본 프로토콜은 양자점을 사용하여 심장 조직 절편에서 단백질을 면역표지하는 방법을 기술한다. 이 기술은 미세 구조 수준에서 모든 단백질의 세포 내 국소화 및 발현을 시각화하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
세포 내 국소화는 적절한 기능을 묘사하고 특정 단백질의 분자 메커니즘을 결정하는 데 중요합니다. 단백질의 세포 내 국소화를 결정하기 위해 몇 가지 정성 및 정량적 기술이 사용됩니다. 단백질의 세포하 국소화를 결정하는 새로운 기술 중 하나는 단백질의 양자점(QD) 매개 면역 표지와 투과 전자 현미경(TEM)으로 이미징하는 것입니다. QD는 결정 구조와 높은 전자 밀도의 이중 특성을 가진 반도체 나노 결정으로 전자 현미경에 적용 할 수 있습니다. 이 현재 방법은 초구조적 수준에서 심장 조직에서 QD-TEM을 사용하여 시그마 1 수용체(Sigmar1) 단백질의 세포내 국소화를 시각화했습니다. 야생형 마우스의 심장 조직 절편의 작은 입방체를 3 % 글루 타르 알데히드로 고정시킨 후, 삼진화시키고, 우라 닐 아세테이트로 염색 한 다음, 에탄올과 아세톤으로 순차적으로 탈수시켰다. 이 탈수 된 심장 조직 절편을 저점도 에폭시 수지에 매립하고 500nm 두께의 얇은 절편으로 절단하고 그리드에 올려 놓은 다음 5 % 메타 요오드 나트륨으로 항원 마스킹을 한 다음 잔류 알데히드를 글리신으로 담금질했습니다. 조직을 차단한 후, 1차 항체, 비오티닐화된 2차 항체 및 스트렙타비딘-접합된 QD에서 순차적 인큐베이션하였다. 이들 염색된 절편을 블롯 건조시키고 TEM을 사용하여 고배율로 이미징하였다. QD-TEM 기술은 심장의 미세 구조 수준에서 Sigmar1 단백질의 세포 내 국소화를 시각화 할 수있었습니다. 이러한 기술은 모든 장기 시스템에서 단백질의 존재 및 세포 내 국소화를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
인체는 수많은 신체 기능을 담당하는 많은 단백질로 구성되어 있습니다. 단백질의 기능은 주로 장기 및 세포 소기관에서의 국소화에 달려 있습니다. 세포내 분획화, 면역형광법 및 세제 매개 단백질 추출을 포함한 여러 기술이 단백질의 세포내 국소화를 결정하는 데 일반적으로 사용됩니다1,2. 면역 형광 염료를 사용하는 현미경 검사는 이러한 기술 중에서 가장 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, 이 기술에 사용된 형광 염료는 덜 안정하고 광퇴색되기 쉽다3. 다른 기술에는 단백질을 전자 밀도, 중금속 (금, 페리틴) 또는 양자점 나노 결정으로 면역 표지하여 초 구조 수준에서 단백질을 시각화 한 다음 투과 전자 현미경 (TEM)4,5을 사용하여 시각화하는 고해상도 현미경이 포함되었습니다.
QD는 생물학적 시스템에서 큰 의미를 갖는 제어 가능한 광발광 특성을 갖는 반도체 금속 화합물로 구성된 반도체 나노 결정입니다3. QD 나노 결정은 적절한 안정성과 기능을 보장하기 위해 나노 결정 형성시 나노 결정이 캡슐화되는 코어 쉘 형식으로 만들어집니다. 일반적으로 사용되는 코어-쉘 나노 결정 조합은 CdSe / ZnS, CdSe / CdS CdSe / ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS 및 CdTe/CdS / ZnS (코어 / 쉘 / 쉘)3입니다. 이러한 나노 결정 조합 중에서 CdSe / ZnS 및 CdSe / CdS가 가장 활발하게 연구되고 2 차 항체 접합체 3,6으로 자주 사용됩니다. 이러한 QD 나노 입자는 또한 기존의 형광단과 다른 여기 및 방출 스펙트럼을 가진 형광 특성을 가지고 있습니다. QD는 벌크 원자가 밴드에서 전자의 여기를 사용하여 기존 형광단에 비해 더 높은 형광 양자 수율을 나타냅니다. 반도체 금속의 나노 결정 배열은 QD 매개 라벨링을보다 안정하고 광 표백에 내성으로 만듭니다6. 또한, QD 및 그의 결정 구조 내의 나노 결정 코어는 상이한 크기의 QD가 넓은 범위의 흡수 스펙트럼 및 매우 좁은 방출 피크(7)를 가질 수있게한다. 또한, 이러한 QD 입자는 높은 전자 밀도를 산출하기에 충분히 커서 투과 전자 현미경 5,8,9를 포함한 고해상도 현미경 기술에 유용합니다. 이러한 QD 나노 결정은 또한 다양한 형광 방출 스펙트럼 및 모양을 가진 여러 크기로 상업적으로 이용 가능하므로 다중 항체10,11로 표지하기에 좋은 후보입니다.
QD 기술은 살아있는 세포 이미징, 세포의 수송 메커니즘 연구, 단백질 확산 운동의 막 수송, 세포의 기능적 이질성 및 세포 내 소기관의 마킹 3,12,13,14,15,16 . QD는 또한 암 조직을 표적화 및 검출하고, 종양의 분자 프로파일 및 면역 상태를 특성화하고, 유리체 및 망막 상막을 시각화하기 위한 분자 진단에도 유용합니다 3,17,18. 또한 QD는 광역학 요법을 통해 종양 악성 종양을 치료하고 눈에 약물을 전달하여 안과 기형을 치료하는 의료 요법에도 사용할 수 있습니다 3,17,18,19.
이러한 매우 유용한 QD 나노 결정을 사용하여 본 연구는 Sigma 1 수용체 (Sigmar1)라는 단백질의 세포 내 국소화를 결정했습니다. Sigmar1은 유비쿼터스 발현 멀티 태스킹 분자 샤페론 단백질입니다. 다양한 조직 및 기관에서 Sigmar1의 세포하 국소화에 초점을 맞춘 광범위한 연구에서 분자 기능20을 유도하는 세포 및 조직 유형 특이적 세포하 국소화가 보고되었습니다. 서로 다른 생화학적 접근법을 사용하는 다양한 세포(신경세포, 광수용체 및 면역 세포)와 조직(간 및 뇌)에서 소포체(ER), 미토콘드리아 관련 ER 막(MAM), 핵 외피, 원형질막, 핵소포체, 핵 및 미토콘드리아에 대한 Sigmar1의 국소화가 보고되었습니다. 이러한 모든 연구에도 불구하고, 심장에서 Sigmar1의 세포 내 국소화는 알려지지 않았습니다20. 따라서, 심장 조직에서 Sigmar1의 세포내 국소화는 QD-매개 면역표지에 이어 TEM 영상화를 이용하여 결정하였다.
본 연구에서, QD-매개 면역표지는 Sigmar1의 세포내 국소화를 뚜렷하게 보여주기 위해 사용되었다. QD를 사용하여 미토콘드리아 막, 특히 내부 미토콘드리아 막에 대한 Sigmar1의 국소화가 심장 조직에 묘사되었습니다. 또한 Sigmar1은 그림 2A-D와 같이 미세 구조 수준에서 근형/소포체(S/ER) 및 리소좀에 위치하는 것으로 밝혀졌습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 글루타르알데히드 고정 및 삼화 후 항원을 언마스킹하기 위해 고농축 나트륨 메타피리오데이트 용액을 사용하는 에칭 또는 항원 마스킹 해제 단계입니다. 이 프로토콜은 실온에서 30분 동안 고농도(5%)의 메타요오드산나트륨을 사용한 단일 처리를 사용했습니다. 나트륨 메타 요오드 배양을위한 더 긴 지속 시간 또는 더 높은 농도는 구조의 응집, 세포 기관에 대한 막 정의의 손실, 섹션의 천공을 유발하여 단백질 또는 구조를 시각화하기 어렵게 만들기 때문에이 단계에서 특별한주의가 필요합니다. 대안적으로, 5% 메타피리오테이트 대신 30분 동안 두 단계로 더 낮은 농도의 (3%) 메타피리오테이트 용액을 사용할 수도 있습니다. 연구에 따르면 이 옵션은 1단계 30분 배양을 위한 5% 메타주기산 용액과 유사한 결과를 나타냅니다. 그러나, 2 회 동안 30 분의 배양을위한 3 % 메타 피리오트 용액은 공정26,27,28에 대한 더 나은 제어를 제공한다. 처음에이 프로토콜은 30 분 동안 10 % 메타 요오드 용액으로 섹션을 배양했습니다. 그러나, 이 농도에 의해 조직 절편에 너무 많은 천공이 생성되었기 때문에, 메타주기산 용액의 최종 농도 및 배양 기간은 테이퍼링되고 30분 동안 5%로 최적화되었다.
또 다른 단계는 글루타르알데히드로 고정 시간을 최적화해야 했습니다. 최적이 아닌 조직 고정은 부적절한 QD 라벨링을 초래하는 반면, 조직을 과도하게 고정하면 더 높은 비특이적 라벨링을 초래합니다. 따라서 단백질의 적절하고 특이적인 표지를 위한 최적의 조직 고정 수준을 결정하고 적정할 때 신중하게 고려해야 합니다. 심장 조직을 사용하는이 방법에서, 글루 타르 알데히드와의 고정 시간은 24 시간 및 48 시간을 시점으로 사용하여 적정되었다. 두 시점 모두에 대해 고정된 섹션의 염색 이미지를 기반으로 24시간 동안 고정된 섹션이 더 나은 결과를 나타내는 것으로 나타났습니다. 현재까지 QD 나노 결정은 525, 565, 585, 605, 655 및 705nm11,29를 포함한 다양한 크기로 제공됩니다. 이러한 각 QD는 자체 방출 스펙트럼을 가지며 서로 다른 파장에서 형광을 방출합니다. 또한 다양한 크기의 상용 QD는 다양한 모양을 표시합니다. 예를 들어, QD 525, 565 및 585는 크기가 다른 거의 구형인 반면 QD 605, 655 및 705는 불규칙한 직사각형 모양입니다. 이들 상이한 QD 나노 결정 중에서, QD 525, 565 및 655는 서로 쉽게 구별가능하다(11, 29). 방출 스펙트럼과 모양의 이러한 차이로 인해 QD는 단백질의 다중 표지 및 형광 및 전자 현미경에 의한 시각화에 적합한 후보입니다. 이 연구에서는 시판되는 QD인 QD 655를 사용하여 Sigmar1 단백질을 표지하여 염색된 절편의 비특이적 배경과 구별했습니다.
고해상도 현미경에서 단백질 표지를 위한 QD의 또 다른 대응물은 면역골드 입자입니다. 면역골드 입자는 전통적으로 고해상도 현미경을 위해 단백질을 표지하는 데 사용됩니다. 이 금 입자는 QD 나노 결정에 비해 전자 밀도가 높고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 그러나 QD는 조직 침투 개선, 안정성 및 저장 수명 향상, 미세 구조 구성 요소의 더 나은 유지로 더 나은 효율성을 나타내므로 단백질 라벨링 4,5에 더 나은 후보가 됩니다. QD는 또한 광학 및 전자 현미경으로 검출할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있어 면역금 라벨링10에 비해 가치가 추가됩니다.
이 QD 매개 면역표지의 한 가지 한계는 처리 중에 사산화오스뮴을 사용한다는 것입니다. 오스뮴 테트라 옥사이드는 전자 밀도, 전도도 및 그렇지 않으면 덜 전자 밀도가 높고 덜 대조적 인 생물학적 막 구조(5,30)의 대비를 증가시키는 데 사용됩니다. 그러나 사산화오스뮴을 사용하면 QD6으로 표지될 때 형광을 생성하기 위해 시편의 특성이 즉각적이고 비가역적으로 파괴됩니다. 이것은 형광 현미경 검사에서 QD의 사용을 제한합니다. 사산화오스뮴의 사용을 생략하는 대안적인 접근법은 형광 특성을 유지하고 따라서 QD 매개 면역표지의 이중 적용에 유리할 것입니다. TEM의 최신 모델 중 일부에는 재료의 원소 조성을 식별 할 수있는 에너지 분산 형 X 선 분석 (EDX) 시스템을 부착 할 수있는 옵션이 있습니다. 이 연구의 또 다른 한계는 EDX를 사용한 샘플 및 이미지 분석의 원소 매핑이 없다는 것입니다. 따라서 향후 연구는 원소 조성을 분석하기 위해 QD 스펙트럼의 EDX 분석에 초점을 맞춰야 합니다.
단백질의 QD 표지는 최근 많은 관심을 받고 있습니다. QD는 생물학 연구 및 의료 치료 모두에서 여러 응용 분야와 이점을 제공합니다. QD는 폴리덴테이트 리간드로 추가로 랩핑되어 양자 수율을 유지하는 증가된 안정성을 나타낸다. 또한, 이러한 생체-호의적 제제로 QD를 캡슐화하는 것은 또한 조직에서의 생체이용률을 증가시켜 종양 검출, 생세포 영상화, 약물 전달 및 조직 영상화에 잠재적으로 응용하기에 좋은 후보가 된다 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 국립 보건원 보조금의 지원을 받았습니다: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 및 R01HL152723; LSUHSC-S CCDS 결승선 상, COVID-19 연구 상 및 LARC 연구 상을 MSB에 수여합니다. LSUHSC-S 말콤 페스트 심혈관 및 AHA CSA에 대한 박사후 연구원 (20POST35210789); 및 LSUHSC-S 말콤 페스트 박사 전 연구원 RA에.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |