Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Visualisering av aktin- och mikrotubulikopplingsdynamik in vitro genom total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/64074

Summary

Detta protokoll är en guide för visualisering av dynamiskt aktin och mikrotubuli med hjälp av en in vitro-total intern fluorescensanalys (TIRF).

Abstract

Traditionellt har aktin- och mikrotubulicytoskeletonerna studerats som separata enheter, begränsade till specifika cellulära regioner eller processer och reglerade av olika sviter av bindande proteiner som är unika för varje polymer. Många studier visar nu att dynamiken hos båda cytoskelettpolymererna är sammanflätade och att denna överhörning krävs för de flesta cellulära beteenden. Ett antal proteiner som är involverade i aktin-mikrotubuliinteraktioner har redan identifierats (dvs Tau, MACF, GAS, forminer och mer) och är väl karakteriserade med avseende på antingen aktin eller mikrotubuli ensam. Relativt få studier visade emellertid analyser av aktin-mikrotubuli-koordination med dynamiska versioner av båda polymererna. Detta kan täppa till framväxande länkningsmekanismer mellan aktin och mikrotubuli. Här möjliggör en total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopibaserad in vitro-rekonstitueringsteknik visualisering av både aktin- och mikrotubulidynamik från den biokemiska reaktionen. Denna teknik bevarar polymerisationsdynamiken hos antingen aktinfilament eller mikrotubuli individuellt eller i närvaro av den andra polymeren. Kommersiellt tillgängligt Tau-protein används för att visa hur aktin-mikrotubulibeteenden förändras i närvaro av ett klassiskt cytoskelett tvärbindande protein. Denna metod kan ge tillförlitliga funktionella och mekanistiska insikter i hur enskilda reglerande proteiner koordinerar aktin-mikrotubulidynamik vid en upplösning av enstaka filament eller högre ordningskomplex.

Introduction

Historiskt sett har aktin och mikrotubuli setts som separata enheter, var och en med sin egen uppsättning reglerande proteiner, dynamikbeteenden och distinkta cellulära platser. Rikliga bevis visar nu att aktin- och mikrotubulipolymerer engagerar sig i funktionella överhörningsmekanismer som är väsentliga för att utföra många cellprocesser inklusive migration, mitotisk spindelpositionering, intracellulär transport och cellmorfologi 1,2,3,4. De olika samordnade beteenden som ligger till grund för dessa exempel är beroende av en invecklad balans mellan kopplingsfaktorer, signaler och fysikaliska egenskaper. De molekylära detaljerna som ligger till grund för dessa mekanismer är dock fortfarande till stor del okända eftersom de flesta studier fokuserar på en enda cytoskelettpolymer i taget 1,2,5.

Aktin och mikrotubuli interagerar inte direkt 6,7,8. Den samordnade dynamiken hos aktin och mikrotubuli som ses i celler förmedlas av ytterligare faktorer. Många proteiner som tros reglera aktin-mikrotubuli överhörning har identifierats och deras aktiviteter är väl karakteriserade med avseende på antingen cytoskelettpolymer ensam 1,2. Växande bevis tyder på att denna enda polymermetod har dolt de dubbla funktionerna hos några av de proteiner / komplex som möjliggör aktin-mikrotubulikopplingshändelser 7,8,9,10,11,12,13. Experiment där båda polymererna är närvarande är sällsynta och definierar ofta mekanismer med en enda dynamisk polymer och statisk stabiliserad version av de andra 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Således behövs metoder för att undersöka de framväxande egenskaperna hos aktin-mikrotubuli-koordinerande proteiner som endast kan förstås fullt ut i experimentella system som använder båda dynamiska polymererna.

Kombinationen av direkta proteinmärkningsmetoder, genetiskt kodade affinitetstaggar och total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi har tillämpats med stor framgång i biomimetiska rekonstitueringssystem 19,20,21,22,23. Många bottom-up-system innehåller inte alla faktorer som reglerar proteiner i celler. Tekniken "biokemi på ett täckglas" har emellertid förfinat många mekanismer för aktin- och mikrotubulidynamik vid höga rumsliga och tidsmässiga skalor, inklusive de komponenter som krävs för polymermontering eller demontering och motorproteinrörelse 5,12,23,24,25,26,27 . Här beskrivs en minimal komponent med enfilament för att undersöka aktin-mikrotubulikoppling in vitro. Detta protokoll kan användas med kommersiellt tillgängliga eller mycket rena renade proteiner, fluorescerande märkta proteiner, perfusionskammare och utvidgas till mer komplicerade scheman som innehåller cellextrakt eller syntetiska system. Här används kommersiellt tillgängligt Tau-protein för att demonstrera hur cytoskelettdynamiken förändras i närvaro av ett aktin-mikrotubulikopplingsprotein, men kan ersättas med andra förmodade aktin-mikrotubuli-samordnande faktorer. Den största fördelen med detta system jämfört med andra tillvägagångssätt är förmågan att samtidigt övervaka dynamiken hos flera cytoskelettpolymerer i en reaktion. Detta protokoll ger också användarna exempel och enkla verktyg för att kvantifiera förändringar i cytoskelettpolymerer. Således kommer protokollanvändare att producera tillförlitliga, kvantitativa upplösningsdata med en filament för att beskriva mekanismer som ligger till grund för hur olika reglerande proteiner samordnar aktin-mikrotubulidynamik.

Protocol

1. Tvätta täckglassen

OBS: Tvätta (24 mm x 60 mm, #1.5) täckglas enligt Smith et al., 201328.

  1. Ordna omslagsglas i en plastbehållare för postsändare.
  2. Sänk ner täckglas i följd i följande lösningar och ultraljudsbehandling i 30-60 min, skölj med ddH2O 10 gånger mellan varje lösning: ddH2O med en droppe diskmedel; 0,1 M KOH. Förvara täckglas i 100% etanol i upp till 6 månader.
    OBS: Rör inte glasytor med oälskade fingrar. Använd pincett istället.

2. Beläggning rengjorda (24 mm x 60 mm, #1.5) täckglas med mPEG- och biotin-PEG-silan

OBS: Detta protokoll använder specifikt ett biotin-streptavidinsystem för att placera aktin och mikrotubuli inom TIRF-bildplanet. Andra beläggningar och system kan användas (t.ex. antikroppar, poly-L-lysin, NEM-myosin, etc.).

  1. Tina alikvoter av PEG-silan och biotin-PEG-silanpulver.
  2. Lös upp PEG-pulver i 80% etanol (pH 2,0) för att generera beläggningslösningar av 10 mg / ml mPEG-silan och 2-4 mg / ml biotin-PEG-silan, strax före användning.
    OBS: PEG-pulver verkar ofta upplösta men kanske inte på mikroskopisk nivå. Korrekt resuspension tar ~1-2 min med konstant pipettering. Användare uppmuntras att pipettera ytterligare 10 gånger efter uppkomsten av pulverupplösning.
    VARNING: Använd handskar för att skydda huden mot koncentrerad HCl när du gör 80% etanol (pH 2,0).
  3. Ta bort det rena (24 mm x 60 mm, #1,5) täckglaset från etanolförvaringen med pincett. Torka med kvävgas och förvara i en ren petriskål.
  4. Täckglas med 100 μL beläggningslösning: en blandning av 2 mg/ml mPEG-silan (MW 2 000) och 0,04 mg/ml biotin-PEG-silan (MW 3 400) i 80 % etanol (pH 2,0).
    OBS: För gles beläggning (rekommenderas) använd 2 mg / ml mPEG-silan och 0,04 mg / ml biotin-PEG-silan. För tät beläggning använd 2 mg/ml mPEG-silan, 4 mg/ml biotin-PEG-silan.
  5. Inkubera täckglas vid 70 °C i minst 18 timmar eller fram till användning.
    OBS: Belagda täckglas bryts ned om de förvaras vid 70 °C i mer än 2 veckor.

3. Montering av bildflödeskammare

  1. Skär 12 remsor dubbelsidig tejp med dubbla ryggar till en längd av 24 mm. Ta bort ena sidan av tejpens baksida och fixera tejpbitar intill de sex spåren som finns på en ren bildkammare.
    OBS: Tejpen måste vara platt för korrekt montering, annars läcker bildkammare. Ta försiktigt bort tejpens baksida för att undvika stötar. Glidande tejpade kamrar på en ren yta för att jämna ut bandkammarkontakter rekommenderas.
  2. Ta bort den andra tejpbiten för att exponera tejpens klibbiga sida längs varje kammarspår. Placera kammartejpen uppåt på en ren yta.
  3. Blanda epoxiharts och härdarlösningar 1:1 (eller enligt tillverkarens anvisningar) i en liten vägbåt.
  4. Använd en P1000-spets för att placera en droppe blandad epoxi mellan tejpremsorna i slutet av varje bildkammarspår (röd pil; Figur 1A). Placera kammartejp/epoxisidan uppåt på en ren yta.
  5. Ta bort ett belagt täckglas från inkubatorn vid 70 °C. Skölj belagda och obelagda ytor på täckglas medddH2Osex gånger, torka med filtrerad kvävgas och fäst sedan på bildkammaren med täckglasbeläggningssidan mot tejpen.
  6. Använd en P200- eller P1000-pipettspets för att applicera tryck på tejpglasgränssnittet för att säkerställa en bra tätning mellan tejpen och täckglaset.
    OBS: Med en ordentlig tätning blir dubbelsidig tejp genomskinlig. Bildkammare som saknar tillräckliga bandkammarkontakter läcker ut.
  7. Inkubera monterade kamrar vid rumstemperatur i minst 5-10 min för att epoxin ska kunna täta kammarbrunnarna helt före användning. Perfusionskamrarna löper ut inom 12-18 timmar efter montering.
    OBS: Beroende på tejpplacering och tjockleken på dubbelsidig tejp som används, kommer den monterade kammaren att ha en slutlig volym på 20-50 μL.

4. Konditionering av perfusionskamrar

  1. Använd en perfusionspump (hastighet inställd på 500 μl/min) för att sekventiellt byta ut konditioneringslösningar i perfusionskammaren enligt följande:
    1. Flöde 50 μL av 1% BSA för att primera bildkammaren. Ta bort överflödig buffert från Luer låsmonteringsbehållare.
    2. Flöde 50 μl av 0,005 mg / ml streptavidin. Inkubera i 1-2 min vid rumstemperatur. Ta bort överskottsbufferten från behållaren.
    3. Flöde 50 μl 1% BSA för att blockera ospecifik bindning. Inkubera i 10-30 s. Ta bort överskottsbufferten från behållaren.
    4. Flöde 50 μL varm (37 °C) 1x TIRF-buffert (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glukos, 0,25% (v/v) metylcellulosa (4 000 cp)).
      OBS: Ta inte bort överflödig buffert från behållaren. Detta förhindrar att kammaren torkar ut, vilket kan införa luftbubblor i systemet.
    5. Valfritt: Flöde 50 μL stabiliserade29 och 50% biotinylerade mikrotubulifrön utspädda i 1x TIRF-buffert.
      OBS: Den korrekta utspädningen måste bestämmas empiriskt och innehålla variabilitet från sats till sats. Protokoll från 27,29 rekommenderas som utgångspunkter. En utspädning som ger 10-30 frön per synfält fungerar bra med denna inställning.

5. Förberedelse av mikroskop

OBS: Biokemiska reaktioner som innehåller dynamiska aktinfilament och mikrotubuli visualiseras / utförs med hjälp av ett inverterat TIRF-mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) utrustat med 120-150 mW solid state-lasrar, ett temperaturkorrigerat 63x TIRF-mål för oljedämpning och en EMCCD-kamera. Proteiner i detta exempel visualiseras vid följande våglängder: 488 nm (mikrotubuli) och 647 nm (aktin).

  1. Ställ in steg-/målvärmaren så att den håller 35–37 °C minst 30 minuter före avbildning av den första biokemiska reaktionen.
  2. Ställ in bildförvärvsparametrarna enligt följande:
    1. Ställ in förvärvsintervallet till var 5: e s i 15-20 min.
    2. Ställ in 488 och 647 laserexponeringar på 50-100 ms vid 5% -10% effekt. Ställ in lämplig TIRF-vinkel för mikroskop.
      OBS: Oavsett mikroskopinställning är det enklaste sättet att ställa in lasereffekt, exponering och TIRF-vinkel att göra justeringar på bilder av endera polymeren ensam (se 5.2.2.1 och 5.2.2.2 nedan). Användare uppmanas starkt att använda de lägsta lasereffekt- och exponeringsinställningarna som fortfarande tillåter detektering.
      1. Justera polymerisationsreaktionen (figur 1C) för att initiera aktinfilamentmontering och få bilder vid 647 nm. Gör lämpliga justeringar.
      2. Justera polymerisationsreaktionen i en andra konditionerad perfusionsbrunn för att initiera mikrotubulimontering (figur 1C) och visualisera vid 488 nm. Gör lämpliga justeringar.

6. Framställning av proteinreaktionsblandningar

  1. Förbered stamlösning av fluorescerande märkt tubulin.
    1. Bestäm koncentrationen av hemlagad omärkt tubulin via spektrofotometri vid Abs280, enligt följande:
      1. Tom spektrofotometer med 1xBRB80 som saknar GTP.
      2. Beräkna koncentrationen av tubulin med hjälp av den bestämda extinktionskoefficienten på 115 000 M-1 cm-1 och följande formel:
        Equation 1
    2. Resuspend kommersiellt tillverkade lyofiliserade lysin-märkta 488-tubulin till 10 μM (1 mg / ml; 100% etikett) med 20 μL av 1x BRB80 saknar GTP.
    3. Tina en 7,2 μl alikvot på 100 μM omärkt återvunnet tubulin29 på is.
      OBS: Återvunnet tubulin är avgörande för framgångsrik mikrotubulimontering in vitro eftersom det tar bort polymerisationsinkompetenta dimerer som bildas i frysta proteinlager29,30.
    4. Kombinera 3 μL 10 μM 488-tubulin med 7,2 μL alikvot på 100 μM omärkt tubulin, högst 15 min före användning.
  2. Förbered stamlösningen av fluorescerande märkt aktin.
    1. För hemlagade proteiner, bestäm koncentrationen och procentetiketten av aktin via spektrofotometri Abs290 och Abs650, enligt följande:
      1. Tom spektrofotometer med G-buffert.
      2. Beräkna koncentrationen av omärkt aktin med hjälp av den bestämda extineringskoefficienten på 25 974 M-1 cm-1 och följande formel:
        Equation 2
      3. Beräkna koncentrationen av lysin märkt Alexa-647-aktin med hjälp av utrotningskoefficienten för omärkt aktin, fluorkorrigeringsfaktorn på 0,03 och följande formel:
        [Alexa-647 aktin], μM = (Abs290 - Equation 3
      4. Beräkna procentetiketten för Alexa-647-aktin med hjälp av den bestämda ε för Alexa-647 på 239 000 M-1 cm-1, enligt följande:
        % etikett av Alexa-647-aktin = (Abs290 - (Equation 4
    2. Tina en 2 μL alikvot av 3 μM 100% märkt biotin-aktin (märkt på lysinrester). Späd 10 gånger genom att tillsätta 18 μl G-buffert.
    3. Kombinera 3 μL utspätt biotinylerat aktin, lämpliga volymer omärkt och märkt aktin (ovan) så att den slutliga blandningen blir 12,5 μM totalt aktin med 10%-30% fluorescerande etikett.
      OBS: Mer än 30% procent fluorescerande aktinmonomerer (slutlig) kan äventyra bildupplösningen eftersom filament blir svåra att urskilja från bakgrunden.
  3. Förbered reaktionsblandningar (figur 1C).
    1. Förbered cytoskelettblandningen (rör A) genom att kombinera 2 μl av 12,5 μM aktinblandningsstocken (6.2.3) med tubulinstockblandningen (6.1.4), högst 15 minuter före avbildning. Förvara på is tills den används.
    2. Förbered proteinreaktionsblandning (rör B) genom att kombinera alla andra experimentella komponenter och proteiner, inklusive: 2x TIRF-buffert, antiblekmedel, nukleotider, buffertar och tillbehörsproteiner. Ett exempel visas i figur 1C.
      OBS: Den slutliga utspädningen resulterar i en 1x TIRF-buffert som innehåller ATP, GTP och jonstyrka inom det uppskattade fysiologiska intervallet.
  4. Inkubera rör A och rör B separat vid 37 °C i 30-60 s. För att initiera reaktion, blanda och tillsätt innehållet i rör B till rör A (nedan).

7. Bildaktin och mikrotubulidynamik

  1. Tillstånd perfusion väl (figur 1B; steg 4 ovan).
  2. Initiera aktin- och mikrotubulimontering samtidigt genom att tillsätta innehållet i rör B (reaktionsblandning) till rör A (cytoskelettblandning) (figur 1C).
  3. Reaktionsflöde 50 μl innehållande 1x TIRF-buffert kompletterad med 15 μM fritt tubulin, 1 mM GTP och 0,5 μM aktinmonomerer och lämpliga volymer buffertkontroller.
  4. Spela in time-lapse-film med hjälp av mikroskopprogramvara för att förvärva var 5: e s i 15-20 min.
    OBS: Initiering av aktin- och mikrotubulidynamik sker inom 2-5 minuter (figur 2). Längre fördröjningar indikerar problem med temperaturkontroll eller koncentrationsrelaterade problem med proteiner i reaktionsblandningen.
  5. Konditionera en ny perfusionsbrunn (steg 4) och ersätt buffertvolymen med reglerande protein(n) av intresse (dvs. Tau) och buffertkontroller (figur 1C). Förvärva enligt beskrivningen i steg 7 (ovan) för att bedöma regulatoriska proteiner för framväxande aktin-mikrotubulifunktioner.

8. Bearbeta och analysera bilder med FIJI-programvara31

  1. Öppna sparade TIRF-filmer och visa som en sammansatt.
  2. Analysera mikrotubulidynamik (figur 3A), enligt följande:
    1. Generera en tidsbaserad maximal Z-projektion från menyn för bildstaplar.
    2. Synkronisera Z-projektionsfönstret med den ursprungliga TIRF-filmen från menyn Analysera> verktyg> Synkronisera Windows .
    3. Rita en linje med hjälp av det raka linjeverktyget längs en mikrotubuli av intresse på den tidsprojicerade bilden.
      1. Öppna ROI-hanteraren (Region of Interest) från analysmenyn (Analysera> Verktyg> ROI Manager).
      2. Spara enskilda mikrotubuliplatser genom att trycka på "t". Upprepa för alla mikrotubuli av intresse.
    4. Rita kymografer över valda linjer med "/" eller kör multi-kymo-makrot som genererar en video och kymograf för varje mikrotubuli i ROI-hanteraren31.
      1. Lägg till skalfälten för både längd (μm) och tid (min) i kymografier på menyn Analysera> Verktyg> Skala staplar .
    5. Mät mikrotubulitillväxthastigheter från kymografsluttningar (figur 3A, 1-2; lutning av svarta linjer).
    6. Räkna dynamiska mikrotubulihändelser (katastrof eller återväxt) från den genererade kymografen eller med hjälp av tillgängliga analysmakron 5,8,18,25. Röda prickade linjer i figur 3A, 1-2 representerar katastrof/snabba demonteringshändelser.
  3. Analysera aktindynamik (figur 3B), enligt följande:
    1. Mät aktinnukleation enligt följande:
      1. Räkna antalet aktinfilament som finns i synfältet 100 s efter initieringen av reaktionen och uttrycka av området (filament per μm2).
      2. Registrera och spara data i ROI-hanteraren, som i steg 8.2.3.1 ovan.
    2. Mät aktinfilamentets töjningshastigheter (figur 3B) enligt följande:
      1. Rita en linje längs ett aktinfilament av intresse med hjälp av segmenterat linjeverktyg.
      2. Lägg till rad i ROI-hanteraren enligt steg 8.2.3.1 ovan.
      3. Upprepa att följa raden (lägga till varje mått i ROI-hanteraren) för minst fyra filmbildrutor.
        OBS: Mätning av sju till åtta på varandra följande ramar rekommenderas, men vissa förhållanden saktar aktinpolymerisationen under den detekterbara gränsen som kan lösas med objektiva / mikroskopinställningar. I ett sådant fall kan mätningar göras med jämna mellanrum över icke-på varandra följande ramar (t.ex. var femte bildruta).
      4. Plotta uppmätta längdvärden över förfluten tid. Lutningen på den genererade linjen är aktinförlängningshastigheten i mikron /s.
      5. Överför slutliga beräknade hastigheter som underenheter s-1 μM-1 med hjälp av en korrigeringsfaktor på 370 underenheter för att ta hänsyn till antalet aktinmonomerer i en mikron av filament32.
  4. Utför korrelativ analys för regioner med parallell aktin-mikrotubuliassociation (figur 3C), enligt följande:
    1. Rita en linje längs en mikrotubuli av intresse vid en viss tidpunkt (dvs 300 s efter reaktionsinitiering) med hjälp av det linjära verktyget.
      1. Lägg till rad i ROI-hanteraren enligt steg 8.2.3.1 ovan.
    2. Plotta fluorescensintensiteten längs linjen i varje kanal.
      1. Välj varje kanal med bildreglaget och rita intensiteterna längs linjen med "kommando k".
      2. Spara eller exportera värden genom att klicka på "lista" -knappen i utdatafönstret.
    3. Uttryck aktin-mikrotubulikopplingshändelser som ett förhållande (aktin överlappande med mikrotubuli) från enskilda händelser eller som ett antal händelser i ett givet synfält vid en konsekvent tidpunkt (figur 3C).
    4. Alternativ: Använd programvara för att bestämma den procentuella överlappningen av båda kanalerna 5,12.

Representative Results

Med de förhållanden som beskrivs ovan (figur 1) bör aktin- och mikrotubulipolymerer vara synliga (och dynamiska) inom 2 minuter efter bildinsamling (figur 2). Som med alla biokemibaserade protokoll kan optimering krävas för olika reglerande proteiner eller satser av protein. Av dessa skäl ställs TIRF-vinkeln och bildexponeringarna först med reaktioner som innehåller varje enskild polymer. Detta bekräftar att lagrade proteiner är funktionella och att tillräckligt med märkt protein finns för detektion. Även om det inte alltid är nödvändigt (och inte utförs här), kan efterbehandling av filmer (dvs. bakgrunds subtraktion, medelvärde eller Fourier-transformationer) användas för att förbättra bildkontrasten (särskilt av mikrotubuli)5,25,33. Den direkta visualiseringen av enstaka aktinfilament och mikrotubuli som tillhandahålls av denna analys stöder kvantitativ bestämning av flera dynamiska åtgärder för antingen cytoskelettkomponenten ensam eller tillsammans, inklusive polymerisationsparametrar (dvs. kärnbildning eller töjningshastighet), demonteringsparametrar (dvs. krympningshastigheter eller katastrofhändelser) och polymerkolignering / överlappning (figur 3 ). Vidare kan dessa åtgärder användas som utgångspunkt för att dechiffrera bindningen eller påverkan av reglerande ligander som Tau (Figur 3). Många mätningar av enstaka aktinfilament eller mikrotubuli kan göras från en TIRF-film. På grund av variationer i täckglasbeläggning, pipettering och andra faktorer bör tillförlitliga mätningar också inkludera flera tekniska replikatreaktioner/filmer.

Många aspekter av mikrotubulidynamik kan bestämmas från exempel kymografer inklusive graden av mikrotubuliförlängning, liksom frekvensen av katastrof- och räddningshändelser (figur 3A). Att använda kymografer för att mäta aktindynamik i detta system är inte lika enkelt eftersom aktinfilament är mer invecklade än mikrotubuli. Som en konsekvens mäts parametrar för aktinfilamentdynamik för hand, vilket är tidskrävande och arbetsintensivt. Antalet kärnbildningar mäts som antalet aktinfilament som finns vid en konsekvent tidpunkt för alla förhållanden. Dessa räkningar varierar mycket mellan TIRF-bildfält, men kan användas med många replikat eller för att komplettera observationer från andra polymerisationsanalyser. Kärnämnesräkningar kan också användas för mikrotubuli om försöksförhållandena saknar stabiliserade mikrotubulifrön. Aktinfilamentets förlängningshastigheter mäts som glödtrådens längd över tid från minst fyra filmramar. Hastighetsvärden överförs per mikromolärt aktin med en korrektionsfaktor på 370 underenheter för att ta hänsyn till antalet aktinmonomerer i ett mikron filament (figur 3B)32. Mätningar för att definiera de samordnade beteendena mellan aktin och mikrotubuli är mindre väldefinierade. Korrelativa analyser har dock tillämpats för att mäta sammanträffandet av båda polymererna inklusive linjeskanningar (figur 3C) eller överlappningsprogramvara 5,11,34.

Data tillgänglighet:
Alla datauppsättningar som är associerade med detta arbete har deponerats i Zenodo och är tillgängliga med rimlig begäran på: 10.5281/zenodo.6368327.

Figure 1
Figur 1. Experimentella scheman: flödeskammarmontering till bildförvärv. (A) Bildbehandlingskammarens sammansättning. Uppifrån och ner: IBIDI-bildkammare tejpas längs perfusionsbrunnar (betecknas med pil); det andra (vita) lagret av tejpunderlag (vänster på i bilden som visas för att bättre orientera användare) tas bort och Epoxi appliceras vid kanten av perfusionskammaren (pil). Obs: För att lättare orientera användare var epoxin ska placeras lämnades den vita baksidan kvar i den här bilden. Det rengjorda och belagda täckglaset är fäst vid bildkammaren med beläggningssidan vänd mot insidan av perfusionsbrunnen. (B) Flödesschema som illustrerar stegen för konditionering av bildkammare för biotin-streptavidinbindningar. (C) Exempel på reaktioner som används för att erhålla TIRF-filmer av dynamiska mikrotubuli och aktinfilament. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Bildsekvenser av växande aktinfilament och mikrotubuli i frånvaro eller närvaro av Tau. Time-lapse bildmontage från TIRF-analyser som innehåller 0,5 μM aktin (10% Alexa-647-aktin och 0,09% biotin-aktin märkt) och 15 μM fritt tubulin (4% HiLyte-488 märkt) i frånvaro (A) eller närvaro (B) av 250 nM Tau. Tid som förflutit från reaktionsinitiering (blandning av rör A och rör B) visas. Skalstreck, 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3. Exempelmätningar av mikrotubuli och aktinfilamentdynamik. (A) Genomsnittlig tidsprojektion av tubulinkanalen visualiserar effektivt totala mikrotubulilängder för de linjeskanningar som används för att generera kymografdiagram. Svarta prickade linjer motsvarar de två exempel kymograferna av dynamiska mikrotubuli som visas till höger. Tillväxtfaserna (solida svarta linjer) och demonteringsfaserna (prickade rosa linjer; två betecknade med rosa pilar) av mikrotubuli visas på varje kymograf. Tidsskalefält, 3 min. Längd skalstång, 10 μm. Reaktionen innehåller 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) och 15 μM fritt tubulin (4% 488-HiLyte-etikett). Endast tubulinkanalen visas. (B) Två exempel på time-lapse-bildmontage som visar enaktinfilament som aktivt polymeriserar. Förlängningshastigheter beräknas som lutningen på tomter av längden på aktinfilament över tid per mikromolärt aktin. Således måste en korrigeringsfaktor på två tillämpas på 0,5 μM aktinreaktioner för jämförelse för hastigheter som vanligtvis bestäms vid 1 μM aktinkoncentration. Exempel från fem filament visas till höger. Skalstänger, 10 μm. Reaktionen innehåller 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) och 15 μM fritt tubulin (4% 488-HiLyte-etikett). Endast aktinkanalen visas. (C) TIRF-bilder av dynamiska mikrotubuli (MT) (grön) och aktinfilament (lila) polymeriserande i frånvaro (vänster) eller närvaro av 250 nM Tau (mitten). Blå prickade linjer och pilar markerar var en linje ritades för linjeskanningsdiagrammen som motsvarar varje villkor (under varje bild). Överlappning mellan mikrotubuli och aktinregioner (visas som svart) kan poängsättas vid en viss tidpunkt per område (höger). Skalstänger, 25 μm. Reaktionerna innehåller 0,5 μM aktin (10% 647-etikett) och 15 μM fritt tubulin (4% 488-HiLyte-etikett) med eller utan 250 nM Tau. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Användningen av total intern reflektionsfluorescens (TIRF) mikroskopi till visualiserade renade proteiner har varit ett fruktbart och övertygande tillvägagångssätt för att dissekera unika mekanismer för cytoskelettreglering 5,23,24,25,26,27,35. Jämfört med traditionella biokemiska analyser kräver TIRF-reaktioner mycket små volymer (50-100 μL), och kvantitativa mätningar av cytoskelettdynamik kan hämtas från en individuell analys. De flesta studier av cytoskelettdynamik fokuserar på ett enda polymersystem (dvs. aktinfilament eller mikrotubuli), så detaljerade mätningar av överhörning eller framväxande beteenden mellan aktinfilament och mikrotubuli som vanligtvis ses i celler har förblivit svårfångade och svåra att rekapitulera i provröret. För att lösa detta problem beskriver detta protokoll ett TIRF-mikroskopisystem med en filament som möjliggör direkt visualisering av dynamiska aktin- och mikrotubulipolymerer i samma biokemiska reaktion. Således går denna metod utöver traditionella analyser som rekapitulerar det dynamiska beteendet hos aktinfilament eller mikrotubuli ensam. Denna teknik utfördes också med Tau som ett exempel på hur flera dynamiska egenskaper förändras i närvaro av en cytoskelettkopplingsfaktor. Detta protokoll kan användas med ytterligare proteiner som är kända eller misstänks för att samordna aktin- eller mikrotubulidynamik, inklusive (men inte begränsat till) MACF, GAS, forminer och mer. Slutligen kan exempelanalyser användas som en guide för att kvantifiera data som förvärvats med detta protokoll.

"Att se är att tro" är en tvingande anledning att utföra mikroskopibaserade analyser. Försiktighet krävs dock vid utförande och tolkning av TIRF-mikroskopiexperiment. En stor utmaning med cytoskelettsammonteringsanalyser är att många vanliga avbildningsförhållanden inte är kompatibla med varje polymer. Mikrotubuli och aktin har vanligtvis olika buffert-, temperatur-, salt-, nukleotid- och koncentrationskrav för polymerisation. Aktin, tubulin, reglerande proteiner av intresse och de buffertar som används i detta protokoll är känsliga för frys-tina cykler. Därför är noggrann hantering av proteiner och buffertar nödvändig för att framgångsrikt kunna utföra detta protokoll. För att lindra många av dessa problem rekommenderas starkt att använda nyåtervunnet tubulin (fryst i <6 veckor) och förröjning av frysta / återsuspenderade aktiner via ultracentrifugering. Dessa överväganden gäller också för den myriad av reglerande proteiner som ska bedömas med detta förfarande, som kan vara känsliga för frys-tina cykler eller koncentrationen av buffertsalter 5,11,36.

Tyvärr finns det ingen buffert som passar alla utan experimentella kompromisser. För att lämplig mer volym för proteiner med lägre koncentration kan ATP och GTP inkluderas i 2x TIRF-buffertlösningen (figur 1C). Men eftersom dessa nukleotider är extremt känsliga för frys-tina cykler rekommenderas det inte. De syrerengörande föreningarna som används här (dvs. katalas och glukosoxidas) är nödvändiga för att visualisera proteiner under långa tidsperioder (minuter till timmar), men är kända för att begränsa mikrotubulipolymerisation vid höga koncentrationer5. Relaterat till dessa buffertöverväganden är en begränsning av detta protokoll att vissa kanoniska mikrotubuliassocierade reglerande proteiner kan kräva mer eller mindre salt för att rekapitulera funktioner som finns i celler eller analyser med hjälp av enbart mikrotubuli (utan aktin). Att ändra saltets natur eller koncentration för att ta itu med dessa problem kommer sannolikt att påverka graden av aktinfilamentpolymerisation och / eller parametrar för mikrotubulidynamik. Mätningar av flera beskrivande parametrar (minimalt, kärnbildning, töjningshastigheter och stabilitet) (figur 3) krävs för att bekräfta protokollframgång eller för att uttryckligen dokumentera effekterna av specifika buffertar eller reglerande proteiner. Till exempel kan för mycket aktinfilamentpolymerisation dölja aktin-mikrotubulikopplingshändelser inom några sekunder. Följaktligen kommer finjustering av experimentella förhållanden genom att sänka den totala koncentrationen av aktin eller inkludera ytterligare proteiner för att undertrycka aktinkärnbildning (dvs. profilin) att förlänga den totala perioden som samordnade aktin-mikrotubuliaktiviteter kan ses tydligt. Kontroller som hanterar dessa krav och tekniska replikat (bortom flera synfält) är viktiga för att användarna ska kunna generera tillförlitliga och reproducerbara resultat.

Cellbaserade studier ger begränsad möjlighet att observera direkta protein-proteinrelationer eller verkan av regulatoriska komplex. Däremot återspeglar några av de mekanismer som hämtas från in vitro-analyser inte alltid de exakta beteendena hos proteiner som ses i celler. Detta klassiska biokemistiska dilemma kan behandlas i framtida tillämpningar av denna teknik med specifika modifieringar. Till exempel, tillsats av funktionella fluorescerande märkta kopplingsproteiner utvidgar denna metod från enfilamentstudier till enmolekylära studier. Analyser kan modifieras ytterligare för att använda cellextrakt som kan lägga till de "saknade" okända nyckelfaktorer som krävs för att rekapitulera cellliknande fenomen. Till exempel har TIRF-baserade analyser som använder jäst- eller Xenopus-extrakt rekonstituerat kontraktila aktomyosinringar37, mitotiska spindlar26,38, komponenter i aktin eller mikrotubulienhet39,40 och jämn dynamik vid centrosomen och kinetokorerna 36,41,42,43 . Dessutom kan sådana system bana väg för artificiella cellsystem som har lipider eller signalfaktorer närvarande 44,45,46.

Disclosures

Det finns inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Jag är tacksam mot Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) och Brian Haarer (SUNY Upstate) för hjälpsamma kommentarer om detta protokoll. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (GM133485).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% BSA (w/v) Fisher Scientific BP1600-100 For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80 Homemade 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO G2133-50KU Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin Cytoskeleton Inc, Denver, CO T240 Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO A-081 Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP Fisher Scientific AC226250010 Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers Leica Microsystems 11889151; 11889148
2 mg/mL catalase Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO C40-100 Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer Homemade 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass Fisher Scientific, Waltham, MA 22-266882 Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) Avantor, Philadelphia, PA RLS000-01 Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener Loctite, Rocky Hill, CT 1365736 Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds Cytoskeleton Inc; Homemade T333P (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock Homemade; this protocol A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls Homemade Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) Laysan Bio Inc biotin-PEG-SIL-3400 Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin Cytoskeleton Inc; Homemade AB07 Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software www.https://imagej.net/software/fiji/downloads Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin Cytoskeleton Inc; Homemade AR05 Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin Cytoskeleton Inc TL488M, TLA590M, TL670M Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer Homemade 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer Homemade 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers IBIDI, Fitchburg, WI 80666 Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera Andor, Belfast, Northern Ireland 8114137
LASX Premium microscope software Leica Microsystems 11640611
Methylcellulose (4,000 cp) Sigma Aldrich Inc M0512
Microscope base equipped with TIRF module Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11889146
mPEG-silane (MW 2,000) Laysan Bio Inc, Arab, AL mPEG-SIL-2000 Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert OKO labs, Pozzioli, Italy 8113569 Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump Harvard Apparatus, Holliston, MA 704504 A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm Genesee Scientific, San Diego, CA 32-107
Plastic slide mailer container Fisher Scientific HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick Grace Biolabs, Bend, OR 620001 Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container Abcam, Cambridge, UK Reused from shipping
Small weigh boat Fisher Scientific 02-202-100
Spectrophotometer
Tau Cytoskeleton Inc TA01 Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective Leica Microsystems 11506319
Tubulin stock Homemade; this protocol A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark) Cytoskeleton Inc; Homemade AKL99 Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
  2. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  3. Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
  4. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
  5. Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
  6. Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
  7. Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004 (2016).
  8. Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
  9. Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  10. Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
  11. Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
  12. Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
  13. Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916 (2021).
  14. Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
  15. Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
  16. Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
  17. Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
  18. Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119 (2022).
  19. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  20. Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
  21. Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
  22. Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
  23. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).
  24. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
  25. Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520 (2019).
  26. King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270 (2020).
  27. Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB's tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
  28. Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008 (2013).
  29. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  30. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  33. Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794 (2019).
  34. Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
  35. Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177 (2020).
  36. Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
  37. Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
  38. Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
  39. Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
  40. Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386 (2018).
  41. Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
  42. Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
  43. Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
  44. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  45. Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433 (2014).
  46. Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
  47. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  48. Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212 (2022).
  49. Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).

Tags

Biokemi utgåva 185 TIRF-mikroskopi aktin mikrotubuli cytoskelettdynamik in vitro-ytanalyser Tau
Visualisering av aktin- och mikrotubulikopplingsdynamik <em>in vitro</em> genom total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henty-Ridilla, J. L. VisualizingMore

Henty-Ridilla, J. L. Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e64074, doi:10.3791/64074 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter