Summary
Neste trabalho, foi desenvolvido um método de detecção rápido, sensível e portátil de Candidatus Liberibacter asiaticus baseado na amplificação da recombinase polimerase combinada com CRISPR-Cas12a.
Abstract
A detecção precoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) por citricultores facilita a intervenção precoce e previne a propagação da doença. Um método simples para o diagnóstico rápido e portátil de Huanglongbing (HLB) é apresentado aqui que combina amplificação da recombinase polimerase e um repórter fluorescente utilizando a atividade nuclease do sistema palindrômico curto agrupado regularmente interespaçado/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). A sensibilidade desta técnica é muito maior do que a PCR. Além disso, este método mostrou resultados semelhantes à qPCR quando as amostras foliares foram utilizadas. Em comparação com os métodos convencionais de detecção de CLas, o método de detecção aqui apresentado pode ser concluído em 90 min e funciona em uma condição isotérmica que não requer o uso de máquinas de PCR. Além disso, os resultados podem ser visualizados através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente no campo.
Introduction
O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças cítricas mais problemáticas do mundo1. O HLB é causado pela bactéria colonizadora de floemas e fastidiosa Candidatus Liberibacter spp., incluindo Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus 2. A espécie associada ao HLB mais prevalente na China e nos EUA é a CLas, que é transmitida por psilídeos cítricos asiáticos (Diaphorina citri) ou por enxerto3. Após serem infectadas por CLas, as árvores cítricas demonstram declínio de crescimento até a morte2. Os sintomas comuns das folhas cítricas infectadas com CLas são manchas manchadas, ilhas verdes (pequenos pontos circulares verde-escuros), veias de cortiça levantadas em folhas mais grossas e coriáceas e brotos amarelados não uniformes2. Além disso, os frutos infectados com CLas parecem pequenos e desequilibrados2.
Como nenhuma variedade cítrica é resistente ao HLB e não há cura terapêutica para o HLB, a prevenção do HLB requer a quarentena e o isolamento de citros CLas-positivos 2,3. Portanto, a detecção precoce é fundamental para o monitoramento e a quarentena para evitar a disseminação de CLas e minimizar as perdas econômicas3. Além disso, a detecção de CLas sensíveis é necessária devido ao baixo título de CLas em plantas durante o estágio inicial da infecção3. Na China, a detecção de CLas é geralmente conduzida por certos centros de teste certificados. No entanto, o processo de detecção geralmente leva pelo menos 1 semana, e a taxa de detecção é cara. Portanto, para ajudar a monitorar a incidência de HLB
Diversas tecnologias têm sido aplicadas para diagnosticar o HLB 4,5,6,7,8,9. A reação em cadeia da polimerase (PCR) e a PCR quantitativa (qPCR) são as ferramentas mais utilizadas para a detecção de CLas devido à sua alta sensibilidade e especificidade 4,5. No entanto, essas tecnologias dependem fortemente de instrumentos caros e pessoal altamente qualificado. Além disso, vários métodos de amplificação isotérmica, como a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), têm sido desenvolvidos como alternativas atraentes aos métodos convencionais de PCR devido à sua simplicidade, rapidez e baixo custo 8,9,10. No entanto, é um desafio aplicá-los para detectar com precisão CLas devido aos sinais de amplificação não específicos, o que pode causar resultados falso-positivos.
A detecção de ácido nucleico à base de endonuclease CRISPR/Cas guiada por RNA (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/associadas a CRISPR) foi desenvolvida como uma tecnologia de diagnóstico molecular de última geração devido à sua alta sensibilidade, especificidade e confiabilidade 11,12,13,14. Essas tecnologias de diagnóstico CRISPR/Cas dependem da atividade nuclease colateral das proteínas Cas para clivar o DNA de fita simples (ssDNA) modificado com um repórter fluorescente e um quencher de fluorescência em cada extremidade dos oligonucleotídeos, bem como um dispositivo de detecção de fluorescência para capturar o repórter fluorescente liberado11,12 . A atividade nuclease de vários efetores de Cas ativados pelo duplex alvo de RNA CRISPR (crRNA) pode clivar indiscriminadamente o ssDNA não-alvo circundante11. O CRISPR-Cas12a (também chamado de Cpf 1), um sistema CRISPR/CAS tipo classe 2 do tipo 2, demonstra diversas vantagens em relação ao Cas9, como menor tolerância à incompatibilidade e maior especificidade13. O sistema Cas12a/crRNA tem sido aplicado para a detecção sensível e específica dos ácidos nucleicos de patógenos e fitopatógenos humanos 14,15,16,17,18. Portanto, a utilização do sistema Cas12a/crRNA deve permitir a detecção precisa e sensível do ácido nucleico de CLas.
Cas12a sozinho não é teoricamente sensível o suficiente para detectar baixos níveis de ácidos nucleicos. Portanto, para melhorar sua sensibilidade de detecção, a detecção de CRISPR-Cas12a é tipicamente combinada com uma etapa de amplificação isotérmica14,15. A amplificação da recombinase polimerase (RPA) permite a amplificação sensível e rápida do DNA isotérmico em uma faixa de temperatura de 37 °C a 42 °C19.
Uma plataforma de detecção chamada DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) que combina a atividade da DNase de Cas12a com RPA e uma leitura de fluorescência foi recentemente concebida12 e demonstrou detectar ácido nucleico com maior sensibilidade20. Além disso, o sinal de fluorescência emitido pelas amostras positivas pode ser observado através de um dispositivo portátil de detecção de fluorescência no campo.
Como amplificamos o DNA com RPA, projetamos crRNA visando o gene nrdB de cinco cópias (ribonucleotídeo redutase β- subunidade) específico para CLas21 e empregamos a atividade DNase da proteína Cas12a, chamamos esse método de detecção de CLas de CLas-DETECTR. Em comparação com os métodos de detecção CLas existentes, o CLas-DETECTR é rápido, preciso, sensível e implantável.
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Protocol
1. Construção do CLas-DETECTR
NOTA: A construção do CLas-DETECTR é um processo de quatro etapas: preparação da solução, isolamento do DNA total dos citros, amplificação isotérmica do DNA e visualização dos resultados. O esquema do ensaio CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.
- Preparação da solução
- Preparar tampão A: 20 mM de NaOH em 6% de PEG 200. Para 100 ml, adicione 113 mg de NaOH e 6 g de PEG 200 em 80 ml de H2O num frasco. Incubar o frasco em banho-maria a 60 °C até que todo o PEG 200 esteja dissolvido. Em seguida, adicione H2O a um volume de 100 mL.
- Preparar a solução B: Para cada reacção, adicionar 10 μL de tampão RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr e 3,9 μL de ddH2O a um volume final de 15,5 μL.
NOTA: F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr são os primers utilizados no ensaio contra o gene nrdB . Consulte a Tabela 1 para a sequência. - Preparar a solução C: Para cada reacção, adicionar 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampão NEB 3.1, 1 μL de crRNA, 4 μL de Cas12a e 11 μL de ddH2O a um volume final de 20 μL.
NOTA: Se houver muitas amostras para detectar, faça um grande volume de solução B e solução C e alíquota mais tarde.
- Isolamento do DNA total dos citros
NOTA: Para economizar tempo e tornar este método adequado para a detecção de CLas de campo, a abordagem alcalina à base de polietilenoglicol (PEG) foi utilizada para a obtenção de extratos brutos de plantas para amplificação de DNA22,23- Folhas cítricas foram utilizadas neste protocolo. Primeiro, soque cinco discos de folha de uma folha. Em seguida, coloque os discos foliares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 200 μL de tampão A.
NOTA: No campo, limpe as folhas primeiro se houver poeira cobrindo-as. Os discos foliares podem ser cortados usando a tampa do tubo de 1,5 mL para evitar a contaminação cruzada. Outros tecidos cítricos, como raízes, caules, frutos e flores, também podem ser utilizados neste protocolo. - Moer os discos das folhas manualmente até alisar com uma haste de plástico.
- Deixe o tubo intacto por 10 min. Em seguida, use o sobrenadante para amplificação do DNA.
NOTA: O ensaio pode ser pausado aqui, e os extratos de plantas brutas que foram extraídos pelo método alcalino-PEG podem ser armazenados a -20 °C por pelo menos 1 ano. As árvores de laranja doce de Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) mostradas no vídeo foram cultivadas em um vaso preenchido com uma mistura de 9/3/1 (v/v/v) solo de turfa/vermiculita/perlita e mantidas em uma estufa localizada no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. As árvores infectadas pelo HLB foram inoculadas por enxertia com brotos de Newhall CLas-positivos. As árvores infectadas e não infectadas pelo HLB foram confirmadas por PCR. A CLas foi detectada usando o par de iniciadores (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) visando o gene nrdB marcador específico da CLas. Por outro lado, sintomas característicos de HLB, manchas manchadas e folhas amareladas podem ser encontrados em árvores CLas-positivas, mas não em árvores CLas-negativas.
- Folhas cítricas foram utilizadas neste protocolo. Primeiro, soque cinco discos de folha de uma folha. Em seguida, coloque os discos foliares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 200 μL de tampão A.
- Amplificação isotérmica do DNA
- Adicionar 1 μL do sobrenadante da etapa 1.2.3 e 1 μL de MgOAc (concentração final de 14 mM) à solução B e misturar bem.
- No laboratório, incube-os em uma incubadora simples a 37 °C por 15 min.
NOTA: No campo, segure os tubos na mão por 15 min. Sugere-se também incubar tubos em uma incubadora simples a 37 °C por 15 min, se as condições permitirem.
- Visualização de resultados
- Adicionar 10 μL da mistura da fase 1.3.2 à solução C e misturar bem.
- Incubá-los em uma incubadora de 37 °C por 60 min.
- Use óculos de proteção e observe o sinal de fluorescência verde liberado do repórter ssDNA rotulado com 5' 6-Fluoresceína a 5' e o quencher de fluorescência a 3' através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente (comprimento de onda de excitação: 440 nm, comprimento de onda de emissão: 500 nm).
NOTA: sinal de fluorescência verde pode durar vários dias, é melhor
CUIDADO: A luz emitida pelo dispositivo de detecção de fluorescência é prejudicial aos olhos. Certifique-se de usar óculos antes de observar os resultados.
2. Teste de especificidade
NOTA: Para testar a especificidade do CLas-DETECTR, a bactéria rizosfera Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) e Burkholderia stabilis cepa 1440 isoladas no laboratório24 foram submetidas ao teste CLas-DETECTR.
NOTA: Candidatus Liberibacter (CLas) não pode ser cultivado. Só se pode obter DNA CLas a partir da extração de DNA genômico de tecidos cítricos infectados com CLas. Xcc é o agente causal de outra importante doença cítrica, o cancro cítrico. Burkholderia stabilis cepa 1440 é uma bactéria anti-Xcc isolada em laboratório. Portanto, cepas puras para todas essas três bactérias foram usadas.
- Extraia o DNA genômico bacteriano (gDNA) usando um kit de extração de DNA genômico bacteriano seguindo o protocolo do fabricante. Use a água como um controle negativo.
- Realizar PCR utilizando tiras de tubo de PCR de 0,2 mL com tampas ópticas em uma mistura de reação de 25 μL contendo 1 μL de F-RPA-RNRf, 1 μL de R-RPA-RNRr, 12,5 μL de Ex Taq Versão 2.0 mais corante, 1 μL de molde de DNA e 9,5 μL de H2O.
- Utilizar as seguintes condições de reacção de ciclo térmico: 1 min a 98 °C; seguido de 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 30 s a 55 °C, 15 s a 72 °C; em seguida, 10 min a 72 °C; e segurar a 16 °C.
- Execute os produtos de PCR em gel de agarose a 1% a 120 V por 15 min.
- Realizar qPCR em uma mistura de reação de 20 μL contendo 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de R-RPA-RNRr, 10 μL de 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL do molde de DNA e 7,4 μL de H2O.
- Utilizar as seguintes condições de reacção de ciclo térmico: 30 s a 95 °C; seguido de 45 ciclos de 5 s a 95 °C e 32 s a 60 °C; e, em seguida, um estágio de curva de fusão de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C.
- Inclua três repetições técnicas em cada repetição.
- Execute o método CLas-DETECTR seguindo as etapas 1.1–1.4.
3. Comparação de sensibilidade
- Para testar a sensibilidade do CLas DETECTR, detecte uma série de diluições de fragmentos de DNA CLas usando PCR, CLas-DETECTR e qPCR, conforme descrito acima.
- Amplificar um segmento de DNA com um comprimento de 1.060 pb de nrdB usando o conjunto de iniciadores F-RNR e R-RNR em uma mistura de reação de 100 μL contendo 4 μL de F-RNR, 4 μL de R-RNR, 50 μL de PrimeSTAR Max Premix, 2 μL de molde de DNA e 40 μL de H2O, seguindo as condições de reação de ciclo térmico (30 s a 98 °C; seguido por 35 ciclos de 10 s a 98 °C, 15 s a 55 °C, 30 s a 72 °C; em seguida, 10 min a 72 °C; e segurar a 16 °C).
NOTA: O gene nrdB (ribonucleotídeo redutase β- subunidade) é específico para CLas21. Pode-se facilmente obter o amplificador nrdB do gDNA cítrico CLas positivo usando o conjunto de primer F-RNR e R-RNR. O conjunto de iniciadores F-RNR e R-RNR amplifica um fragmento nrdB de 1.060 pb, enquanto o conjunto de primer F-RPA-RNR e R-RPA-RNR amplifica um fragmento de 104 pb do gene nrdB, que é a parte do fragmento nrdB de 1.060 pb. - Purifice os produtos de PCR com um kit de extração de gel de DNA seguindo o manual do fabricante.
- Diluir os produtos de PCR que contêm os amplificadores nrdB com ddH2O esterilizado.
- Calcule o número de cópias do gene nrdB usando o número de cópia de DNA on-line comercialmente disponível e a calculadora de diluição.
- Preparar diluições de ADN contendo 2,01 × 106 cópias/μL, 2,01 × 105 cópias/μL, 2,01 × 104 cópias/μL, 2,01 × 103 cópias/μL, 2,01 × 10 2 cópias/μL, 2,01 × 101 cópias/μL, 2,01 × 100 cópias/μL e2,01 × 10−1 cópias/μL de fragmento de ADN CLas.
4. Detecção de amostras
NOTA: Após o teste de especificidade e sensibilidade, o método CLas-DETECTR foi utilizado para detectar a presença de CLas nas amostras de folhas de campo coletadas de laranjeiras doces Newhall cultivadas no viveiro de recursos de germoplasma no campus da Universidade Normal de Gannan, Jiangxi, China. Uma qPCR foi realizada para verificar os resultados.
- Teste um total de 15 árvores. Use a água como um controle negativo.
- Execute os métodos CLas-DETECTR e qPCR conforme descrito acima.
NOTA: Devido às características de distribuição desigual da CLas em citros, as folhas com sintomas de HLB foram coletadas prioritariamente. Se uma árvore parecia saudável, as folhas foram coletadas aleatoriamenteCLas-DETECTR sistema funciona corretamente.
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Representative Results
Aqui, descrevemos uma plataforma portátil, CLas-DETECTR, que vasculha os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a para diagnosticar o HLB em campo. O esquema do CLas-DETECTR é ilustrado na Figura 1A.
Quando amostras foliares das árvores de Newhall infectadas e não infectadas por HLB (Figura 1B), para as quais a presença de CLas foi confirmada por PCR (Figura 1C), foram submetidas ao teste CLas-DETECTR, observou-se sinal de fluorescência verde na amostra infectada por HLB, mas não na amostra não infectada por HLB e controle negativo (Figura 1D).
Determinamos a especificidade do CLas-DETECTR utilizando ácidos nucleicos extraídos de outras bactérias. O conjunto de iniciadores de F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr utilizado no ensaio CLas-DETECTR também foi utilizado em PCR e qPCR. Uma banda pôde ser observada na eletroforese em gel de agarose quando amplificada usando gDNA de folha cítrica CLas-positivo, mas não outro gDNA bacteriano nos ensaios de PCR (Figura 2A). Nos ensaios de qPCR, o valor médio do ciclo limiar (Ct) de CLas foi de 24 ± 0,7, enquanto os valores médios de Ct de A. tumefaciens GV3101, Xcc e B. stabilis da cepa 1440 foram 38 ± 0,7, 39 ± 1,4 e 39 ± 0,7, respectivamente (Figura 2B). Normalmente, o resultado é considerado negativo quando o valor de Ct é superior a 38. Estes resultados demonstram que o par de iniciadores F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr são específicos para CLas. No ensaio CLas-DETECTR, apenas o gDNA CLas demonstrou sinais de fluorescência verde; o gDNA extraído da cepa 1440 de A. tumefaciens GV3101, Xcc e B. stabilis não o fez (Figura 2C), o que significa que o CLas-DETECTR pode detectar CLas especificamente.
Também testamos a sensibilidade do CLas-DETECTR usando uma série de diluições de DNA CLas. A PCR pôde detectar 2,01 × 102 cópias/μL (Figura 3A). Por outro lado, o CLas-DETECTR pôde detectar 2,01 × 100 cópias/μL, o que sugere que este é viável como diagnóstico de campo sensível (Figura 3B). A qPCR pôde detectar 2,01 × 10−1 cópias/μL, mas o valor de Ct foi superior a 36 (Figura 3C). Portanto, CLas-DETECTR é duas ordens de magnitude mais sensível que a PCR tradicional e uma ordem de magnitude menos sensível que a qPCR quando são utilizados amplificadores diluídos (Figura 3).
Finalmente, examinamos a viabilidade do CLas-DETECTR para amostras de campo e comparamos sua sensibilidade com a qPCR, uma abordagem de detecção de ácido nucleico estabelecida e sensível21. Normalmente, um valor de Ct de detecção de CLas por qPCR superior a 36 significa que a concentração de CLas é inferior a 2,01 × 10−1 cópias/μL, o que é uma concentração muito baixa (Figura 3C). Dentre as 15 amostras, o valor de Ct das amostras 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 detectadas por qPCR foi inferior a 36, e foram observados sinais de fluorescência verde aparente (Figura 4). Por outro lado, quando os valores de Ct das amostras 6, 7, 9, 12 e 15 detectados por qPCR foram indeterminados, não foram observados sinais de fluorescência verde (Figura 4). Além disso, sinais fracos de fluorescência verde foram observados quando os valores de Ct da amostra 5 e da amostra 11 detectados por qPCR foram superiores a 36 (Figura 4). Os resultados sugerem que nossa plataforma é uma ferramenta rápida, robusta e sensível para o diagnóstico de HLB no campo.
| Não | Nome | Sequência (5' a 3') | ||||||||||||
| 1 | crRNA1-nrdB | rUrArUrUrUrUrCrUrArCrUrArArGrUrUrArArUrUrUrUrGrCrArUrArGrGrCrGrArUrUrUrUrCrGrArGrGrArG | ||||||||||||
| 2 | ssDNA-FQ | FAM-TTTATTT-BHQ1 | ||||||||||||
| 3 | F-RPA-RNRf | AAAAGTCGCACCATGCTCCATGAAGCTACC | ||||||||||||
| 4 | R-RPA-RNRr | TGTTCACATGAGGGAGCATTTAACCCCACGAA | ||||||||||||
| 5 | F-RNR | ATGGCAAATAACACAGGATTAAGCCC | ||||||||||||
| 6 | R-RNR | TTAATCCCATTTCAACCCTGCTCC | ||||||||||||
Tabela 1: Ácido nucleico utilizado neste estudo. O ssDNA-FQ é DNA de fita simples marcado com 5' 6-FAM (Fluoresceína) a 5' e o quencher de fluorescência Black Hole Quencher 1 (BHQ1) a 3'. Abreviaturas: F = repórter fluorescente; Q = quenther de fluorescência.
Figura 1: Projeto e validação do CLas-DETECTR. (A) Esquema do ensaio CLas-DETECTR. Passo 1: Preparar tampão A contendo 20 mM de NaOH em 6% de PEG 200 para extração rápida de gDNA; solução B contendo 10 μL de tampão RPA, 0,8 μL de F-RPA-RNRf, 0,8 μL de F-RPA-RNRr e 3,9 μL de ddH2O em cada reação para amplificação isotérmica de DNA; solução C contendo 1 μL de ssDNA reporter, 3 μL de tampão NEB 3.1, 1 μL de crRNA visando nrdB, 4 μL de Cas12a e 11 μL de ddH2O em cada reação para liberação de repórter fluorescente. Passo 2: Cinco discos foliares perfurados das folhas foram utilizados para extrair o DNA total dos citros com 200 μL de tampão A. Passo 3: Os ácidos nucleicos específicos de CLas foram amplificados usando os primers F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr visando o gene marcador específico de CLas nrdB na solução B com 1 μL de sobrenadante do passo 2 e 1 μL de MgOAc a 37 °C por 15 min. Passo 4: A solução C com 10 μL da mistura a partir do passo 3 foi incubada a 37 °C por 60 min, e o sinal de fluorescência verde foi observado através de um dispositivo portátil de detecção de lâmpadas fluorescentes. O ssDNA-FQ foi marcado com 5' 6-FAM (Fluoresceína) a 5' e um quencher de fluorescência Black Hole Quencher 1 (BHQ1) a 3'. Abreviaturas: F = repórter fluorescente; Q = quenther de fluorescência. (B) A árvore infectada pelo HLB (à esquerda) mostra manchas manchadas e folhas amarelas, mas a árvore não infectada pelo HLB (à direita) parece verde. (C) A presença de CLas foi confirmada pelo par de iniciadores F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr. (D) A amostra infectada pelo HLB demonstra sinais de fluorescência verde, enquanto a não infectada pelo HLB e o H2O não o fazem no ensaio CLas-DETECTR. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Testando a especificidade do CLas-DETECTR. (A) Eletroforese em gel de agarose dos resultados de PCR, (B) o valor de Ct dos resultados de qPCR e (C) os resultados de CLas-DETECTR amplificados com o par de iniciadores de F-RPA-RNRf e R-RPA-RNRr usando gDNA extraído de folhas de Newhall CLas-positivas e três outras bactérias. Novamente, H2O serviu como um controle negativo. M: Escada de DNA; gDNA extraído de folhas de Newhall CLas-positivas (1), Agrobacterium tumefaciens GV3101 (2), Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc, 3) e Burkholderia stabilis cepa 1440 isoladas em nosso laboratório (4). O valor de Ct representa o valor médio de Ct de três repetições técnicas ± erro padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação da sensibilidade do CLas-DETECTR com PCR e qPCR. Análise de detecção de uma série de diluições específicas de amplificador de DNA CLas usando (A) PCR, (B) CLas-DETECTR e (C) qPCR. (A) De 25 μL dos produtos de PCR, 5 μL foram carregados no gel. (B) As imagens foram capturadas com uma câmera de smartphone através de óculos de proteção sob a luz emitida por um dispositivo portátil de detecção fluorescente (comprimento de onda de excitação: 440 nm, comprimento de onda de emissão: 500 nm). Os mesmos primers foram utilizados em todos os ensaios. Os produtos de PCR purificados com um comprimento de 1.060 pb amplificados com o conjunto de primer F-RNR e R-RNR visando o gene nrdB específico de CLas foram diluídos usando H2O em concentrações de 2,01 × 106 cópias/μL (1), 2,01 × 105 cópias/μL (2), 2,01 × 104 cópias/μL (3), 2,01 × 103 cópias/μL (4), 2,01 × 102 cópias/μL (5), 2,01 × 101 cópias/μL (6), 2,01 × 100 cópias/μL (7) e 2,01 × 10−1 cópias/μL (8). O H2O serviu como um controle negativo. M: Escada de DNA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Detecção de CLas usando amostras de campo. CLas em 15 amostras foliares coletadas de laranjeiras doces de Newhall foram testadas pelos ensaios CLas-DETECTR e qPCR descritos acima. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo apresenta um método rápido e portátil para detecção de CLas denominado CLas-DETECTR, que combina os sistemas RPA e CRISPR-Cas12a. O fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 1. O CLas-DETECTR detecta CLas com especificidade e sensibilidade (Figura 2 e Figura 3). Além disso, usando amostras de folhas de Newhall, o CLas-DETECTR detecta CLas com a mesma sensibilidade que a qPCR (Figura 4). Notavelmente, os resultados da detecção podem ser visualizados diretamente através de um dispositivo portátil portátil independente de instrumentos baseados em laboratório, o que é crítico para o diagnóstico de HLB em tempo real.
Há várias considerações importantes para o protocolo. Primeiro, a contaminação cruzada deve ser estritamente evitada no processo de amostragem, pois o CLas-DETECTR é tão sensível quanto o qPCR. Os reagentes de reação não devem ser expostos a luz solar intensa. Todos os passos devem ser seguidos com precisão para alcançar os melhores resultados. Um controle positivo, um plasmídeo contendo fragmentos de genes específicos de CLas, deve ser incluído para garantir que o sistema CLas-DETECTR funcione corretamente no campo. Por último, todos os resíduos experimentais relacionados com CLas devem ser tratados como um risco biológico e autoclavados antes da eliminação.
Se nenhum sinal de fluorescência for detectado para o controle positivo, inibidores podem existir na mistura de reação e os reagentes precisam ser trocados. Caso contrário, se a fluorescência for muito fraca para distinguir, o tempo de incubação pode ser estendido por mais tempo, o tempo de incubação pode levar a falsos positivos.
Os métodos de detecção CLas existentes exigem máquinas de PCR caras, locais de operação fixos e pessoal treinado. No entanto, o método aqui apresentado permite que o HLB seja diagnosticado com precisão e sensibilidade no campo por uma ampla gama de pessoas, incluindo citricultores.
No entanto, CLas-DETECTR tem algumas limitações. Em primeiro lugar, as amostras de citrinos não podem ser directamente utilizadas no protocolo e o gADN dos citrinos tem de ser extraído. Em segundo lugar, uma incubadora simples é necessária para o RPA e a ativação da atividade nuclease de Cas12a para resultados consistentes. Em terceiro lugar, os resultados precisam ser visualizados através de um dispositivo portátil de detecção fluorescente. Embora as faixas de fluxo lateral pudessem ser empregadas para mostrar os resultados diretamente, isso aumentaria
Amostras foliares foram testadas neste protocolo. No futuro, o CLas-DETECTR poderia ser aplicado para detectar a presença de CLas em amostras de pervincas e psilídeos. Além disso, alterando o crRNA e os primers, essa tecnologia de diagnóstico molecular também poderia ser usada para outras doenças cítricas, como cancro cítrico, vírus do decaimento cítrico e vírus da fragmentação de folhas de citros. Enquanto estamos trabalhando no CLas-DETECTR, essa abordagem também tem sido usada para detectar CLas em paralelo por outros25.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Programa Nacional de P & D da China (2021YFD1400805), o Programa de P & D de Ciência e Tecnologia da Província de Jiangxi (20194ABC28007), Projetos do Departamento de Educação de Jiangxi (GJJ201449) e a Inovação Colaborativa da Pesquisa Científica Agrícola Moderna na Província de Jiangxi (JXXTCX2015002(3+2)-003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China |
| Hole puncher | Deli | 114 | China |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
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