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Biology

क्वांटम डॉट्स-मध्यस्थता इम्यूनो-लेबलिंग का उपयोग करके हृदय में प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की कल्पना करना, इसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64085
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल क्वांटम डॉट्स का उपयोग करके हृदय ऊतक वर्गों में एक प्रोटीन को इम्यूनो-लेबलिंग की एक विधि का वर्णन करता है। यह तकनीक अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर किसी भी प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करती है।

Abstract

उपकोशिकीय स्थानीयकरण उचित कार्य को रेखांकित करने और किसी विशेष प्रोटीन के आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए कई गुणात्मक और मात्रात्मक तकनीकों का उपयोग किया जाता है। प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने में उभरती तकनीकों में से एक क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) -एक प्रोटीन की मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग है, जिसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के साथ उन्हें इमेजिंग किया जाता है। क्यूडी क्रिस्टलीय संरचना और उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व की दोहरी संपत्ति के साथ एक अर्धचालक नैनोक्रिस्टल है, जो उन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर लागू करता है। इस वर्तमान विधि ने अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर हृदय के ऊतकों में क्यूडी-टीईएम का उपयोग करके सिग्मा 1 रिसेप्टर (सिगमार 1) प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की कल्पना की। जंगली प्रकार के माउस से हृदय ऊतक वर्गों के छोटे क्यूब्स को 3% ग्लूटारल्डिहाइड में तय किया गया था, बाद में ऑस्मिकेटेड, यूरिनिल एसीटेट से सना हुआ, इसके बाद इथेनॉल और एसीटोन के साथ अनुक्रमिक निर्जलीकरण हुआ। इन निर्जलित हृदय ऊतक वर्गों को कम चिपचिपाहट वाले एपॉक्सी रेजिन में एम्बेडेड किया गया था, 500 एनएम मोटाई के पतले वर्गों में काटा गया था, ग्रिड पर रखा गया था, और बाद में 5% सोडियम मेटापीरियडेट के साथ एंटीजन अनमास्किंग के अधीन किया गया था, इसके बाद ग्लाइसिन के साथ अवशिष्ट एल्डिहाइड का शमन किया गया था। ऊतकों को अवरुद्ध कर दिया गया था, इसके बाद प्राथमिक एंटीबॉडी, बायोटिनिलेटेड द्वितीयक एंटीबॉडी और स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित क्यूडी में अनुक्रमिक इनक्यूबेशन थे। इन दाग वाले वर्गों को टीईएम का उपयोग करके उच्च आवर्धन पर धब्बा सुखाया गया और चित्रित किया गया। क्यूडी-टीईएम तकनीक ने दिल में अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर सिगमार 1 प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दी। इन तकनीकों का उपयोग किसी भी अंग प्रणाली में किसी भी प्रोटीन और उपकोशिकीय स्थानीयकरण की उपस्थिति की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मानव शरीर कई शारीरिक कार्यों के लिए जिम्मेदार कई प्रोटीनों से बना है। प्रोटीन का कार्य काफी हद तक अंग और सेलुलर ऑर्गेनेल में उनके स्थानीयकरण पर निर्भर करता है। उपकोशिकीय विभाजन, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और डिटर्जेंट-मध्यस्थता प्रोटीन निष्कर्षण सहित कई तकनीकों का उपयोग आमतौर पर प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण 1,2 को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी इन तकनीकों में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। हालांकि, इस तकनीक में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट रंजक कम स्थिर हैं और फोटोब्लीचिंग3 के लिए प्रवण हैं। अन्य तकनीकों में इलेक्ट्रॉन-घने, भारी धातुओं (सोना, फेरिटिन) या क्वांटम डॉट्स नैनोक्रिस्टल के साथ इम्यूनोलेबलिंग प्रोटीन द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर प्रोटीन की कल्पना करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी शामिल थी और इसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) 4,5 का उपयोग करके उन्हें कल्पना की गई थी।

क्यूडी एक अर्धचालक नैनोक्रिस्टल है जो अर्धचालक धातु यौगिकों से बना है जिसमें नियंत्रणीय फोटोलुमिनेसेंस गुण होते हैं जो जैविक प्रणालियों में एक महान महत्वरखते हैं। क्यूडी नैनोक्रिस्टल को कोर-शेल प्रारूप में बनाया जाता है जहां उनकी उचित स्थिरता और कार्यप्रणाली सुनिश्चित करने के लिए नैनोक्रिस्टल के गठन में एक नैनोक्रिस्टल को समझाया जाता है। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कोर-शेल नैनोक्रिस्टल संयोजन सीडीएसई / जेडएनएस, सीडीएसई / सीडीएस सीडीएसई / जेडएनएसई, सीडीटीई / सीडीएस, सीडीटीई / जेडएनएस, और सीडीटीई / सीडीएस / जेडएनएस (कोर / शेल / शेल) 3 हैं। इन नैनोक्रिस्टल संयोजनों में, सीडीएसई / जेडएनएस और सीडीएसई / सीडीएस का सबसे सख्ती से अध्ययन किया जाता है और अक्सर द्वितीयक एंटीबॉडी संयुग्म 3,6 के रूप में उपयोग किया जाता है। इन क्यूडी नैनोकणों में पारंपरिक फ्लोरोफोरे की तुलना में अलग-अलग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ फ्लोरोसेंट गुण भी होते हैं। क्यूडी पारंपरिक फ्लोरोफोरेस की तुलना में उच्च प्रतिदीप्ति क्वांटम पैदावार प्रदर्शित करने के लिए थोक वैलेंस बैंड से इलेक्ट्रॉनों की उत्तेजना को नियोजित करता है। अर्धचालक धातुओं की नैनोक्रिस्टल व्यवस्था क्यूडी-मध्यस्थता लेबलिंग को अधिक स्थिर और फोटोब्लीचिंग 6 के लिए प्रतिरोधी बनातीहै। इसके अलावा, क्यूडी में नैनोक्रिस्टल कोर और इसकी क्रिस्टलीय संरचना विभिन्न आकारों के क्यूडी को अवशोषण स्पेक्ट्रा की एक विस्तृत श्रृंखला और बहुत संकीर्ण उत्सर्जन चोटियों7 की अनुमति देती है। इसके अलावा, ये क्यूडी कण उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व उत्पन्न करने के लिए काफी बड़े हैं, जिससे उन्हें ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5,8,9 सहित उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों में उपयोगी बनाया जाता है। ये क्यूडी नैनोक्रिस्टल विभिन्न प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और आकारों के साथ कई आकारों में व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध हैं, जिससे उन्हें कई एंटीबॉडी10,11 के साथ लेबलिंग के लिए एक महान उम्मीदवार बना दिया गया है।

क्यूडी तकनीक ने कई कार्यात्मक गुणों के कारण जैविक अनुसंधान में बहुत महत्व आकर्षित किया, जिसमें लाइव-सेल इमेजिंग में उपयोग, कोशिका में परिवहन तंत्र का अध्ययन, प्रोटीन के प्रसार आंदोलन का झिल्ली परिवहन, कोशिकाओं की कार्यात्मक विषमता और इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 3,12,13,14,15,16 का अंकन शामिल है। . क्यूडी कैंसर के ऊतकों को लक्षित करने और पता लगाने के लिए आणविक निदान में भी उपयोगी है, ट्यूमर की आणविक प्रोफ़ाइल और प्रतिरक्षा स्थिति को चिह्नित करता है, और विट्रियस बॉडी और एपिरेटिनल झिल्ली 3,17,18 की कल्पना करता है। इसके अलावा, क्यूडी का उपयोग चिकित्सा उपचारों में फोटोडायनामिक थेरेपी और नेत्र विसंगतियों के माध्यम से ट्यूमर विकृतियों का इलाज करने के लिए आंखों तक दवाएं पहुंचाकर 3,17,18,19 भी किया जा सकता है।

इन अत्यधिक उपयोगी क्यूडी नैनोक्रिस्टल का उपयोग करते हुए, वर्तमान अध्ययन ने सिग्मा 1 रिसेप्टर (सिगमार 1) नामक प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित किया। सिगमार 1 एक सर्वव्यापी रूप से व्यक्त मल्टी-टास्किंग आणविक चैपरोन प्रोटीन है। विभिन्न ऊतकों और अंगों में सिगमार 1 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर ध्यान केंद्रित करने वाले व्यापक अध्ययनों ने आणविक कार्य20 को प्राप्त करने वाले सेल और ऊतक-प्रकार के विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानीयकरण की सूचना दी। विभिन्न जैव रासायनिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके विभिन्न कोशिकाओं (न्यूरोनल, फोटोरिसेप्टर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं) और ऊतकों (यकृत और मस्तिष्क) में, अध्ययनों ने एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े ईआर झिल्ली (एमएएम), परमाणु लिफाफा, प्लाज्मा झिल्ली, न्यूक्लियोप्लाज्मिक रेटिकुलम, न्यूक्लियस और माइटोकॉन्ड्रिया पर सिग्मार 1 के स्थानीयकरण की सूचना दी। इन सभी अध्ययनों के बावजूद, दिल में सिगमार 1 का उपकोशिकीय स्थानीयकरणअज्ञात रहा। इसलिए, कार्डियक ऊतक में सिगमार 1 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जिसके बाद टीईएम इमेजिंग थी।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं ने प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड (आठवां संस्करण, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, बेथेस्डा, एमडी) का अनुपालन किया और लुइसियाना स्टेट यूनिवर्सिटी हेल्थ साइंसेज सेंटर-श्रेवेपोर्ट की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। एफवीबी / एन पृष्ठभूमि वाले छह महीने के नर चूहों का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इस्तेमाल किए गए चूहों को पिंजरों में एक अच्छी तरह से विनियमित वातावरण में रखा गया था, जिससे 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे-चक्र की अनुमति मिलती थी, पानी और एक नियमित चाउ आहार एड लिबिटम प्रदान किया जाता था, और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुसार देखभाल की गई थी। समग्र प्रक्रिया को चित्र 1 में चित्रित किया गया है।

