Summary
Detta protokoll beskriver kristalliseringen av mikroskopiska iskristaller och klatrathydrater i mikrofluidiska anordningar, vilket möjliggör vätskeutbyte runt de bildade kristallerna. Detta ger oöverträffade möjligheter att undersöka kristalliseringsprocessen och bindningsmekanismerna hos hämmarna.
Abstract
En exakt mekanistisk beskrivning av vattenkristallisering är utmanande och kräver några nyckelelement: utmärkt temperaturkontroll för att möjliggöra bildandet av enstaka mikroskopiska kristaller och ett lämpligt mikroskopisystem kopplat till det kalla steget. Metoden som beskrivs häri lägger till en annan viktig funktion som inkluderar utbyte av lösningar kring is- och klatrathydratkristaller. Det beskrivna systemet består av en kombination av unika och hemutvecklade instrument, inklusive mikrofluidik, högupplösta kalla steg och fluorescensmikroskopi. Det kalla steget var utformat för mikrofluidiska anordningar och möjliggör bildandet av is- / hydratkristaller i mikronstorlek inuti mikrofluidiska kanaler och utbyte av lösningar runt dem. Temperaturupplösningen och stabiliteten i det kalla steget är en millikelvin, vilket är avgörande för att kontrollera tillväxten av dessa små kristaller. Detta mångsidiga system används för att studera de olika processerna för is- och hydratkristallisering och mekanismen genom vilken tillväxten av dessa kristaller hämmas. Protokollet beskriver hur man förbereder mikrofluidiska anordningar, hur man odlar och kontrollerar mikroskopiska kristaller i de mikrofluidiska kanalerna och hur användningen av vätskeflödet runt is/ hydratkristaller ger nya insikter i kristallisering av vatten.
Introduction
Frostskyddsproteiner (AFP) och frostskyddsglykoproteiner (AFGP) skyddar olika kallanpassade organismer från frostskador1. AFP och AFGP (generaliserade som AF(G)Ps) hämmar tillväxten av iskristaller genom att binda irreversibelt till deras ytor och hämma ytterligare tillväxt på grund av Gibbs-Thomson-effekten 2,3,4,5. Det resulterande gapet som bildas mellan smälttemperaturen, som i stort sett är oförändrad, och den nyligen deprimerade frysningstemperaturen kallas termisk hysteres (TH) och representerar en mätbar parameter som motsvarar AFP-aktivitet6. Användningen av AFP för att hämma istillväxt har långtgående och olika tillämpningar och erbjuder potentiell förbättring inom olika områden, inklusive kryokonservering, fryst livsmedelskvalitet och skydd av kallexponerade grödor.
Kristalliseringen av vatten vid låga temperaturer och höga tryck i närvaro av små organiska molekyler resulterar i bildandet av klatrathydrater (eller gashydrater), där det vanligaste hydratet är metanhydrat7. Kristalliseringen av metanhydrater i gas-/oljeflödesledningar kan orsaka pluggar, vilket kan orsaka explosioner på grund av gaständning 8,9,10. Nuvarande ansträngningar för att förhindra hydratkristallisering i flödeslinjer inkluderar användning av termodynamiska (alkoholer och glykoler) och kinetiska (främst polymerer) hämmare11,12,13,14. AFP har också visat sig binda till klatrathydratkristaller och hämma deras tillväxt, vilket pekar på den potentiella användningen av AFP för att hindra bildandet av pluggar och därigenom ge en grönare lösning15.
Mikrofluidik är en vanlig metod som används för att studera egenskaperna hos vätskor vid små provvolymer (ner till fL) som flödas genom ett nätverk av mikrokanaler16. Mikrokanalerna följer ett mönster skapat på en kiselskiva (formen) med litografi17. Ett vanligt material för att tillverka mikrofluidiska anordningar är polydimetylsiloxan (PDMS), vilket är billigt och relativt enkelt att arbeta med i forskningslaboratorier. Utformningen av funktionerna (kanalerna) är sammansatt med hänsyn till enhetens specifika syfte; Således kan den användas för en mängd olika applikationer, inklusive DNA-avkänning18, medicinsk diagnos19 och kristallisationsprocesser 3,20,21.
Detta protokoll beskriver en unik mikrofluidisk metod för att odla is- och hydratkristaller i mikronstorlek med olika hämmare, inklusive AFP och AFGP. För dessa experiment användes Tetrahydrofuran (THF) hydrater för att efterlikna egenskaperna hos metangashydrater22, som kräver specialutrustning för tryck- och temperaturkontroll23. Fluorescerande märkta AF (G) Ps användes för att visualisera och analysera adsorptionen av proteinerna till kristallytan, och i kombination med fluorescerande avbildning möjliggjorde det mikrofluidiska tillvägagångssättet erhållandet av nyckelfunktioner i bindningsprocessen för dessa molekyler till kristallytor.
Protocol
1. Tillverkning av mikrofluidiska enheter
- Täck insidan av en petriskål med aluminiumfolie och lägg den förberedda formen i petriskålen.
- Tillverka formarna med hjälp av litografiteknikerna som beskrivs i referenser. De två enhetsdesignerna som används i detta arbete visas i figur 1.
- Bered 30–40 ml PDMS-blandningen genom att väga en blandning på 1:10 (vikt) av härdningsmedlet och elastomeren (se materialtabell) och blanda kontinuerligt i cirka 5 minuter tills blandningen verkar vit och nästan ogenomskinlig.
OBS: Placera en plastkopp på vågen, häll elastomeren i koppen och tillsätt sedan härdningsmedlet för att uppnå ett viktförhållande på 1:10. - Häll PDMS-blandningen i petriskålen med formen och avgasa i en exsickator tills inga bubblor finns kvar (cirka 30 min).
- Grädda formen med flytande PDMS i en ugn eller på en kokplatta vid 70 ° C tills en gummiliknande konsistens erhålls. Denna process tar ungefär en timme.
- Klipp ut enheten genom att spåra runt funktionerna med en skalpell, var noga med att trycka framåt med skalpellen istället för ner eftersom formen är ömtålig. Ta bort den utskurna PDMS-enheten och placera den upp och ner i en ny petriskål. Ta bort damm och smutspartiklar från bottenytan genom att fästa och ta bort en bit tejp (se Materialförteckning).
- Använd en trubbig sprutnål (20 G) för att stansa ut hål i enheten baserat på det präglade mönstret, använd vid behov ett mikroskop. Se till att hålet tränger igenom den andra sidan av enheten och använd pincett för att ta bort de utstansade bitarna.
- Tvätta noggrant en täckglas (18 x 18 mm, 0,14 mm tjock) med vatten och tvål och sedan med isopropanol. Använd lufttryck för att torka den rengjorda täckglaset.
- Sätt i det rengjorda PDMS och täckglaset i plasmarengöraren, stäng ventilerna och slå på strömmen, vakuumet och pumpen. Låt plasmarengöraren gå i ungefär en minut, ställ in RF på HI och låt lite luft komma in i plasmarengöraren med hjälp av den fina ventilen.
- När visningsfönstrets färg ändras från lila till rosa, låt plasmarengöraren arbeta i 50 s och stäng av RF. Håll pumpen på i en minut, och efter att ha stängt av den, öppna gradvis huvudventilen för att släppa in luft i plasmarengöraren.
OBS: En alternativ metod för att uppnå jämförbara resultat är värmebindning. För denna metod, lägg formen på täckglaset och placera den på en värmeplatta inställd på 70-80 ° C i cirka 60 minuter.
- När visningsfönstrets färg ändras från lila till rosa, låt plasmarengöraren arbeta i 50 s och stäng av RF. Håll pumpen på i en minut, och efter att ha stängt av den, öppna gradvis huvudventilen för att släppa in luft i plasmarengöraren.
- Tryck pdms-ytan på den rengjorda täckglaset och bekräfta att de är bundna genom att inte observera att de lossnar när du drar upp något på täckglaset.
- Fäst nålen på en 90° trubbig nål (18 G) med en tång och dra av plastsprutans kontakt för att ta bort den. Sätt in ena änden av nålen i ett Tygon-rör (0,020 "ID, 0,060" OD, se Materialförteckning) och den andra änden i ett av de utstansade hålen på enheten. Upprepa processen för de andra hålen.
- För att ta bort luftbubblor, injicera vatten / buffert i kanalerna med en glasspruta (en pump är valfri, men ingen pump användes här). Filtrera alla vätskor med ett 0,22 μm filter innan du injicerar dem i enheten.
- Använd ett blockeringsmedel som en 1% BSA-lösning för att förhindra bindning av fluorescensmärkta AFP på PDMS-väggarna. Injicera blockeringsmedlet i inloppskanalen och låt det förbli i mikrokanalerna i 20 minuter. Injicera sedan buffertlösningen i inloppskanalen för att spola ut BSA-lösningen.
OBS: Den resulterande PDMS-enheten är fäst vid en täckglas längs bottenytan, ansluten till slangar i dess inlopps- och utloppshål och belagd med ett blockeringsmedel i dess kanaler.
2. Ställa in mikrofluidikanordningen
- Applicera en liten mängd nedsänkningsolja på ytan av kopparkylsteget (se materialtabell) och sprid den med en luddfri torkduk för att skapa ett tunt lager olja. Placera sedan en ren safirskiva (se Materialförteckning) på det skapade oljeskiktet. Applicera en droppe nedsänkningsolja på mitten av safirskivan och placera PDMS-enheten på droppen så att enhetens funktioner är inriktade över betraktningshålet i det kalla steget.
- Håll enheten på plats och fäst slangen på ytterväggarna på aluminiumlådan som rymmer det kalla steget med tejp. Anteckna placeringen av varje specifikt rör.
- Använd en glasspruta för att injicera 4-5 μL AF(G)P-lösning (se materialförteckning) i inloppskanalen. Stäng locket på det kalla steget.
OBS: Koncentrationen av AFP-lösningarna kan varieras och bestämmas baserat på deras fluorescensintensitet. I detta protokoll var koncentrationsintervallet 5-40 μL.
3. Bildning av enstaka kristaller i de mikrofluidiska kanalerna
- Rensa det kalla steget med torr luft / kväve för att förhindra att kondens bildas inuti det. Aktivera ett cirkulerande kylbad för att cirkulera vatten genom det kalla steget och fungera som en kylfläns.
- Starta temperaturkontrollprogrammet och ställ in temperaturen på -25 °C.
OBS: Frysning kommer att ske när provet når en temperatur på ~-20 °C, vilket kan observeras som en plötslig mörkare och uppruggning av provet. Vilket mål som helst kan användas vid denna tidpunkt, helst 4x-målet, vilket gör det möjligt för användaren att observera hela mikrofluidiska kanaler. - Långsamt, genom att öka temperaturen med cirka 1 °C/5 s, närma sig provets smältpunkt, som kan variera från -1 till -0,2 °C beroende på vilken buffert som används i AF(G)P-lösningen. När temperaturen närmar sig smältpunkten, vänta tills några enstaka kristaller är isolerade.
OBS: Vid behov kan oönskad is smältas lokalt med hjälp av en IR-laser (980 nm) (se Materialförteckning), som är fixerad på mikroskopet. Lasern smälter närliggande iskristaller så länge den är på. - Vid denna tidpunkt rekommenderas att byta till 10x eller 20x mål för att bättre observera enstaka kristaller. Efter att ha erhållit en enda kristall på önskad plats, odla kristallen genom att minska temperaturen något (med ~ 0,01 ° C) tills kristallens kanter möter kanalväggarna.
