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Biology

Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64070
* These authors contributed equally

Summary

In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.

Abstract

La diagnosi precoce di Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) da parte degli agrumicoltori facilita l'intervento precoce e previene la diffusione della malattia. Qui viene presentato un semplice metodo per la diagnosi rapida e portatile di Huanglongbing (HLB) che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e un reporter fluorescente che utilizza l'attività nucleasica del sistema 12a (CRISPR-Cas12a) associato a CRISPR regolarmente intervallato. La sensibilità di questa tecnica è molto più alta della PCR. Inoltre, questo metodo ha mostrato risultati simili alla qPCR quando sono stati utilizzati campioni di foglie. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas convenzionali, il metodo di rilevamento qui presentato può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica che non richiede l'uso di macchine PCR. Inoltre, i risultati possono essere visualizzati attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo.

Introduction

Huanglongbing (HLB) è una delle malattie degli agrumi più problematiche in tutto il mondo1. L'HLB è causata dai batteri filocolonizzatori e fastidiosi Candidatus Liberibacter spp., tra cui Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus 2. La specie associata all'HLB più diffusa in Cina e negli Stati Uniti è CLas, che viene trasmessa dalle psillidi asiatiche degli agrumi (Diaphorina citri) o attraverso l'innesto3. Dopo essere stati infettati da CLas, gli alberi di agrumi mostrano un declino della crescita fino alla morte2. I sintomi comuni delle foglie di agrumi infettate da CLas sono chiazze chiazzate, isole verdi (piccoli punti circolari verde scuro), vene di sughero sollevate su foglie più spesse e coriacee e germogli ingialliti non uniformi2. Inoltre, i frutti infetti da CLas appaiono piccoli e sbilenchi2.

Poiché nessuna varietà di agrumi è resistente all'HLB e non esiste una cura terapeutica per l'HLB, la prevenzione dell'HLB richiede la quarantena e l'isolamento degli alberi di agrumi CLas-positivi 2,3. Pertanto, la diagnosi precoce è fondamentale per il monitoraggio e la quarantena per prevenire la diffusione di CLas e ridurre al minimo le perdite economiche3. Inoltre, è necessario rilevare CLas sensibili a causa del basso titolo di CLas nelle piante durante la fase iniziale dell'infezione3. In Cina, il rilevamento di CLas viene solitamente condotto da alcuni centri di test certificati. Tuttavia, il processo di rilevamento richiede in genere almeno 1 settimana e la tassa di rilevamento è costosa. Pertanto, per aiutare a monitorare l'incidenza di HLB

Varie tecnologie sono state applicate per diagnosticare HLB 4,5,6,7,8,9. La reazione a catena della polimerasi (PCR) e la PCR quantitativa (qPCR) sono gli strumenti più utilizzati per la rilevazione di CLas grazie alla loro elevata sensibilità e specificità 4,5. Tuttavia, queste tecnologie si basano fortemente su strumenti costosi e personale altamente qualificato. Inoltre, diversi metodi di amplificazione isotermica, come l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), sono stati sviluppati come alternative interessanti ai metodi PCR convenzionali grazie alla loro semplicità, rapidità e basso costo 8,9,10. Tuttavia, è difficile applicarli per rilevare con precisione i CLas a causa dei segnali di amplificazione non specifici, che possono causare risultati falsi positivi.

Il rilevamento dell'acido nucleico basato su endonucleasi CRISPR / Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) guidato da RNA è stato sviluppato come tecnologia di diagnostica molecolare di nuova generazione grazie alla sua elevata sensibilità, specificità e affidabilità11,12,13,14. Queste tecnologie diagnostiche CRISPR/Cas si basano sull'attività di nucleasi collaterale delle proteine Cas per scindere il DNA a singolo filamento (ssDNA) modificato con un reporter fluorescente e un quencher di fluorescenza a ciascuna estremità degli oligonucleotidi, nonché un dispositivo di rilevamento della fluorescenza per catturare il reporter fluorescente rilasciato11,12 . L'attività nucleasica di diversi effettori Cas attivati dal duplex bersaglio dell'RNA CRISPR (crRNA) può scindere indiscriminatamente il circostante ssDNA11 non bersaglio. CRISPR-Cas12a (chiamato anche Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas di classe 2 di tipo V-A, dimostra diversi vantaggi rispetto a Cas9, come una minore tolleranza al mismatch e una maggiore specificità13. Il sistema Cas12a/crRNA è stato applicato per la rilevazione sensibile e specifica degli acidi nucleici di patogeni umani e fitopatogeni 14,15,16,17,18. Pertanto, l'utilizzo del sistema Cas12a/crRNA dovrebbe consentire la rilevazione accurata e sensibile dell'acido nucleico di CLas.

Cas12a da solo non è teoricamente abbastanza sensibile da rilevare bassi livelli di acidi nucleici. Pertanto, per migliorare la sua sensibilità di rilevamento, il rilevamento CRISPR-Cas12a è tipicamente combinato con un passo di amplificazione isoterma14,15. L'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) consente un'amplificazione del DNA isoterma sensibile e rapida in un intervallo di temperatura da 37 °C a 42 °C19.

Una piattaforma di rilevamento chiamata DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) che combina l'attività DNasi di Cas12a con RPA e una lettura della fluorescenza è stata recentemente ideata12 e ha dimostrato di rilevare l'acido nucleico con una maggiore sensibilità20. Inoltre, il segnale di fluorescenza emesso dai campioni positivi può essere osservato attraverso un dispositivo portatile di rilevamento della fluorescenza sul campo.

Poiché abbiamo amplificato il DNA con RPA, progettato crRNA mirato al gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-subunità) a cinque copie specifico di CLas21 e impiegato l'attività DNasi della proteina Cas12a, abbiamo chiamato questo metodo di rilevamento CLas CLas-DETECTR. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas esistenti, CLas-DETECTR è veloce, accurato, sensibile e implementabile.

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Protocol

1. Costruzione del CLas-DETECTR

NOTA: La costruzione di CLas-DETECTR è un processo in quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e visualizzazione dei risultati. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.

  1. Preparazione della soluzione
    1. Preparare il tampone A: 20 mM NaOH in PEG 200 al 6%. Per 100 ml, aggiungere 113 mg di NaOH e 6 g di PEG 200 in 80 ml di H2O in un flacone. Incubare il flacone a bagnomaria a 60 °C fino a quando tutto il PEG 200 è sciolto. Quindi, aggiungere H2O a un volume di 100 ml.
    2. Preparare la soluzione B: Per ogni reazione, aggiungere 10 μL di tampone RPA, 0,8 μL di F-RPA-RNRf, 0,8 μL di R-RPA-RNRr e 3,9 μL di ddH2O ad un volume finale di 15,5 μL.
      NOTA: F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr sono i primer utilizzati nel test contro il gene nrdB . Vedere la tabella 1 per la sequenza.
    3. Preparare la soluzione C: Per ogni reazione, aggiungere 1 μL di ssDNA reporter, 3 μL di tampone NEB 3.1, 1 μL di crRNA, 4 μL di Cas12a e 11 μL di ddH2O ad un volume finale di 20 μL.
      NOTA: Se vi sono molti campioni da rilevare, effettuare un grande volume di soluzione B e soluzione C e aliquote in seguito.
  2. Isolamento totale del DNA degli agrumi
    NOTA: Per risparmiare tempo e rendere questo metodo adatto per la rilevazione di CLas di campo, è stato utilizzato l'approccio basato sul glicole polietilenico alcalino (PEG) per ottenere estratti vegetali grezzi per l'amplificazione del DNA22,23
    1. Le foglie di agrumi sono state utilizzate in questo protocollo. Per prima cosa, punzona, punzonate cinque dischi fogliari da una foglia. Quindi, inserire i dischi fogliari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere 200 μL di tampone A.
      NOTA: Sul campo, pulire prima le foglie se c'è polvere che le copre. I dischi fogliari possono essere tagliati utilizzando il coperchio del tubo da 1,5 ml per evitare la contaminazione incrociata. Altri tessuti di agrumi, come radici, steli, frutti e fiori, possono anche essere utilizzati in questo protocollo.
    2. Macinare manualmente i dischi fogliari fino a lisci con un'asta di plastica.
    3. Lasciare il tubo indisturbato per 10 minuti. Quindi, utilizzare il surnatante per l'amplificazione del DNA.
      NOTA: Il test può essere messo in pausa qui e gli estratti vegetali grezzi estratti con il metodo alcalino-PEG possono essere conservati a -20 °C per almeno 1 anno. Gli alberi di Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) mostrati nel video sono stati coltivati in un vaso riempito con un mix di 9/3/1 (v / v / v) terreno di torba / vermiculite / perlite e mantenuto in una serra situata nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. Gli alberi infetti da HLB sono stati inoculati mediante innesto con gemme Newhall CLas-positive. Gli alberi infetti da HLB e non infetti da HLB sono stati confermati dalla PCR. La CLas è stata rilevata utilizzando la coppia di primer (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) mirata al gene marcatore specifico CLas nrdB. D'altra parte, i sintomi caratteristici di HLB, la chiazza macchiata e le foglie ingiallite possono essere trovati su CLas-positivi ma non su alberi CLas-negativi.
  3. Amplificazione isotermica del DNA
    1. Aggiungere 1 μL di surnatante della fase 1.2.3 e 1 μL di MgOAc (concentrazione finale di 14 mM) nella soluzione B e mescolare bene.
    2. In laboratorio, incubarli in una semplice incubatrice a 37 °C per 15 minuti.
      NOTA: Sul campo, tenere i tubi in mano per 15 minuti. Si consiglia inoltre di incubare i tubi in un semplice incubatore a 37 °C per 15 minuti se le condizioni lo consentono.
  4. Visualizzazione dei risultati
    1. Aggiungere 10 μL della miscela del punto 1.3.2 nella soluzione C e mescolare bene.
    2. Incubarli in un'incubatrice a 37 °C per 60 minuti.
    3. Indossare occhiali e osservare il segnale di fluorescenza verde rilasciato dal reporter ssDNA etichettato con 5' 6-Fluoresceina a 5' e il quencher di fluorescenza a 3' attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile (lunghezza d'onda di eccitazione: 440 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500 nm).
      NOTA: il segnale di fluorescenza verde può durare diversi giorni, è meglio
      ATTENZIONE: La luce emessa dal dispositivo di rilevazione a fluorescenza è dannosa per gli occhi. Assicurati di indossare occhiali prima di osservare i risultati.

2. Test di specificità

NOTA: Per testare la specificità di CLas-DETECTR, il batterio della rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) e Burkholderia stabilis ceppo 1440 isolato in laboratorio24 sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR.

NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) non può essere coltivato. Si può ottenere DNA CLas solo dall'estrazione di DNA genomico da tessuti di agrumi infettati da CLas. Xcc è l'agente causale di un'altra importante malattia degli agrumi, il cancro degli agrumi. Burkholderia stabilis ceppo 1440 è un batterio anti-Xcc isolato in laboratorio. Pertanto, sono stati utilizzati ceppi puri per tutti e tre questi batteri.

  1. Estrarre il DNA genomico batterico (gDNA) utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico batterico seguendo il protocollo del produttore. Usa l'acqua come controllo negativo.
  2. Eseguire la PCR utilizzando strisce tubolari PCR da 0,2 ml con cappucci ottici in una miscela di reazione da 25 μL contenente 1 μL di F-RPA-RNRf, 1 μL di R-RPA-RNRr, 12,5 μL di Ex Taq Versione 2.0 più colorante, 1 μL di modello di DNA e 9,5 μL di H2O.
    1. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione del ciclo termico: 1 min a 98 °C; seguiti da 35 cicli di 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C, 15 s a 72 °C; poi 10 min a 72 °C; e tenere a 16 °C.
    2. Eseguire i prodotti PCR su gel di agarosio all'1% a 120 V per 15 minuti.
  3. Eseguire la qPCR in una miscela di reazione da 20 μL contenente 0,8 μL di F-RPA-RNRf, 0,8 μL di R-RPA-RNRr, 10 μL di 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL del modello di DNA e 7,4 μL di H2O.
    1. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione del ciclo termico: 30 s a 95 °C; seguiti da 45 cicli di 5 s a 95 °C e 32 s a 60 °C; e poi uno stadio di curva di fusione di 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C.
    2. Includi tre ripetizioni tecniche in ogni ripetizione.
  4. Eseguire il metodo CLas-DETECTR seguendo i passaggi da 1.1 a 1.4.

3. Confronto della sensibilità

  1. Per testare la sensibilità di CLas DETECTR, rilevare una serie di diluizioni di frammenti di DNA CLas utilizzando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, come descritto sopra.
  2. Amplificare un segmento di DNA con una lunghezza di 1.060 bp da nrdB utilizzando il primer set F-RNR e R-RNR in una miscela di reazione da 100 μL contenente 4 μL di F-RNR, 4 μL di R-RNR, 50 μL di PrimeSTAR Max Premix, 2 μL di DNA template e 40 μL di H2O, seguendo le condizioni di reazione del ciclo termico (30 s a 98 °C; seguiti da 35 cicli di 10 s a 98 °C, 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; poi 10 min a 72 °C; e tenere a 16 °C).
    NOTA: Il gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-) è specifico per CLas21. Si può facilmente ottenere l'amplicone nrdB dal gDNA di agrumi CLas-positivo usando il primer set F-RNR e R-RNR. Il primer set F-RNR e R-RNR amplifica un frammento nrdB da 1.060 bp, mentre il primer set F-RPA-RNR e R-RPA-RNR amplifica un frammento di 104 bp del gene nrdB, che è la parte del frammento nrdB da 1.060 bp.
  3. Purificare i prodotti PCR con un kit di estrazione del gel di DNA seguendo il manuale del produttore.
  4. Diluire i prodotti PCR contenenti gli ampliconi nrdB con ddH2O sterilizzato.
  5. Calcola il numero di copie del gene nrdB utilizzando il numero di copia del DNA online disponibile in commercio e il calcolatore di diluizione.
  6. Preparare diluizioni del DNA contenenti 2,01 × 106 copie/μL, 2,01 × 105 copie/μL, 2,01 × 104 copie/μL, 2,01 × 103 copie/μL, 2,01 × 10 2 copie/μL, 2,01 × 101 copie/μL, 2,01 × 100 copie/μL e2,01 × 10−1 copie/μL di frammenti di DNA CLas.

4. Rilevamento del campione

NOTA: Dopo il test di specificità e sensibilità, il metodo CLas-DETECTR è stato utilizzato per rilevare la presenza di CLas nei campioni di foglie di campo raccolti dagli aranci dolci di Newhall coltivati nel vivaio di risorse di germoplasma nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. È stata eseguita una qPCR per verificare i risultati.

  1. Prova un totale di 15 alberi. Usa l'acqua come controllo negativo.
  2. Eseguire i metodi CLas-DETECTR e qPCR come descritto in precedenza.
    NOTA: A causa delle caratteristiche di distribuzione non uniforme delle CLas negli agrumi, le foglie che mostrano sintomi di HLB sono state raccolte in via prioritaria. Se un albero sembrava sano, le foglie sono state raccolte in modo casualeIl sistema CLas-DETECTR funziona correttamente.

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Representative Results

Qui, abbiamo descritto una piattaforma portatile, CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a per diagnosticare HLB sul campo. Lo schema di CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.

Quando campioni di foglie provenienti dagli alberi di Newhall infetti da HLB e non infetti da HLB (Figura 1B), per i quali la presenza di CLas è stata confermata dalla PCR (Figura 1C), sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR, è stato osservato un segnale di fluorescenza verde nel campione infetto da HLB ma non nel campione non infetto da HLB e controllo negativo (Figura 1D).

Abbiamo determinato la specificità di CLas-DETECTR utilizzando acidi nucleici estratti da altri batteri. Il set di primer di F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr utilizzato nel test CLas-DETECTR è stato utilizzato anche in PCR e qPCR. Una banda potrebbe essere vista nell'elettroforesi su gel di agarosio quando amplificata usando gDNA di foglie di agrumi CLas-positivo ma non altro gDNA batterico nei saggi PCR (Figura 2A). Nei saggi qPCR, il valore medio del ciclo soglia (Ct) di CLas era 24 ± 0,7, mentre i valori medi di Ct di A. tumefaciens GV3101, Xcc e B. stabilis ceppo 1440 erano rispettivamente 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 e 39 ± 0,7 (Figura 2B). Di solito, il risultato è considerato negativo quando il valore Ct è superiore a 38. Questi risultati dimostrano che la coppia di primer F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr sono specifici per i CLa. Nel test CLas-DETECTR, solo il gDNA CLas ha dimostrato segnali di fluorescenza verde; il gDNA estratto da A. tumefaciens GV3101, Xcc e B. stabilis ceppo 1440 non lo ha fatto (Figura 2C), il che significa che CLas-DETECTR può rilevare CLas in modo specifico.

Abbiamo anche testato la sensibilità di CLas-DETECTR utilizzando una serie di diluizioni del DNA CLas. La PCR potrebbe rilevare 2,01 × 102 copie/μL (Figura 3A). D'altra parte, CLas-DETECTR potrebbe rilevare 2,01 × 100 copie / μL, il che suggerisce che questo è praticabile come diagnostica del campo sensibile (Figura 3B). La qPCR poteva rilevare 2,01 × 10−1 copie/μL, ma il valore Ct era superiore a 36 (Figura 3C). Pertanto, CLas-DETECTR è due ordini di grandezza più sensibile della PCR tradizionale e un ordine di grandezza meno sensibile della qPCR quando vengono utilizzati ampliconi diluiti (Figura 3).

Infine, abbiamo esaminato la fattibilità di CLas-DETECTR per campioni di campo e confrontato la sua sensibilità con qPCR, un approccio di rilevamento degli acidi nucleici consolidato e sensibile21. Di solito, un valore Ct di rilevamento CLas mediante qPCR superiore a 36 significa che la concentrazione di CLas è inferiore a 2,01 × 10−1 copie/μL, che è una concentrazione molto bassa (Figura 3C). Tra i 15 campioni, il valore Ct dei campioni 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 rilevati dalla qPCR era inferiore a 36 e sono stati osservati segnali di fluorescenza verde apparente (Figura 4). D'altra parte, quando i valori di Ct dei campioni 6, 7, 9, 12 e 15 rilevati dalla qPCR erano indeterminati, non sono stati osservati segnali di fluorescenza verde (Figura 4). Inoltre, deboli segnali di fluorescenza verde sono stati osservati quando i valori di Ct del campione 5 e del campione 11 rilevati da qPCR erano superiori a 36 (Figura 4). I risultati suggeriscono che la nostra piattaforma è uno strumento rapido, robusto e sensibile per la diagnosi HLB sul campo.

No Nome Sequenza (da 5' a 3')
1 crRNA1-nrdB rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrArArGrUrGrUrArGrArArUrUrUrCrArUrArGrGrCrArUrCrGrArGrArG
2 ssDNA-FQ FAM-TTTATTT-BHQ1
3 F-RPA-RNRf AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC
4 R-RPA-RNRr TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA
5 F-RNR ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC
6 R-RNR TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC

Tabella 1: Acido nucleico utilizzato in questo studio. L'ssDNA-FQ è DNA a singolo filamento marcato con 5' 6-FAM (Fluoresceina) a 5' e il quencher di fluorescenza Black Hole Quencher 1 (BHQ1) a 3'. Abbreviazioni: F = reporter fluorescente; Q = quencher di fluorescenza.

Figure 1
Figura 1: Progettazione e validazione del CLas-DETECTR. (A) Schema del saggio CLas-DETECTR. Passo 1: Preparare il tampone A contenente 20 mM NaOH in PEG 200 al 6% per una rapida estrazione del gDNA; soluzione B contenente 10 μL di tampone RPA, 0,8 μL di F-RPA-RNRf, 0,8 μL di F-RPA-RNRr e 3,9 μL di ddH2O in ciascuna reazione per l'amplificazione isoterma del DNA; C contenente 1 μL di ssDNA reporter, 3 μL di tampone NEB 3.1, 1 μL di crRNA mirato a nrdB, 4 μL di Cas12a e 11 μL di ddH2O in ciascuna reazione per il rilascio di reporter fluorescenti. Fase 2: Cinque dischi fogliari perforati dalle foglie sono stati utilizzati per estrarre il DNA totale degli agrumi con 200 μL di tampone A. Fase 3: Gli acidi nucleici specifici per CLas sono stati amplificati utilizzando i primer F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr mirati al gene marcatore specifico CLas nrdB in soluzione B con 1 μL di surnatante dallo stadio 2 e 1 μL di MgOAc a 37 °C per 15 min. Fase 4: La soluzione C con 10 μL della miscela della fase 3 è stata incubata a 37 °C per 60 minuti e il segnale di fluorescenza verde è stato osservato attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile. L'ssDNA-FQ è stato marcato con 5' 6-FAM (Fluoresceina) a 5' e un quencher di fluorescenza Black Hole Quencher 1 (BHQ1) a 3'. Abbreviazioni: F = reporter fluorescente; Q = quencher di fluorescenza. (B) L'albero infetto da HLB (a sinistra) mostra chiazze chiazzate e foglie gialle, ma l'albero non infetto da HLB (a destra) sembra verde. (C) La presenza di CLas è stata confermata utilizzando la coppia di primer F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr. (D) Il campione infetto da HLB mostra segnali di fluorescenza verde, mentre il campione infetto da HLB e H2O non lo fanno nel test CLas-DETECTR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Test della specificità di CLas-DETECTR. (A) Elettroforesi su gel di agarosio dei risultati della PCR, (B) il valore Ct dei risultati della qPCR e (C) i risultati di CLas-DETECTR amplificati con la coppia di primer di F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr utilizzando gDNA estratto da foglie di Newhall CLas-positive e altri tre batteri. Ancora una volta, H2O serviva come controllo negativo. M: scala del DNA; gDNA estratto da foglie di Newhall CLas-positive (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) e Burkholderia stabilis ceppo 1440 isolato nel nostro laboratorio (4). Il valore Ct rappresenta il valore Ct medio di tre ripetizioni tecniche ± errore standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Confronto della sensibilità di CLas-DETECTR con PCR e qPCR. Analisi di rilevamento di una serie di specifiche diluizioni di ampliconi del DNA CLas mediante (A) PCR, (B) CLas-DETECTR e (C) qPCR. (A) Da 25 μL dei prodotti PCR, 5 μL sono stati caricati nel gel. (B) Le immagini sono state catturate con una fotocamera dello smartphone attraverso occhiali protettivi sotto la luce emessa da un dispositivo portatile di rilevamento fluorescente (lunghezza d'onda di eccitazione: 440 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500 nm). Gli stessi primer sono stati utilizzati in tutti i saggi. I prodotti PCR purificati con una lunghezza di 1.060 bp amplificati con il primer set F-RNR e R-RNR mirato al gene nrdB specifico per CLas sono stati diluiti utilizzando H2O in concentrazioni di 2,01 × 106 copie/μL (1), 2,01 × 105 copie/μL (2), 2,01 × 104 copie/μL (3), 2,01 × 103 copie/μL (4), 2,01 × 102 copie/μL (5), 2,01 × 101 copie/μL (6), 2,01 × 100 copie/μL (7) e 2,01 × 10−1 copie/μL (8). H2O è servito come controllo negativo. M: Scala del DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rilevamento di CLas mediante campioni di campo. CLas in 15 campioni di foglie raccolti dagli aranci dolci di Newhall è stato testato mediante i saggi CLas-DETECTR e qPCR descritti sopra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Questo studio presenta un metodo rapido e portatile per rilevare CLas chiamato CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1. CLas-DETECTR rileva CLas con specificità e sensibilità (Figura 2 e Figura 3). Inoltre, utilizzando campioni di foglie di Newhall, CLas-DETECTR rileva CLas con la stessa sensibilità della qPCR (Figura 4). In particolare, i risultati del rilevamento possono essere visualizzati direttamente attraverso un dispositivo portatile portatile indipendente dagli strumenti di laboratorio, che è fondamentale per la diagnosi HLB in tempo reale.

Ci sono diverse considerazioni importanti per il protocollo. In primo luogo, la contaminazione incrociata dovrebbe essere rigorosamente evitata nel processo di campionamento, poiché CLas-DETECTR è sensibile quanto la qPCR. I reagenti di reazione non devono essere esposti alla luce solare intensa. Tutti i passaggi devono essere seguiti con precisione per ottenere risultati ottimali. Un controllo positivo, un plasmide contenente frammenti di geni specifici di CLas, dovrebbe essere incluso per garantire che il sistema CLas-DETECTR funzioni correttamente sul campo. Infine, tutti i rifiuti sperimentali correlati al CLas dovrebbero essere trattati come un rischio biologico e sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento.

Se non vengono rilevati segnali di fluorescenza per il controllo positivo, possono esistere inibitori nella miscela di reazione e i reagenti devono essere cambiati. Altrimenti, se la fluorescenza è troppo debole per distinguere, il tempo di incubazione può essere prolungato Il tempo di incubazione più lungo può portare a falsi positivi.

I metodi di rilevamento CLas esistenti richiedono costose macchine PCR, siti operativi fissi e personale addestrato. Tuttavia, il metodo qui presentato consente di diagnosticare HLB in modo accurato e sensibile sul campo da una vasta gamma di persone, compresi i coltivatori di agrumi.

Tuttavia, CLas-DETECTR ha alcune limitazioni. In primo luogo, i campioni di agrumi non possono essere utilizzati direttamente nel protocollo e il gDNA degli agrumi deve essere estratto. In secondo luogo, è necessario un semplice incubatore per l'RPA e l'attivazione dell'attività di nucleasi di Cas12a per risultati coerenti. In terzo luogo, i risultati devono essere visualizzati attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile. Sebbene le strisce di flusso laterali potrebbero essere impiegate per mostrare direttamente i risultati, ciò aumenterebbe

I campioni di foglie sono stati testati in questo protocollo. In futuro, CLas-DETECTR potrebbe essere applicato per rilevare la presenza di CLas in pervinche e campioni di psillidi. Inoltre, modificando il crRNA e i primer, questa tecnologia diagnostica molecolare potrebbe essere utilizzata anche per altre malattie degli agrumi, come il cancro degli agrumi, il virus del decadimento degli agrumi e il virus della frammentazione delle foglie di agrumi. Mentre stiamo lavorando su CLas-DETECTR, questo approccio è stato utilizzato anche per rilevare CLas in parallelo da altri25.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal National Key R & S Program of China (2021YFD1400805), dal Major Science and Technology R & S Program della provincia di Jiangxi (20194ABC28007), dai progetti del Dipartimento dell'istruzione di Jiangxi (GJJ201449) e dall'innovazione collaborativa della moderna ricerca scientifica agricola nella provincia di Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2)-003).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit Corning 09319KE1 China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Solarbio D1600 China
EnGen LbCas12a  TOLOBIO 32104-01 China
Ex Taq Version 2.0 plus dye TaKaRa RR902A China
Handheld fluorescent detection device  LUYOR 3415RG China
Hole puncher  Deli 114 China
Magnesium acetate, MgOAc TwistDx TABAS03KIT UK
NaOH SCR 10019718 China
NEB buffer 3.1  NEB B7203 USA
PCR strip tubes LABSELECT PST-0208-FT-C China
PEG 200  Sigma P3015 USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras TaKaRa R045A China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder  New England Biolabs N0550S USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) TaKaRa RR820B China
TwistAmp Basic TwistDx TABAS03KIT UK

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References

  1. Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
  2. Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  3. Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
  4. Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
  5. Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
  6. Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
  7. Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
  8. Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
  9. Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
  10. Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
  11. Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
  12. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  15. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
  16. Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
  17. Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
  18. Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
  19. Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
  20. Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
  21. Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
  22. Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
  23. Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
  24. Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
  25. Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).

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Biologia Numero 190
Rilevamento di <em>Candidatus</em> liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a
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Li, M., Qin, H., Long, Y., Cheng,More

Li, M., Qin, H., Long, Y., Cheng, M., Li, L., Huang, A., Wang, N., Duan, S. Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a. J. Vis. Exp. (190), e64070, doi:10.3791/64070 (2022).

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