被开发为传统PCR方法的有吸引力的替代方案8，9，10。然而，由于非特异性扩增信号，应用它们来准确检测CLas具有挑战性，这可能会导致假阳性结果。
RNA引导的CRISPR/Cas（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关）基于核酸内切酶的核酸检测因其高灵敏度、特异性和可靠性而发展成为下一代分子诊断技术11，12，13，14。这些 CRISPR/Cas诊断技术依靠Cas蛋白的附带核酸酶活性来切割用荧光报告基因和寡核苷酸两端的荧光淬灭剂修饰的单链DNA（ssDNA），以及用于捕获释放的荧光报告基因的荧光检测装置11，12.由CRISPR RNA（crRNA）靶标双链体激活的几种Cas效应子的核酸酶活性可以不加选择地切割周围的非靶点ssDNA11。CRISPR-Cas12a（也称为Cpf 1）是一种2类V-A CRISPR / Cas系统，与Cas9相比具有多种优势，例如更低的失配耐受性和更高的特异性13。Cas12a/crRNA系统已被应用于人类病原体和植物病原体14，15，16，17，18的核酸的灵敏和特异性检测。因此，利用Cas12a/crRNA系统应能够准确灵敏地检测CLas的核酸。
单独的Cas12a在理论上不足以检测低水平的核酸。因此，为了提高其检测灵敏度，CRISPR-Cas12a检测通常与等温扩增步骤14、15相结合。重组酶聚合酶扩增 （RPA） 可在 37 °C 至 42 °C 的温度范围内实现灵敏、快速的等温 DNA 扩增19。
最近设计了一种名为DETECTR（DNA核酸内切酶靶向CRISPR 反式 报告基因）的检测平台，该平台将Cas12a的DNA酶活性与RPA和荧光读数相结合12 ，并已被证明可以检测具有更高灵敏度的核酸20。此外，阳性样品发出的荧光信号可以通过现场的手持式荧光检测设备进行观察。
由于我们用RPA扩增DNA，设计了针对CLas 21特异性的五拷贝nrdB（核糖核苷酸还原酶β-亚基）基因的crRNA，并采用了Cas12a蛋白的DNase活性，因此我们称之为CLas检测方法CLas-DETECTR。与现有的CLas检测方法相比，CLas-DETECTR具有快速、准确、灵敏、可部署的特点。
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Protocol
1. CLas-DETECTR的构建
注意：CLas-DETECTR的构建是一个四步过程：溶液制备，柑橘总DNA分离，等温DNA扩增和结果可视化。CLas-DETECTR测定的示意图如图 1A所示。
- 溶液制备
- 制备缓冲液A：20mM NaOH在6%PEG 200中。对于 100 mL，将 113 mg NaOH 和 6 g PEG 200 加入瓶中的 80 mL H2O 中。将瓶子在60°C的水浴中孵育，直到所有PEG 200溶解。然后，将 H2O 加入到 100 mL 的体积中。
- 制备溶液 B：对于每个反应，加入 10 μL RPA 缓冲液、0.8 μL F-RPA-RNRf、0.8 μL R-RPA-RNRr 和 3.9 μL ddH2O 至最终体积为 15.5 μL。
注意：F-RPA-RNRf 和 R-RPA-RNRr 是用于测定 NRDB 基因的引物。有关序列，请参见 表 1 。 - 制备溶液 C：对于每个反应，加入 1 μL ssDNA 报告基因、3 μL NEB 缓冲液 3.1、1 μL crRNA、4 μL Cas12a 和 11 μL ddH2O 至最终体积为 20 μL。
注意：如果要检测的样品很多，请制备大量溶液B和溶液C，然后等分。
- 柑橘总DNA分离
注意：为了节省时间并使该方法适用于现场CLas检测，使用基于碱性聚乙二醇（PEG）的方法获得用于DNA扩增的粗植物提取物22，23- 该协议中使用了柑橘叶。首先，从一片叶子上打出五个叶盘。接下来，将叶盘放入 1.5 mL 微量离心管中，并加入 200 μL 缓冲液 A。
注意：在田间，如果有灰尘覆盖叶子，请先清洁它们。可以使用 1.5 mL 管的盖子夹住叶盘，以避免交叉污染。其他柑橘组织，如根，茎，果实和花，也可以用于此协议。 - 手动研磨叶盘，直到用塑料棒光滑。