- Byt till 50x-målet, injicera AF(G)P-lösningen i kanalerna och observera fluorescensintensitetsökningen, vilket indikerar att proteinlösningen framgångsrikt injicerades i kanalerna. Utför detta steg noggrant för att undvika smältning av iskristallen under utbytet av lösningar. Övervaka och justera noggrant både flödeshastigheten (genom att applicera mer / mindre tryck på glassprutan) och temperaturen under lösningsutbytesprocessen.
- Ge proteinerna tillräckligt med tid för att ackumuleras och binda på kristallytan.
OBS: Detta varierar beroende på ackumulerings- och adsorptionshastigheterna för AF(G)P 5,25. I ett typiskt experiment tillåts 5-10 min för AFP-ackumulering
4. Termisk hysteres (TH) aktivitetsmätning
OBS: Detta steg är valfritt.
- Bestäm kristallens smältpunkt genom att justera temperaturen med små steg på 0,002 °C och observera den högsta temperaturen som en liten kristall kan utsättas för utan att den smälter.
- På temperaturregulatorns RAMP-funktion ställer du in kylhastigheten på -0,05 till -0,01 °C/4 s och aktiverar RAMP. Observera den exakta temperaturen vid vilken plötslig kristalltillväxt sker.
OBS: Detta värde kallas sprängtemperaturen och motsvarar frysningstemperaturen. Skillnaden mellan smält- och frystemperaturerna är TH-aktiviteten25.
5. Lösningsutbyte runt enstaka kristaller
- Se till att provtemperaturen är i TH-gapet för att förhindra smältning eller tillväxt av kristallen under experimentet.
- Registrera lösningsutbytesprocessen med hjälp av NIS Elements-avbildningsprogrammet (se materialförteckningen) för senare analys av fluorescensdata. Injicera långsamt buffertlösningen i det andra inloppet till den mikrofluidiska anordningen och observera en minskning av den fluorescerande signalen med en hastighet som beror på trycket som appliceras på sprutan.
- Använd denna visuella representation för att säkerställa att det applicerade trycket inte är för högt för att inte få kristallen att smälta. Se figur 2 för en sekvens av bilder som visar lösningsutbytesprocessen.
- Mät fluorescensintensiteten i den mikrofluidiska kanalen med hjälp av bildprogrammet.
OBS: Signalen bör toppa vid området nära kristallytan, vilket indikerar AFP-bindning, och bör vara relativt låg i den omgivande lösningen, som har spolats med buffert. - Mät TH-aktiviteten efter lösningsutbytet efter steg 4.
- Upprepa experimentet genom att isolera en ny kristall (steg 3.3-3.5). Injicera AFP-lösningen med en glasspruta och upprepa lösningsutbytet (steg 5.1-5.3). Skaffa en ny enkristall (steg 3.3-3.5) och flöda AFP-lösningen in i kanalerna med hjälp av glassprutan.
6. Experiment med klatratrahydrater
- För att erhålla THF-hydrater, förbered en THF / vattenlösning med ett molförhållande på 1:15, vilket är ett volymförhållande på 1: 3,326. Bibehåll detta förhållande i alla lösningar som används i följande experiment, inklusive de som innehåller AF(G)Ps eller andra hämmare.
- Följ steg 1 och 2 för att förbereda mikrofluidikanordningen och placera den i det kalla steget. Ställ in temperaturen på -25 °C; Provet fryser vid ~-20 °C enligt beskrivningen i steg 3.2.
- När THF-lösningen är frusen, öka långsamt temperaturen tills all is har smält.
OBS: Isens smältpunkt är något nedtryckt av THF. - För att säkerställa att alla iskristaller smälter med uteslutande av hydraterna, håll temperaturen vid 1 ° C i 3 minuter.
- Ställ in temperaturen på -2 ° C och observera överflödet av hydrater som uppträder i de mikrofluidiska kanalerna i frånvaro av hämmare.
OBS: THF-hydrater är formade som oktaedroner (figur 2), och i vissa fall är kristallerna mycket tunna; därför kan tydlig observation vara utmanande. I dessa fall rekommenderas att upprepa steg 6.4-6.5 för att erhålla nya kristaller. - Injicera AF(G)P/inhibitorn i mikrofluidikkanalen med hjälp av glassprutan samtidigt som temperaturen justeras för att säkerställa att de erhållna kristallerna inte smälter/växer. Låt några minuter för inhibitormolekylerna att adsorbera till kristallytan.
- Om det behövs mäter du TH-aktiviteten efter steg 4.
- Byt lösningen runt kristallerna enligt beskrivningen i steg 5.2-5.3.
Representative Results
Lösningsutbyte med iskristaller
Ett lyckat lösningsutbyte runt en iskristall presenteras i figur 3. Tidsstämpeln på varje ögonblicksbild indikerar att lösningsutbytet var relativt snabbt; ett långsammare utbyte är dock möjligt. Fluorescensintensiteten som kommer från de isadsorberade AFGP-molekylerna observeras tydligt efter att utbytet är klart (figur 3, höger). En kvantitativ analys av AFP-koncentrationen på isytan övervakas med hjälp av ett utpekat intresseområde (ROI) (figur 4). I detta experiment4 användes AFP typ III (QAE-isoform) utspädd i 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) och 100 mM NaCl. Lösningen byts ut runt en bipyramidformad kristall, och fluorescensintensiteten i lösningen och på isen övervakas. Det röda diagrammet som indikerar fluorescenssignalen i lösningen reduceras med en faktor 100 under lösningsutbytet, medan den beräknade signalen (grön plot) på isytan förblir konstant. Den beräknade signalen för de isadsorberade molekylerna erhölls genom att subtrahera signalen som kommer från lösningen (multiplicerad med en konstant som hänför sig till tjockleken på den mikrofluidiska kanalen) från signalen som kommer från isen4.
Lösningsutbyte med THF-hydrater
Mikrofluidiska experiment med THF-hydrater utfördes på samma sätt som experimenten med is. Efter att hydratkristallerna tilläts adsorbera inhibitormolekylerna från lösningen injicerades en inhibitorfri lösning i kanalerna. Figur 5 visar THF-hydrater efter lösningsutbyte med två typer av hämmare: AFGP1-5 märkt med fluoresceinisotiocyanat (FITC) (figur 5A) och safranin O (se materialtabell), som är ett fluorescensfärgämne26 (figur 5B). Detta är den första demonstartionen av en AFGP-bindning till ytan av ett klatrathydrat.
Figur 1: En schematisk representation av de mikrofluidiska kanaler som används i denna studie. Båda mönstren innehåller två inlopp och ett uttag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: THF-hydrater bildades i den mikrofluidiska kanalen efter att temperaturen kylts till ~-2 °C. Morfologin för alla presenterade kristaller är en tetraeder; Vissa kristaller är dock orienterade annorlunda. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ett representativt experiment som uppvisar lösningsutbyte runt en enda iskristall i en mikrofluidisk kanal. Ursprungligen innehöll lösningen AFGP1-5 märkt med FITC, och isadsorberade AFGP observerades inte. Efter att lösningen bytts ut mot en AFGP-fri lösning detekterades proteinerna som tidigare hade adsorberats till isytan tydligt (bilden till höger). Skalstreck = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: En kvantitativ och kvalitativ analys av AFP-koncentrationen på isytan. (A) En iskristall vid hög AFP-lösningskoncentration (före lösningsutbyte). (B) Samma kristall efter det att AFP-lösningen utbytts med en AFP-fri buffertlösning. Skalstreck = 20 μm. (C) Kvantitativ analys av fluorescensintensiteten på isytan (svart) och i lösningen (röd) under ett lösningsutbyte. Den gröna kurvan representerar den beräknade intensiteten på isytan. Figuren är anpassad med tillstånd från referens4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Enstaka THF-hydratkristaller i mikrofluidiska kanaler efter att lösningen runt dem (A, AFGP1-5) eller (B,Safranine O) utbytts. Bilden i (B) återges från referens26. Skalstreck = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll utformades för att utnyttja kombinationen av mikrofluidiskt flöde med mikroskopiska kristaller för att avslöja nya insikter om kristalltillväxt och dess hämning. Ett millikelvinupplöst temperaturkontrollerat kallt steg27 möjliggör kontroll av enstaka mikroskopiska kristaller belägna inuti mikrofluidiska kanaler, vilket möjliggör utbyte av lösningar runt dem. Medan tillverkningen av mikrofluidiska anordningar är standard och liknar vanliga metoder17,18, är kontrollen över tillväxt och smältning av kristaller inuti enheten unik och ny. Den mest kritiska komponenten i detta system är den fantastiska temperaturkontrollen, som uppnås genom att använda Peltier termoelektriska kylare, återkoppling från en termistor som ligger nära provet och en högupplöst temperaturregulator som styr återkopplingsslingan.
Ett annat kritiskt steg är själva lösningsutbytet, eftersom kristallerna kan smälta eller växa under denna process; Således måste temperaturen justeras under lösningsutbytet för att förhindra tillväxt / smältning. Bildandet av kristaller i mikrofluidiska kanaler stör vätskeflödet och utgör den största utmaningen för detta system; Således måste tillväxten av dessa kristaller kontrolleras. Här monterades en IR-laser (980 nm) på det inverterade mikroskopet och användes för att lokalt smälta oönskade is/hydratkristaller28. Om en sådan laser inte kan användas kan metallkontakterna i den mikrofluidiska anordningen värmas upp med en extra Peltier termoelektrisk kylare, som smälter isen i enhetens inlopp/utlopp.
Metoden som beskrivs här inkluderar hemutvecklade instrument (kallt stadium) och kräver utbildning, eftersom några av de ovan nämnda stegen är utmanande. Eftersom koncentrationen av lösningen som omger kristallerna kan förändras även när flödet inte är avsett, kan ett enkelt kalibreringssteg5 ge en tillförlitlig uppskattning av koncentrationen baserat på fluorescenssignalen. En annan möjlig lösning på oönskat flöde (till exempel under TH-mätningar) är mikrofluidiska ventiler, som beskrivs i referens4.
Detta system användes också för att utforska tillväxtbeteendet hos D2O-is iH2O-vätska, en studie som avslöjade ett nytt fenomen av mikroskopiska, skulpterade isytor27. Således kan mikrofluidik användas vid studier av olika kristallina system som svarar väl på temperaturförändringar.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Erkännande görs till givarna av American Chemical Society Petroleum Research Fund för stöd till denna forskning (bidragsnummer 60191-UNI5). Författarna vill tacka professor Ido Braslavsky för banbrytande användning av mikrofluidiska enheter för att studera frostskyddsproteiner och is. Författarna är tacksamma mot prof. Arthur DeVries, prof. Konrad Meister och prof. Peter Davies för att ha tillhandahållit frostskyddsproteinprover.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
| 90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
| Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
| Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
| Cold stage | Home made | ||
| Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
| Glass syringe | |||
| Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
| Inverted microscope, Eclipse Ti - S | Nikon | ||
| Invisible tape | Staples | ||
| lint-free wipe | Kimwipes | ||
| Newport 3040 temperature controller | Newport | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
| Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
| Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
| sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
| Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
| Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |
References
- Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. Ice-Binding Proteins and Their Function. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Drori, R., Davies, P. L., Braslavsky, I. When are antifreeze proteins in solution essential for ice growth inhibition. Langmuir. 31 (21), 5805-5811 (2015).
- Meister, K., DeVries, A. L., Bakker, H. J., Drori, R. Antifreeze glycoproteins bind irreversibly to ice. Journal of the American Chemical Society. 140 (30), 9365-9368 (2018).
- Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. Journal of Visualized Experiments. (72), e4189 (2013).
- Ruppel, C. D., Kessler, J. D. The interaction of climate change and methane hydrates. Reviews of Geophysics. 55 (1), 126-168 (2017).
- Mozaffar, H., Anderson, R., Tohidi, B. Effect of alcohols and diols on PVCap-induced hydrate crystal growth patterns in methane systems. Fluid Phase Equilibria. 425, 1-8 (2016).
- Sa, J. H., et al. Inhibition of methane and natural gas hydrate formation by altering the structure of water with amino acids. Scientific Reports. 6, 31582 (2016).
- Lederhos, J. P., Long, J. P., Sum, A., Christiansen, R. L., Sloan, E. D. Effective kinetic inhibitors for natural gas hydrates. Chemical Engineering Science. 51 (8), 1221-1229 (1996).
- Sun, T., Davies, P. L., Walker, V. K. Structural Basis for the Inhibition of Gas Hydrates by α-Helical Antifreeze Proteins. Biophysical Journal. 109 (8), 1698-1705 (2015).
- Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. Effect of antifreeze proteins on the nucleation, growth, and the memory effect during tetrahydrofuran clathrate hydrate formation. Journal of the American Chemical Society. 128 (9), 2844-2850 (2006).
- Zeng, H., Wilson, L. D., Walker, V. K., Ripmeester, J. A. The inhibition of tetrahydrofuran clathrate-hydrate formation with antifreeze protein. Canadian Journal of Physics. 81 (1-2), 17-24 (2003).
- Walker, V. K., et al. Antifreeze proteins as gas hydrate inhibitors. Canadian Journal of Chemistry. 93 (8), 839-849 (2015).
- Gordienko, R., et al. Towards a green hydrate inhibitor: imaging antifreeze proteins on clathrates. PloS One. 5 (2), 8953 (2010).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. Double emulsion generation using a polydimethylsiloxane (PDMS) co-axial flow focus device. Journal of Visualized Experiments. (106), e53516 (2015).
- Dutse, S. W., Yusof, N. A. Microfluidics-based lab-on-chip systems in DNA-based biosensing: An overview. Sensors. 11 (6), 5754-5768 (2011).
- Burklund, A., Tadimety, A., Nie, Y., Hao, N., Zhang, J. X. J. Advances in diagnostic microfluidics. Advances in Clinical Chemistry. 95, 1-72 (2020).
- Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4 (3), 032202 (2017).
- Haleva, L., et al. Microfluidic cold-finger device for the investigation of ice-binding proteins. Biophys Journal. 111 (6), 1143-1150 (2016).
- Vlasic, T. M., Servio, P. D., Rey, A. D. THF hydrates as model systems for natural gas hydrates: Comparing their mechanical and vibrational properties. Industrial and Engineering Chemistry Research. 58 (36), 16588-16596 (2019).
- Chen, W., Pinho, B., Hartman, R. L. Flash crystallization kinetics of methane (sI) hydrate in a thermoelectrically-cooled microreactor. Lab on a Chip. 17 (18), 3051-3060 (2017).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Drori, R., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Ice-binding proteins that accumulate on different ice crystal planes produce distinct thermal hysteresis dynamics. Journal of the Royal Society Interface. 11 (98), 20140526 (2014).
- Soussana, T. N., Weissman, H., Rybtchinski, B., Drori, R. Adsorption-inhibition of clathrate hydrates by self-assembled nanostructures. ChemPhysChem. 22 (21), 2182-2189 (2021).
- Drori, R., Holmes-Cerfon, M., Kahr, B., Kohn, R. v, Ward, M. D. Dynamics and unsteady morphologies at ice interfaces driven by D2O-H2O exchange. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11627-11632 (2017).
- Deng, J., Apfelbaum, E., Drori, R. Ice growth acceleration by antifreeze proteins leads to higher thermal hysteresis activity. Journal of Physical Chemistry B. 124 (49), 11081-11088 (2020).
