Protocollo di salvataggio degli embrioni per l'ibridazione interspecifica nello squash
Summary
L’articolo descrive un protocollo di salvataggio embrionale per la rigenerazione di embrioni immaturi derivato dall’ibridazione interspecifica di Cucurbita pepo e Cucurbita moschata. Il protocollo può essere facilmente replicato e sarà una risorsa importante per i programmi di allevamento delle zucche.
Abstract
L’ibridazione interspecifica nelle colture di Cucurbita (zucca) è auspicabile per ampliare la variazione genetica e per l’introgressione di alleli utili. Gli embrioni immaturi generati da questi ampi incroci devono essere rigenerati utilizzando adeguate tecniche di salvataggio degli embrioni. Sebbene questa tecnica sia ben consolidata per molte colture, manca una descrizione dettagliata della metodologia appropriata per la zucca che ne consenta l’applicazione di routine. Qui descriviamo un protocollo di salvataggio degli embrioni utile per l’ibridazione interspecifica di C. pepo e C . moschata. Per identificare combinazioni praticabili per il salvataggio degli embrioni, sono stati eseguiti 24 incroci interspecifici. L’allegagione è stata ottenuta da ventidue croci, indicando un tasso di successo del 92%. Tuttavia, la maggior parte dei frutti ottenuti erano partenocarpici, con semi privi di embrioni (semi vuoti). Solo una combinazione incrociata conteneva embrioni immaturi che potevano essere rigenerati utilizzando terreni di crescita delle piante basali. Un totale di 10 embrioni sono stati salvati dal frutto interspecifico F1 e il tasso di successo del salvataggio degli embrioni è stato dell’80%. Il protocollo di salvataggio degli embrioni sviluppato qui sarà utile per l’ibridazione interspecifica nei programmi di allevamento delle zucche.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) è un genere molto diversificato della famiglia delle Cucurbitaceae che contiene 27 specie diverse, di cui cinque sono addomesticate1. Tra questi, Cucurbita moschata, C. pepo e C. maxima sono i più importanti economicamente al mondo. Negli Stati Uniti, C. moschata e C. pepo sono le due specie più importanti nella produzione agricola. C. pepo è costituito da quattro sottospecie (ovifera, pepo, fraternal e gumala) che contengono gruppi di cultivar di zucca sia estivi che invernali di crookneck, straightneck, ghianda, capesante, cocozelle, midollo vegetale, zucchine e zucca2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente di tipi di mercato di zucca invernale tra cui butternut, Dickinson e formaggio del gruppo1. Le due specie sono morfologicamente e fenotipicamente diverse, con C. pepo considerato per la sua resa, precocità, abitudine di crescita del cespuglio e diversi tratti dei frutti tra cui la forma del frutto, la dimensione del frutto, il colore della polpa e il modello di buccia. D’altra parte, C. moschata è apprezzato per il suo adattamento al calore e all’umidità, nonché per la resistenza alle malattie e ai parassiti 6,7. L’ibridazione interspecifica tra C. moschata e C. pepo non è solo un’importante strategia per l’introgressione delle caratteristiche desiderabili tra le due specie, ma consente anche l’ampliamento della base genetica nei programmi di allevamento 7,8.
I primi incroci tra C. moschata e C. pepo sono stati fatti per determinare la loro compatibilità e / o barriere tassonomiche 9,10,11, mentre studi successivi si sono concentrati principalmente sul trasferimento di tratti desiderabili12,13,14. L’ibridazione interspecifica tra le due specie ha mirato al trasferimento di nuovi tratti come l’abitudine di crescita di un cespuglio o semi-cespuglio e una migliore resa da C. pepo insieme alla resistenza alle malattie, all’adattabilità allo stress abiotico e all’aumento del vigore da C. moschata14,15,16. Ad esempio, incroci specifici tra C. pepo (P5) e C. moschata (MO3) hanno portato a una maggiore resa di frutta 13, mentre le accessioni di C. moschata (nigeriane locali e menina) sono state ampiamente utilizzate come fonte primaria di resistenza ai potyvirus nelle cultivar coltivate di C. pepo 17,18.
Studi precedenti hanno dimostrato che l’ibridazione tra C. moschata e C. pepo è possibile ma difficile 8,15. Gli incroci interspecifici potrebbero risultare in nessuna allegagione (aborto), frutti partenocarpici privi di semi vitali (semi vuoti), frutti senza semi in cui gli embrioni immaturi non riescono a svilupparsi (stenospermocarpia), o frutti con pochi embrioni immaturi che possono essere salvati in piante mature attraverso il salvataggio di embrioni15,16. Ad esempio, nessun seme vitale è stato ottenuto incrociando C. pepo (regina da tavola, materna) con C. moschata (formaggio grande, paterno), tuttavia, l’incrocio reciproco ha prodotto 57 semi vitali da 134 impollinazioni9. Hayase ha ottenuto semi vitali da incroci di C. moschata e C. pepo solo quando gli incroci sono stati fatti alle 04:00 del mattino usando polline immagazzinato a 10 ° C durante la notte19. Baggett ha incrociato otto diverse varietà di C. moschata con C. pepo (delicata) e ha riferito che su 103 impollinazioni totali, sono stati ottenuti 83 frutti che sembravano normali, ma nessuno di essi conteneva semi vitali8. In un incrocio tra C. pepo (S179) e C. moschata (NK), Zhang et al. hanno ottenuto 15 frutti con 2.994 semi, ma solo 12 di quei semi erano vitali mentre i restanti mostravano solo uno sviluppo rudimentale. Questi studi suggeriscono che anche se l’incrocio interspecifico tra C. moschata e C. pepo è altamente benefico, ottenere frutti con semi vitali dagli incroci è impegnativo16.
Il salvataggio degli embrioni è stato suggerito come metodo appropriato per superare i problemi derivanti dall’aborto precoce o da embrioni poco sviluppati ed è una delle prime e più efficaci tecniche di coltura in vitro per la rigenerazione di embrioni immaturi16,20. Il salvataggio degli embrioni comporta la coltura in vitro di embrioni sottosviluppati/immaturi, seguita dal trasferimento in un mezzo nutritivo sterile per facilitare il recupero delle piantine e, infine, delle piante mature21. Sebbene il salvataggio degli embrioni sia comunemente usato nell’allevamento di zucche, manca una descrizione dettagliata della metodologia appropriata che consentirebbe la sua applicazione di routine. L’uso della tecnica di salvataggio degli embrioni per superare le barriere di ibridazione interspecifica nelle specie di Cucurbita è stato segnalato già nel 195422. Tuttavia, il successo del salvataggio degli embrioni nei primi studi non è stato segnalato o molto basso. Metwally et al. hanno riportato un tasso di successo del 10% (rigenerazione in piante mature) tra 100 embrioni ibridi interspecifici salvati da un incrocio tra C. pepo e C. martinezii23. Sisko et al. hanno riportato un tasso variabile di successo della rigenerazione embrionale tra embrioni ottenuti da diverse combinazioni incrociate: il tasso di rigenerazione degli ibridi ottenuti incrociando C. maxima (Bos. Max) e C. pepo (Gold Rush) è stato del 15,5%, per C. pepo (Zucchine) e C. moschata (Hokaido) è stato del 20%, mentre per C. pepo (Gold Rush) e C. moschata (Dolga) è stato del 37,5%24. Oltre al genotipo, i terreni e le condizioni di coltura in vitro sono fattori importanti per il successo della tecnica25,26. Nel presente studio, sono state testate varie combinazioni incrociate tra C. moschata e C. pepo ed è stata sviluppata una semplice metodologia per utilizzare la tecnica di salvataggio degli embrioni nella zucca. Lo sviluppo di una tecnica di salvataggio degli embrioni semplice e facilmente riproducibile faciliterà l’ibridazione interspecifica e il miglioramento del germoplasma nei programmi di allevamento delle zucche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esistono due principali colli di bottiglia per il successo dell’ibridazione interspecifica tra C. moschata e C. pepo: la barriera di compatibilità incrociata, che è determinata dalla reattività del genotipo per produrre embrioni ibridi, e le barriere post-fecondazione, che ostacolano lo sviluppo di embrioni ibridi a semi normali. Come precedentemente riportato per la zucca, il test di compatibilità incrociata nel presente studio ha rivelato che la maggior parte del frutto si è sviluppata partenocar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 e l’Istituto di scienze alimentari e agricole dell’Università della Florida.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
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