ביטוי טרנסגני נגיפי בלבבות מכרסמים והערכת הסיכון להפרעות קצב לב
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לביטוי טרנסגני בלבבות חולדות ועכברים על ידי הזרקה ישירה של הנגיף בהנחיית אקוקרדיוגרפיה. שיטות להערכת הרגישות של לבבות להפרעות קצב חדריות על ידי גירוי חשמלי מתוכנת של לבבות מבודדים, Langendorff-perfused מוסברים גם כאן.
Abstract
מחלות לב הן הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. בשל קלות הטיפול והשפע של זנים מהונדסים, מכרסמים הפכו למודלים חיוניים למחקר לב וכלי דם. עם זאת, הפרעות קצב לב קטלניות ספונטניות שלעתים קרובות גורמות לתמותה בחולי מחלות לב הן נדירות במודלים של מכרסמים של מחלות לב. הסיבה העיקרית לכך היא ההבדלים בין המינים בתכונות החשמליות של הלב בין בני אדם למכרסמים ומהווה אתגר לחקר הפרעות קצב לב באמצעות מכרסמים. פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת ביטוי טרנסגני יעיל בשריר הלב של עכברים וחולדות באמצעות זריקות תוך-שריריות מונחות אקוקרדיוגרפיה של נגיף רקומביננטי (אדנו-וירוס ונגיף הקשור לאדנו). עבודה זו גם מתווה שיטה המאפשרת הערכה אמינה של רגישות הלב להפרעות קצב באמצעות עכברים ולבבות עכברים וחולדות מבודדים, לנגנדורף, עם גירויים חשמליים אדרנרגיים ומתוכנתים. טכניקות אלה הן קריטיות לחקר הפרעות בקצב הלב הקשורות לשיפוץ לב שלילי לאחר פציעות, כגון אוטם שריר הלב.
Introduction
מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, וגבו את חייהם של 18 מיליון אנשים בשנת 2017 לבדה1. מכרסמים, במיוחד עכברים וחולדות, הפכו למודל הנפוץ ביותר במחקר קרדיווסקולרי בשל קלות הטיפול והזמינות של ביטויי יתר מהונדסים שונים או קווי נוקאאוט. מודלים של מכרסמים היו בסיסיים להבנת מנגנוני המחלה ולזיהוי מטרות טיפוליות חדשות פוטנציאליות באוטם שריר הלב2, יתר לחץ דם3, אי ספיקת לב4 וטרשת עורקים5. עם זאת, השימוש במכרסמים במחקרים על הפרעות קצב לב מוגבל על ידי גודל הלב הקטן שלהם וקצב הלב המהיר יותר בהשוואה למודלים אנושיים או בעלי חיים גדולים. לכן, הפרעות קצב קטלניות ספונטניות בעכברים או בחולדות לאחר אוטם שריר הלב הן נדירות2. החוקרים נאלצים להתמקד בשינויים משניים עקיפים שעשויים לשקף מצע פרו-אריתמי, כגון פיברוזיס או ביטוי גנים, מבלי להראות שינויים משמעותיים בעומס הפרעות קצב או נטיות פרו-קצביות. כדי להתגבר על מגבלה זו, שיטה המאפשרת הערכה אמינה של הרגישות של לבבות עכברים וחולדות לטכיאריתמיות חדריות לאחר שינוי גנטי 6,7 או אוטם שריר הלב2 מתוארת בפרוטוקול הנוכחי. שיטה זו משלבת גירוי קולטן אדרנרגי עם גירוי חשמלי מתוכנת כדי לגרום לטכיאריתמיות חדריות בלבבות עכברים וחולדותמבודדים, מסוג Langendorff-perfused.
גישות סטנדרטיות להעברת גנים נגיפיים ברקמת שריר הלב של מכרסמים כרוכות לעתים קרובות בחשיפת הלב על ידי בית החזה 9,10,11, שהוא הליך פולשני וקשור להתאוששות מאוחרת של בעלי החיים לאחר ההליך. מאמר זה מתאר שיטה של הזרקה ישירה של וירוס בהזרקה ישירה של הנגיף תחת הדרכת הדמיה אולטרסאונד לביטוי יתר של טרנסגנים. הליך פחות פולשני זה מאפשר התאוששות מהירה יותר של בעלי החיים לאחר הזרקה נגיפית ופחות פגיעה ברקמות, בהשוואה לבית החזה, מפחית כאב ודלקת לאחר הניתוח בבעל החיים, ובכך מאפשר הערכה טובה יותר של ההשפעות של גנים מהונדסים על תפקוד הלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר שלבים הם קריטיים להצלחת הכנת הלב המבודד והמבודד של לנגנדורף. ראשית, חשוב להימנע מכל נזק ללב במהלך איסוף הלב (למשל, עקב סחיטה או חיתוך בשוגג עם המספריים). שנית, זה קריטי לשים את הלב שנאסף לתוך פתרון טירוד קר בהקדם האפשרי כי זה יעצור את פעימות הלב ולהפחית את צריכת החמצן של הלב. שלישית, אסור …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הפרויקט של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) (PJT-148918 ו- PJT-180533, ל- WL), פרס חוקר הקריירה המוקדמת של CIHR (AR8-162705, ל- WL), קרן הלב והשבץ של קנדה (HSFC) מלגת מקדונלד ופרס חוקר חדש (S-17-LI-0866, ל- WL), מלגות סטודנטים (ל- JW ו- YX), ומלגת פוסט-דוקטורט (ל- AL) מאוניברסיטת אוטווה קרנות הקדשת לב במכון הלב. המחברים מודים למר ריצ’רד סימור על תמיכתו הטכנית. איור 2 נוצר עם Biorender.com עם רישיונות מאושרים.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