1. जानवरों की तैयारी

  1. 3% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। मध्य पेट के ऊपर के क्षेत्र में क्षैतिज चीरा लगाकर और त्वचा को खींचकर छाती खोलें। सावधानी से, किसी भी अन्य अंगों को छिद्रित किए बिना छाती गुहा को खोलने के लिए एक और चीरा लगाएं 21,22,23.
    1. पूर्ण मायोकार्डियल विश्राम सुनिश्चित करने के लिए 2 मिनट के लिए कार्डियोप्लेजिक समाधान (50 एमएम केसीएल, पीबीएस में 5% डेक्सट्रोज, पूरक फ़ाइल 1 देखें) में ठंडे 3% ग्लूटारल्डिहाइड का उपयोग करके दाएं वेंट्रिकल को पहले शीर्ष के माध्यम से24 परफ्यूज करें।
  2. सोडियम कैकोडाइलेट बफर (पीएच 7.4, चरण 2.1.1) के 0.1 एम में बर्फ-ठंडा 3% ग्लूटारल्डिहाइड का उपयोग करके दिल को एक और 2 मिनट के लिए शुद्ध करें। गुरुत्वाकर्षण दबाव का उपयोग करके, दिल में फिक्सेटिव पेश करने के लिए 25 जी 5/8 "सुई का उपयोग करें। जब दिल फिक्सेटिव से भरना शुरू कर देता है, तो दिल के शीर्ष को उठाएं और दबाव से राहत पाने के लिए दिल से 1-2 मिमी पर नीचे की वाहिकाओं को काटें और तरल पदार्थों को बाहर निकलने दें।
  3. दिल को विच्छेदित करें, एट्रिया24 को हटा दें, और पेट्री डिश में वेंट्रिकल्स को बर्फ-ठंडा 3% ग्लूटारल्डिहाइड / 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट में गिरा दें। निर्धारण के 30-60 मिनट के बाद एक तितली को काट लें और इसे पेट्री डिश में रखें जिसमें 3% ग्लूटारल्डिहाइड / कैकोडाइलेट हो ( सामग्री की तालिका देखें)। 1 मिमी3 के छोटे क्यूब्स में सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके दिल को काट लें, जबकि यह ग्लूटारल्डिहाइड / कैकोडाइलेट समाधान में है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ग्लूटारल्डिहाइड / कैकोडाइलेट घोल में विच्छेदित हृदय ऊतक को ठीक / विसर्जित करें।

