スカッシュにおける種間ハイブリダイゼーションのための胚レスキュープロトコル
Summary
この記事では、 ペポカボチャ と モシャタ菌の種間交配に由来する未熟胚の再生のための胚救助プロトコルについて説明しています。プロトコルは簡単に複製でき、スカッシュ繁殖プログラムの重要なリソースになります。
Abstract
ククルビタ作物(スカッシュ)における種間ハイブリダイゼーションは、遺伝的変異の拡大および有用な対立遺伝子の侵入のために望ましい。これらの広い交配から生成された未熟胚は、適切な胚救助技術を使用して再生する必要があります。この技術は多くの作物で十分に確立されていますが、その日常的な適用を可能にするスカッシュの適切な方法論の詳細な説明は不足しています。ここでは、C. pepoとC. moschataの種間ハイブリダイゼーションに有用な胚レスキュープロトコルについて述べる。胚救助のための実行可能な組み合わせを特定するために、24の種間交雑が実施された。結実は22の交配から得られ、92%の成功率を示した。しかし、得られた果実のほとんどは単為結実であり、種子には胚(空の種子)が含まれていませんでした。1つの交雑組み合わせのみが、基礎植物成長培地を使用して再生できる未熟胚を含んでいました。種間F1果実から合計10個の胚が救出され、胚救助の成功率は80%であった。ここで開発された胚救助プロトコルは、スカッシュ育種プログラムにおける種間ハイブリダイゼーションに役立ちます。
Introduction
ウリ科(2n = 40)は、ウリ科の非常に多様な属であり、27の異なる種を含み、そのうち5種は家畜化されています1。これらの中で、ククルビタモシャタ、C.ペポ、 およびC.マキシマは世界で最も経済的に重要です。米国では、C. moschataとC. pepoが農業生産において最も重要な2つの種です。C. pepoは、クルックネック、ストレートネック、ドングリ、ホタテ、ココゼル、野菜骨髄、ズッキーニ、カボチャの夏と冬のカボチャの両方の品種グループを含む4つの亜種(オビフェラ、ペポ、兄弟、およびグマラ)で構成されています2,3,4,5。C. moschataは主に、バターナッツ、ディキンソン、チーズグループ1などの冬カボチャ市場タイプで構成されています。2種は形態学的にも表現型的にも多様であり、C. pepoは収量、早さ、茂みの成長習慣、果実の形、果実の大きさ、果色、皮の模様などの多様な果実形質が評価されています。一方、C. moschataは、熱と湿度、および病害虫抵抗性への適応で高く評価されています6,7。C. moschataとC. pepoの間の種間交雑は、2つの種間の望ましい特性の導入のための重要な戦略であるだけでなく、育種プログラムにおける遺伝的基盤の拡大も可能にします7,8。
C. moschataとC. pepoの初期の交配は、それらの適合性および/または分類学的障壁を決定するために行われました9,10,11、その後の研究は主に望ましい形質の伝達に焦点を当てていました12,13,14。2つの種間の種間交配は、病害抵抗性、非生物的ストレスへの適応性、およびC. moschataからの活力の増加とともに、ブッシュまたはセミブッシュの成長習慣などの新しい形質の伝達とC.ペポからの収量の改善を標的としています14,15,16。例えば、C. pepo(P5)とC. moschata(MO3)の間の特定の交配は、より高い果実収量をもたらしました13が、C. moschataアクセッション(ナイジェリアローカルおよびメニーナ)は、栽培されたC.ペポ栽培品種のポチウイルスに対する耐性の主要な供給源として広く使用されています17,18。
以前の研究では、C. moschataとC. pepoの間のハイブリダイゼーションは可能であるが困難であることが示された8,15。種間交配は、結実なし(流産)、生存可能な種子のない単為結実の果実(空の種子)、未熟胚が発達しない種なし果実(狭窄精子)、または胚救助によって成熟植物に救助できる未熟胚がほとんどない果実をもたらす可能性があります15,16。例えば、C. pepo(テーブルクイーン、母方)とC. moschata(大きなチーズ、父方)を交配しても生存可能な種子は得られませんでしたが、相互交配は134の受粉から57の生存可能な種子を生み出しました9。早瀬は、10°Cで一晩保存した花粉を用いて、午前4:00に交配を行った場合にのみ、C. moschataおよびC. pepo交配から生存種子を得た19。バゲットは、8つの異なるC. moschata品種をC. pepo(デリカタ)と交配し、103の総受粉のうち、正常に見える83の果実が得られましたが、それらのどれにも生存可能な種子が含まれていなかったと報告しました8。C. pepo (S179) と C. moschata (NK) の交配では、Zhangらは2,994個の種子を含む15個の果実を得たが、そのうち12個のみが生存可能であり、残りは初歩的な発達しか示さなかった。これらの研究は、C. moschataとC. pepoの間の種間交配が非常に有益であるにもかかわらず、交配から生存可能な種子を持つ果実を得ることが要求されていることを示唆しています16。
胚レスキューは、早期流産または発達不良の胚から生じる問題を克服するための適切な方法として提案されており、未熟胚の再生のための最も早く、最も成功した体外培養技術の1つです16,20。胚救助には、未発達/未熟な胚のin vitro培養とそれに続く無菌栄養培地への移植が含まれ、実生の回復を促進し、最終的には成熟した植物21。胚レスキューはスカッシュ育種で一般的に使用されていますが、その日常的な適用を可能にする適切な方法論の詳細な説明は不足しています。Cucurbita種における種間ハイブリダイゼーション障壁を克服するための胚救助技術の使用は、早くも1954年に報告された22。しかし、初期の研究における胚救助の成功は、報告されていないか、非常に低かった。Metwallyらは、C. pepoとC. martinezii23の交配から救出された100個の種間雑種胚のうち、10%の成功率(成熟した植物への再生)を報告した。Siskoらは、異なる交配の組み合わせから得られた胚の間で胚再生の成功率がばらつきがあることを報告しました:C. maxima(Bos. Max)とC. pepo(ゴールドラッシュ)を交配することによって得られた雑種の再生率は15.5%、C. pepo(ズッキーニ)とC. moschata(北海道)は20%、C. pepo(ゴールドラッシュ)とC. moschata(ドルガ)は37.5%でした24。 遺伝子型に加えて、培地およびインビトロ培養条件は、技術の成功のための重要な要素である25,26。本研究では、C. moschataとC. pepoの様々な交雑組み合わせをテストし、スカッシュにおける胚救助技術を利用するための簡単な方法論を開発した。シンプルで容易に再現可能な胚救助技術の開発は、スカッシュ育種プログラムにおける種間ハイブリダイゼーションと生殖質増強を促進するでしょう。
Protocol
Representative Results
Discussion
C. moschataとC. pepoの種間ハイブリダイゼーションを成功させるには、ハイブリッド胚を生成するための遺伝子型応答性によって決定される交差適合性障壁と、正常な種子への雑種胚の発生を妨げる受精後障壁の2つの主要なボトルネックがあります。スカッシュについて以前に報告されたように、現在の研究の相互適合性試験では、ほとんどの果実が単為結実で発達し、ほとんどの…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、USDA国立食品農業研究所、NRSプロジェクト番号によってサポートされました。FLA-TRC-006176およびフロリダ大学食品農業科学研究所。
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
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