Summary
ويصف هذا البروتوكول تبلور بلورات الجليد المجهرية وهيدرات الكلاثرات في أجهزة الموائع الدقيقة، مما يتيح تبادل السوائل حول البلورات المشكلة. وهذا يوفر إمكانيات لا مثيل لها لدراسة عملية التبلور وآليات ربط المثبطات.
Abstract
يعد الوصف الميكانيكي الدقيق لتبلور المياه أمرا صعبا ويتطلب بعض العناصر الرئيسية: التحكم الرائع في درجة الحرارة للسماح بتكوين بلورات مجهرية واحدة ونظام مجهري مناسب مقترن بالمرحلة الباردة. تضيف الطريقة الموضحة هنا ميزة مهمة أخرى تتضمن تبادل المحاليل حول بلورات هيدرات الجليد والكلاثرات. يتكون النظام الموصوف من مزيج من الأدوات الفريدة والمطورة محليا ، بما في ذلك الموائع الدقيقة ، والمراحل الباردة عالية الدقة ، والفحص المجهري الفلوري. تم تصميم المرحلة الباردة لأجهزة الموائع الدقيقة وتسمح بتكوين بلورات ثلجية / هيدرات بحجم ميكرون داخل قنوات الموائع الدقيقة وتبادل المحاليل حولها. دقة درجة الحرارة واستقرار المرحلة الباردة هي ميليكلفن واحد ، وهو أمر بالغ الأهمية للتحكم في نمو هذه البلورات الصغيرة. يستخدم هذا النظام المتنوع لدراسة العمليات المختلفة لتبلور الجليد والهيدرات والآلية التي يتم من خلالها تثبيط نمو هذه البلورات. يصف البروتوكول كيفية تحضير أجهزة الموائع الدقيقة ، وكيفية زراعة البلورات المجهرية والتحكم فيها في قنوات الموائع الدقيقة ، وكيف أن استخدام تدفق السوائل حول بلورات الجليد / الهيدرات يوفر رؤى جديدة في تبلور الماء.
Introduction
تحمي البروتينات المضادة للتجمد (AFPs) والبروتينات السكرية المضادة للتجمد (AFGPs) مختلف الكائنات الحية المتكيفة مع البرد من أضرار الصقيع1. تمنع AFPs و AFGPs (المعممة باسم AF (G) Ps) نمو بلورات الجليد عن طريق الارتباط بشكل لا رجعة فيه بأسطحها وتثبيط المزيد من النمو بسبب تأثير Gibbs-Thomson 2,3,4,5. تسمى الفجوة الناتجة التي تتشكل بين درجة حرارة الانصهار ، والتي لم تتغير إلى حد كبير ، ودرجة حرارة التجمد المكتئبة حديثا بالتباطؤ الحراري (TH) وتمثل معلمة قابلة للقياس تتوافق مع نشاط AFP6. إن استخدام AFPs لمنع نمو الجليد له تطبيقات بعيدة المدى ومتنوعة ، مما يوفر تعزيزا محتملا في مختلف المجالات ، بما في ذلك الحفظ بالتجميد ، وجودة الأغذية المجمدة ، وحماية المحاصيل المعرضة للبرد.
يؤدي تبلور الماء في درجات حرارة منخفضة وضغوط عالية في وجود جزيئات عضوية صغيرة إلى تكوين هيدرات كلاثرات (أو هيدرات غاز) ، حيث يكون الهيدرات الأكثر وفرة هو هيدرات الميثان7. قد يؤدي تبلور هيدرات الميثان في خطوط تدفق الغاز / النفط إلى حدوث سدادات ، مما قد يسبب انفجارات بسبب اشتعال الغاز8،9،10. تشمل الجهود الحالية لمنع تبلور الهيدرات في خطوط التدفق استخدام مثبطات الديناميكا الحرارية (الكحول والجليكولات) والحركية (البوليمرات بشكل رئيسي)11،12،13،14. كما وجد أن ال AFPs ترتبط ببلورات هيدرات الكلاثرات وتمنع نموها ، مما يشير إلى الاستخدام المحتمل ل AFPs لإعاقة تكوين المقابس ، وبالتالي توفير حل أكثر اخضرارا15.
الموائع الدقيقة هي طريقة سائدة تستخدم لدراسة خصائص السوائل في أحجام العينات الصغيرة (وصولا إلى fL) التي تتدفق عبر شبكة من القنوات الدقيقة16. تتبع القنوات الدقيقة نمطا تم إنشاؤه على رقاقة السيليكون (القالب) باستخدام الطباعة الحجرية17. من المواد الشائعة الاستخدام لتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهي غير مكلفة وبسيطة نسبيا للعمل معها في مختبرات البحوث. يتكون تصميم الميزات (القنوات) فيما يتعلق بالغرض المحدد للجهاز ؛ وبالتالي ، يمكن استخدامه لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك استشعار الحمض النووي18 ، والتشخيص الطبي19 وعمليات التبلور3،20،21.
يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة من نوعها للموائع الدقيقة لزراعة بلورات الجليد والهيدرات بحجم ميكرون مع مثبطات مختلفة ، بما في ذلك AFPs و AFGPs. بالنسبة لهذه التجارب ، تم استخدام هيدرات Tetrahydrofuran (THF) لمحاكاة خصائص هيدرات غاز الميثان22 ، والتي تتطلب معدات متخصصة للتحكم في الضغط ودرجة الحرارة23. تم استخدام AF (G) Ps المسمى بالفلورسنت لتصور وتحليل امتزاز البروتينات على سطح الكريستال ، وإلى جانب التصوير الفلوري ، سمح نهج الموائع الدقيقة بالحصول على السمات الرئيسية لعملية ربط هذه الجزيئات بالأسطح الكريستالية.
Protocol
1. تصنيع جهاز الموائع الدقيقة
- قم بتغطية السطح الداخلي لطبق بتري بورق الألمنيوم وضع القالب المعد مسبقا في طبق بتري.
- قم بتصنيع القوالب باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الموضحة في المراجع. ويبين الشكل 1 تصميمي الجهازين المستخدمين في هذا العمل.
- تحضير 30-40 مل من خليط PDMS عن طريق وزن خليط 1:10 (بالوزن) من عامل المعالجة والمطاط الصناعي (انظر جدول المواد) والخلط المستمر لمدة 5 دقائق تقريبا حتى يظهر الخليط أبيض وغير شفاف تقريبا.
ملاحظة: ضع كوبا بلاستيكيا على ميزان الوزن، واسكب المطاط الصناعي في الكوب، ثم أضف عامل المعالجة لتحقيق نسبة وزن 1:10. - صب خليط PDMS في طبق بتري مع القالب والديغا في مجفف حتى لا تبقى أي فقاعات (حوالي 30 دقيقة).
- اخبز القالب مع PDMS السائل في فرن أو على صفيحة ساخنة عند 70 درجة مئوية حتى يتم الحصول على اتساق يشبه المطاط. تستغرق هذه العملية حوالي ساعة.
- قم بقص الجهاز عن طريق تتبع الميزات باستخدام مشرط ، مع الحرص على المضي قدما باستخدام المشرط بدلا من الأسفل لأن القالب هش. قم بإزالة جهاز PDMS المقطوع ، وضعه رأسا على عقب في طبق بتري جديد. قم بإزالة جزيئات الغبار والأوساخ من السطح السفلي عن طريق توصيل وإزالة قطعة من الشريط اللاصق (انظر جدول المواد).
- استخدم إبرة حقنة حادة (20 جم) لثقب الثقوب في الجهاز بناء على النمط المطبوع ، باستخدام المجهر إذا لزم الأمر. تأكد من أن الثقب يخترق الجانب الآخر من الجهاز ، واستخدم الملقط لإزالة القطع المثقوبة.
- اغسل الغطاء جيدا (18 × 18 مم ، بسماكة 0.14 مم) بالماء والصابون ، ثم باستخدام الأيزوبروبانول. استخدم ضغط الهواء لتجفيف الغطاء الذي تم تنظيفه.
- أدخل PDMS الذي تم تنظيفه والغطاء في منظف البلازما ، وأغلق الصمامات ، وقم بتشغيل الطاقة والمكنسة الكهربائية والمضخة. اسمح لمنظف البلازما بالعمل لمدة دقيقة تقريبا ، واضبط التردد اللاسلكي على HI ، واسمح لبعض الهواء بدخول منظف البلازما باستخدام الصمام الدقيق.
- عندما يتغير لون نافذة العرض من الأرجواني إلى الوردي ، دع منظف البلازما يعمل لمدة 50 ثانية وقم بإيقاف تشغيل الترددات اللاسلكية. حافظ على تشغيل المضخة لمدة دقيقة ، وبعد إيقاف تشغيلها ، افتح الصمام الرئيسي تدريجيا للسماح للهواء بالدخول إلى منظف البلازما.
ملاحظة: هناك طريقة بديلة لتحقيق نتائج قابلة للمقارنة وهي الترابط الحراري. لهذه الطريقة ، ضع القالب على الغطاء وضعه على صفيحة ساخنة مضبوطة على 70-80 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة تقريبا.
- عندما يتغير لون نافذة العرض من الأرجواني إلى الوردي ، دع منظف البلازما يعمل لمدة 50 ثانية وقم بإيقاف تشغيل الترددات اللاسلكية. حافظ على تشغيل المضخة لمدة دقيقة ، وبعد إيقاف تشغيلها ، افتح الصمام الرئيسي تدريجيا للسماح للهواء بالدخول إلى منظف البلازما.
- اضغط على سطح PDMS على الغطاء النظيف وتأكد من أنها مرتبطة من خلال عدم ملاحظة أي انفصال عند سحبها قليلا على الغطاء العلوي.
- قم بتأمين إبرة إبرة حادة بزاوية 90 درجة (18 جم) بزوج من الكماشة واسحب موصل المحقنة البلاستيكية لإزالتها. أدخل أحد طرفي الإبرة في أنبوب Tygon (0.020 "ID، 0.060" OD، انظر جدول المواد) والطرف الآخر في أحد الثقوب المثقوبة للجهاز. كرر العملية للثقوب الأخرى.
- لإزالة فقاعات الهواء ، قم بحقن الماء / المخزن المؤقت في القنوات باستخدام حقنة زجاجية (المضخة اختيارية ، ولكن لم يتم استخدام أي مضخة هنا). قم بتصفية جميع السوائل باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر قبل حقنها في الجهاز.
- استخدم عامل حجب مثل محلول BSA بنسبة 1٪ لمنع ربط AFPs الموسومة بالتألق على جدران PDMS. حقن عامل الحجب في قناة المدخل واسمح له بالبقاء في القنوات الدقيقة لمدة 20 دقيقة. ثم قم بحقن محلول المخزن المؤقت في قناة المدخل لطرد محلول BSA.
ملاحظة: يتم توصيل جهاز PDMS الناتج بغطاء على طول سطحه السفلي ، ومتصل بأنابيب في فتحات المدخل والمخرج ، ومغلف بعامل حجب في قنواته.
2. إعداد جهاز الموائع الدقيقة
- ضع كمية صغيرة من زيت الغمر على سطح المرحلة الباردة النحاسية (انظر جدول المواد) وانشرها باستخدام منديل خال من الوبر لإنشاء طبقة رقيقة من الزيت. بعد ذلك ، ضع قرص ياقوت نظيف (انظر جدول المواد) على طبقة الزيت التي تم إنشاؤها. ضع قطرة من زيت الغمر على وسط قرص الياقوت وضع جهاز PDMS على الأسفل بحيث يتم محاذاة ميزات الجهاز فوق فتحة العرض في المرحلة الباردة.
- قم بتثبيت الجهاز في مكانه وقم بتثبيت الأنبوب على الجدران الخارجية لصندوق الألومنيوم الذي يضم المرحلة الباردة باستخدام شريط لاصق. قم بتدوين موضع كل أنبوب محدد.
- استخدم حقنة زجاجية لحقن 4-5 ميكرولتر من محلول AF(G)P (انظر جدول المواد) في قناة المدخل. أغلق غطاء المرحلة الباردة.
ملاحظة: يمكن تنويع تركيز محاليل AFP وتحديدها بناء على شدة التألق. وفي هذا البروتوكول، كان نطاق التركيزات 5-40 ميكرولتر.
3. تشكيل بلورات واحدة في قنوات الموائع الدقيقة
- قم بتطهير المرحلة الباردة بالهواء الجاف / النيتروجين لمنع التكثيف من التشكل داخلها. قم بتنشيط حمام تبريد دائري لتدوير الماء خلال المرحلة الباردة ويكون بمثابة بالوعة حرارية.
- بدء برنامج التحكم في درجة الحرارة وتعيين درجة الحرارة إلى -25 درجة مئوية.
ملاحظة: سيحدث التجميد عندما تصل العينة إلى درجة حرارة ~-20 درجة مئوية ، والتي يمكن ملاحظتها على أنها سواد مفاجئ وخشونة العينة. يمكن استخدام أي هدف في هذه المرحلة ، ويفضل أن يكون الهدف 4x ، والذي يمكن المستخدم من مراقبة كامل قنوات الموائع الدقيقة. - ببطء، مع زيادة درجة الحرارة بمقدار 1 درجة مئوية / 5 ثانية تقريبا، تقترب من نقطة انصهار العينة، والتي يمكن أن تتراوح من -1 إلى -0.2 درجة مئوية اعتمادا على المخزن المؤقت المستخدم في محلول AF(G)P. عندما تقترب درجة الحرارة من نقطة الانصهار ، انتظر حتى يتم عزل عدد قليل من البلورات المفردة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن إذابة الجليد غير المرغوب فيه محليا باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء (980 نانومتر) (انظر جدول المواد)، والذي يتم تثبيته على المجهر. يذوب الليزر بلورات الجليد القريبة طالما أنه قيد التشغيل. - في هذه المرحلة ، يوصى بالتبديل إلى أهداف 10x أو 20x لمراقبة البلورات الفردية بشكل أفضل. بعد الحصول على بلورة واحدة في الموقع المطلوب ، قم بزراعة البلورة عن طريق خفض درجة الحرارة قليلا (بمقدار 0.01 درجة مئوية تقريبا) حتى تلتقي حواف البلورة بجدران القناة.
- قم بالتبديل إلى هدف 50x ، وحقن محلول AF (G) P في القنوات ، ولاحظ زيادة كثافة التألق ، مما يشير إلى أن محلول البروتين تم حقنه بنجاح في القنوات. قم بتنفيذ هذه الخطوة بعناية لتجنب ذوبان بلورة الجليد أثناء تبادل الحلول. راقب عن كثب واضبط كل من معدل التدفق (عن طريق تطبيق ضغط أكثر / أقل على المحقنة الزجاجية) ودرجة الحرارة أثناء عملية تبادل المحلول.
- اسمح للبروتينات بوقت كاف للتراكم والارتباط بسطح الكريستال.
ملاحظة: يختلف هذا بناء على معدلات التراكم والامتزاز ل AF(G)P 5,25. في تجربة نموذجية ، يسمح ب 5-10 دقائق لتراكم AFP
4. قياس نشاط التباطؤ الحراري (TH)
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية.
- حدد درجة انصهار البلورة عن طريق ضبط درجة الحرارة بخطوات صغيرة تبلغ 0.002 درجة مئوية ومراقبة أعلى درجة حرارة يمكن أن تتعرض لها بلورة صغيرة دون ذوبانها.
- على وظيفة RAMP الخاصة بوحدة التحكم في درجة الحرارة ، اضبط معدل التبريد على -0.05 إلى -0.01 درجة مئوية / 4 ثانية وقم بتنشيط RAMP . لاحظ درجة الحرارة الدقيقة التي يحدث فيها نمو البلورات المفاجئ.
ملاحظة: تسمى هذه القيمة درجة حرارة الانفجار وتتوافق مع درجة حرارة التجميد. الفرق بين درجات حرارة الانصهار والتجميد هو نشاط TH25.
5. تبادل الحل حول بلورات واحدة
- تأكد من أن درجة حرارة العينة في فجوة TH لمنع ذوبان أو نمو البلورة أثناء التجربة.
- سجل عملية تبادل الحلول باستخدام برنامج تصوير عناصر NIS (انظر جدول المواد) لتحليل بيانات التألق لاحقا. حقن المحلول العازل ببطء في المدخل الثاني لجهاز الموائع الدقيقة ، ولاحظ انخفاضا في إشارة الفلورسنت بمعدل يعتمد على الضغط المطبق على المحقنة.
- استخدم هذا التمثيل المرئي للتأكد من أن الضغط المطبق ليس مرتفعا جدا حتى لا يتسبب في ذوبان الكريستال. انظر الشكل 2 للحصول على سلسلة من الصور التي توضح عملية تبادل الحلول.
- قياس شدة التألق في قناة الموائع الدقيقة باستخدام برنامج التصوير.
ملاحظة: يجب أن تصل الإشارة إلى ذروتها في المنطقة القريبة من سطح البلورة، مما يشير إلى ارتباط AFP، ويجب أن تكون منخفضة نسبيا في المحلول المحيط، الذي تم مسحه بمخزن مؤقت. - قم بقياس نشاط TH بعد تبادل الحلول باتباع الخطوة 4.
- كرر التجربة عن طريق عزل بلورة جديدة (الخطوات 3.3-3.5). حقن محلول AFP بحقنة زجاجية وكرر تبادل المحلول (الخطوات 5.1-5.3). احصل على بلورة واحدة جديدة (الخطوات 3.3-3.5) واسكب محلول AFP في القنوات باستخدام المحقنة الزجاجية.
6. تجارب مع هيدرات كلاثرات
- للحصول على هيدرات THF ، قم بإعداد محلول THF / ماء بنسبة مولية تبلغ 1:15 ، وهي نسبة حجم 1:3.326. حافظ على هذه النسبة في جميع المحاليل المستخدمة في التجارب التالية، بما في ذلك تلك التي تحتوي على AF(G)Ps أو مثبطات أخرى.
- اتبع الخطوتين 1 و 2 لإعداد جهاز الموائع الدقيقة ووضعه في المرحلة الباردة. اضبط درجة الحرارة على -25 درجة مئوية ؛ سوف تتجمد العينة عند ~-20 درجة مئوية كما هو موضح في الخطوة 3.2.
- بعد تجميد محلول THF ، قم بزيادة درجة الحرارة ببطء حتى يذوب كل الجليد.
ملاحظة: درجة انصهار الجليد مكتئبة قليلا بواسطة THF. - لضمان ذوبان جميع بلورات الجليد عند استبعاد الهيدرات ، حافظ على درجة الحرارة عند 1 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- اضبط درجة الحرارة على -2 درجة مئوية ولاحظ وفرة الهيدرات التي تظهر في قنوات الموائع الدقيقة في حالة عدم وجود مثبطات.
ملاحظة: تتشكل هيدرات THF على شكل ثماني السطوح (الشكل 2) ، وفي بعض الحالات ، تكون البلورات رقيقة جدا. وبالتالي ، قد تكون الملاحظة الواضحة صعبة. في هذه الحالات، يوصى بتكرار الخطوات من 6.4 إلى 6.5 للحصول على بلورات جديدة. - حقن AF (G) P / مثبط في قناة الموائع الدقيقة باستخدام حقنة الزجاج أثناء ضبط درجة الحرارة لضمان عدم ذوبان / نمو البلورات التي تم الحصول عليها. اسمح لبضع دقائق حتى تمتص جزيئات المثبط سطح الكريستال.
- إذا لزم الأمر، قم بقياس نشاط TH باتباع الخطوة 4.
- تبادل المحلول حول البلورات كما هو موضح في الخطوات 5.2-5.3.
Representative Results
تبادل الحلول مع بلورات الثلج
يتم عرض تبادل حل ناجح حول بلورة الجليد في الشكل 3. يشير الطابع الزمني لكل لقطة إلى أن تبادل الحلول كان سريعا نسبيا. ومع ذلك ، فإن التبادل الأبطأ ممكن. ويلاحظ بوضوح شدة التألق القادمة من جزيئات AFGP الممتزجة بالجليد بعد اكتمال التبادل (الشكل 3، على اليمين). ويرصد تحليل كمي لتركيز ال AFP على سطح الجليد باستخدام أداة معينة لمنطقة الاهتمام (الشكل 4). في هذه التجربة4 ، تم استخدام AFP من النوع الثالث (QAE isoform) المخفف في 50 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.8) و 100 mM NaCl. يتم تبادل المحلول حول بلورة ثنائية الشكل ، ويتم مراقبة شدة التألق في المحلول وعلى الجليد. يتم تقليل المخطط الأحمر الذي يشير إلى إشارة التألق في المحلول بعامل 100 أثناء تبادل المحلول ، بينما تظل الإشارة المحسوبة (المخطط الأخضر) على سطح الجليد ثابتة. تم الحصول على الإشارة المحسوبة للجزيئات الممتزجة بالجليد عن طريق طرح الإشارة القادمة من المحلول (مضروبة في ثابت يتعلق بسمك قناة الموائع الدقيقة) من الإشارة القادمة من الجليد4.
تبادل المحلول مع هيدرات THF
أجريت تجارب الموائع الدقيقة مع هيدرات THF بشكل مشابه للتجارب مع الجليد. بعد السماح لبلورات الهيدرات بامتصاص جزيئات المثبطات من المحلول ، تم حقن محلول خال من المثبطات في القنوات. يعرض الشكل 5 هيدرات THF بعد تبادل المحلول مع نوعين من المثبطات: AFGP1-5 المسمى بإيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) (الشكل 5A) والسافرانين O (انظر جدول المواد) ، وهي صبغة فلورية26 (الشكل 5B). هذا هو أول شيطان من AFGP ملزمة لسطح هيدرات كلاثرات.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لقنوات الموائع الدقيقة المستخدمة في هذه الدراسة. يتضمن كلا التصميمين مدخلين ومنفذا واحدا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: هيدرات THF التي تشكلت في قناة الموائع الدقيقة بعد تبريد درجة الحرارة إلى ~-2 درجة مئوية. مورفولوجيا جميع البلورات المقدمة هي رباعي السطوح. ومع ذلك ، يتم توجيه بعض البلورات بشكل مختلف. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تجربة تمثيلية تعرض تبادل المحلول حول بلورة جليدية واحدة في قناة ميكروفلويدية. في البداية ، احتوى الحل على AFGP1-5 المسمى ب FITC ، ولم يتم ملاحظة AFGPs الممتزجة بالجليد. بعد استبدال المحلول بمحلول خال من AFGP ، تم اكتشاف البروتينات التي تم امتصاصها سابقا إلى سطح الجليد بوضوح (الصورة على اليمين). شريط المقياس = 25 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل كمي ونوعي لتركيز AFP على سطح الجليد. (أ) بلورة جليدية بتركيز محلول AFP مرتفع (قبل تبادل المحلول). (ب) نفس البلورة بعد استبدال محلول وكالة فرانس برس بمحلول عازل خال من ال AFP. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (C) التحليل الكمي لشدة التألق على سطح الجليد (أسود) وفي المحلول (أحمر) أثناء تبادل المحلول. يمثل المنحنى الأخضر الكثافة المحسوبة على سطح الجليد. تم تكييف الشكل بإذن من المرجع4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: بلورات هيدرات THF المفردة في قنوات الموائع الدقيقة بعد تبادل المحلول المحيط بها (A ، AFGP1-5) أو (B ، Safranine O). الصورة الواردة في (B) مستنسخة من المرجع26. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول للاستفادة من مزيج من تدفق الموائع الدقيقة مع البلورات المجهرية من أجل الكشف عن رؤى جديدة حول نمو البلورات وتثبيطها. تتيح المرحلة الباردة27 التي يتم التحكم في درجة حرارتها بدقة ميليكلفن التحكم في بلورات مجهرية مفردة تقع داخل قنوات الموائع الدقيقة ، مما يسمح بتبادل المحاليل حولها. في حين أن تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة قياسي ومشابه للممارسات الشائعة17,18 ، فإن التحكم في نمو وذوبان البلورات داخل الجهاز فريد وجديد. المكون الأكثر أهمية في هذا النظام هو التحكم الرائع في درجة الحرارة ، والذي يتم تحقيقه باستخدام مبردات Peltier الكهروحرارية ، وردود الفعل من الثرمستور الموجود بالقرب من العينة ، ووحدة تحكم في درجة الحرارة عالية الدقة تحكم حلقة التغذية المرتدة.
خطوة حاسمة أخرى هي تبادل الحل نفسه ، حيث قد تذوب البلورات أو تنمو أثناء هذه العملية. وبالتالي ، يجب ضبط درجة الحرارة أثناء تبادل المحلول لمنع النمو / الذوبان. يتداخل تكوين البلورات في قنوات الموائع الدقيقة مع تدفق السائل ويشكل التحدي الرئيسي لهذا النظام ؛ وبالتالي ، يجب التحكم في نمو هذه البلورات. هنا ، تم تركيب ليزر الأشعة تحت الحمراء (980 نانومتر) على المجهر المقلوب وتم استخدامه لإذابة بلورات الجليد / الترطيب غير المرغوب فيها محليا28. إذا تعذر استخدام مثل هذا الليزر ، فيمكن تسخين الموصلات المعدنية لجهاز الموائع الدقيقة بواسطة مبرد كهروحراري إضافي من Peltier ، والذي سيذيب الجليد في مدخل / مخرج الجهاز.
تتضمن الطريقة الموضحة هنا أدوات مطورة منزليا (المرحلة الباردة) وتتطلب التدريب ، حيث أن بعض الخطوات المذكورة أعلاه تشكل تحديا. نظرا لأن تركيز المحلول المحيط بالبلورات قد يتغير حتى عندما لا يكون التدفق مقصودا ، فإن خطوة المعايرة البسيطة5 يمكن أن توفر تقديرا موثوقا به للتركيز بناء على إشارة التألق. حل آخر ممكن للتدفق غير المرغوب فيه (أثناء قياسات TH ، على سبيل المثال) هو صمامات الموائع الدقيقة ، الموضحة في المرجع4.
تم استخدام هذا النظام أيضا لاستكشاف سلوك نمو الجليد D 2 Oفي سائل H2O ، وهي دراسة كشفت عن ظاهرة جديدة للأسطح الجليدية المجهرية الصدفية27. وبالتالي ، يمكن استخدام الموائع الدقيقة في دراسة الأنظمة البلورية المختلفة التي تستجيب بشكل جيد للتغيرات في درجات الحرارة.
Disclosures
اي
Acknowledgments
يتم تقديم شكر وتقدير إلى الجهات المانحة لصندوق أبحاث البترول التابع للجمعية الكيميائية الأمريكية لدعم هذا البحث (رقم المنحة 60191-UNI5). يود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور إيدو براسلافسكي على ريادته في استخدام أجهزة الموائع الدقيقة لدراسة البروتينات المضادة للتجمد والجليد. المؤلفون ممتنون للبروفيسور آرثر ديفريس والبروفيسور كونراد مايستر والبروفيسور بيتر ديفيز لتقديم عينات من البروتين المضاد للتجمد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
| 90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
| Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
| Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
| Cold stage | Home made | ||
| Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
| Glass syringe | |||
| Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
| Inverted microscope, Eclipse Ti - S | Nikon | ||
| Invisible tape | Staples | ||
| lint-free wipe | Kimwipes | ||
| Newport 3040 temperature controller | Newport | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
| Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
| Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
| sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
| Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
| Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |
References
- Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. Ice-Binding Proteins and Their Function. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition. Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).
- Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice. Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).
- Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).
- Ruppel, C. D., Kessler, J. D. The interaction of climate change and methane hydrates. Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).
- Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems. Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).
- Sa, J. H., et al. Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids. Scientific Reports. 6, 31582 (2016).
- Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates. Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).
- Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by α-Helical Antifreeze Proteins. Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).
- Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation. Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).
- Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein. Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).
- Walker, V. K., et al. Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors. Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).
- Gordienko, R., et al. Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates. PloS One. 5 (2), 8953 (2010).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device. Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview. Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).
- Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. Advances in diagnostic microfluidics. Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).
- Haleva, L., et al. Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins. Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).
- Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties. Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).
- Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor. Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics. Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).
- Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures. ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).
- Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v, Ward, M. D. Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).
- Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity. Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).