2. हृदय ऊतक प्रसंस्करण

  1. निर्धारण के 24 घंटे के बाद, ऊतकों को 20 मिनट के लिए सोडियम कैकोडाइलेट बफर के 0.1 एम में धो लें।
    1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर तैयार करें।
      1. 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर तैयार करने के लिए, 90 एमएल आसुत जल में सोडियम कैकोडाइलेट (21.4 ग्राम) और 1% कैल्शियम क्लोराइड समाधान (3 एमएल) को भंग करके 1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर का स्टॉक तैयार करें। आसुत जल को जोड़कर घोल को 100 एमएल तक मात्रा दें। घोल को अच्छी तरह से हिलाएं और विलेय को भंग करने के लिए इसे रात भर छोड़ दें।
      2. इसके बाद, 10 एमएल 1 एम सोडियम कैकोडाइलेट स्टॉक समाधान लें और इसे 80 एमएल आसुत जल में जोड़ें। एचसीएल का उपयोग करके पीएच को 7.4 में समायोजित करें और आसुत जल जोड़कर इसे 100 एमएल तक मात्रा दें।
  2. 20 मिनट के लिए 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में धोने को दोहराएं। सोडियम कैकोडाइलेट बफर से ऊतकों को निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान में डुबोएं। इस प्रक्रिया को ऑस्मिकेशन कहा जाता है।
    1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान तैयार करें।
      1. 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान तैयार करने के लिए, कुल 8 एमएल समाधान बनाने के लिए 4% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान, 4 एमएल ( सामग्री की तालिका देखें), 1 एम सोडियम कैकोडिलेट स्टॉक समाधान (0.8 एमएल), और आसुत जल (3.2 एमएल) लें।
        नोट: यह पूरी प्रक्रिया और यहां से चरणों को फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
  3. ऑस्मिकेशन के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2% सोडियम एसीटेट समाधान में ऊतकों को डुबोएं।
    1. आसुत जल के 20 एमएल में 4 ग्राम सोडियम एसीटेट को घोलकर 2% सोडियम एसीटेट घोल तैयार करें।
  4. इसके बाद, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 2% यूरिनिल एसीटेट समाधान में ऊतकों को डुबोएं।
    1. आसुत जल के 20 एमएल में 4 ग्राम यूरिनिल एसीटेट को घोलकर 2% यूरिनिल एसीटेट घोल तैयार करें।
  5. यूरिनिल एसीटेट धुंधला होने के बाद, पूरक फ़ाइल 1 में उल्लिखित क्रम में वर्गीकृत अल्कोहल और एसीटोन के माध्यम से क्रमिक रूप से ऊतकों को निर्जलित करें।

3. हृदय ऊतक एम्बेडिंग

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कम चिपचिपाहट एपॉक्सी राल में निर्जलित ऊतकों को एम्बेड करें।
    1. कम चिपचिपाहट वाले एपॉक्सी राल बनाने के लिए, 50 एमएल ट्यूब में 10.24 एमएल विनाइल साइक्लोहेक्सीन डाइऑक्साइड (ईआरएल 4221) एपॉक्सी मोनोमर, पॉलीप्रोपाइलीन ग्लाइकोल (डीईआर 732) के 6.74 एमएल डाइग्लिसिडिल ईथर और 30.05 एमएल नॉनएनिल सक्सिनिक एनहाइड्राइड (एनएसए) ( सामग्री की तालिका देखें) मिलाएं। 2 मिनट के लिए हाथ से सस्पेंशन को अच्छी तरह से हिलाएं।
    2. 2-डाइमिथाइलमिनोएथेनॉल (डीएमएई, सामग्री की तालिका देखें) एपॉक्सी त्वरक की 18 बूंदें जोड़ें और घटकों को अच्छी तरह से मिलाने के लिए निलंबन को हिलाएं।
    3. मिश्रण के निम्नलिखित अनुक्रम में एपॉक्सी राल में ऊतकों को संक्रमित करें।
      1. 100% एसीटोन को 1: 1 राल के साथ बदलें: एसीटोन निलंबन और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इसमें ऊतकों को डुबोएं।
      2. 1: 1 राल को बदलें: एसीटोन निलंबन 6: 1 राल के साथ: एसीटोन निलंबन और 3 घंटे के लिए इसमें ऊतकों को डुबोएं।
      3. अंत में, 6: 1 राल: एसीटोन निलंबन को 100% राल निलंबन के साथ बदलें और ऊतकों को कमरे के तापमान पर रात भर इसमें डुबो दें।
  2. ऊतकों को 8 मिमी माइक्रो मोल्ड्स में ताजा राल में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और रात भर में 70 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेडेड ऊतकों को ठीक करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि राल कठोर है लेकिन इलाज के बाद भंगुर नहीं है।

4. अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके ऊतक सेक्शनिंग

  1. अल्ट्रामाइक्रोटोम पर चढ़ने से पहले ऊतक के साथ राल ब्लॉक को 1 मिमी से बड़ा ट्रिम न करें ( सामग्री की तालिका देखें)। मोल्ड को अल्ट्रामाइक्रोटोम के खंडित हाथ में यथासंभव सटीक रूप से रखें और मैन्युअल रूप से नमूना मोल्ड को हीरे के चाकू की ओर आगे बढ़ाएं।
  2. हिस्टो चाकू के साथ 500 एनएम (एक-आधा माइक्रोन) की मोटाई पर अनुभागों को काटें ( सामग्री की तालिका देखें), और ईएम लूप टूल का उपयोग करके, उन्हें उठाएं और उन्हें ग्लास स्लाइड पर रखें।
  3. रुचि के क्षेत्र को खोजने के लिए टोल्यूडाइन ब्लू स्टेन25 के लिए एक गर्म प्लेट पर ग्लास स्लाइड रखें।
  4. रुचि के क्षेत्र का पता लगाने के बाद, हल्के सोने के अल्ट्राथिन वर्गों (100 एनएम) का उत्पादन करने के लिए अल्ट्रा 45 ° चाकू ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। इन अल्ट्राथिन वर्गों को 200 जाल तांबा ग्रिड के सुस्त पक्ष पर रखें।

5. अल्ट्राथिन हार्ट सेक्शन धुंधला होना

  1. एक नक़्क़ाशी समाधान का उपयोग करके एंटीजन को अनमास्क करके धुंधला करना शुरू करें, यानी, 5% सोडियम मेटापीरियडेट समाधान।
    1. आसुत जल में 5% सोडियम मेटापीरियडेट ( सामग्री की तालिका देखें) समाधान का 500 μL तैयार करें।
      नोट: उपयोग करने से पहले ताजा समाधान तैयार करें।
    2. एक साफ पैराफिन फिल्म पर सोडियम मेटापीरियोडेट समाधान के 20 μL डालें। नक़्क़ाशी समाधान की बूंद पर ऊतक वर्गों के साथ पूरी तरह से सूखे ग्रिड रखें।
      नोट: ऊतक अनुभाग के साथ ग्रिड के सुस्त पक्ष को नक़्क़ाशी समाधान की ओर सामना करना चाहिए।
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान पर अनुभाग ग्रिड छोड़ दें।
  2. 60 सेकंड के लिए आसुत जल की एक बूंद पर रखकर उकेरे गए ऊतक अनुभाग को धो लें।
  3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.05 एम ग्लाइसिन समाधान की बूंद पर अनुभाग ग्रिड रखकर अवशिष्ट एल्डिहाइड को अवरुद्ध करें। अवशिष्ट ग्लाइसिन समाधान को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर पर ग्रिड के किनारों को ब्लॉट करें।
    1. 1x PBS (pH 7.4) के 1 mL में 3.75 mg ग्लाइसिन को घोलकर 0.05 M ग्लाइसिन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें।
  4. अनुभाग ग्रिड को कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए ब्लॉकिंग समाधान के 10-20 μL में रखें।
    नोट: ब्लॉकिंग समाधान संरचना: 200 μL की अंतिम मात्रा बनाने के लिए 1% सामान्य बकरी सीरम (NGS) + 1% BSA का 20 μL (अंतिम एकाग्रता: 10%) + 1x PBS (pH 7.4) का 178 μL।
  5. फिल्टर पेपर पर ग्रिड किनारों को ब्लॉट करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कंडीशनिंग के लिए एंटीबॉडी डिल्यूएंट पर ग्रिड सेक्शन रखें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ग्रिड वर्गों को इनक्यूबेट करें (इस मामले में सिगमार 1, सामग्री की तालिका देखें; एंटीबॉडी डिल्यूएंट में पतला 1: 10) एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में 1 घंटे 30 मिनट के लिए।
  7. ब्लोट ग्रिड को सुखाएं और 5 मिनट के लिए दो बार एंटीबॉडी डिल्यूएंट के साथ ग्रिड अनुभागों को धोएं।
  8. एक ह्यूमिडिफाइड कक्ष में 1 घंटे के लिए बायोटिनाइलेटेड द्वितीयक एंटीबॉडी (इस मामले में, बायोटिनाइलेटेड बकरी एंटी-खरगोश पॉलीक्लोनल द्वितीयक एंटीबॉडी, सामग्री की तालिका देखें; एंटीबॉडी डिल्यूएंट में पतला 1: 10) के साथ ग्रिड वर्गों को इनक्यूबेट करें।
  9. ब्लोट ग्रिड को सुखाएं और 5 मिनट के लिए दो बार एंटीबॉडी डिल्यूएंट के साथ ग्रिड अनुभागों को धोएं।
  10. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित क्यूडी (क्यूडी655 एनएम, सामग्री की तालिका देखें; एंटीबॉडी डिल्यूएंट में पतला 1: 10) में ग्रिड वर्गों को कमरे के तापमान पर एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कक्ष को कवर करके प्रकाश के संपर्क को रोकें।
  11. फिल्टर पेपर का उपयोग करके ग्रिड किनारों को सुखाएं और ग्रिड अनुभागों को 2 मिनट के लिए पानी की बूंदों पर रखकर धोएं।
  12. ग्रिड के किनारों को सूखने के लिए धब्बा दें।

6. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) इमेजिंग

  1. एक नमूना चौकड़ी धारक में कॉपर ग्रिड पर अल्ट्राथिन वर्गों को रखें और इलेक्ट्रॉन बीम में ग्रिड के चयन की अनुमति देने के लिए उन्हें एक स्थिति में दबाएं।
  2. माइक्रोस्कोप कॉलम में नमूना धारक डालें और गोनियोमीटर को खाली करने के लिए पंप स्विच को संलग्न करें, इसके बाद माइक्रोस्कोप कॉलम में नमूना धारक का पूर्ण सम्मिलन ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. छवि अवलोकन के लिए बीम उत्पन्न करने से पहले वोल्टेज को 80 केवी पर सेट करें।
  4. वांछित क्षेत्र पर अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित करें, उच्च गति वाले डिजिटल कैमरे का उपयोग करके छवि को कैप्चर करें, और फ़ाइल को .tif प्रारूप में सहेजें।
    नोट: इस अध्ययन में छवि को कैप्चर करने के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग 80 केवी के वोल्टेज या उच्च तनाव वोल्टेज और 20,000x के आवर्धन में तेजी ला रही थी।

Representative Results

वर्तमान क्यूडी-टीईएम पद्धति ने वयस्क माउस अल्ट्रा-पतले हृदय वर्गों पर एंटी-सिगमार 1 लक्षित क्यूडी लेबलिंग करके उपकोशिकीय हृदय डिब्बों पर सिगमार 1 की उपस्थिति और इसके स्थानीयकरण की कल्पना की। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आंतरिक और बाहरी), लाइसोसोम और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम / सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर) झिल्ली-माइटोकॉन्ड्रियल इंटरफ़ेस (चित्रा 2 ए, बी) पर क्यूडी लेबल वाले इलेक्ट्रॉन-घने एंटी-सिग्मार 1 को क्यूडी-टीईएम छवियों द्वारा चित्रित किया गया था। इसके अलावा, हृदय वर्गों को खरगोश आईजीजी और क्यूडी के साथ एंटी-सिगमार 1 खरगोश प्राथमिक एंटीबॉडी (चित्रा 2 सी, डी) के लिए आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में भी लेबल किया गया था। इसलिए, क्यूडी-टीईएम इमेजिंग ने अंतर्जात सिगमार 1 के स्थानीयकरण और इसके संवर्धन को ज्यादातर लाइसोसोम और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पर उजागर किया।

Figure 1
चित्रा 1: QD-TEM करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अनुक्रमिक चरणों और प्रक्रियाओं को दिखाने वाला योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए, बी) प्रतिनिधि टीईएम छवियां माइटोकॉन्ड्रिया (बाहरी और आंतरिक-झिल्ली), माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) / सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) झिल्ली और लाइसोसोम पर क्यूडी लेबल वाले सिगमार 1 दिखाती हैं। (C, D) क्यूडी और खरगोश आईजीजी के साथ लेबल किए गए आइसोटाइप नियंत्रण के हृदय वर्गों की टीईएम छवि। स्केल बार: 200 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: ऊतक निर्जलीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पीबीएस और अन्य समाधानों की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्तमान अध्ययन में, क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग का उपयोग सिगमार 1 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को विशिष्ट रूप से दिखाने के लिए किया गया था। क्यूडी का उपयोग करते हुए, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली, विशेष रूप से आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पर सिगमार 1 के स्थानीयकरण को हृदय ऊतक में चित्रित किया गया था। इसके अतिरिक्त, सिगमार 1 को अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर सारकोप्लाज्मिक / एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एस / ईआर) और लाइसोसोम पर भी स्थित पाया गया था, जैसा कि चित्र 2 ए-डी में दिखाया गया है।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम ग्लूटारैल्डिहाइड निर्धारण और ऑस्मिकेशन के बाद एंटीजन को हटाने के लिए अत्यधिक केंद्रित सोडियम मेटापीरियोडेट समाधान का उपयोग करके नक़्क़ाशी या एंटीजन अनमास्किंग चरण है। इस प्रोटोकॉल ने कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सोडियम मेटापीरियडेट की उच्च एकाग्रता (5%) के साथ एक एकल उपचार का उपयोग किया। सोडियम मेटापीरियडेट के लिए लंबी अवधि या उच्च एकाग्रता के रूप में इस चरण में अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है इनक्यूबेशन परिणामस्वरूप संरचनाओं का एकत्रीकरण, ऑर्गेनेल के लिए झिल्ली की परिभाषा का नुकसान और अनुभाग में छिद्रण का कारण होगा, जिससे प्रोटीन या संरचना की कल्पना करना मुश्किल हो जाएगा। वैकल्पिक रूप से, 30 मिनट के लिए दो चरणों में (3%) मेटापीरियडेट समाधान की कम सांद्रता का उपयोग 5% मेटापीरियोडेट के बजाय भी किया जा सकता है। अध्ययनों ने इस विकल्प को एक-चरण 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए 5% मेटापीरियडेट समाधान के समान परिणाम प्रदर्शित करने के लिए दिखाया है। हालांकि, दो बार के लिए 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए 3% मेटापीरियडेट समाधान प्रक्रिया 26,27,28 पर बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है। प्रारंभ में, इस प्रोटोकॉल ने 30 मिनट के लिए 10% मेटापीरियडेट समाधान के साथ अनुभागों के इनक्यूबेशन का उपयोग किया। हालांकि, इस एकाग्रता द्वारा ऊतक अनुभाग में बनाए गए बहुत सारे छिद्रों के कारण, मेटापीरियडेट समाधान की अंतिम एकाग्रता और इनक्यूबेशन अवधि को कम कर दिया गया और 30 मिनट के लिए 5% तक अनुकूलित किया गया।

एक अन्य कदम के लिए ग्लूटारल्डिहाइड के साथ निर्धारण समय के अनुकूलन की आवश्यकता थी। ऊतकों के उप-निर्धारण के परिणामस्वरूप अपर्याप्त क्यूडी लेबलिंग होती है, जबकि ऊतकों के अधिक निर्धारण के परिणामस्वरूप उच्च गैर-विशिष्ट लेबलिंग होती है। इसलिए, प्रोटीन के उचित और विशिष्ट लेबलिंग के लिए ऊतक निर्धारण के इष्टतम स्तर को निर्धारित करने और निर्धारित करने में सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। हृदय के ऊतकों का उपयोग करके इस विधि में, ग्लूटारल्डिहाइड के साथ निर्धारण समय को टाइमपॉइंट के रूप में 24 घंटे और 48 घंटे का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। दोनों टाइमपॉइंट के लिए तय किए गए अनुभागों की धुंधला छवियों के आधार पर, यह पाया गया कि 24 घंटे के लिए तय किए गए अनुभागों ने बेहतर परिणाम प्रदर्शित किए। आज तक, क्यूडी नैनोक्रिस्टल कई आकारों में उपलब्ध हैं, जिनमें 525, 565, 585, 605, 655 और 705 एनएम11,29 शामिल हैं। इनमें से प्रत्येक क्यूडी का अपना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है और विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न आकारों के ये व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्यूडी विभिन्न आकृतियों को प्रदर्शित करते हैं; उदाहरण के लिए, QD 525, 565, और 585 विभिन्न आकारों के साथ लगभग गोलाकार हैं, जबकि QD 605, 655 और 705 अनियमित आयताकार आकार के हैं। इन विभिन्न क्यूडी नैनोक्रिस्टल में से, क्यूडी 525, 565 और 655 एक दूसरे से आसानी से अलग हैं11,29। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और आकृतियों में ये अंतर क्यूडी को प्रोटीन के बहु-लेबलिंग और प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक महान उम्मीदवार बनाते हैं। इस अध्ययन में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्यूडी, क्यूडी 655 का उपयोग सिगमार 1 प्रोटीन को लेबल करने के लिए किया गया था ताकि इसे दाग वाले वर्गों में किसी भी गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि से अलग किया जा सके।

उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में प्रोटीन लेबलिंग के लिए क्यूडी का एक और समकक्ष इम्यूनोगोल्ड कण है। इम्यूनोगोल्ड कणों का उपयोग पारंपरिक रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन को लेबल करने के लिए किया जाता है। ये सोने के कण क्यूडी नैनोक्रिस्टल की तुलना में अत्यधिक इलेक्ट्रॉन-घने और आसानी से पहचाने जाने योग्य हैं। हालांकि, क्यूडी ऊतकों में बेहतर प्रवेश, उच्च स्थिरता और शेल्फ जीवन, और अल्ट्रास्ट्रक्चरल घटकों के बेहतर प्रतिधारण के साथ बेहतर दक्षता प्रदर्शित करता है, जिससे उन्हें प्रोटीन लेबलिंग 4,5 के लिए बेहतर उम्मीदवार बना दिया जाता है। क्यूडी में प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दोनों द्वारा पता लगाने की एक अनूठी क्षमता भी है, जो इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग10 पर इसके मूल्य को जोड़ती है।

इस क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग की एक सीमा प्रसंस्करण के दौरान ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग है। ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग इलेक्ट्रॉन घनत्व, चालकता और अन्यथा कम इलेक्ट्रॉन-घने और कम विपरीत जैविक झिल्ली संरचनाओं 5,30 के विपरीत को बढ़ाने के लिए किया जाता है। हालांकि, ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग तुरंत और अपरिवर्तनीय रूप से क्यूडी6 के साथ लेबल किए जाने पर प्रतिदीप्ति बनाने के लिए नमूने की संपत्ति को नष्ट कर देता है। यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में क्यूडी के उपयोग को सीमित करता है। ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के उपयोग को छोड़ने वाला एक वैकल्पिक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट गुणों को बनाए रखने में फायदेमंद होगा और इसलिए क्यूडी-मध्यस्थता इम्यूनोलेबलिंग का दोहरा अनुप्रयोग होगा। टीईएम के कुछ नए मॉडलों में ऊर्जा फैलाने वाले एक्स-रे विश्लेषण (ईडीएक्स) प्रणाली को संलग्न करने का विकल्प है जो सामग्री की मौलिक संरचना की पहचान की अनुमति देता है। अध्ययन की एक और सीमा ईडीएक्स का उपयोग करके एक नमूने और छवि विश्लेषण के मौलिक मानचित्रण की कमी है। इसलिए, भविष्य के अध्ययनों को मौलिक संरचना का विश्लेषण करने के लिए क्यूडी स्पेक्ट्रा के ईडीएक्स विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए।

प्रोटीन के क्यूडी लेबलिंग ने हाल के दिनों में बहुत ध्यान आकर्षित किया है। क्यूडी जैविक अनुसंधान और चिकित्सा चिकित्सा विज्ञान दोनों में कई अनुप्रयोग और फायदे प्रदान करता है। क्यूडी को पॉलीडेंट लिगैंड के साथ लपेटने से क्वांटम उपज को बनाए रखने में स्थिरता में वृद्धि होती है। इसके अलावा, इन जैव-अनुकूल एजेंटों के साथ क्यूडी को संलग्न करने से ऊतकों में इसकी जैव उपलब्धता भी बढ़ जाती है, जिससे यह ट्यूमर, लाइव-सेल इमेजिंग, दवा वितरण और ऊतक इमेजिंग3,31,32 का पता लगाने में संभावित अनुप्रयोग के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बन जाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1, और R01HL152723; एलएसयूएचएससी-एस सीसीडीएस फिनिश लाइन अवार्ड, कोविड-19 रिसर्च अवार्ड और एमएसबी को एलएआरसी रिसर्च अवार्ड; एलएसयूएचएससी-एस मैल्कम फिस्ट कार्डियोवैस्कुलर और सीएसए के लिए एएचए पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (20POST35210789); और एलएसयूएचएससी-एस मैल्कम फिस्ट आरए के लिए प्री-डॉक्टरेट फैलोशिप।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 Mesh copper grid Ted Pella G200HH
6-month-old male mice with FVB/N background Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Acetone 100% Fisher Chemicals A949
Antibody diluent Dako S3022
anti-Sigmar1 antibody Cell Signaling 61994S
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody Sigma Aldrich B7389
BSAc (10%) Electron Microscopy Sciences 25557
Calcium chloride Sigma Aldrich C7902
Cytoseal Xyl Thermo fisher 8312-4
DER 732C36AA10:C33 Electron Microscopy Sciences 13010
Dextrose Sigma Aldrich G7528
Diamond Knife Diatome Histo; Ultra 450
DMAE Electron Microscopy Sciences 13300
Electron microscope JEOL JEOL-1400 Flash
ERL 4221 Electron Microscopy Sciences 15004
Ethanol 100% Fisher Chemicals A405P
Glutaraldehyde 3% Electron Microscopy Sciences 16538-15
Glycine Alfa Aesar A13816
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA56
Micromolds Ted Pella 10505
Microtome Leica Microsystem EM UC7
Normal goat serum Invitrogen PCN5000
NSA Electron Microscopy Sciences 19050
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19150
Parafilm Genesse Scientific 16-101
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5655
Potassium Phosphate monobasic Sigma Aldrich 71640
Qdot 655 Streptavidin Conjugate Invitrogen Q10121MP
Sodium Acetate Fisher Scientific BP334
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
Sodium metaperiodate Sigma Aldrich 71859
Sodium Phosphate dibasic Sigma Aldrich P9541
Surgical blade (size 10) Aspen surgical 371110
TEM  image software AMT-V700 AMT TEM imaging systems
TEM imaging camera XR80 TEM series AMT TEM imaging systems
Toluidine Blue O solution (0.5%) Fisher Scientic S25612
Uranyl acetate Polysciences 21447

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References

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जीव विज्ञान अंक 187
क्वांटम डॉट्स-मध्यस्थता इम्यूनो-लेबलिंग का उपयोग करके हृदय में प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की कल्पना करना, इसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
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