Настоящий протокол описывает способ иммуномаркировки белка в участках сердечной ткани с использованием квантовых точек. Этот метод предоставляет полезный инструмент для визуализации субклеточной локализации и экспрессии любого белка на ультраструктурном уровне.
Субклеточная локализация имеет решающее значение для определения правильной функции и определения молекулярных механизмов конкретного белка. Для определения субклеточной локализации белков используется несколько качественных и количественных методик. Одним из новых методов определения субклеточной локализации белка является опосредованная квантовыми точками (QD) иммуномаркировка белка с последующей их визуализацией с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ). QD представляет собой полупроводниковый нанокристалл с двойным свойством кристаллической структуры и высокой электронной плотностью, что делает их применимыми к электронной микроскопии. Этот современный метод визуализировал субклеточную локализацию белка рецептора Sigma 1 (Sigmar1) с использованием QD-TEM в сердечной ткани на ультраструктурном уровне. Небольшие кубики участков сердечной ткани у мыши дикого типа фиксировали в 3% глутаральдегиде, впоследствии осмикали, окрашивали уранилацетатом с последующим последовательным обезвоживанием этанолом и ацетоном. Эти обезвоженные участки сердечной ткани внедряли в низковязкие эпоксидные смолы, разрезали на тонкие срезы толщиной 500 нм, наносили на сетку, а затем подвергали антигенному демаскированию 5% метапериодатом натрия с последующим гашением остаточных альдегидов глицином. Ткани блокировали, за чем следовала последовательная инкубация в первичном антителе, биотинилированном вторичном антителе и стрептавидин-конъюгированном QD. Эти окрашенные участки были высушены пятнами и визуализированы при большом увеличении с использованием TEM. Методика QD-TEM позволила визуализировать субклеточную локализацию белка Sigmar1 на ультраструктурном уровне в сердце. Эти методы могут быть использованы для визуализации присутствия любого белка и субклеточной локализации в любой системе органов.
Человеческий организм состоит из множества белков, ответственных за многочисленные функции организма. Функция белков во многом зависит от их локализации в органе и клеточных органеллах. Несколько методов, включая субклеточное фракционирование, иммунофлуоресценцию и экстракцию белка, опосредованной детергентами, обычно используются для определения субклеточной локализации белка 1,2. Микроскопия с использованием иммунофлуоресцентного красителя является наиболее широко используемым методом среди этих методов. Однако флуоресцентные красители, используемые в этой технике, менее стабильны и склонны к фотоотбеливанию3. Другие методы включали микроскопию с высоким разрешением для визуализации белка на ультраструктурном уровне путем иммуномаркировки белков электронно-плотными, тяжелыми металлами (золото, ферритин) или нанокристаллами квантовых точек с последующей визуализацией их с использованием просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)4,5.
QD представляет собой полупроводниковый нанокристалл, состоящий из полупроводниковых металлических соединений с контролируемыми свойствами фотолюминесценции, имеющими большое значение в биологических системах3. Нанокристаллы QD изготавливаются в формате ядро-оболочка, где нанокристалл инкапсулируется при образовании нанокристаллов для обеспечения их надлежащей стабильности и функционирования. Обычно используется комбинация нанокристаллов ядра и оболочки: CdSe/ZnS, CdSe/CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS и CdTe/CdS/ZnS (ядро/оболочка/оболочка)3. Среди этих нанокристаллических комбинаций наиболее активно изучаются CdSe/ZnS и CdSe/CdS и часто используются в качестве вторичных конъюгатов антител 3,6. Эти наночастицы QD также обладают флуоресцентными свойствами с другими спектрами возбуждения и излучения, чем традиционные флуорофоры. QD использует возбуждение электронов из объемной валентной зоны для демонстрации более высоких квантовых выходов флуоресценции по сравнению с традиционными флуорофорами. Нанокристаллическое расположение полупроводниковых металлов делает QD-опосредованную маркировку более стабильной и устойчивой к фотоотбеливанию6. Кроме того, нанокристаллическое ядро в QD и его кристаллическая структура позволяют QD различных размеров иметь широкий диапазон спектров поглощения и очень узкие пикиизлучения 7. Кроме того, эти частицы QD достаточно велики, чтобы дать высокую электронную плотность, что делает их полезными в методах микроскопии с высоким разрешением, включая просвечивающую электронную микроскопию 5,8,9. Эти нанокристаллы QD также коммерчески доступны в нескольких размерах с различными спектрами и формами флуоресцентного излучения, что делает их отличным кандидатом для маркировки несколькими антителами10,11.
Технология QD привлекла большое значение в биологических исследованиях благодаря множеству функциональных свойств, включая использование в визуализации живых клеток, изучение транспортных механизмов в клетке, мембранный транспорт диффузионного движения белка, функциональную гетерогенность клеток и маркировку внутриклеточных органелл 3,12,13,14,15,16 . QD также полезен в молекулярной диагностике для нацеливания и обнаружения раковых тканей, характеристики молекулярного профиля опухоли и иммунного статуса, а также визуализации стекловидного тела и эпиретинальных мембран 3,17,18. Кроме того, QD также может использоваться в медицинской терапии для лечения злокачественных опухолей с помощью фотодинамической терапии и офтальмологических аномалий путем доставки лекарств в глаза 3,17,18,19.
Используя эти очень полезные нанокристаллы QD, настоящее исследование определило субклеточную локализацию белка под названием рецептор Sigma 1 (Sigmar1). Sigmar1 представляет собой повсеместно экспрессируемый многозадачный молекулярный белок-шаперон. Обширные исследования, посвященные субклеточной локализации Sigmar1 в различных тканях и органах, сообщили о специфической субклеточной локализации клеточного и тканевого типа, вызывающей молекулярную функцию20. В различных клетках (нейронных, фоторецепторных и иммунных клетках) и тканях (печени и мозга) с использованием различных биохимических подходов в исследованиях сообщалось о локализации Sigmar1 на эндоплазматическом ретикулуме (ER), митохондрий-ассоциированной мембране ER (MAM), ядерной оболочке, плазматической мембране, нуклеоплазматическом ретикулуме, ядре и митохондриях. Несмотря на все эти исследования, субклеточная локализация Sigmar1 в сердце оставалась неизвестной20. Поэтому субклеточную локализацию Sigmar1 в сердечной ткани определяли с помощью QD-опосредованной иммуномаркировки с последующей визуализацией ТЭМ.
В настоящем исследовании QD-опосредованное иммуномаркирование использовалось для отчетливого показа субклеточной локализации Sigmar1. Используя QD, локализация Sigmar1 на митохондриальной мембране, особенно на внутренней митохондриальной мембране, была изображена в сердечной ткани. Кроме того, было также обнаружено, что Sigmar1 расположен на саркоплазматическом/эндоплазматическом ретикулуме (S/ER) и лизосомах на ультраструктурном уровне, как показано на рисунке 2A-D.
Критическим шагом в этом протоколе является этап травления или демаскации антигена с использованием высококонцентрированного раствора метапериодата натрия для разоблачения антигена после фиксации и осмикации глутаральдегида. В этом протоколе применяли однократную обработку с высокой концентрацией (5%) метапериодата натрия в течение 30 мин при комнатной температуре. На этом этапе необходима дополнительная осторожность, поскольку более длительная или более высокая концентрация инкубации метапериодата натрия приведет к агрегации структур, потере определения мембраны для органелл и вызовет перфорацию в секции, что затруднит визуализацию белка или структуры. Альтернативно, более низкая концентрация (3%) раствора метапериодата в два этапа в течение 30 мин также может быть использована вместо 5% метапериодата. Исследования показали, что этот вариант демонстрирует аналогичные результаты, как и при использовании 5% раствора метапериодата для одноэтапной 30-минутной инкубации. Однако 3% раствор метапериодата в течение 30 мин инкубации в течение двух раз обеспечивает лучший контроль над процессом 26,27,28. Первоначально в этом протоколе использовалась инкубация срезов с 10% раствором метапериодата в течение 30 мин. Однако из-за слишком большого количества перфораций, созданных в тканевом сечении этой концентрацией, конечная концентрация и продолжительность инкубации раствора метапериодата были уменьшены и оптимизированы до 5% в течение 30 мин.
Еще один шаг требовал оптимизации времени фиксации глутаровым альдегидом. Неоптимальная фиксация тканей приводит к неадекватной маркировке QD, тогда как чрезмерная фиксация тканей приводит к более высокой неспецифической маркировке. Поэтому необходимо тщательно рассмотреть вопрос об определении и титровании оптимального уровня фиксации тканей для правильной и специфической маркировки белков. В этом методе с использованием тканей сердца время фиксации глутаровым альдегидом титровали с использованием 24 ч и 48 ч в качестве временных точек. Основываясь на изображениях окрашивания секций, зафиксированных для обеих временных точек, было обнаружено, что участки, зафиксированные в течение 24 часов, отображали лучшие результаты. На сегодняшний день нанокристаллы QD доступны в нескольких размерах, включая 525, 565, 585, 605, 655 и 705 нм11,29. Каждый из этих QD имеет свои собственные спектры излучения и излучает флуоресценцию на разных длинах волн. Кроме того, эти коммерчески доступные QD разных размеров отображают различные формы; например, QD 525, 565 и 585 практически сферические с различными размерами, тогда как QD 605, 655 и 705 имеют неправильную продолговатую форму. Из этих различных нанокристаллов QD QD 525, 565 и 655 легко отличить друг от друга11,29. Эти различия в спектрах излучения и формах делают QD отличным кандидатом для мультимаркировки белков и визуализации с помощью флуоресценции и электронной микроскопии. В этом исследовании коммерчески доступный QD, QD 655, был использован для маркировки белка Sigmar1, чтобы отличить его от любого неспецифического фона в окрашенных участках.
Другим аналогом QD для маркировки белка в микроскопии с высоким разрешением является частица иммунозолотого. Частицы иммунозолотого традиционно используются для маркировки белков для микроскопии с высоким разрешением. Эти частицы золота обладают высокой электронной плотностью и легко идентифицируются по сравнению с нанокристаллами QD. Тем не менее, QD демонстрирует лучшую эффективность с лучшим проникновением в ткани, более высокой стабильностью и сроком годности, а также лучшим удержанием ультраструктурных компонентов, что делает их лучшим кандидатом для маркировки белка 4,5. QD также обладает уникальной способностью обнаруживаться как световой, так и электронной микроскопией, что повышает его ценность по сравнению с маркировкой иммунозолотого10.
Одним из ограничений этого QD-опосредованного иммуномаркировки является использование тетроксида осмия во время обработки. Тетроксид осмия используется для увеличения электронной плотности, проводимости и контрастности менее электронно-плотных и менее контрастных биологических мембранных структур 5,30. Однако использование тетроксида осмия мгновенно и необратимо разрушает свойство образца создавать флуоресценцию при маркировке QD6. Это ограничивает использование QD в флуоресцентной микроскопии. Альтернативный подход, исключающий использование тетроксида осмия, будет выгоден для сохранения флуоресцентных свойств и, следовательно, двойного применения QD-опосредованного иммуномаркировки. Некоторые из новых моделей ТЕА имеют возможность подключения системы энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDX), которая позволяет идентифицировать элементный состав материалов. Другим ограничением исследования является отсутствие элементного отображения образца и анализа изображений с использованием EDX. Поэтому будущие исследования должны быть сосредоточены на EDX-анализе спектров QD для анализа элементного состава.
QD маркировка белков получила большое внимание в последнее время. QD предлагает несколько применений и преимуществ как в биологических исследованиях, так и в медицинской терапии. QD, дополнительно обернутый полидентатным лигандом, демонстрирует повышенную стабильность, поддерживая квантовый выход. Кроме того, инкапсуляция QD с этими био-благоприятными агентами также увеличивает его биодоступность в тканях, что делает его хорошим кандидатом для потенциального применения при обнаружении опухолей, визуализации живых клеток, доставке лекарств и визуализации тканей 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 и R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award и LARC Research Award для MSB; LSUHSC-S Малкольм Фейст Сердечно-сосудистая и AHA Постдокторская стипендия CSA (20POST35210789); и LSUHSC-S Малкольм Фейст Преддокторская стипендия в РА.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |