Embryo Rescue Protocol voor interspecifieke hybridisatie in squash
Summary
Het artikel beschrijft een embryoreddingsprotocol voor de regeneratie van onrijpe embryo’s afgeleid van de interspecifieke hybridisatie van Cucurbita pepo en Cucurbita moschata. Het protocol kan gemakkelijk worden gerepliceerd en zal een belangrijke bron zijn voor squashfokkerijprogramma’s.
Abstract
Interspecifieke hybridisatie in Cucurbita-gewassen (squash) is wenselijk voor het verbreden van genetische variatie en voor de introgressie van nuttige allelen. Onrijpe embryo’s die uit deze brede kruisingen worden gegenereerd, moeten worden geregenereerd met behulp van geschikte embryoreddingstechnieken. Hoewel deze techniek voor veel gewassen goed ingeburgerd is, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de juiste methodologie voor squash die de routinematige toepassing ervan mogelijk zou maken. Hier beschrijven we een embryoreddingsprotocol dat nuttig is voor interspecifieke hybridisatie van C. pepo en C. moschata. Om levensvatbare combinaties voor embryoredding te identificeren, werden 24 interspecifieke kruisingen uitgevoerd. Fruitset werd verkregen uit tweeëntwintig kruisen, wat wijst op een slagingspercentage van 92%. De meeste verkregen vruchten waren echter parthenocarpisch, met zaden zonder embryo’s (lege zaden). Slechts één kruiscombinatie bevatte onrijpe embryo’s die konden worden geregenereerd met behulp van basale plantengroeimedia. In totaal werden 10 embryo’s gered uit de interspecifieke F1-vrucht en het slagingspercentage van embryoredding was 80%. Het hier ontwikkelde embryoreddingsprotocol zal nuttig zijn voor interspecifieke hybridisatie in squashveredelingsprogramma’s.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) is een zeer divers geslacht in de Cucurbitaceae-familie die 27 verschillende soorten bevat, waarvan er vijf gedomesticeerd zijn1. Hiervan zijn Cucurbita moschata, C. pepo en C. maxima wereldwijd de economisch belangrijkste. In de VS zijn C. moschata en C. pepo de twee belangrijkste soorten in de landbouwproductie. C. pepo bestaat uit vier ondersoorten (ovifera, pepo, fraternal en gumala) die zowel zomer- als winterpompoencultivargroepen van kromhals, rechte hals, eikel, sint-jakobsschelp, cocozelle, groentemerg, courgette en pompoenbevatten 2,3,4,5. C. moschata bestaat voornamelijk uit winterpompoenmarkttypen, waaronder butternut, Dickinson en kaasgroep1. De twee soorten zijn morfologisch en fenotypisch divers, waarbij C. pepo wordt beschouwd om zijn opbrengst, gehoorzaamheid, struikgroeigewoonte en diverse fruitkenmerken, waaronder fruitvorm, vruchtgrootte, vleeskleur en korstpatroon. Aan de andere kant wordt C. moschata gewaardeerd om zijn aanpassing aan hitte en vochtigheid, evenals ziekte- en plaagresistentie 6,7. Interspecifieke hybridisatie tussen C. moschata en C. pepo is niet alleen een belangrijke strategie voor introgressie van wenselijke kenmerken tussen de twee soorten, maar maakt ook de verbreding van de genetische basis in fokprogramma’s mogelijk 7,8.
Vroege kruisingen tussen C. moschata en C. pepo werden gemaakt om hun compatibiliteit en / of taxonomische barrières 9,10,11 te bepalen, terwijl latere studies zich vooral richtten op het overbrengen van wenselijke eigenschappen 12,13,14. Interspecifieke hybridisatie tussen de twee soorten is gericht op de overdracht van nieuwe eigenschappen zoals een struik- of semi-struikgroeigewoonte en verbeterde opbrengst van C. pepo, samen met ziekteresistentie, aanpassingsvermogen aan abiotische stress en verhoogde kracht van C. moschata 14,15,16. Specifieke kruisingen tussen C. pepo (P5) en C. moschata (MO3) hebben bijvoorbeeld geresulteerd in een hogere vruchtopbrengst13, terwijl C. moschata-toetredingen (Nigerian Local en Menina) op grote schaal zijn gebruikt als de primaire bron van resistentie tegen potyvirussen in gekweekte C. pepo-cultivars 17,18.
Eerdere studies toonden aan dat hybridisatie tussen C. moschata en C. pepo mogelijk is, maar moeilijk 8,15. De interspecifieke kruisingen kunnen resulteren in geen vruchtzetting (abortus), parthenocarpische vruchten zonder levensvatbare zaden (lege zaden), pitloze vruchten waar de onrijpe embryo’s zich niet ontwikkelen (stenospermocarpie) of vruchten met weinig onrijpe embryo’s die kunnen worden gered tot volwassen planten door embryoredding15,16. Er werden bijvoorbeeld geen levensvatbare zaden verkregen door C. pepo (tafelkoningin, moeder) te kruisen met C. moschata (grote kaas, vaderlijk), maar het wederzijdse kruis leverde 57 levensvatbare zaden op uit 134 bestuivingen9. Hayase verkreeg levensvatbare zaden van C. moschata en C. pepo kruisingen alleen wanneer kruisingen werden gemaakt om 04:00 uur met behulp van stuifmeel opgeslagen bij 10 °C ‘s nachts19. Baggett kruiste acht verschillende C. moschata-variëteiten met C. pepo (delicata) en meldde dat van de 103 totale bestuivingen 83 vruchten werden verkregen die normaal leken, maar geen van hen bevatte levensvatbare zaden8. In een kruising tussen C. pepo (S179) en C. moschata (NK) verkregen Zhang et al. 15 vruchten met 2.994 zaden, maar slechts 12 van die zaden waren levensvatbaar, terwijl de rest slechts rudimentaire ontwikkeling vertoonde. Deze studies suggereren dat hoewel interspecifieke kruising tussen C. moschata en C. pepo zeer gunstig is, het verkrijgen van fruit met levensvatbare zaden uit de kruisen veeleisend is16.
Embryoredding is voorgesteld als een geschikte methode om problemen te overwinnen die voortvloeien uit vroege abortering of slecht ontwikkelde embryo’s en is een van de vroegste en meest succesvolle in vitro kweektechnieken voor regeneratie van onrijpe embryo’s16,20. Embryoredding omvat de in vitro kweek van onderontwikkelde/onrijpe embryo’s, gevolgd door overdracht naar een steriel voedingsmedium om het herstel van zaailingen en uiteindelijk volwassen planten te vergemakkelijken21. Hoewel embryoredding vaak wordt gebruikt in de squashfokkerij, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de juiste methodologie die de routinematige toepassing ervan mogelijk zou maken. Het gebruik van embryoreddingstechniek om interspecifieke hybridisatiebarrières bij Cucurbita-soorten te overwinnen, werd al in 1954 gemeld22. Het succes van embryoredding in de vroege studies was echter niet gemeld of zeer laag. Metwally et al. rapporteerden een succespercentage van 10% (regeneratie in volwassen planten) onder 100 interspecifieke hybride embryo’s gered uit een kruising tussen C. pepo en C. martinezii23. Sisko et al. rapporteerden een variabel succespercentage van embryoregeneratie bij embryo’s verkregen uit verschillende kruiscombinaties: het regeneratiepercentage van hybriden verkregen door kruising van C. maxima (Bos. Max) en C. pepo (Gold Rush) was 15,5%, voor C. pepo (Courgette) en C. moschata (Hokaido) was 20%, terwijl voor C. pepo (Gold Rush) en C. moschata (Dolga) het 37,5% 24 was. Naast het genotype zijn media en in vitro kweekomstandigheden belangrijke factoren voor het succes van de techniek25,26. In de huidige studie werden verschillende kruiscombinaties tussen C. moschata en C. pepo getest en werd een eenvoudige methodologie ontwikkeld voor het gebruik van de embryoreddingstechniek in squash. De ontwikkeling van een eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbare embryoreddingstechniek zal interspecifieke hybridisatie en kiemplasmaverbetering in squashveredelingsprogramma’s vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee belangrijke knelpunten voor succesvolle interspecifieke hybridisatie tussen C. moschata en C. pepo: kruiscompatibiliteitsbarrière, die wordt bepaald door genotyperesponsiviteit om hybride embryo’s te produceren, en post-bevruchtingsbarrières, die de ontwikkeling van hybride embryo’s naar normale zaden belemmeren. Zoals eerder gemeld voor squash, onthulde de kruiscompatibiliteitstest in de huidige studie dat het grootste deel van de vrucht zich parthenocarpisch ontwikkelde, waarbij de mees…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 en het University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. . Cucurbits. , (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. ‘Butternut and C. pepo L. ‘Delicata’. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).
- Vining, K. J. . Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).
