Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация субклеточной локализации белка в сердце с помощью иммуномаркировки, опосредованной квантовыми точками, с последующей просвечивающей электронной микроскопией

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64085
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

Summary

Настоящий протокол описывает способ иммуномаркировки белка в участках сердечной ткани с использованием квантовых точек. Этот метод предоставляет полезный инструмент для визуализации субклеточной локализации и экспрессии любого белка на ультраструктурном уровне.

Abstract

Субклеточная локализация имеет решающее значение для определения правильной функции и определения молекулярных механизмов конкретного белка. Для определения субклеточной локализации белков используется несколько качественных и количественных методик. Одним из новых методов определения субклеточной локализации белка является опосредованная квантовыми точками (QD) иммуномаркировка белка с последующей их визуализацией с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ). QD представляет собой полупроводниковый нанокристалл с двойным свойством кристаллической структуры и высокой электронной плотностью, что делает их применимыми к электронной микроскопии. Этот современный метод визуализировал субклеточную локализацию белка рецептора Sigma 1 (Sigmar1) с использованием QD-TEM в сердечной ткани на ультраструктурном уровне. Небольшие кубики участков сердечной ткани у мыши дикого типа фиксировали в 3% глутаральдегиде, впоследствии осмикали, окрашивали уранилацетатом с последующим последовательным обезвоживанием этанолом и ацетоном. Эти обезвоженные участки сердечной ткани внедряли в низковязкие эпоксидные смолы, разрезали на тонкие срезы толщиной 500 нм, наносили на сетку, а затем подвергали антигенному демаскированию 5% метапериодатом натрия с последующим гашением остаточных альдегидов глицином. Ткани блокировали, за чем следовала последовательная инкубация в первичном антителе, биотинилированном вторичном антителе и стрептавидин-конъюгированном QD. Эти окрашенные участки были высушены пятнами и визуализированы при большом увеличении с использованием TEM. Методика QD-TEM позволила визуализировать субклеточную локализацию белка Sigmar1 на ультраструктурном уровне в сердце. Эти методы могут быть использованы для визуализации присутствия любого белка и субклеточной локализации в любой системе органов.

Introduction

Человеческий организм состоит из множества белков, ответственных за многочисленные функции организма. Функция белков во многом зависит от их локализации в органе и клеточных органеллах. Несколько методов, включая субклеточное фракционирование, иммунофлуоресценцию и экстракцию белка, опосредованной детергентами, обычно используются для определения субклеточной локализации белка 1,2. Микроскопия с использованием иммунофлуоресцентного красителя является наиболее широко используемым методом среди этих методов. Однако флуоресцентные красители, используемые в этой технике, менее стабильны и склонны к фотоотбеливанию3. Другие методы включали микроскопию с высоким разрешением для визуализации белка на ультраструктурном уровне путем иммуномаркировки белков электронно-плотными, тяжелыми металлами (золото, ферритин) или нанокристаллами квантовых точек с последующей визуализацией их с использованием просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ)4,5.

QD представляет собой полупроводниковый нанокристалл, состоящий из полупроводниковых металлических соединений с контролируемыми свойствами фотолюминесценции, имеющими большое значение в биологических системах3. Нанокристаллы QD изготавливаются в формате ядро-оболочка, где нанокристалл инкапсулируется при образовании нанокристаллов для обеспечения их надлежащей стабильности и функционирования. Обычно используется комбинация нанокристаллов ядра и оболочки: CdSe/ZnS, CdSe/CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS и CdTe/CdS/ZnS (ядро/оболочка/оболочка)3. Среди этих нанокристаллических комбинаций наиболее активно изучаются CdSe/ZnS и CdSe/CdS и часто используются в качестве вторичных конъюгатов антител 3,6. Эти наночастицы QD также обладают флуоресцентными свойствами с другими спектрами возбуждения и излучения, чем традиционные флуорофоры. QD использует возбуждение электронов из объемной валентной зоны для демонстрации более высоких квантовых выходов флуоресценции по сравнению с традиционными флуорофорами. Нанокристаллическое расположение полупроводниковых металлов делает QD-опосредованную маркировку более стабильной и устойчивой к фотоотбеливанию6. Кроме того, нанокристаллическое ядро в QD и его кристаллическая структура позволяют QD различных размеров иметь широкий диапазон спектров поглощения и очень узкие пикиизлучения 7. Кроме того, эти частицы QD достаточно велики, чтобы дать высокую электронную плотность, что делает их полезными в методах микроскопии с высоким разрешением, включая просвечивающую электронную микроскопию 5,8,9. Эти нанокристаллы QD также коммерчески доступны в нескольких размерах с различными спектрами и формами флуоресцентного излучения, что делает их отличным кандидатом для маркировки несколькими антителами10,11.

Технология QD привлекла большое значение в биологических исследованиях благодаря множеству функциональных свойств, включая использование в визуализации живых клеток, изучение транспортных механизмов в клетке, мембранный транспорт диффузионного движения белка, функциональную гетерогенность клеток и маркировку внутриклеточных органелл 3,12,13,14,15,16 . QD также полезен в молекулярной диагностике для нацеливания и обнаружения раковых тканей, характеристики молекулярного профиля опухоли и иммунного статуса, а также визуализации стекловидного тела и эпиретинальных мембран 3,17,18. Кроме того, QD также может использоваться в медицинской терапии для лечения злокачественных опухолей с помощью фотодинамической терапии и офтальмологических аномалий путем доставки лекарств в глаза 3,17,18,19.

Используя эти очень полезные нанокристаллы QD, настоящее исследование определило субклеточную локализацию белка под названием рецептор Sigma 1 (Sigmar1). Sigmar1 представляет собой повсеместно экспрессируемый многозадачный молекулярный белок-шаперон. Обширные исследования, посвященные субклеточной локализации Sigmar1 в различных тканях и органах, сообщили о специфической субклеточной локализации клеточного и тканевого типа, вызывающей молекулярную функцию20. В различных клетках (нейронных, фоторецепторных и иммунных клетках) и тканях (печени и мозга) с использованием различных биохимических подходов в исследованиях сообщалось о локализации Sigmar1 на эндоплазматическом ретикулуме (ER), митохондрий-ассоциированной мембране ER (MAM), ядерной оболочке, плазматической мембране, нуклеоплазматическом ретикулуме, ядре и митохондриях. Несмотря на все эти исследования, субклеточная локализация Sigmar1 в сердце оставалась неизвестной20. Поэтому субклеточную локализацию Sigmar1 в сердечной ткани определяли с помощью QD-опосредованной иммуномаркировки с последующей визуализацией ТЭМ.

Protocol

Процедуры обращения с животными в этом протоколе соответствовали Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию (восьмое издание, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, штат Мэриленд) и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Центра медицинских наук Университета штата Луизиана в Шривпорте. Шестимесячные самцы мышей с фоном FVB / N были использованы для настоящего исследования. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). Используемые мыши были размещены в хорошо регулируемой среде в клетках, допускающих 12-часовой светло-темный цикл, обеспечены водой и регулярной диетой чау ad libitum, и за ними ухаживали в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Общий процесс проиллюстрирован на рисунке 1.

1. Подготовка животных

  1. Обезболивают мышей, используя 3% изофлурана. Откройте грудную клетку, сделав горизонтальный разрез в области выше среднего живота и потянув за кожу. Осторожно сделайте еще один разрез, чтобы открыть грудную полость без прокола каких-либо других органов 21,22,23.
    1. Перфузируйте 24 сердца через вершину сначала, а затем правый желудочек с использованием холодного 3% глутаральдегида в кардиоплегическом растворе (50 мМ KCl, 5% декстрозы в PBS, см. Дополнительный файл 1) в течение 2 мин для обеспечения полного расслабления миокарда.
  2. Перфузируют сердце с помощью ледяного 3% глутаральдегида в 0,1 М буфера какодилата натрия (рН 7,4, стадия 2.1.1) еще 2 мин. Используя гравитационное давление, используйте иглу 25 G 5/8", чтобы ввести фиксаторы в сердце. Сразу после того, как сердце начнет наполняться фиксирующим средством, поднимите верхушку сердца и перережьте сосуды под ним на расстоянии 1-2 мм от сердца, чтобы снять давление и дать жидкостям стекать.
  3. Рассекните сердце, удалите предсердия24 и опустите желудочки в ледяной 3% глутаровый альдегид / 0,1 М какодилата натрия в чашке Петри. Сделайте нарезку бабочкой после 30-60 мин фиксации и поместите ее в чашку Петри, содержащую 3% глутаральдегида/какодилата (см. Таблицу материалов). Нарежьте сердце хирургическим лезвием небольшими кубиками по 1мм3 , пока оно находится в растворе глутаральдегида/какодилата.
  4. Зафиксируйте/погрузите рассеченную ткань сердца в раствор глутаральдегида/какодилата в течение 24 ч при 4 °C.

2. Обработка сердечной ткани

  1. После 24 ч фиксации промыть ткани в 0,1 М буфера какодилата натрия в течение 20 мин.
    1. Подготовьте 0,1 М какодилатного буфера, выполнив следующие действия.
      1. Для получения 0,1 М буфера какодилата натрия готовят запас 1 М буфера какодилата натрия путем растворения какодилата натрия (21,4 г) и 1% раствора хлорида кальция (3 мл) в 90 мл дистиллированной воды. Обомите раствор до 100 мл, добавив дистиллированную воду. Хорошо перемешайте раствор и оставьте на ночь, чтобы растворить растворенное вещество.
      2. Далее берут 10 мл 1 М раствора какодилата натрия и добавляют его в 80 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью HCl и объежите его до 100 мл, добавив дистиллированную воду.
  2. Повторите промывку в 0,1 М буфера какодилата натрия еще 20 мин. Удалить ткани из буфера какодилата натрия и погрузить их в 2% раствор тетроксида осмия на 4 ч при комнатной температуре. Этот процесс называется осмикацией.
    1. Приготовьте 2% раствор тетроксида осмия, выполнив следующие действия.
      1. Для приготовления 2% раствора тетроксида осмия берут 4% раствор тетроксида осмия, 4 мл (см. Таблицу материалов), 1 М раствора какодилата натрия (0,8 мл) и дистиллированную воду (3,2 мл), чтобы получить в общей сложности 8 мл раствора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Весь этот процесс и шаги, вытекающие из этого, должны выполняться в вытяжном шкафу.
  3. После осмикации погружают ткани в 2% раствор ацетата натрия на 10 мин при комнатной температуре.
    1. Готовят 2% раствор ацетата натрия, растворяя 4 г ацетата натрия в 20 мл дистиллированной воды.
  4. Далее погружают ткани в 2% раствор уранилацетата в течение 1 ч при комнатной температуре.
    1. Готовят 2% раствор уранилацетата, растворяя 4 г уранилацетата в 20 мл дистиллированной воды.
  5. После окрашивания уранилацетата обезвоживают ткани последовательно через градуированные спирты и ацетон в порядке, указанном в дополнительном файле 1.

3. Встраивание сердечной ткани

  1. Встраивайте обезвоженные ткани в эпоксидную смолу с низкой вязкостью, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Для получения эпоксидной смолы с низкой вязкостью смешайте 10,24 мл эпоксидного мономера диоксида винилциклогексена (ERL 4221), 6,74 мл диглицидилового эфира полипропиленгликоля (DER 732) и 30,05 мл неэнилсутарного ангидрида (NSA) (см. Таблицу материалов) в трубке объемом 50 мл. Хорошо перемешайте суспензию вручную в течение 2 мин.
    2. Добавьте 18 капель эпоксидного ускорителя 2-диметиламиноэтанола (DMAE, см. Таблицу материалов) и перемешайте суспензию, чтобы тщательно перемешать компоненты.
    3. Пропитать ткани эпоксидной смолой в следующей последовательности смеси.
      1. Заменить 100% ацетон смолой 1:1: суспензией ацетона и погрузить в нее ткани на 1 ч при комнатной температуре.
      2. Заменить смолу 1:1: ацетоновую суспензию на смолу 6:1: ацетоновую суспензию и погрузить в нее ткани на 3 ч.
      3. Наконец, замените смолу 6:1: ацетоновую суспензию на 100% смоляную суспензию и оставьте ткани погруженными в нее на ночь при комнатной температуре.
  2. Поместите ткани в свежую смолу в 8 мм микроформах (см. Таблицу материалов) и отверждайте внедренные ткани при 70 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что смола твердая, но не хрупкая после отверждения.

4. Сечение тканей с помощью ультрамикротома

  1. Обрежьте смоляные блоки тканью не более чем на 1 мм перед установкой на ультрамикротом (см. Таблицу материалов). Поместите форму как можно точнее в сегментированную руку ультрамикротома и вручную переместите образец формы к алмазному ножу.
  2. Вырежьте срезы толщиной 500 нм (полмикрона) ножом Histo (см. Таблицу материалов) и с помощью инструмента EM loop возьмите их и поместите на стеклянную горку.
  3. Поместите стеклянную горку на конфорку для толуидинового синего пятна25 , чтобы найти интересующую область.
  4. Найдя интересующую область, используйте нож Ultra 45° (см. Таблицу материалов) для получения ультратонких срезов бледного золота (100 нм). Поместите эти ультратонкие секции на тусклую сторону медной сетки из 200 ячеек.

5. Ультратонкое окрашивание участка сердца

  1. Начните окрашивание с демаскирования антигена с помощью травильного раствора, т.е. 5% раствора метапериодата натрия.
    1. Готовят 500 мкл 5% раствора метапериодата натрия (см. Таблицу материалов) в дистиллированной воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий раствор перед использованием.
    2. Нанесите 20 мкл раствора метапериодата натрия на чистую парафиновую пленку. Поместите полностью высушенные сетки с участками ткани на каплю травильного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тусклая сторона сетки с участком ткани должна быть обращена к раствору для травления.
    3. Оставьте сетку секций на растворе на 30 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть вытравленный участок ткани, поместив его на каплю дистиллированной воды на 60 с.
  3. Блокируют остаточные альдегиды, помещая сетки секций на каплю 0,05 М раствора глицина в течение 10 мин при комнатной температуре. Промокните края сетки на фильтровальной бумаге, чтобы удалить остаточный раствор глицина.
    1. Готовят 0,05 М раствора глицина (см. Таблицу материалов), растворяя 3,75 мг глицина в 1 мл 1x PBS (рН 7,4).
  4. Поместите сетки секций в 10-20 мкл блокирующего раствора на 25 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав блокирующего раствора: 2 мкл 1% нормальной козьей сыворотки (NGS) + 20 мкл 1% BSA (конечная концентрация: 10%) + 178 мкл 1x PBS (рН 7,4) для получения конечного объема 200 мкл.
  5. Промокните края сетки на фильтровальной бумаге и поместите срез сетки на разбавитель антител для кондиционирования при комнатной температуре в течение 10 мин.
  6. Инкубируют срезы сетки с первичным антителом (Sigmar1 в данном случае см. Таблицу материалов; разводят 1:10 в разбавителе антител) в течение 1 ч 30 мин в увлажненной камере.
  7. Промокните сетку и промыть участки сетки разбавителем антител дважды по 5 мин каждая.
  8. Инкубируют срезы сетки с биотинилированным вторичным антителом (в данном случае биотинилированным козьим анти-кроликом поликлональным вторичным антителом, см. Таблицу материалов; разбавляют 1:10 в разбавителе антител) в течение 1 ч в увлажненной камере.
  9. Промокните сетку и промыть участки сетки разбавителем антител дважды по 5 мин каждая.
  10. Инкубируют срезы сетки в коммерчески доступном стрептавидин-конъюгированном QD (QD655 нм, см. Таблицу материалов; разбавляют 1:10 в разбавителе антител) в течение 1 ч в увлажненной камере при комнатной температуре. Предотвратите воздействие света, покрыв камеру алюминиевой фольгой.
  11. Промокните края сетки фильтровальной бумагой и промойте участки сетки, поместив их на капли воды на 2 мин.
  12. Промокните края сетки, чтобы высохнуть.

6. Визуализация просвечивающей электронной микроскопии (TEM)

  1. Поместите ультратонкие срезы на медные решетки в держатель квартета образцов и зажмите их в положении, позволяющем выбрать сетки в электронном пучке.
  2. Вставьте держатель образца в колонку микроскопа и задействуйте переключатель насоса для эвакуации гониометра, после чего следует полное введение держателя образца в колонку микроскопа (см. Таблицу материалов).
  3. Установите напряжение на 80 кВ перед генерацией луча для наблюдения изображения.
  4. Хорошо сфокусируйтесь на нужной области, захватите изображение с помощью высокоскоростной цифровой камеры и сохраните файл в .tif формате.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка микроскопа для захвата изображения в этом исследовании заключалась в ускорении напряжения или напряжения высокого напряжения 80 кВ и увеличении в 20 000 раз.

Representative Results

Настоящая методология QD-TEM визуализировала присутствие Sigmar1 и его локализацию на субклеточных сердечных компартментах путем выполнения анти-Sigmar1 таргетной QD маркировки на ультратонких участках сердца взрослой мыши. Электронно-плотный анти-Sigmar1, меченый QD на митохондриальных мембранах (внутренних и наружных), лизосомах и эндоплазматическом ретикулуме / саркоплазматическом ретикулуме (ER / SR) мембранно-митохондриальном интерфейсе (рисунок 2A, B), были проиллюстрированы изображениями QD-TEM. Кроме того, участки сердца также были помечены IgG и QD кролика в качестве контроля изотипа для первичного антитела кролика против Sigmar1 (рисунок 2C, D). Поэтому визуализация QD-TEM подчеркнула локализацию эндогенного Sigmar1 и его обогащение в основном на лизосомах и митохондриальных мембранах.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация, показывающая последовательные шаги и процедуры, используемые для выполнения QD-TEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Sigmar1 иммуномаркированный QD в тканях сердца взрослых мышей. (A,B) Репрезентативные изображения TEM, показывающие Sigmar1, меченый QD на митохондриях (наружной и внутренней мембране), митохондриях-ассоциированных эндоплазматических ретикулумных (ER) / саркоплазматических ретикулумных (SR) мембранах и лизосомах. (С,Г) TEM изображение сердечных участков изотипа контроля, помеченных QDs и кроликом IgG. Шкала шкалы: 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Состав PBS и других растворов, используемых для обезвоживания тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

В настоящем исследовании QD-опосредованное иммуномаркирование использовалось для отчетливого показа субклеточной локализации Sigmar1. Используя QD, локализация Sigmar1 на митохондриальной мембране, особенно на внутренней митохондриальной мембране, была изображена в сердечной ткани. Кроме того, было также обнаружено, что Sigmar1 расположен на саркоплазматическом/эндоплазматическом ретикулуме (S/ER) и лизосомах на ультраструктурном уровне, как показано на рисунке 2A-D.

Критическим шагом в этом протоколе является этап травления или демаскации антигена с использованием высококонцентрированного раствора метапериодата натрия для разоблачения антигена после фиксации и осмикации глутаральдегида. В этом протоколе применяли однократную обработку с высокой концентрацией (5%) метапериодата натрия в течение 30 мин при комнатной температуре. На этом этапе необходима дополнительная осторожность, поскольку более длительная или более высокая концентрация инкубации метапериодата натрия приведет к агрегации структур, потере определения мембраны для органелл и вызовет перфорацию в секции, что затруднит визуализацию белка или структуры. Альтернативно, более низкая концентрация (3%) раствора метапериодата в два этапа в течение 30 мин также может быть использована вместо 5% метапериодата. Исследования показали, что этот вариант демонстрирует аналогичные результаты, как и при использовании 5% раствора метапериодата для одноэтапной 30-минутной инкубации. Однако 3% раствор метапериодата в течение 30 мин инкубации в течение двух раз обеспечивает лучший контроль над процессом 26,27,28. Первоначально в этом протоколе использовалась инкубация срезов с 10% раствором метапериодата в течение 30 мин. Однако из-за слишком большого количества перфораций, созданных в тканевом сечении этой концентрацией, конечная концентрация и продолжительность инкубации раствора метапериодата были уменьшены и оптимизированы до 5% в течение 30 мин.

Еще один шаг требовал оптимизации времени фиксации глутаровым альдегидом. Неоптимальная фиксация тканей приводит к неадекватной маркировке QD, тогда как чрезмерная фиксация тканей приводит к более высокой неспецифической маркировке. Поэтому необходимо тщательно рассмотреть вопрос об определении и титровании оптимального уровня фиксации тканей для правильной и специфической маркировки белков. В этом методе с использованием тканей сердца время фиксации глутаровым альдегидом титровали с использованием 24 ч и 48 ч в качестве временных точек. Основываясь на изображениях окрашивания секций, зафиксированных для обеих временных точек, было обнаружено, что участки, зафиксированные в течение 24 часов, отображали лучшие результаты. На сегодняшний день нанокристаллы QD доступны в нескольких размерах, включая 525, 565, 585, 605, 655 и 705 нм11,29. Каждый из этих QD имеет свои собственные спектры излучения и излучает флуоресценцию на разных длинах волн. Кроме того, эти коммерчески доступные QD разных размеров отображают различные формы; например, QD 525, 565 и 585 практически сферические с различными размерами, тогда как QD 605, 655 и 705 имеют неправильную продолговатую форму. Из этих различных нанокристаллов QD QD 525, 565 и 655 легко отличить друг от друга11,29. Эти различия в спектрах излучения и формах делают QD отличным кандидатом для мультимаркировки белков и визуализации с помощью флуоресценции и электронной микроскопии. В этом исследовании коммерчески доступный QD, QD 655, был использован для маркировки белка Sigmar1, чтобы отличить его от любого неспецифического фона в окрашенных участках.

Другим аналогом QD для маркировки белка в микроскопии с высоким разрешением является частица иммунозолотого. Частицы иммунозолотого традиционно используются для маркировки белков для микроскопии с высоким разрешением. Эти частицы золота обладают высокой электронной плотностью и легко идентифицируются по сравнению с нанокристаллами QD. Тем не менее, QD демонстрирует лучшую эффективность с лучшим проникновением в ткани, более высокой стабильностью и сроком годности, а также лучшим удержанием ультраструктурных компонентов, что делает их лучшим кандидатом для маркировки белка 4,5. QD также обладает уникальной способностью обнаруживаться как световой, так и электронной микроскопией, что повышает его ценность по сравнению с маркировкой иммунозолотого10.

Одним из ограничений этого QD-опосредованного иммуномаркировки является использование тетроксида осмия во время обработки. Тетроксид осмия используется для увеличения электронной плотности, проводимости и контрастности менее электронно-плотных и менее контрастных биологических мембранных структур 5,30. Однако использование тетроксида осмия мгновенно и необратимо разрушает свойство образца создавать флуоресценцию при маркировке QD6. Это ограничивает использование QD в флуоресцентной микроскопии. Альтернативный подход, исключающий использование тетроксида осмия, будет выгоден для сохранения флуоресцентных свойств и, следовательно, двойного применения QD-опосредованного иммуномаркировки. Некоторые из новых моделей ТЕА имеют возможность подключения системы энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDX), которая позволяет идентифицировать элементный состав материалов. Другим ограничением исследования является отсутствие элементного отображения образца и анализа изображений с использованием EDX. Поэтому будущие исследования должны быть сосредоточены на EDX-анализе спектров QD для анализа элементного состава.

QD маркировка белков получила большое внимание в последнее время. QD предлагает несколько применений и преимуществ как в биологических исследованиях, так и в медицинской терапии. QD, дополнительно обернутый полидентатным лигандом, демонстрирует повышенную стабильность, поддерживая квантовый выход. Кроме того, инкапсуляция QD с этими био-благоприятными агентами также увеличивает его биодоступность в тканях, что делает его хорошим кандидатом для потенциального применения при обнаружении опухолей, визуализации живых клеток, доставке лекарств и визуализации тканей 3,31,32.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 и R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award и LARC Research Award для MSB; LSUHSC-S Малкольм Фейст Сердечно-сосудистая и AHA Постдокторская стипендия CSA (20POST35210789); и LSUHSC-S Малкольм Фейст Преддокторская стипендия в РА.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 Mesh copper grid Ted Pella G200HH
6-month-old male mice with FVB/N background Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Acetone 100% Fisher Chemicals A949
Antibody diluent Dako S3022
anti-Sigmar1 antibody Cell Signaling 61994S
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody Sigma Aldrich B7389
BSAc (10%) Electron Microscopy Sciences 25557
Calcium chloride Sigma Aldrich C7902
Cytoseal Xyl Thermo fisher 8312-4
DER 732C36AA10:C33 Electron Microscopy Sciences 13010
Dextrose Sigma Aldrich G7528
Diamond Knife Diatome Histo; Ultra 450
DMAE Electron Microscopy Sciences 13300
Electron microscope JEOL JEOL-1400 Flash
ERL 4221 Electron Microscopy Sciences 15004
Ethanol 100% Fisher Chemicals A405P
Glutaraldehyde 3% Electron Microscopy Sciences 16538-15
Glycine Alfa Aesar A13816
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA56
Micromolds Ted Pella 10505
Microtome Leica Microsystem EM UC7
Normal goat serum Invitrogen PCN5000
NSA Electron Microscopy Sciences 19050
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19150
Parafilm Genesse Scientific 16-101
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5655
Potassium Phosphate monobasic Sigma Aldrich 71640
Qdot 655 Streptavidin Conjugate Invitrogen Q10121MP
Sodium Acetate Fisher Scientific BP334
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
Sodium metaperiodate Sigma Aldrich 71859
Sodium Phosphate dibasic Sigma Aldrich P9541
Surgical blade (size 10) Aspen surgical 371110
TEM  image software AMT-V700 AMT TEM imaging systems
TEM imaging camera XR80 TEM series AMT TEM imaging systems
Toluidine Blue O solution (0.5%) Fisher Scientic S25612
Uranyl acetate Polysciences 21447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lidke, D. S., Lidke, K. A. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).
  2. de Duve, C. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20 (1971).
  3. Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).
  4. Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).
  5. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).
  6. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  7. Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  9. Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).
  11. Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  12. Lidke, D. S., et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).
  13. Pleskova, S. N., et al. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).
  14. Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).
  15. Hanaki, K. -i, et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).
  16. Lim, Y. T., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).
  17. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  18. Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).
  19. Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).
  20. Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575 (2021).
  21. Bohne, B., Harding, G. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).
  22. Roszkowski, M. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).
  23. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988 (2021).
  24. Jones, W. K., et al. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).
  25. Hunter, E. E. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).
  26. Morris, R. E., Ciraolo, G. M. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).
  27. Brorson, S. H. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).
  28. Lobo, M. V. T., et al. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).
  29. Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).
  30. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  31. Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).
  32. Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233 (2021).

Tags

Биология выпуск 187
Визуализация субклеточной локализации белка в сердце с помощью иммуномаркировки, опосредованной квантовыми точками, с последующей просвечивающей электронной микроскопией
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aishwarya, R., Abdullah, C. S.,… More

Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Remex, N. S., Nitu, S., Hartman, B., King, J., Bhuiyan, M. S. Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64085, doi:10.3791/64085 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter