Summary
В протоколе представлена модель иммунотерапии рака с использованием клеточной вакцинации опухоли с Flt3L-экспрессирующей меланомой B16-F10. Этот протокол демонстрирует процедуры, включая подготовку культивируемых опухолевых клеток, имплантацию опухоли, облучение клеток, измерение роста опухоли, выделение внутриопухолевых иммунных клеток и анализ проточной цитометрии.
Abstract
Fms-подобный тирозинкиназа 3 лиганд (Flt3L) представляет собой кроветворный цитокин, который способствует выживанию и дифференцировке дендритных клеток (DC). Он был использован в опухолевых вакцинах для активации врожденного иммунитета и усиления противоопухолевых реакций. Этот протокол демонстрирует терапевтическую модель с использованием клеточной опухолевой вакцины, состоящей из Flt3L-экспрессирующих клеток меланомы B16-F10 вместе с фенотипическим и функциональным анализом иммунных клеток в микроокружении опухоли (TME). Описаны процедуры культивируемой подготовки опухолевых клеток, имплантации опухоли, облучения клеток, измерения размера опухоли, выделения внутриопухолевых иммунных клеток и анализа проточной цитометрии. Общей целью этого протокола является предоставление доклинической модели иммунотерапии солидной опухоли и исследовательской платформы для изучения взаимосвязи между опухолевыми клетками и инфильтрирующими иммунными клетками. Протокол иммунотерапии, описанный здесь, может быть объединен с другими терапевтическими методами, такими как блокада иммунных контрольных точек (анти-CTLA-4, анти-PD-1, анти-PD-L1 антитела) или химиотерапия с целью улучшения терапевтического эффекта меланомы.
Introduction
Иммунотерапия рака была признана многообещающей терапевтической стратегией, основанной на ее менее токсичных побочных эффектах и более длительных ответах. Было разработано несколько типов иммунотерапии, включая онколитическую вирусную терапию, противораковые вакцины, цитокиновую терапию, моноклональные антитела, перенос приемных клеток (CAR-T-клетки или CAR-NK) и блокаду иммунных контрольных точек1.
Для противораковых вакцин существуют различные формы терапевтических вакцин, такие как цельноклеточные вакцины, белковые или пептидные вакцины и РНК- или ДНК-вакцины. Вакцинация опирается на способность антигенпрезентирующих клеток (АПК) обрабатывать опухолевые антигены, включая опухолеспецифические антигены, и представлять их в иммуногенной форме Т-клеткам. Дендритные клетки (ДК), как известно, являются наиболее мощными АПК и, как полагают, играют важную роль в противоопухолевом иммунитете 2,3. Эти клетки поглощают и обрабатывают опухолевые антигены, а затем мигрируют в дренирующие лимфатические узлы (dLN), чтобы праймировать и активировать опухолеспецифические Т-эффекторные (Teff) клетки путем вовлечения рецептора Т-клеток (TCR) и костимуляторных молекул. Это приводит к дифференцировке и расширению опухолеспецифических цитотоксических Т-клеток (CTL), которые проникают в опухоль и убивают опухолевые клетки4. Следовательно, активация и созревание ДК представляют собой привлекательные стратегии для стимуляции иммунитета против опухолевых антигенов.
Известно, что Flt3L способствует созреванию и расширению функционально зрелых DC, которые экспрессируют белки MHC класса II, CD11c, DEC205 и CD865. Было показано, что внутриопухолевое, но не внутривенное введение вектора аденовируса, включающего ген Flt3L (Adv-Flt3L), способствует иммунной терапевтической активности в отношении ортропотопических опухолей6. Flt3L также используется в вакцинах на основе опухолевых клеток, состоящих из облученных клеток B16-F10, стабильно экспрессирующих ретровирусно трансдуцированный Flt3L в качестве способа усиления перекрестной презентации опухолевых антигенов ДК и, таким образом, увеличения противоопухолевых ответов. Протокол вакцинации против опухоли B16-Flt3L, описанный здесь, основан на исследовании, опубликованном группой7 доктора Джеймса Эллисона. В этой статье они сообщили, что вакцина B16-Flt3L в сочетании с блокадой CTLA-4 синергетически индуцировала отторжение установленной меланомы, что приводило к увеличению выживаемости.
Целью этого протокола является предоставление доклинической модели иммунотерапии меланомы. Здесь подробно описаны процедуры того, как приготовить и имплантировать опухолевые вакцины, а также как проанализировать состав и функцию внутриопухолевых иммунных клеток из солидной опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши, использованные в исследовании, содержались и размещались в виварии Института иммунологии Ла-Хойя (LJI) в специфических условиях, свободных от патогенов, с контролируемой температурой и влажностью. Эксперименты на животных проводились с 8-14-недельными самками мышей C57BL/6 в соответствии с руководящими принципами и протоколами, одобренными Комитетом по уходу за животными LJI.
1. Подготовка культивируемых опухолевых клеток к имплантации
- Культивирование клеток меланомы B16-F10 в модифицированной среде Дульбекко (IMDM) Iscove, содержащей 10% термоинактивированного FBS, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1 мМ MEM заменимых аминокислот и 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина. Поддерживайте клеточную линию при 37 °C при 5% CO2.
- Семена 1,5-2 х 106 B16-F10 клеток в колбе 175T и культуре в течение 2 дней. Собирайте клетки, когда они на 75%-80% сливаются.
- Снимите питательную среду и промойте колбу один раз PBS. Аспирировать PBS и добавить 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА с последующим резким постукиванием по ободу колбы для культивирования.
- Добавьте 15 мл питательной среды для нейтрализации трипсина-ЭДТА и перелейте содержимое колбы в трубку центрифуги объемом 50 мл. Вымойте поверхность посуды 10 мл PBS и перелейте в ту же 50 мл трубку.
- Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 200 х г. Выбросьте супернатант и разбейте гранулу ячейки пальцем, постукивая по дну трубки.
- Добавьте холодные 10 мл PBS и осторожно пипетируйте клеточную суспензию; затем вручную подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра. Держите клетки на льду перед инъекцией.
2. Имплантация опухоли
- Газ обезболивает мышей 5% изофлураном при расходе газа 1,0 л в минуту в вытяжном шкафу. Измените скорость потока на поддерживающую дозу 2% изофлурана, как только мыши будут полностью обезболены. Для этого протокола анестезия была выполнена ветеринаром в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными и их использованию.
- Сбрить волосы на левом боку мышей и стерилизовать место инъекции с помощью спиртовых салфеток. Внутрикожно (т.д.) имплантируют опухолевые клетки B16-F10 в 5 х 105 клеток в 50 мкл холодного PBS в левом боку с помощью иглы 30 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Доза имплантированных опухолевых клеток B16-F10 может потребоваться скорректировать в диапазоне 0,5-5 х 105 клеток для успешного развития опухоли. - После имплантации измеряют длину и ширину опухоли три раза в неделю с помощью электронного цифрового суппорта. Рассчитайте объем опухоли (3 мм) по формуле:
Объем опухоли (3 мм) = ширина2 × длина × 0,5
Лечить мышей опухолевой вакциной, когда опухоли достигли размера ≥2 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли обычно можно измерить на 3 день после имплантации 5 х 105 опухолевых клеток. Более высокая скорость роста опухоли B16-F10 наблюдалась у самцов C57BL/6, Rag1-/-, или Rag2-/-γc-/-мышей. Аналогичное наблюдение было описано в других исследованиях8. Рекомендуется поддерживать пол мышей последовательным. Тем не менее, обратите внимание, что NIH делает акцент на сексе как важной биологической переменной в биомедицинских исследованиях.
3. Подготовка вакцины и инъекция Flt3L-экспрессирующих B16-F10 (B16-Flt3L) клеток
- Поддерживать клетки B16-Flt3L в DMEM, содержащие 8% термоинактивированного FBS, 2 мМ глутамина и 100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина при 37 °C при 5% CO2.
- Семена 1 х 106 B16-Flt3L клеток в колбе 175T и культуры в течение 2 дней. Собирают клетки, когда они на 75%-80% сливаются, как описано на этапах 1,3-1,6, и суспендируют в 1 мл холодного PBS.
- Облучение клеток при дозе 150 Гр гамма-лучей с помощью рентгеновского облучателя с настройкой параметров 160 кВ и 25 мА. Подсчитайте и проверьте жизнеспособность клеток, окрашивая их в синий цвет перед инъекцией.
- Газ обезболивает мышей, как описано ранее, и стерилизует место инъекции с помощью спиртовых салфеток. Внутрикожно вводят мышам 1 х 106 облученных B16-Flt3L клеток в 50 мкл холодного PBS на том же фланге, что и первоначальная имплантация опухоли, ~ 1 см от места первичной опухоли на 3, 6 и 9 день после первоначальной имплантации клеток.
- Пометьте места инъекции вакцины цветной ручкой, чтобы отличить ее от первичной опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если первоначально имплантировано0,5 х 10 5 клеток B16-F10, рекомендуется проводить вакцинацию на 8, 11 и 14 день.
4. Изоляция внутриопухолевых иммунных клеток
- Жертвоприношение мышей с использованиемСО2 и вывиха шейки матки в вытяжном капюшоне в конце эксперимента (на 15 день после имплантации опухоли; Рисунок 1).
- Хирургически удаляют опухоль с кожей у каждой мыши и помещают ее в 24-луночную пластину с 1 мл 10% среды FBS/RPMI-1640. Высушите опухоли с помощью бумажного полотенца перед взвешиванием.
- Разрежьте опухоли на мелкие кусочки. Добавьте 2 мл буфера пищеварения (100 мкг/мл TL Liberase и 200 мкг/мл ДНКазы I в среде RPMI-1640) и инкубируйте в течение 25 мин при 37 °C.
- Добавьте 10 мл 10% среды FBS/RPMI-1640, чтобы остановить пищеварение. Перенесите клетки с помощью серологической пипетки объемом 25 мл и используйте поршень шприца объемом 1 мл для измельчения ткани на клеточном ситечке 40 мкм.
- Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируют гранулы в 5 мл 40% градиента плотности удельной среды в PBS, разбавленной до 1x концентрации).
- Медленно добавляйте клеточную суспензию поверх 5 мл 80% градиентно-специфической среды плотности, содержащей PBS. Центрифугирование ячеек при разрешении 325 x g с низкой настройкой тормозов в течение 23 мин при комнатной температуре (RT).
- После центрифугирования тщательно соберите слой лейкоцитов на границе раздела между 40% и 80% плотностью-градиент-специфической средой и пропустите его через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм. Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Инкубировать гранулу в 2 мл буфера лизиса эритроцитов (ЭРИАК) в течение 5 мин при РТ. После инкубации добавляют 10 мл 10% среды FBS/RPMI-1640 для закалки буфера лизиса RBC.
- Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируют клетки в 0,5 мл 10% среды FBS/RPMI-1640 и подсчитывают общее количество клеток перед использованием для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите селезенку или dLN в качестве контроля для стратегии определения стратегии иммунных клеток с помощью анализа проточной цитометрии. Следуйте методу изоляции клеток, как описано выше, со следующими изменениями: Используйте поршень шприца объемом 1 мл для измельчения ткани на сетчатом фильтре 70 мкм. Промыть ткань 10% средой FBS/RPMI-1640 для получения одноклеточных суспензий. Lyse РБК, как описано.
5. Анализ проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, собранные из слоя лейкоцитов, содержат иммунные клетки и опухолевые клетки. Рекомендуется использовать две независимые окрашивающие панели.
- Окрашивание поверхности
- Переместите ячейки в 96-луночную V-образную нижнюю пластину. Промыть клетки PBS и окрасить их красителем жизнеспособности клеток (50-100 мкл/хорошо) в течение 15 мин при РТ.
- Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Окрашивают поверхностные маркеры смешанными антителами (подробное разведение приведено в Таблице материалов) в буфере FACS (1% FBS и 0,05% NaN3 в PBS) в течение 30 мин на льду (50-100 мкл/лунка).
- Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин и дважды промывайте их буфером FACS.
- Зафиксируйте клетки с буфером фиксации клеток (50-100 мкл / колодец) в течение 35 мин на льду. Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин и дважды промывайте их буфером FACS.
- Храните образцы в буфере FACS (150-200 мкл/пробирка) при температуре 4 °C и защищайте от света. Приобретайте образцы на проточном цитометре. Для популяции ДК и Т-клеток следуйте стратегиям гаширования, представленным на рисунке 2B и рисунке 3A.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания миелоидных ДК рекомендуется инкубировать FC-блокатор (Rat anti-mouse CD16/CD32) в течение 15 мин на льду перед инкубацией поверхностных антител (этап 5.1.2).
- Анализ цитокинов при повторной стимуляции ex vivo
- Обложите клетки в полной среде (RPMI-1640, дополненный 10% FBS, 10 мМ HEPES, рН 7,2-7,6, 0,1 мМ заменимой аминокислоты, 1 мМ пирувата натрия, 100 МД/мл каждого пенициллина и стрептомицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ Л-глутамина) и стимулируйте 50 нг/мл PMA плюс 1 мкМ иономицина в присутствии ингибитора транспорта белка в течение 4 ч при 37 °C при 5% CO2.
- Выполните окрашивание поверхности для поверхностных маркеров, как описано выше на шаге 5.1.
- Добавляют раствор для пермеабилизации (50-100 мкл/лунка) и инкубируют в течение 5 мин при РТ для внутриклеточного окрашивания. Инкубируют клетки с антителами, специфичными для цитокинов или ядерных белков, в пермеабилизационном растворе (50-100 мкл/лунка) в течение 60 мин на льду или на ночь при 4 °C.
- Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин и дважды промывайте их буфером FACS. Храните образцы при температуре 4 °C и защищайте от света. Приобретайте образцы на проточном цитометре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление антител, возможно, придется корректировать по мере необходимости для достижения оптимального окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Видимая черная точка имплантированных клеток B16-F10 обычно наблюдается на поверхности кожи ~ через 3 дня после имплантации опухоли. Мышей лечат опухолевой вакциной через 3, 6 и 9 дней после того, как узелок опухоли достиг размера ≥2 мм. Мы наблюдали значительное снижение роста опухоли у вакцинированных мышей группы ~ 2 недели после имплантации опухоли (рисунок 1). В конце эксперимента мы выделили внутриопухолевые иммунные клетки и проанализировали их количество и экспрессию маркеров клеточной поверхности, а также выработку цитокинов после короткой стимуляции in vitro , как описано выше. Клетки, собранные из слоя лейкоцитов, все еще содержат много опухолевых клеток, что затрудняет легкое определение популяции лимфоцитов. Поэтому использование параллельно спленоцитов рекомендуется для правильного определения подмножеств внутриопухолевых иммунных клеток в анализе проточной цитометрии (рисунок 2А). Здесь показаны стратегии измерения CD103+CD11c+DC, CD8+, CD4+ и Treg (рисунок 2B и рисунок 3A) вместе с компенсационной матрицей (таблица 1 и таблица 2). Репрезентативные данные о полученных подсчетах и частоте каждой популяции также представлены на рисунке 2C и рисунке 3B.
Внутриопухолевые CD103+CD11c+DC, которые представляют собой наиболее мощные опухолевые антигенообрабатывающие и представляющие клетки 9,10, у вакцинированных мышей показали значительно повышенную экспрессию костимуляторного лиганда CD86 (рисунок 4). У вакцинированных мышей также наблюдалось увеличение инфильтрирующих опухоль CD8+ и CD4 + Foxp3− Т-клеток (рисунок 5A), а также CD8 + GzmB + и IFN-γ + CTL (рисунок 5B). Эти результаты свидетельствуют о том, что эта вакцинация опухоли способствует созреванию ДК и индуцирует более сильный противоопухолевый иммунитет.
Рисунок 1: Анализ роста опухоли в терапевтической модели клеточной опухолевой вакцины с использованием Flt3L-экспрессирующих клеток меланомы B16-F10. Самкам мышей C57BL/6 имплантировали, т.е. клетки B16-F10 (5 x 105) и вводили облученные (150 Гр) клетки B16-Flt3L (1 x 106) в соседнем участке на том же фланге. Наконечники стрел указывают временные точки вакцинации. Показаны кумулятивные данные четырех экспериментов (Control, n = 12; B16-Flt3L, n = 10). Данные представлены в виде среднего ± SEM. Статистический анализ методом двустороннего повторного измерения теста ANOVA с бонферрони после теста. *P < 0,05; ***P < 0,001. Эта цифра была изменена с11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегии гаширования лимфоцитов и CD103+CD11c+DC. (A) Стратегии захвата лимфоцитов в образцах селезенки и опухоли. (B) Стратегии определения внутриопухолевой CD103+CD11c+DCs в образце опухоли. (C) Показаны приобретенные подсчеты и частота каждой популяции от репрезентативной невакцинированной контрольной мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стратегии гаширования CD8+, CD4+ и Treg. (A) Стратегии определения Т-клеток в образце опухоли. (B) Показаны приобретенные подсчеты и частота каждой популяции от репрезентативной невакцинированной контрольной мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспрессия поверхности CD86 на внутриопухолевых ДК CD103+ . Экспрессия сообщается как медианная интенсивность флуоресценции (MFI), нормализованная до средней MFI в контрольной группе (= 1). Контроль, n = 8; B16-Flt3L, n = 10. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Статистический анализ с помощью непарного T-теста Студента. **P < 0,01. Эта цифра была изменена с11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анализ внутриопухолевых Т-клеток у контрольных и вакцинированных мышей. (А) Перечисление опухолевых инфильтрирующих CD8+ (слева) и не-Treg CD4+ (справа) на грамм опухолевой ткани. (B) Перечисление внутриопухолевых GzmB+ (слева) и IFNγ+ (справа) CD8+ Т-клеток. Контроль, n = 11; B16-Flt3L, n = 10. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Статистический анализ с помощью непарного T-теста студента. *P < 0,05; **P < 0,01. Эта цифра была изменена с11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Компенсационная матрица на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Компенсационная матрица , рисунок 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, основан на исследовании группы Эллисон. Они продемонстрировали, что комбинация вакцины B16-Flt3L с блокадой CTLA-4 показала синергетический эффект на выживаемость и рост опухоли, тогда как у мышей, получавших вакцину B16-Flt3L или лечение антителами против CTLA-4, не наблюдалось только снижения роста опухоли 7. Недавние исследования выявили новый Treg-intrinsic CTLA4-PKCη сигнальный путь, который играет важную обязательную роль в регулировании контактно-зависимой супрессивной активности Treg11. Как лечение вакциной B16-Flt3L в одиночку, так и комбинация вакцины с Treg-специфической делецией PKCη значительно уменьшали рост опухоли при имплантации большего количества (0,5-5 x 10 5) клеток меланомы B16-F10, чем в исследовании Эллисона (1 x 104) клеток. Тонкие различия в источнике клеток меланомы или мышей могут объяснить эту разницу. Поэтому рекомендуется титровать количество имплантированных опухолевых клеток. Повышенная инфильтрация CD8+ Т-клеток в первичной опухоли аналогичным образом наблюдалась в предыдущем исследовании7. Кроме того, мы наблюдали повышенную экспрессию CD86 на внутриопухолевых CD103 + CD11c + DC, что, вероятно, объясняет более сильную активацию и расширение опухолевых инфильтрирующих CD8 + CTL.
Этот протокол, использующий клеточную опухолевую вакцину, экспрессирующую Flt3L, удобен и прост в использовании и служит надежной моделью для изучения инфильтратов внутриопухолевых иммунных клеток, включая DC. Например, сигнализация PKCη необходима для контактно-зависимой подавляющей активности Treg. Таким образом, Prkch−/− Treg показал более высокую эффективность сопряжения с БТР в системе кокультуры Treg-DC in vitro , что указывает на дефект способности Prkch−/− Treg разрывать контакт и отрываться от присоединенных DC12. Вакцинация B16-Flt3L, вероятно, набирает более зрелые ДК, которые более эффективно представляют опухолеспецифические антигены и, таким образом, она, вероятно, облегчит наблюдение за взаимодействием между инфильтрирующим опухоль Treg и DC с помощью визуализации живых клеток.
Соблюдение достаточного расстояния между первичной опухолью и опухолевой вакциной является важной особенностью этого протокола. Это физическое разделение имеет решающее значение для того, чтобы обеспечить пространство для роста первичной опухоли и избежать потенциального слияния между двумя опухолевыми имплантатами. Альтернативно, опухолевая вакцина может быть имплантирована в противоположный фланг относительно первичной опухоли, поскольку сообщалось также, что она ингибирует рост опухоли7. Одним из ограничений исследования является отсутствие коммерческого источника клеточной линии B16-Flt3L, но та же концепция может быть применена к другим типам опухолей, например, к аденокарциноме простаты TRAMP-C27.
Хотя протокол, описанный здесь, использует клетки меланомы B16-F10 в качестве модели опухоли, основные принципы могут быть адаптированы и модифицированы по мере необходимости для создания иммунотерапевтических моделей для других солидных опухолей. Кроме того, протокол вакцинации, который мы использовали, может быть легко объединен с другими терапевтическими методами, например, блокадой контрольных точек на основе CTLA-4 или PD-1, для достижения аддитивных или синергетических эффектов, которые потенциально могут привести к более мощному противоопухолевому иммунитету и повышению выживаемости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Стивена Шёнбергера за предоставление клеток B16-Flt3L и персоналу лаборатории цитометрии животных и проточной цитометрии LJI за отличную поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