- 让管子不受干扰10分钟。然后，使用上清液进行DNA扩增。
注意：测定可以在此处暂停，通过碱性PEG方法提取的粗植物提取物可以在-20°C下储存至少1年。视频中显示的纽霍尔甜橙（Citrus sinensis Osbeck var. Newhall）树生长在一个装有9/3/1（v/v/v）泥炭土/蛭石/珍珠岩混合物的花盆中，并在位于中国江西甘南师范大学校园内的温室中维护。HLB感染的树木通过嫁接CLas阳性纽霍尔芽进行接种。HLB感染和未感染HLB的树木通过PCR确认。使用靶向CLas特异性标记基因 nrdB的引物对（F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr）检测CLas。另一方面，特征性的HLB症状，斑点斑驳和发黄的叶子可以在CLas阳性的树上发现，但在CLas阴性的树上则不然。
- 该协议中使用了柑橘叶。首先，从一片叶子上打出五个叶盘。接下来，将叶盘放入 1.5 mL 微量离心管中，并加入 200 μL 缓冲液 A。
- 等温DNA扩增
- 将步骤 1.2.3 中的 1 μL 上清液和 1 μL MgOAc（14 mM 终浓度）加入溶液 B 中并充分混合。
- 在实验室中，将它们在37°C的简单培养箱中孵育15分钟。
注意：在现场，将试管握在手中15分钟。如果条件允许，还建议在37°C的简单培养箱中孵育管15分钟。
- 结果可视化
- 将步骤 1.3.2 中的 10 μL 混合物加入溶液 C 中并充分混合。
- 将它们在37°C培养箱中孵育60分钟。
- 戴上护目镜，通过手持式荧光检测装置（激发波长：440 nm，发射波长：500 nm）观察用5'6-荧光素标记的ssDNA报告基因和3'标记的荧光猝灭剂释放的绿色荧光信号。
注意：绿色荧光信号可持续数天，最好
注意：荧光检测装置发出的光对眼睛有害。在观察结果之前，请务必戴上护目镜。
2. 特异性试验
注意：为了测试CLas-DETECTR的特异性，在实验室24中分离的根际细菌根际细菌根癌农杆菌GV3101，柑橘黄单胞菌亚种（Xcc）和伯克霍尔德氏菌株1440进行了CLas-DETECTR测试。
注意：自由念珠菌（CLas）不能培养。人们只能从感染CLas的柑橘组织中提取基因组DNA来获得CLas DNA。 Xcc 是另一种重要的柑橘病害柑橘溃疡病的病原体。 伯克霍尔德氏菌菌 株1440是在实验室中分离的抗Xcc 细菌。因此，使用了所有这三种细菌的纯菌株
- 按照制造商的方案，使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取细菌基因组 DNA （gDNA）。用水作为阴性对照。
- 在含有 1 μL F-RPA-RNRf、1 μL R-RPA-RNRr、12.5 μL Ex Taq 2.0 版加染料、1 μL DNA 模板和 9.5 μL H 2 O 的 25 μL 反应混合物中使用带光学盖的0.2mL PCR 试管进行 PCR。
- 使用以下热循环反应条件：在98°C下1分钟;随后在98°C下进行35次循环，每次10 s，在55°C下30 s，在72 °C下15 s;然后在72°C下10分钟;并保持在16°C。
- 在120V下在1%琼脂糖凝胶上运行PCR产物15分钟。
- 在含有 0.8 μL F-RPA-RNRf、0.8 μL R-RPA-RNRr、10 μL 2x TB 绿色预混料 Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）、1 μL DNA 模板和 7.4 μL H2O 的 20 μL 反应混合物中进行 qPCR。
- 使用以下热循环反应条件：95°C下30秒;随后在95°C下进行45次循环，每次5 s，在60 °C下循环32 s;然后在95°C下15秒，在60°C下1分钟，在95°C下15秒的熔融曲线阶段。
- 在每次重复中包括三个技术重复。
- 按照步骤 1.1–1.4 执行 CLas-DETECTR 方法。
3. 灵敏度比较
- 要测试CLas DETECTR的灵敏度，请使用PCR，CLas-DETECTR和qPCR检测一系列CLas DNA片段稀释液，如上所述。
- 在含有 4 μL F-RNR、4 μL R-RNR、50 μL PrimeSTAR Max 预混料、2 μL DNA 模板和 40 μL H2O 的 100 μL 反应混合物中，使用引物组 F-RNR 和 R-RNR 从 nrdB 扩增长度为 1，060 bp 的 DNA 片段，按照热循环反应条件（98 °C 下 30 秒;然后在 98 °C 下进行 35 次循环，每次 10 秒， 55°C时15秒，72°C时30秒;然后在72°C下10分钟;并保持在16°C）。
注意： nrdB（核糖核苷酸还原酶β-亚基）基因对CLas 21具有特异性。使用引物集F-RNR和R-RNR可以很容易地从CLas阳性的柑橘gDNA中获得 nrdB 扩增子。引物集F-RNR和R-RNR扩增1，060 bp nrdB片段，而引物集F-RPA-RNR和R-RPA-RNR扩增nrdB基因的104 bp片段，这是1，060 bp nrdB 片段的一部分。 - 按照制造商手册使用DNA凝胶提取试剂盒纯化PCR产物。
- 用灭菌的ddH2O稀释含有nrdB扩增子的PCR产物。
- 使用市售的在线DNA拷贝数和稀释计算器计算 nrdB 基因的拷贝数。
- 制备含有 2.01 × 106 拷贝/μL、2.01 × 105 拷贝/μL、2.01 × 104 拷贝/μL、2.01 × 103 拷贝/μL、2.01 × 102 拷贝/μL、2.01 × 101 拷贝/μL、2.01 × 100 拷贝/μL 和 2.01 × 10−1 拷贝/μL 的 CLas DNA 片段的 DNA 稀释液。
4. 样品检测
注意：在特异性和灵敏度测试之后，使用CLas-DETECTR方法检测从中国江西南师范大学校园种质资源苗圃中生长的纽霍尔甜橙树收集的田间叶样中是否存在CLas。进行qPCR以验证结果。
- 总共测试15棵树。用水作为阴性对照。
- 如上所述执行CLas-DETECTR和qPCR方法。
注意：由于CLas在柑橘中的分布不均匀特征，优先收集显示HLB症状的叶子。如果一棵树看起来很健康，则随机收集叶子CLas-DETECTR系统正常工作。
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Representative Results
在这里，我们描述了一个便携式平台CLas-DETECTR，它结合了RPA和CRISPR-Cas12a系统，以在现场诊断HLB。CLas-DETECTR 的模式如图 1A 所示。
当来自HLB感染和未感染HLB的Newhall树的叶样品（图1B）通过PCR确认CLas的存在（图1C）时，在HLB感染的样品中观察到绿色荧光信号，但在HLB未感染的样品和阴性对照中没有（图1D）。
我们使用从其他细菌中提取的核酸确定了CLas-DETECTR的特异性。CLas-DETECTR测定中使用的F-RPA-RNRf和R-RPA-RNRr引物集也用于PCR和qPCR。在PCR测定中使用CLas阳性柑橘叶gDNA扩增时，琼脂糖凝胶电泳中可以看到条带，但在PCR测定中没有其他细菌gDNA扩增（图2A）。在qPCR测定中，CLas的平均阈值循环（Ct）值为24±0.7，而 根癌曲霉 GV3101， Xcc和 稳定芽孢杆菌 菌株1440的平均Ct值分别为38±0.7，39±1.4和39±0.7（图2B）。通常，当 Ct 值高于 38 时，结果被视为负数。这些结果表明，F-RPA-RNRf和R-RPA-RNRr引物对CLas具有特异性。在CLas-DETECTR测定中，只有CLas gDNA显示出绿色荧光信号;从 根癌农 杆菌GV3101， Xcc和 稳定芽孢杆菌 菌株1440中提取的gDNA没有（图2C），这意味着CLas-DETECTR可以特异性检测CLas。
我们还使用一系列CLas DNA稀释液测试了CLas-DETECTR的灵敏度。PCR可以检测2.01×102 拷贝/μL（图3A）。另一方面，CLas-DETECTR 可以检测 2.01 × 100 拷贝/μL，这表明这是一种可行的敏感现场诊断（图 3B）。qPCR可以检测到2.01×10−1 拷贝/μL，但Ct值高于36（图3C）。因此，当使用稀释扩增子时，CLas-DETECTR的灵敏度比传统PCR高两个数量级，比qPCR低一个数量级（图3）。
最后，我们研究了CLas-DETECTR在现场样品中的可行性，并将其灵敏度与qPCR（一种成熟的灵敏核酸检测方法）进行了比较21。通常，通过qPCR检测CLas的Ct值高于36意味着CLas浓度小于2.01×10−1 拷贝/μL，这是一个非常低的浓度（图3C）。在15个样品中，qPCR检测到的样品1、2、3、4、8、10、13和14的Ct值均小于36，观察到明显的绿色荧光信号（图4）。另一方面，当qPCR检测到的样品6，7，9，12和15的Ct值未确定时，未观察到绿色荧光信号（图4）。此外，当qPCR检测到的样品5和样品11的Ct值高于36时，观察到微弱的绿色荧光信号（图4）。结果表明，我们的平台是现场HLB诊断的快速，强大和灵敏的工具。
| 不 | 名字 | 序列 （5' 至 3'） | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArArUrUrUrCrArCrArArUrGrUrGrUrArGrUrArUrGrUrArUrArGrGrCrGrUrGrArUrUrUrCrGrArGrGrG | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
表1：本研究中使用的核酸。 ssDNA-FQ是单链DNA，在5'处用5'6-FAM（荧光素）标记，在3'处用荧光猝灭剂黑洞猝灭剂1（BHQ1）标记。缩写：F = 荧光报告基因;Q = 荧光淬灭剂。
图 1：CLas-DETECTR 的设计和验证。 （A） CLas-DETECTR测定示意图。 第 1 步： 在6%PEG 200中制备含有20mM NaOH的缓冲液A，用于快速gDNA提取;溶液 B，每次反应中含有 10 μL RPA 缓冲液、0.8 μL F-RPA-RNRf、0.8 μL F-RPA-RNRr 和 3.9 μL ddH2O，用于等温 DNA 扩增;溶液 C 含有 1 μL ssDNA 报告基因、3 μL NEB 缓冲液 3.1、1 μL 靶向 nrdB 的 crRNA、4 μL Cas12a 和 11 μL ddH2O，用于荧光报告基因释放。第 2 步：使用从叶子上打孔的五个叶盘用 200 μL 缓冲液 A 提取柑橘总 DNA。 第 3 步：使用引物 F-RPA-RNRf 和 R-RPA-RNRr 在溶液 B 中靶向 CLas 特异性标记基因 nrdB 扩增 CLas 特异性核酸，其中 1 μL 来自步骤 2 的上清液和 1 μL MgOAc 在 37 °C 下扩增 CLas 特异性标记基因 nrdB，持续 15 分钟。 第 4 步： 将含有步骤3中的10μL混合物的溶液C在37°C下孵育60分钟，并通过手持式荧光检测装置观察绿色荧光信号。ssDNA-FQ在5'处用5'6-FAM（荧光素）标记，在3'处用荧光猝灭剂黑洞猝灭剂1（BHQ1）标记。缩写：F = 荧光报告基因;Q = 荧光淬灭剂。（B）受HLB感染的树（左）显示斑点斑驳和黄色叶子，但未感染HLB的树（右）看起来是绿色的。（C）使用引物对F-RPA-RNRf和R-RPA-RNRr确认CLas的存在。（D）HLB感染的样品显示绿色荧光信号，而未感染的HLB和H2O在CLas-DETECTR测定中没有。请点击此处查看此图的大图。
图 2：测试 CLas-DETECTR 的特异性。 （A）PCR结果的琼脂糖凝胶电泳，（B）qPCR结果的Ct值，以及（C）使用从CLas阳性纽霍尔叶和其他三种细菌中提取的gDNA使用引物对F-RPA-RNRf和R-RPA-RNRr扩增的CLas-DETECTR结果。再次，H2O作为阴性对照。M：DNA阶梯;从CLas阳性的Newhall叶（1），根癌农杆菌GV3101（2），柑橘黄单胞菌亚种（Xcc，3）和我们实验室中分离的伯克霍尔德氏菌株1440中提取的gDNA（4）。Ct 值表示标准误差±三次技术重复的平均 Ct 值。请点击此处查看此图的大图。
图 3：CLas-DETECTR 与 PCR 和 qPCR 的灵敏度比较。 使用 （A） PCR、（B） CLas-DETECTR 和 （C） qPCR 对一系列特异性 CLas DNA 扩增子稀释液进行检测分析。（A） 从 25 μL PCR 产物中，将 5 μL 上样到凝胶中。（B）照片是在手持荧光检测装置（激发波长：440nm，发射波长：500nm）发出的光下，通过护目镜用智能手机相机拍摄的。在所有测定中使用相同的引物。使用H 2 O将用靶向CLas特异性nrdB基因的引物集F-RNR和R-RNR扩增长度为1，060 bp的纯化PCR产物稀释至浓度为2.01 × 106拷贝/μL （1）、2.01 × 105拷贝/μL （2）、2.01 × 104拷贝/μL （3）、2.01 × 103拷贝/μL （4）、2.01 × 102 拷贝/μL （5）、2.01 × 101 拷贝/μL （6）， 2.01 × 100 拷贝/μL （7），2.01 × 10−1 拷贝/μL （8）。H2O作为阴性对照。男：DNA阶梯。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用现场样本进行 CLas 检测。 从纽霍尔甜橙树收集的15个叶样品中的CLas通过CLas-DETECTR和上述qPCR测定进行了测试。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本研究提出了一种快速便携的CLas检测方法，称为CLas-DETECTR，该方法结合了RPA和CRISPR-Cas12a系统。工作流程如图 1 所示。CLas-DETECTR 检测 CLas 具有特异性和灵敏度（图 2 和图 3）。此外，使用纽霍尔叶样品，CLas-DETECTR以与qPCR相同的灵敏度检测CLas（图4）。值得注意的是，检测结果可以通过独立于实验室仪器的手持便携式设备直接可视化，这对于实时HLB诊断至关重要。
该协议有几个重要的注意事项。首先，在取样过程中应严格避免交叉污染，因为CLas-DETECTR与qPCR一样敏感。反应试剂不得暴露在强烈的阳光下。必须精确遵循所有步骤才能获得最佳效果。应包括阳性对照，即含有CLas特异性基因片段的质粒，以确保CLas-DETECTR系统在现场正常工作。最后，所有与CLas相关的实验废物都应作为生物危害物进行处理，并在处置前进行高压灭菌。
如果未检测到阳性对照的荧光信号，则反应混合物中可能存在抑制剂，需要更换试剂。否则，如果荧光太弱而无法区分，则孵育时间可以延长，更长的孵育时间可能导致假阳性。
现有的CLas检测方法需要昂贵的PCR仪、固定的操作部位和训练有素的人员。然而，这里介绍的方法允许包括柑橘种植者在内的广泛人群在田间准确和灵敏地诊断HLB。
但是，CLas-DETECTR有一些局限性。首先，柑橘样品不能直接用于方案中，需要提取柑橘gDNA。其次，需要一个简单的培养箱来进行RPA和Cas12a核酸酶活性的激活以获得一致的结果。第三，需要通过手持式荧光检测设备对结果进行可视化。虽然可以使用横向流条直接显示结果，但这会增加
在该协议中测试了叶样品。将来，CLas-DETECTR可用于检测长春花和木虱样品中CLas的存在。此外，通过改变crRNA和引物，这种分子诊断技术还可以用于其他柑橘病害，如柑橘溃疡病、柑橘腐烂病毒和柑橘叶碎裂病毒。当我们研究CLas-DETECTR时，这种方法也被其他人用于并行检测CLas25。
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Disclosures
提交人声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研发计划（2021YFD1400805）、江西省重大科技研发计划（20194ABC28007）、江西省教育厅项目（GJJ201449）、江西省现代农业科学研究协同创新（JXXTCX2015002（3+2）-003）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
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