Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca
Summary
Il presente protocollo descrive i metodi per l’espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.
Abstract
Le malattie cardiache sono la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo. A causa della facilità di manipolazione e dell’abbondanza di ceppi transgenici, i roditori sono diventati modelli essenziali per la ricerca cardiovascolare. Tuttavia, le aritmie cardiache letali spontanee che spesso causano mortalità nei pazienti con malattie cardiache sono rare nei modelli di roditori di malattie cardiache. Ciò è dovuto principalmente alle differenze di specie nelle proprietà elettriche cardiache tra uomo e roditori e rappresenta una sfida per lo studio delle aritmie cardiache utilizzando i roditori. Questo protocollo descrive un approccio per consentire un’espressione transgenica efficiente nel miocardio ventricolare di topo e ratto utilizzando iniezioni intramuscolari guidate da ecocardiografia di virus ricombinante (adenovirus e virus adeno-associati). Questo lavoro delinea anche un metodo per consentire una valutazione affidabile della suscettibilità cardiaca alle aritmie utilizzando cuori di topo e ratto isolati e perfusi da Langendorff con stimolazioni elettriche sia adrenergiche che programmate. Queste tecniche sono fondamentali per lo studio dei disturbi del ritmo cardiaco associati al rimodellamento cardiaco avverso dopo lesioni, come l’infarto del miocardio.
Introduction
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo, causando la morte di 18 milioni di persone nel solo 20171. I roditori, in particolare topi e ratti, sono diventati il modello più comunemente usato nella ricerca cardiovascolare a causa della facilità di manipolazione e della disponibilità di varie linee di sovraespressione transgenica o knockout. I modelli di roditori sono stati fondamentali per comprendere i meccanismi della malattia e per identificare potenziali nuovi bersagli terapeutici nell’infarto miocardico2, nell’ipertensione3, nell’insufficienza cardiaca4 e nell’aterosclerosi5. Tuttavia, l’uso dei roditori negli studi sulle aritmie cardiache è limitato dalle loro piccole dimensioni del cuore e dalla frequenza cardiaca più veloce rispetto ai modelli umani o animali di grandi dimensioni. Pertanto, le aritmie letali spontanee nei topi o nei ratti dopo infarto miocardico sono rare2. I ricercatori sono costretti a concentrarsi su cambiamenti secondari indiretti che potrebbero riflettere un substrato pro-aritmico, come la fibrosi o l’espressione genica, senza mostrare cambiamenti significativi nel carico di aritmia o tendenze pro-aritmiche. Per superare questa limitazione, nel presente protocollo è descritto un metodo che consente una valutazione affidabile della suscettibilità dei cuori di topo e ratto alle tachiaritmie ventricolari dopo modificazione genetica 6,7 o infarto miocardico2. Questo metodo combina la stimolazione del recettore adrenergico con la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari in8 cuori isolati di topo e ratto permeati da Langendorff.
Gli approcci standard per il trasferimento genico virale nel tessuto miocardico dei roditori spesso comportano l’esposizione del cuore mediante toracotomia 9,10,11, che è una procedura invasiva ed è associata a un ritardo nel recupero degli animali dopo la procedura. Questo articolo descrive un metodo di iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida di imaging ecografico per la sovraespressione dei transgeni. Questa procedura meno invasiva consente un recupero più rapido dell’animale dopo l’iniezione virale e meno lesioni tissutali, rispetto alla toracotomia, riduce il dolore post-operatorio e l’infiammazione nell’animale e, quindi, consente una migliore valutazione degli effetti dei geni transgenici sulla funzione cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi passaggi sono fondamentali per il successo della preparazione cardiaca isolata e perfusa da Langendorff. In primo luogo, è importante evitare qualsiasi danno al cuore durante la raccolta del cuore (ad esempio, a causa di spremitura accidentale o taglio con le forbici). In secondo luogo, è fondamentale mettere il cuore raccolto in una soluzione fredda di Tyrode il prima possibile perché questo fermerà il battito cardiaco e ridurrà il consumo di ossigeno del cuore. In terzo luogo, l’inserimento dell’ago nell’a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 e PJT-180533, a WL), dal CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, a WL), dalla borsa di studio McDonald della Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) e dal New Investigator Award (S-17-LI-0866, a WL), borse di studio per studenti (a JW e YX) e una borsa di studio post-dottorato (ad AL) dall’Università di Ottawa Cardiac Endowment Funds presso l’Heart Institute. Gli autori ringraziano Richard Seymour per il suo supporto tecnico. La Figura 2 è stata creata con Biorender.com con licenze approvate.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
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