Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering af subcellulær lokalisering af et protein i hjertet ved hjælp af kvanteprikker-medieret immunmærkning efterfulgt af transmissionselektronmikroskopi

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64085
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

Summary

Den nuværende protokol beskriver en metode til immunmærkning af et protein i hjertevævssektionerne ved hjælp af kvanteprikker. Denne teknik giver et nyttigt værktøj til at visualisere ethvert proteins subcellulære lokalisering og ekspression på ultrastrukturelt niveau.

Abstract

Den subcellulære lokalisering er afgørende for at afgrænse korrekt funktion og bestemme de molekylære mekanismer for et bestemt protein. Flere kvalitative og kvantitative teknikker bruges til at bestemme den subcellulære lokalisering af proteiner. En af de nye teknikker til bestemmelse af den subcellulære lokalisering af et protein er kvanteprikker (QD) -medieret immunmærkning af et protein efterfulgt af billeddannelse af dem med transmissionselektronmikroskopi (TEM). QD er en halvleder nanokrystal med en dobbelt egenskab af krystallinsk struktur og høj elektrontæthed, hvilket gør dem anvendelige til elektronmikroskopi. Denne nuværende metode visualiserede den subcellulære lokalisering af Sigma 1-receptorprotein (Sigmar1) ved hjælp af QD-TEM i hjertevævet på ultrastrukturelt niveau. Små terninger af hjertevævssektionerne fra en vildtype mus blev fastgjort i 3% glutaraldehyd, efterfølgende osmiceret, farvet med uranylacetat, efterfulgt af sekventiel dehydrering med ethanol og acetone. Disse dehydrerede hjertevævssektioner blev indlejret i epoxyharpikser med lav viskositet, skåret i tynde sektioner med 500 nm tykkelse, sat på gitteret og efterfølgende udsat for antigendemaskering med 5% natriummetaperiodat efterfulgt af slukning af de resterende aldehyder med glycin. Vævene blev blokeret efterfulgt af sekventiel inkubation i primært antistof, biotinyleret sekundært antistof og streptavidinkonjugeret QD. Disse farvede sektioner blev tørret og afbildet ved høj forstørrelse ved hjælp af TEM. QD-TEM-teknikken tillod visualisering af Sigmar1-proteinets subcellulære lokalisering på det ultrastrukturelle niveau i hjertet. Disse teknikker kan bruges til at visualisere tilstedeværelsen af ethvert protein og subcellulær lokalisering i ethvert organsystem.

Introduction

Den menneskelige krop er sammensat af mange proteiner, der er ansvarlige for mange kropsfunktioner. Funktionen af proteiner afhænger i vid udstrækning af deres lokalisering i organet og cellulære organeller. Flere teknikker, herunder subcellulær fraktionering, immunfluorescens og vaskemiddelmedieret proteinekstraktion, bruges almindeligvis til at bestemme proteinets subcellulære lokalisering 1,2. Mikroskopi ved hjælp af immunfluorescerende farvestof er den mest anvendte metode blandt disse teknikker. Imidlertid er de fluorescerende farvestoffer, der anvendes i denne teknik, mindre stabile og tilbøjelige til fotoblegning3. Andre teknikker involverede højopløsningsmikroskopi for at visualisere proteinet på et ultrastrukturelt niveau ved immunmærkning af proteiner med elektrontætte, tungmetaller (guld, ferritin) eller kvanteprikker nanokrystaller og efterfulgt af visualisering af dem ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM)4,5.

QD er en halvleder nanokrystal sammensat af halvledermetalforbindelser med kontrollerbare fotoluminescensegenskaber, der har stor betydning i biologiske systemer3. QD nanokrystaller er lavet i et kerneskalformat, hvor en nanokrystal er indkapslet i dannelsen af nanokrystaller for at sikre deres korrekte stabilitet og funktion. Almindeligt anvendte core-shell nanokrystaller kombination er CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS, og CdTe/CdS/ZnS (core/shell/shell)3. Blandt disse nanokrystalkombinationer undersøges CdSe/ZnS og CdSe/CdS mest energisk og anvendes hyppigt som sekundære antistofkonjugater 3,6. Disse QD-nanopartikler har også fluorescerende egenskaber med forskellige excitations- og emissionsspektre end traditionelle fluorophorer. QD anvender excitation af elektroner fra bulkvalensbåndet til at udvise højere fluorescenskvanteudbytter sammenlignet med traditionelle fluorophorer. Nanokrystalarrangementet af halvledermetaller gør QD-medieret mærkning mere stabil og modstandsdygtig over for fotoblegning6. Derudover tillader nanokrystalkernen i QD og dens krystallinske struktur QD i forskellige størrelser at have en bred vifte af absorptionsspektre og meget smalle emissionstoppe7. Desuden er disse QD-partikler store nok til at give høj elektrontæthed, hvilket gør dem nyttige i højopløsningsmikroskopiteknikker, herunder transmissionselektronmikroskopi 5,8,9. Disse QD-nanokrystaller er også kommercielt tilgængelige i flere størrelser med forskellige fluorescensemissionsspektre og former, hvilket gør dem til en god kandidat til mærkning med flere antistoffer10,11.

QD-teknologi tiltrak stor betydning i biologisk forskning på grund af flere funktionelle egenskaber, herunder anvendelse i levende cellebilleddannelse, undersøgelse af transportmekanismer i cellen, membrantransport af proteinets diffusionsbevægelse, funktionel heterogenitet af celler og mærkning af intracellulær organel 3,12,13,14,15,16 . QD er også nyttig i molekylær diagnostik til målretning og påvisning af kræftvæv, karakterisering af tumorens molekylære profil og immunstatus og visualisering af glaslegeme og epiretinale membraner 3,17,18. Derudover kan QD også bruges i medicinske terapier til behandling af tumormaligniteter via fotodynamisk terapi og oftalmiske anomalier ved at levere medicin til øjnene 3,17,18,19.

Ved hjælp af disse meget nyttige QD-nanokrystaller bestemte denne undersøgelse den subcellulære lokalisering af et protein ved navn Sigma 1-receptor (Sigmar1). Sigmar1 er et allestedsnærværende udtrykt multi-tasking molekylært chaperonprotein. Omfattende undersøgelser med fokus på Sigmar1's subcellulære lokalisering i forskellige væv og organer rapporterede en celle- og vævstypespecifik subcellulær lokalisering, der fremkaldte molekylær funktion20. I forskellige celler (neuronale, fotoreceptor- og immunceller) og væv (lever og hjerne) ved hjælp af forskellige biokemiske tilgange rapporterede undersøgelser lokalisering af Sigmar1 på endoplasmatisk retikulum (ER), mitokondrie-associeret ER-membran (MAM), nuklear kuvert, plasmamembran, nukleoplasmatisk retikulum, kerne og mitokondrier. På trods af alle disse undersøgelser forblev den subcellulære lokalisering af Sigmar1 i hjertet ukendt20. Derfor blev den subcellulære lokalisering af Sigmar1 i hjertevæv bestemt ved anvendelse af den QD-medierede immunmærkning efterfulgt af TEM-billeddannelse.

Protocol

Dyrehåndteringsprocedurerne i denne protokol overholdt vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr (ottende udgave, National Institutes of Health, Bethesda, MD) og blev godkendt af Animal Care and Use Committee of Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport. Seks måneder gamle hanmus med FVB/N-baggrund blev brugt til denne undersøgelse. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel). De anvendte mus blev anbragt i et velreguleret miljø i bure, der tillod en 12 timers lys-mørk cyklus, forsynet med vand og en regelmæssig chow-diæt ad libitum og blev passet i henhold til NIH-vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyrene. Den samlede proces er illustreret i figur 1.

1. Tilberedning af dyr

  1. Anæstetiser musene ved hjælp af 3% isofluran. Åbn brystet ved at lave et vandret snit i regionen over den midterste mave og trække huden. Lav forsigtigt et andet snit for at åbne brysthulen uden at punktere andre organer21,22,23.
    1. Perfuse24 hjertet gennem toppen først, og derefter højre ventrikel ved hjælp af kold 3% glutaraldehyd i kardioplegisk opløsning (50 mM KCl, 5% dextrose i PBS, se supplerende fil 1) i 2 minutter for at sikre fuldstændig myokardieafslapning.
  2. Gennemtræng hjertet ved hjælp af iskold 3% glutaraldehyd i 0,1 M natriumcacodylatbuffer (pH 7,4, trin 2.1.1) i yderligere 2 min. Brug tyngdekraftstrykket til at bruge en 25 G 5/8 "nål til at introducere fikseringsmidlerne i hjertet. Umiddelbart efter at hjertet begynder at fylde op med fikseringsmidlet, skal du løfte toppen af hjertet og skære karrene nedenunder 1-2 mm fra hjertet for at lette trykket og lade væskerne dræne.
  3. Disseker hjertet, fjern atrierne24, og slip ventriklerne i iskold 3% glutaraldehyd/0,1 M natriumcacodylat i en petriskål. Lav en sommerfugl skåret efter 30-60 min fiksering og læg den i en petriskål indeholdende 3% glutaraldehyd/cacodylate (se Materialetabel). Hak hjertet ved hjælp af et kirurgisk blad i små terninger på 1 mm3 , mens det er i glutaraldehyd/cacodylatopløsning.
  4. Fikser/nedsænk det dissekerede hjertevæv i glutaraldehyd/cacodylatopløsning i 24 timer ved 4 °C.

2. Behandling af hjertevæv

  1. Efter 24 timers fiksering vaskes vævene i 0,1 M natriumcacodylatbuffer i 20 min.
    1. Forbered 0,1 M cacodylatbuffer ved at følge nedenstående trin.
      1. For at forberede 0,1 M natriumcacodylatbuffer fremstilles en bestand af 1 M natriumcacodylatbuffer ved at opløse natriumcacodylat (21,4 g) og 1% calciumchloridopløsning (3 ml) i 90 ml destilleret vand. Opløsningen opsuges til 100 ml ved tilsætning af det destillerede vand. Rør opløsningen godt og lad den stå natten over for at opløse det opløste stof.
      2. Tag derefter 10 ml 1 M natriumcacodylatstamopløsning og tilsæt det til 80 ml destilleret vand. Juster pH-værdien til 7,4 ved hjælp af HCI, og volumen den op til 100 ml ved at tilsætte destilleret vand.
  2. Gentag vasken i 0,1 M natriumkacodylatbuffer i yderligere 20 min. Fjern vævene fra natriumcacodylatbufferen og nedsænk dem i 2% osmiumtetroxidopløsning i 4 timer ved stuetemperatur. Denne proces kaldes osmication.
    1. Forbered 2% Osmiumtetroxidopløsning ved at følge nedenstående trin.
      1. For at fremstille 2% Osmiumtetroxidopløsning skal du tage 4% Osmiumtetroxidopløsning, 4 ml (se Materialetabel), 1 M natriumcacodylatstamopløsning (0,8 ml) og destilleret vand (3,2 ml) for at fremstille i alt 8 ml opløsning.
        BEMÆRK: Hele denne proces og trinene herfra skal udføres i røghætten.
  3. Efter osmication nedsænkes vævene i 2% natriumacetatopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur.
    1. Der fremstilles 2% natriumacetatopløsning ved at opløse 4 g natriumacetat i 20 ml destilleret vand.
  4. Derefter nedsænkes vævene i 2% uranylacetatopløsning i 1 time ved stuetemperatur.
    1. Der fremstilles 2% uranylacetatopløsning ved at opløse 4 g uranylacetat i 20 ml destilleret vand.
  5. Efter farvning af uranylacetat dehydreres vævene sekventielt gennem de klassificerede alkoholer og acetone i den rækkefølge, der er nævnt i supplerende fil 1.

3. Indlejring af hjertevæv

  1. Integrer det dehydrerede væv i epoxyharpiks med lav viskositet ved at følge nedenstående trin.
    1. For at fremstille epoxyharpiks med lav viskositet blandes 10,24 ml vinylcyclohexendioxid (ERL 4221) epoxymonomer, 6,74 ml diglycidylether af polypropylenglycol (DER 732) og 30,05 ml nonenyl ravsyreanhydrid (NSA) (se materialetabel) i et 50 ml rør. Rør affjedringen godt i hånden i 2 min.
    2. Tilsæt 18 dråber 2-dimethylaminoethanol (DMAE, se Materialetabel) epoxyaccelerator og rør suspensionen for at blande komponenterne grundigt.
    3. Imprægnerer vævene i epoxyharpiks i følgende blandingssekvens.
      1. Udskift 100% acetone med 1: 1 harpiks: acetonesuspension og nedsænk vævene i det i 1 time ved stuetemperatur.
      2. Udskift 1:1 harpiks: acetonesuspension med 6:1 harpiks: acetonesuspension og nedsænk vævene i det i 3 timer.
      3. Endelig skal du udskifte 6: 1-harpiksen: acetonesuspensionen med 100% harpikssuspension og lade væv nedsænkes i det natten over ved stuetemperatur.
  2. Vævene sættes i frisk harpiks i 8 mm mikroforme (se Materialetabel) og hærd det indlejrede væv ved 70 °C natten over.
    BEMÆRK: Sørg for, at harpiksen er hård, men ikke skør efter hærdning.

4. Vævssektionering ved hjælp af et ultramikrotom

  1. Trim harpiksblokkene med vævet til ikke større end 1 mm, før de monteres på ultramikrotomet (se Materialetabel). Placer formen nøjagtigt som muligt i ultramikrotomets segmenterede arm, og fremryk prøveformen manuelt mod diamantkniven.
  2. Skær sektionerne i en tykkelse på 500 nm (en halv mikron) med en Histo-kniv (se Materialetabel), og brug EM-loopværktøjet, tag dem op og læg dem på et glasglas.
  3. Placer glasrutsjebanen på en kogeplade til toluidinblå plet25 for at finde interesseområdet.
  4. Når du har fundet interesseområdet, skal du bruge en Ultra 45 ° kniv (se Materialetabel) til at producere blegguld ultratynde sektioner (100 nm). Placer disse ultratynde sektioner på den kedelige side af et 200 mesh kobbergitter.

5. Ultratynd farvning af hjertesektion

  1. Start farvningen ved at afsløre antigenet ved hjælp af en ætsningsopløsning, dvs. 5% natriummetaperiodatopløsning.
    1. Der fremstilles 500 μL 5% natriummetaperiodat (se materialetabel) opløsning i destilleret vand.
      BEMÆRK: Tilbered frisk opløsning før brug.
    2. Der anbringes 20 μL natriummetaperiodatopløsning på en ren paraffinfilm. Placer de helt tørrede gitter med vævssektioner på ætsningsopløsningens dråbe.
      BEMÆRK: Den kedelige side af gitteret med vævssektionen skal vende mod ætsningsopløsningen.
    3. Lad sektionsgitteret stå på opløsningen i 30 minutter ved stuetemperatur.
  2. Vask den ætsede vævssektion ved at placere den på en dråbe destilleret vand i 60 s.
  3. Bloker de resterende aldehyder ved at placere sektionsgitterene på en dråbe 0,05 M glycinopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur. Blotlæg gitterets kanter på filterpapir for at fjerne den resterende glycinopløsning.
    1. Der fremstilles 0,05 M glycinopløsning (se materialetabel) ved at opløse 3,75 mg glycin i 1 ml 1x PBS (pH 7,4).
  4. Placer sektionsgitterene i 10-20 μL blokeringsopløsning i 25 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Blokerende opløsningssammensætning: 2 μL 1% normalt gedeserum (NGS) + 20 μL 1% BSA (endelig koncentration: 10%) + 178 μL 1x PBS (pH 7,4) for at fremstille et slutvolumen på 200 μL.
  5. Blotlæg gitterkanterne på filterpapir, og anbring gittersektionen på antistoffortyndingsmiddel til konditionering ved stuetemperatur i 10 minutter.
  6. Inkubere gittersektionerne med primært antistof (Sigmar1 i dette tilfælde, se Materialetabel; fortyndet 1:10 i antistoffortyndingsmiddel) i 1 time og 30 minutter i et befugtet kammer.
  7. Tør gitteret tørt og vask gittersektionerne med antistoffortyndingsmiddel to gange i 5 minutter hver.
  8. Inkubere gittersektionerne med biotinyleret sekundært antistof (i dette tilfælde biotinyleret gedeanti-kanin polyklonalt sekundært antistof, se Materialetabel; fortyndet 1:10 i antistoffortyndingsmiddel) i 1 time i et befugtet kammer.
  9. Tør gitteret tørt og vask gittersektionerne med antistoffortyndingsmiddel to gange i 5 minutter hver.
  10. Inkubere gittersektionerne i kommercielt tilgængelig streptavidinkonjugeret QD (QD655nm, se Materialetabel; fortyndet 1:10 i antistoffortyndingsmiddel) i 1 time i et befugtet kammer ved stuetemperatur. Undgå udsættelse for lys ved at dække kammeret med aluminiumsfolie.
  11. Tør gitterkanterne tørre med filterpapir, og vask gittersektionerne ved at placere dem på vanddråber i 2 minutter.
  12. Blot kanterne af gitteret for at tørre.

6. Transmission Electron Microscopy (TEM) billeddannelse

  1. Placer de ultratynde sektioner på kobbergitter i en prøvekvartetholder, og klem dem i en position, der tillader valg af gitre i elektronstrålen.
  2. Indsæt prøveholderen i mikroskopkolonnen, og indfør pumpekontakten for at evakuere goniometeret efterfulgt af fuld indsættelse af prøveholderen i mikroskopkolonnen (se Materialetabel).
  3. Indstil spændingen til 80 kV, før strålen genereres til billedobservation.
  4. Fokuser godt på det ønskede område, tag billedet ved hjælp af et højhastigheds digitalkamera, og gem filen i .tif format.
    BEMÆRK: Mikroskopindstillingen til at tage billede i denne undersøgelse var accelererende spænding eller højspændingsspænding på 80 kV og en forstørrelse på 20.000x.

Representative Results

Den nuværende QD-TEM-metode visualiserede tilstedeværelsen af Sigmar1 og dens lokalisering på de subcellulære hjerterum ved at udføre anti-Sigmar1 målrettet QD-mærkning på voksne mus ultratynde hjertesektioner. Elektrontæt anti-Sigmar1 mærket QD på mitokondriemembraner (indre og ydre), lysosomer og det endoplasmatiske retikulum / sarkoplasmatiske retikulum (ER / SR) membran-mitokondriegrænseflade (figur 2A, B) blev illustreret af QD-TEM-billederne. Derudover blev hjerteafsnit også mærket med kanin IgG og QD som en isotypekontrol for anti-Sigmar1 kanin primært antistof (figur 2C, D). Derfor fremhævede QD-TEM-billeddannelse lokaliseringen af endogen Sigmar1 og dens berigelse hovedsagelig på lysosomerne og mitokondriemembranerne.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration, der viser de sekventielle trin og procedurer, der bruges til at udføre QD-TEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sigmar1 immunmærket QD i voksne mus hjertevæv. (A,B) Repræsentative TEM-billeder, der viser Sigmar1 mærket QD på mitokondrier (ydre og indre membran), mitokondrier-associerede endoplasmatiske retikulum (ER) / sarkoplasmatisk retikulum (SR) membraner og lysosomer. (C,D) TEM-billede af hjertesektionerne af isotypekontrol mærket med QD'er og kanin IgG. Vægtstang: 200 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Sammensætning af PBS og andre opløsninger, der anvendes til vævsdehydrering. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne undersøgelse blev QD-medieret immunmærkning brugt til tydeligt at vise den subcellulære lokalisering af Sigmar1. Ved hjælp af QD blev Sigmar1's lokalisering på mitokondriemembranen, især den indre mitokondriemembran, afbildet i hjertevæv. Derudover blev Sigmar1 også fundet at være placeret på sarkoplasmatisk / endoplasmatisk retikulum (S / ER) og lysosomer på ultrastrukturelt niveau, som vist i figur 2A-D.

Et kritisk trin i denne protokol er ætsnings- eller antigendemaskeringstrinnet ved anvendelse af stærkt koncentreret natriummetaperiodatopløsning til at afsløre antigenet efter glutaraldehydfiksering og osmication. Denne protokol anvendte en enkelt behandling med en høj koncentration (5%) natriummetaperiodat i 30 minutter ved stuetemperatur. Ekstra pleje er nødvendig i dette trin, da en længere varighed eller højere koncentration for natriummetaperiodatinkubation vil resultere i aggregering af strukturer, tab af membrandefinition for organellerne og forårsage perforeringer i sektionen, hvilket gør det svært at visualisere proteinet eller strukturen. Alternativt kan en lavere koncentration af (3%) metaperiodatopløsning i to trin i 30 minutter også anvendes i stedet for 5% metaperiodat. Undersøgelser har vist, at denne mulighed viser lignende resultater som med 5% metaperiodatopløsning til et-trins 30 minutters inkubation. Imidlertid giver en 3% metaperiodatopløsning til 30 minutters inkubation i to gange bedre kontrol over processen26,27,28. Oprindeligt anvendte denne protokol inkubation af sektionerne med 10% metaperiodatopløsning i 30 minutter. På grund af for mange perforeringer skabt i vævsafsnittet ved denne koncentration blev den endelige koncentration og inkubationsvarighed af metaperiodatopløsningen imidlertid nedtrappet og optimeret til 5% i 30 minutter.

Et andet trin krævede optimering af fikseringstiden med glutaraldehyd. Suboptimal fiksering af væv resulterer i utilstrækkelig QD-mærkning, mens overfiksering af væv resulterer i højere uspecifik mærkning. Derfor skal der nøje overvejes ved bestemmelse og titrering af et optimalt vævsfikseringsniveau for korrekt og specifik mærkning af proteiner. I denne metode ved anvendelse af hjertevæv blev fikseringstiden med glutaraldehyd titreret ved hjælp af 24 timer og 48 timer som tidspunkter. Baseret på farvningsbillederne af de sektioner, der var fastgjort til begge tidspunkter, blev det konstateret, at sektioner fastgjort til 24 timer viste bedre resultater. Til dato er QD nanokrystaller tilgængelige i flere størrelser, herunder 525, 565, 585, 605, 655 og 705 nm11,29. Hver af disse QD har sine egne emissionsspektre og udsender fluorescens ved forskellige bølgelængder. Derudover viser disse kommercielt tilgængelige QD'er i forskellige størrelser forskellige former; for eksempel er QD 525, 565 og 585 næsten sfæriske med forskellige størrelser, mens QD 605, 655 og 705 er uregelmæssige aflange formede. Af disse forskellige QD-nanokrystaller kan QD 525, 565 og 655 let skelnes fra hinanden11,29. Disse forskelle i emissionsspektre og former gør QD til en god kandidat til multi-mærkning af proteiner og visualisering ved fluorescens og elektronmikroskopi. I denne undersøgelse blev en kommercielt tilgængelig QD, QD 655, brugt til at mærke Sigmar1-proteinet for at skelne det fra enhver ikke-specifik baggrund i de farvede sektioner.

Et andet modstykke til QD til proteinmærkning i højopløsningsmikroskopi er immunguldpartiklen. Immunogoldpartiklerne bruges traditionelt til at mærke proteiner til højopløsningsmikroskopi. Disse guldpartikler er meget elektrontætte og let identificerbare sammenlignet med QD nanokrystaller. QD udviser dog bedre effektivitet med bedre penetration i væv, højere stabilitet og holdbarhed og bedre tilbageholdelse af ultrastrukturelle komponenter, hvilket gør dem til en bedre kandidat til proteinmærkning 4,5. QD har også en unik evne til at blive detekteret ved både lys- og elektronmikroskopi, hvilket øger dets værdi i forhold til immunguldmærkning10.

En begrænsning af denne QD-medierede immunmærkning er brugen af osmiumtetroxid under behandlingen. Osmiumtetroxid bruges til at øge elektrontætheden, ledningsevnen og kontrasten mellem ellers mindre elektrontætte og mindre kontrasterende biologiske membranstrukturer 5,30. Imidlertid ødelægger brugen af osmiumtetroxid øjeblikkeligt og irreversibelt prøvens egenskab for at skabe fluorescens, når den er mærket med QD6. Dette begrænser brugen af QD i fluorescensmikroskopi. En alternativ tilgang, der udelader brugen af osmiumtetroxid, vil være fordelagtig med hensyn til at bevare de fluorescerende egenskaber og dermed den dobbelte anvendelse af QD-medieret immunmærkning. Nogle af de nyere modeller af TEM har mulighed for at vedhæfte EDX-systemet (Energy Dispersive X-Ray Analysis), der muliggør identifikation af materialernes elementære sammensætning. En anden begrænsning af undersøgelsen er manglen på elementær kortlægning af en prøve og billedanalyse ved hjælp af EDX. Derfor bør fremtidige undersøgelser fokusere på EDX-analysen af QD-spektrene for at analysere elementsammensætningen.

QD-mærkning af proteiner har fået stor opmærksomhed i nyere tid. QD tilbyder flere anvendelser og fordele inden for både biologisk forskning og medicinsk terapi. QD, der desuden er pakket ind med polydentatligand, udviser øget stabilitet, der opretholder kvanteudbyttet. Yderligere øger indkapsling af QD med disse bio-gunstige midler også dets biotilgængelighed i væv, hvilket gør det til en god kandidat til potentiel anvendelse til påvisning af tumorer, levende cellebilleddannelse, lægemiddelafgivelse og vævsbilleddannelse 3,31,32.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 og R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award og LARC Research Award til MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Kardiovaskulær og AHA Postdoctoral Fellowship til CSA (20POST35210789); og LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship til RA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 Mesh copper grid Ted Pella G200HH
6-month-old male mice with FVB/N background Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Acetone 100% Fisher Chemicals A949
Antibody diluent Dako S3022
anti-Sigmar1 antibody Cell Signaling 61994S
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody Sigma Aldrich B7389
BSAc (10%) Electron Microscopy Sciences 25557
Calcium chloride Sigma Aldrich C7902
Cytoseal Xyl Thermo fisher 8312-4
DER 732C36AA10:C33 Electron Microscopy Sciences 13010
Dextrose Sigma Aldrich G7528
Diamond Knife Diatome Histo; Ultra 450
DMAE Electron Microscopy Sciences 13300
Electron microscope JEOL JEOL-1400 Flash
ERL 4221 Electron Microscopy Sciences 15004
Ethanol 100% Fisher Chemicals A405P
Glutaraldehyde 3% Electron Microscopy Sciences 16538-15
Glycine Alfa Aesar A13816
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA56
Micromolds Ted Pella 10505
Microtome Leica Microsystem EM UC7
Normal goat serum Invitrogen PCN5000
NSA Electron Microscopy Sciences 19050
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19150
Parafilm Genesse Scientific 16-101
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5655
Potassium Phosphate monobasic Sigma Aldrich 71640
Qdot 655 Streptavidin Conjugate Invitrogen Q10121MP
Sodium Acetate Fisher Scientific BP334
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
Sodium metaperiodate Sigma Aldrich 71859
Sodium Phosphate dibasic Sigma Aldrich P9541
Surgical blade (size 10) Aspen surgical 371110
TEM  image software AMT-V700 AMT TEM imaging systems
TEM imaging camera XR80 TEM series AMT TEM imaging systems
Toluidine Blue O solution (0.5%) Fisher Scientic S25612
Uranyl acetate Polysciences 21447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lidke, D. S., Lidke, K. A. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).
  2. de Duve, C. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20 (1971).
  3. Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).
  4. Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).
  5. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).
  6. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  7. Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  9. Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).
  11. Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  12. Lidke, D. S., et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).
  13. Pleskova, S. N., et al. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).
  14. Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).
  15. Hanaki, K. -i, et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).
  16. Lim, Y. T., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).
  17. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  18. Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).
  19. Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).
  20. Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575 (2021).
  21. Bohne, B., Harding, G. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).
  22. Roszkowski, M. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).
  23. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988 (2021).
  24. Jones, W. K., et al. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).
  25. Hunter, E. E. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).
  26. Morris, R. E., Ciraolo, G. M. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).
  27. Brorson, S. H. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).
  28. Lobo, M. V. T., et al. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).
  29. Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).
  30. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  31. Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).
  32. Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233 (2021).

Tags

Biologi udgave 187
Visualisering af subcellulær lokalisering af et protein i hjertet ved hjælp af kvanteprikker-medieret immunmærkning efterfulgt af transmissionselektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aishwarya, R., Abdullah, C. S.,… More

Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Remex, N. S., Nitu, S., Hartman, B., King, J., Bhuiyan, M. S. Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64085, doi:10.3791/64085 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter