Summary
Mushjärttransplantationsmodeller representerar värdefulla forskningsverktyg för att studera transplantationsimmunologi. Det nuvarande protokollet beskriver mus heterotopisk cervikal hjärttransplantation som innebär placering av manschetter på mottagarens gemensamma halspulsåder och givarens lungartärstam för att möjliggöra laminärt blodflöde.
Abstract
Murina modeller av hjärttransplantation används ofta för att studera ischemi-reperfusionsskada, medfödda och adaptiva immunsvar efter transplantation och effekten av immunmodulerande terapier på transplantatavstötning. Heterotopisk cervikal hjärttransplantation hos möss beskrevs först 1991 med suturerade anastomoser och modifierades därefter för att inkludera manschetttekniker. Denna modifiering möjliggjorde förbättrade framgångsgrader, och sedan dess har det funnits flera rapporter som har föreslagit ytterligare tekniska förbättringar. Översättningen till mer utbredd användning är dock fortfarande begränsad på grund av de tekniska svårigheterna i samband med transplantatanastomoser, vilket kräver precision för att uppnå tillräcklig längd och kaliber på manschetterna för att undvika vaskulär anastomotisk vridning eller överdriven spänning, vilket kan leda till skador på transplantatet. Detta protokoll beskriver en modifierad teknik för att utföra heterotopisk cervikal hjärttransplantation hos möss som innebär manschettplacering på mottagarens gemensamma halspulsåder och givarens lungartär i linje med blodflödets riktning.
Introduction
publicerade1 den första beskrivningen av heterotopisk bukhjärttransplantation hos råttor 1964. Dessa kirurgiska tekniker förfinades och förenklades av Ono et al. 19692. beskrev först en metod för heterotopisk bukhjärttransplantation hos möss 1973; I likhet med de tidigare rapporterade råttmodellerna involverade detta engraftment i värdens buk med revaskularisering genom end-to-side anastomoser av donatorns lungartär och stigande aorta till mottagarens underlägsna vena cava respektivebukaorta 3. Heterotopisk cervikal hjärttransplantation hos råttor beskrevs av Heron 1971 med hjälp av teflonmanschetter gjorda av 16 G (1,6 mm ytterdiameter) intravenösa katetrar4. Chen5 och Matsuura et al.6 rapporterade senare heterotopisk cervikal hjärttransplantation hos möss 1991, vars tekniker främst skilde sig åt i deras metod för re-anastomos. Chens tillvägagångssätt involverade suturerade anastomoser av givarens stigande aorta till mottagarens halspulsåder och givarens lungartär till mottagarens yttre halsven5. På grund av den avancerade tekniska skicklighet som krävs för dessa mikrokirurgiska suturerade anastomoser var en betydande tid och erfarenhet nödvändig för att uppnå en hög framgångsgrad. beskrev en metod som använde en icke-suturmanschettteknik, liknande den som användes av Heron, som involverade end-to-end anastomoser med hjälp av extra-luminal placering av manschetter. Han formade teflonmanschetter från 22 G (0,8 mm ytterdiameter) och 24 G (0,67 mm ytterdiameter) intravenösa katetrar och placerade dem över mottagarens yttre halsven respektive vanliga halspulsåder6. Dessa manschetter placerades sedan inuti donatorns lungartär och aorta och säkrades genom att binda en suturligatur runt anslutningen. Detta tillvägagångssätt översattes till en förbättrad framgångsgrad. Viktigast av allt, det resulterade i en förkortning av den tid som krävs för att slutföra båda cervikala anastomoserna, vilket minskar den varma ischemiska tiden för transplantatet till mindre än en tredjedel av den som använder buksutureringsmetoden. Eftersom manschetterna placeras runt kärlets yttre yta finns det ingen främmande kropp som utsätts för kärlets lumen, vilket i stor utsträckning minskar risken för trombos efter operation7. Under tiden ger användningen av manschetttekniken stöd runt kärlen på platsen för anastomosen utan att kräva någon suturering, vilket minskar risken för blödning efter revaskularisering6.
Många revideringar av denna teknik har föreslagits. För att rymma den korta längden på musens vanliga halspulsåder (cirka 5 mm) utvecklade Tomita et al.8 en modifiering av denna teknik med en mindre arteriell manschett (0,6 mm ytterdiameter) medan man utelämnade att hålla suturer och dra artären direkt genom manschetten med fina pincett istället. förenklade detta tillvägagångssätt ytterligare genom att placera 22 G och 24 G manschetter på donatorns högra lungartär respektive mottagarens högra gemensamma halspulsåder9. Olika rapporter har beskrivit modifieringar av dessa tillvägagångssätt, inklusive användning av specialiserade manschetter, mikrokirurgiska klämmor, kärldilatatorer och kardioplegi10,11,12. I synnerhet involverar alla dessa metoder den retrograda cirkulationen av blod genom hjärtat, med blod som strömmar från mottagarens gemensamma halspulsåder till givarens aorta, kranskärlen, koronar sinus, sedan tömning i höger atrium och utgång från lungartären till mottagarens yttre halsven.
Jämfört med engraftment i buken erbjuder cervikal hjärttransplantation flera fördelar. Som tidigare nämnts möjliggör cervikal exponering snabbare revaskularisering och kortare varma ischemiska gånger6. Den livmoderhalsiga metoden är också mindre invasiv och är förknippad med kortare postoperativa återhämtningstider eftersom den undviker en laparotomi6. Viktigt är att end-to-end anastomoser med manschetter kan utföras istället för end-to-side anastomoser, vilket minskar risken för komplikationer som anastomotisk blödning. Bukmetoden innebär också en ökad risk för att utveckla trombotiska komplikationer i bukaorta eller underlägsen vena cava, vilket leder till ryggmärgsischemi och bakbensförlamning. Den ytliga cervikala placeringen av transplantationen möjliggör enkel åtkomst till transplantatviabilitetsbedömning genom palpation, elektrokardiografi och invasiv eller icke-invasiv avbildning. Även om livmoderhalstransplantaten återupptar spontan hjärtaktivitet efter reperfusion, påverkar de inte signifikant mottagarens systoliska och diastoliska parametrar. Denna modell ger värdefull insikt för att studera cellulära svar efter transplantation, såsom ischemi-reperfusionsskada och transplantatavstötning. Dessutom erbjuder denna modell ett idealiskt tillvägagångssätt för att möjliggöra avbildning efter transplantation, såsom intravital tvåfotonmikroskopi eller positronemissionstomografi (PET) avbildning. För detta ändamål har vårt laboratorium tidigare rapporterat metoder för att avbilda rörliga vävnader och organ i musen, inklusive att slå murina hjärtan och aortabågtransplantat efter heterotopisk livmoderhalstransplantation för att visualisera leukocythandel under ischemi-reperfusionsskada och inom aterosklerotiska plack, respektive13,14,15 . Dessutom, på grund av dess ytliga läge och enkel exponering, är denna modell lämplig för hjärttransplantation16.
Denna rapport beskriver en teknik som möjliggör laminärt blodflöde med den yttre placeringen av vaskulära manschetter på kärlen från vilka blodflödet härstammar. Detta möjliggör en smidig övergång av blodflödet från ett kärl till nästa, vilket undviker exponering av den distala kärlkanten i kärllumen. Dessutom använder tekniken en större 20 G manschett, istället för tidigare använda 22 G manschetter, för donatorns lungartär för att säkerställa riklig återgång av blodflödet till mottagaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurhanteringsprocedurer utfördes i enlighet med NIH: s riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och godkändes av djurstudiekommittén vid Washington University School of Medicine. Hjärtan från C57BL/6 (B6) och BALB/c-möss (som väger 20-25 g) transplanterades till könsmatchade B6-mottagare (6-8 veckors ålder). Mössen erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning). Syngeneiska transplantationer utfördes för att utvärdera cellulära svar relaterade till ischemi-reperfusionsskada, och allogena transplantationer utfördes för att undersöka immunmekanismerna som är involverade i transplantattolerans och avstötning. B6-lysozym M-grönt fluorescerande protein (LysM-GFP) reportermöss17, ursprungligen erhållet från Klaus Ley från La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, och därefter uppfödt i vår anläggning, användes som mottagare för utvalda experiment för att visualisera neutrofil infiltration i hjärttransplantat. Överlevnadskirurgi utfördes med hjälp av aseptiska procedurer.
1. Förfarande för givare
- Bedöva mössen genom att injicera ketamin (80−100 mg/kg) och xylazin (8−10 mg/kg) (se materialförteckning) intraperitonealt i donatormusen. Bekräfta kirurgiskt anestesiplan med tå och svansnypa.
- Förbered det kirurgiska området genom att raka håret från bröstet och buken med en elektrisk rakhyvel.
- Administrera 100 enheter heparin (se materialtabell) intravenöst i penisvenen (män) eller yttre halsvenen (män eller kvinnor).
- Placera mössen i ryggläge med frambenen över huvudet. Säkra frambenen och bakbenen med kirurgisk tejp och desinficera huden med tre alternerande scrubs av 0,75% jod och 70% etanol.
- Utför ett snitt, median laparosternotomi, från navel till sternal vinkel (3-4 cm), följt av en bilateral torakotomi längs varje costal marginal (2 cm bilateralt). Vik den främre bröstväggen över halsen för full exponering av mediastinum.
- Skär ut tymus och exponera den intratorakiska underlägsna vena cava.
- Transekt över bukaortans bredd för exsanguination.
- För retrograd perfusion, injicera 1,5 ml 4 °C saltlösning i den intratorakiska underlägsna vena cava med nålen orienterad överlägset mot transplantatet, som tidigare beskrivits13.
- Ligate den överlägsna vena cava med en 8-0 silke sutur och dela distalt.
- Upprepa den retrograda perfusionen genom att injicera ytterligare 1,5 ml 4 °C saltlösning via den underlägsna vena cava.
- Ligate den sämre vena cava med en 8-0 silke sutur och dela distalt.
- Dissekera aortabågen och lungartärstammen för transplantatskörd och transektera båda distalt. Ligate lungvenerna på den bakre ytan av hjärtat med en 6-0 silkesutsutur och dela distalt.
- Utför transplantatberedning genom att ta bort givarhjärtat från bröstkaviteten. Placera det utskurna hjärtat i en plastbehållare fylld med 4 °C hepariniserad saltlösning i 1-2 minuter. Överför ympkvisten till en steril plastkolv fylld med is för manschettplacering (figur 1A).
OBS: Hjärttransplantatet måste stanna kvar på kolven i cirka 5 minuter för att placera donatorns lungartärmanschett. - Placera en 1 mm lång 20 G angiokateter (se materialtabell) manschett över lungartären för donatormanschetten. Använd fina pincett, vik försiktigt kanterna på artären tillbaka över manschetten. Fäst det vikta kärlet på manschetten med en 10-0 nylonbindning, som beskrivits tidigare18 (figur 1B,C).
- Förvara donatorhjärtat i hepariniserad saltlösning eller annan konserveringslösning vid 4 °C.
OBS: Medan vissa kanske föredrar specifika konserveringslösningar (t.ex. University of Wisconsin-lösningen) för långvarig ischemisk konservering, kan det vara dyrt19. Saltlösning kan vara ett lämpligt alternativ för korta perioder av ischemi (<1 h)20. I slutändan beror valet av konserveringslösning på den experimentella designen21.
2. Förfarande för mottagare
- Injicera ketamin (80−100 mg/kg) och xylazin (8−10 mg/kg) intraperitonealt i mottagarmusen för anestesi. Injicera buprenorfin med fördröjd frisättning (0,5-1,0 mg/kg) subkutant för analgesi. Bekräfta kirurgiskt anestesiplan med tå och svansnypa.
- Förbered det kirurgiska området genom att raka håret från livmoderhalsområdet med en elektrisk rakhyvel. Applicera steril, icke-medicinsk oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torkning av hornhinnan.
- Placera djuret i ryggläge med framben intill kroppen och huvudet vände sig något åt vänster. Säkra frambenen och bakbenen med kirurgisk tejp. Desinficera huden med tre alternerande scrubs av 0,75% jod och 70% etanol.
- Gör ett mittlinje cervikalt snitt från den nedre underkäken till bröstbenet.
- Transect den högra sternocleidomastoid muskeln. Skär ut den högra loben i den submandibulära körteln för att skapa utrymme för transplantatimplantation.
- Knyt en slipknot över den proximala yttre halsvenen med en 6-0 silkessutur. Ligate den distala yttre halsvenen och intilliggande grenar med en 8-0 silke sutur. Gör ett tvärgående snitt över den främre väggen i den yttre halsvenen.
- Placera en 10-0 nylon sutur genom kanten av den proximala yttre halsvenen och den underliggande vävnaden för att säkra venen under manschettinsättning (figur 1D).
- Ligate den distala högra gemensamma halspulsådern med en 8-0 silke sutur bara sämre än carotid bifurcation. Knyt en slipknot över den proximala vanliga halspulsådern med en 6-0 silkessutur. Transect artären distalt mellan suturerna.
- I likhet med donatormanschetten, placera en 0,6 mm lång 24 G angiokatetermanschett över mottagarens högra gemensamma halspulsåder. Använd fina pincett, vik försiktigt kanterna på artären tillbaka över manschetten. Fäst det vikta kärlet på manschetten med en 10-0 nylonbindning.
- Placera donatorhjärtat överlägset det högra livmoderhalsområdet.
- Droppa kall saltlösning på hjärttransplantatet med några minuters mellanrum under implantation.
- Placera en 10-0 nylon sutur genom kanten av donatoraortan och genom en ytlig bit av den underliggande vävnaden för att säkra transplantatet på plats (figur 1E).
- Spola donatoraortan med 0,5 ml 0,9% hepariniserad saltlösning.
- Sätt in mottagarens vanliga halspulsådermanschett i donatoraortan. Säkra anastomosen med 8-0 silkeslipsen (figur 1F). Ta bort aortaatankarsuturen.
- Avlufta den yttre halsvenen genom att spola mottagarens yttre halsven med 0,5 ml 0,9% hepariniserad saltlösning.
- Utför lungartäranastomos genom att sätta in donatorns lungartärmanschett i mottagarens yttre halsven och säkra med en 8-0 silkeslips (figur 1G). Ta bort den yttre jugularvenens ankare sutur och transektera den återstående bakre väggen i den yttre halsvenen för att frigöra transplantatet från den underliggande vävnaden. Se till att transplantatet är ordentligt orienterat utan att kinka eller vrida anastomoserna.
- Släpp slipknoterna på mottagarens yttre halsven följt av den gemensamma halspulsådern för att initiera hjärttransplantatreperfusion (figur 1H).
- Stäng snittet på livmoderhalshuden med en avbruten 6-0 nylonsutur.
3. Postoperativ vård
- Placera mottagaren i en varm återhämtningskammare omedelbart efter operationen och övervaka noga tills den är helt återställd från anestesi (cirka 1 h).
- Fortsätt att noggrant övervaka djuret (var 6-8 h) i minst 72 timmar efter operationen för tecken på onormalt beteende, såsom slöhet, skakningar, snabb andning eller anorexi.
- För smärtkontroll, injicera karprofen (5 mg/kg) subkutant var 8-12:e timme för analgesi, förutom subkutant buprenorfin (0,05 mg/kg) var 8-12:e timme i 24-48 timmar med början i slutet av operationen.
4. Intravital tvåfotonavbildning av leukocythandel i hjärttransplantatet
- Injicera ketamin (80-100 mg/kg) och xylazin (8-10 mg/kg) intraperitonealt i en B6 LysM-GFP-mottagarmus17 2 timmar efter transplantatreperfusion för anestesi.
- Utför orotrakeal intubation med en 20 G angiokateter, som tidigare beskrivits18.
- Anslut angiokatetern till slangen från en mekanisk ventilator för mus och ventilera med rumsluft med en hastighet av 120 andetag/min och en tidvattenvolym på 0,5 ml18.
- Injicera 12 μL 655 nm icke-riktade kvantprickar (se materialförteckningen), suspenderade intravenöst i 50 μl PBS, enligt beskrivningen tidigare13.
- Öppna nacksnittet igen för att exponera hjärttransplantatet. Placera musen i en stabiliseringskammare.
- Säkra en del av den fria väggen i vänster kammare med en tunn ring av vävnadslim (se materialtabell), applicerad på en glasöverdragsskiva fäst vid den övre kammarplattan.
- Placera kammaren under tvåfotonmikroskopets mål för att skaffa bilder och videor, som beskrivits tidigare13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna mushalscancer heterotopiska hjärttransplantationsmodell har använts för att utföra över 1 000 transplantationer i vårt laboratorium, med en överlevnad på cirka 97%. Framgångsgraden är något högre än tidigare rapporter som använder andra cervikala heterotopiska hjärttransplantationstekniker hos möss10,11,20. Detta kan potentiellt hänföras till den större 20 G manschetten placerad på donatorns lungartär för att säkerställa riklig återgång av blodflödet till mottagaren (figur 1B, C). Dessutom minimerar inriktningen av blodflödet med manschettplacering i den nuvarande tekniken risken för trombos och anastomotisk turbulens (figur 1,2). Medan magnetisk resonanstomografi (MRI) eller ultraljud kan bedöma turbulensen hos transplantatperfusion22,23, har vi ännu inte använt dessa tekniker i experimenten. Intraoperativ död med denna teknik är sällsynt för erfarna mikrokirurger. Postoperativ dödlighet beror oftast på blödningskomplikationer. Den genomsnittliga mottagaroperationstiden var 36,5 ± 3,5 min, med en genomsnittlig kall ischemitid på 20 min. För överlevnadsstudier bedömdes hjärttransplantat dagligen genom direkt visualisering och digital palpation av hjärtslaget. Möss offras vanligtvis för transplantatutvärdering cirka 7-14 dagar postoperativt. Intravital tvåfotonavbildning är ett terminalt förfarande som vanligtvis utförs tidigt efter transplantation för att utvärdera leukocythandel (figur 3).
De flesta syngena transplantationer upprätthöll starka hjärtslag fram till offret, upp till 6 månader efter transplantation. Vid grov inspektion verkade de flesta syngena transplantat normala och histologisk undersökning avslöjade inga tecken på avslag. Alla icke-immunsupprimerade allogena transplantationer (BALB/c till B6) utvecklade en minskad hjärtslag inom 1-2 veckor efter engraftment. Utskurna allogena transplantat från sådana möss utvidgades grovt, och histologisk undersökning visade diffus infiltration av lymfocyter och områden med myokardiell nekros.
Figur 1: Förberedelse av hjärttransplantat för transplantation . (A) Hjärtat skärs ut från donatormusen. (B,C) Lungartärstammen exponeras och dras genom en 20 G manschett, viks tillbaka och säkras med en 10-0 nylonsutur. (D) En 10-0 nylon sutur placeras genom kanten av mottagarens yttre halsven och fixeras till underliggande vävnad. (E) En 10-0 nylon sutur placeras genom kanten på donatoraortan och fästs vid den underliggande vävnaden intill mottagarens halspulsåder. (F) Mottagarens gemensamma halspulsådermanschett sätts in i donatoraortan och säkras med 8-0 silke sutur. (G) Donatorns lungartärmanschett sätts in i mottagarens yttre halsven och säkras med en 8-0 silke sutur. (H) Proximal slipknot på mottagarens yttre halsven frigörs, följt av frisättning av den gemensamma halspulsådern slipknot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Intraoperativ vy av hjärttransplantat. En 1 mm 20 G manschett dras över donatorns lungartär och säkras med en 10-0 nylonbindning. En 0,6 mm 24 G manschett dras över mottagarens högra gemensamma halspulsåder och säkras med en 10-0 nylonbindning. Ankarsuturer (10-0 nylon) placeras i väggen i donatoraortan och mottagarens högra yttre halsven och fästs på underliggande vävnad för att förhindra rörelse under manschettinsättning. (AO = aorta, PA = lungartär, CCA = vanlig halspulsåder, EJV = yttre halsven). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Intravital tvåfotonavbildning av leukocytdynamik i hjärttransplantatet. Intravital tvåfotonavbildning av bultande hjärta transplanterat från B6-mus till B6 LysM-GFP-mottagare visar handel med mottagarneutrofiler i hjärttransplantatvävnaderna mellan 2-3 timmar postoperativt. (Grön = neutrofiler, röd = kärl märkta med kvantprickar). Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komplikation | Möjliga orsaker | Lösningar |
| Mottagarens död | Hypotermi | Värmedyna |
| Uttorkning | 0,9% saltlösning i.p. postoperativt | |
| Dålig transplantatperfusion | Karotisartärens vridning | Re-anastomos, eller |
| Thrombus eller flygemboli | Öppna arteriell anastomos och spola med hepariniserad saltlösning | |
| Venös obstruktion | Thrombus eller flygemboli | Re-anastomos, eller |
| Öppna venös anastomos och spola med hepariniserad saltlösning | ||
| Postoperativ blödning | Blödande jugular vengrenar | Ligate jugular vengrenar |
| Bomullspinne kompression | ||
| Lösa manschetter | Dra åt manschetterna | |
| Svag hjärtslag | Kallt hjärttransplantat | Dropp varm saltlösning på ytan av hjärtat |
| Transplantat vridning | Felaktig transplantatposition | Se till att transplantatet är ordentligt orienterat innan huden stängs |
| Oregelbunden aktivitet (t.ex. springa i cirklar) | Cerebral ischemi | Ligate vanlig halspulsåder sämre än karotisbifurcation |
Tabell 1: Felsökning för komplikationer. Vanliga komplikationer med lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av denna teknik kan mus heterotopisk cervikal hjärttransplantation utföras på mindre än 40 minuter av en erfaren mikrokirurg och på cirka 60 minuter av en mikrokirurg på grundnivå. Medan cervikal hjärttransplantation har studerats i många djurmodeller, är en musmodell fortfarande guldstandarden på grund av flera väldefinierade genetiska stammar, genetiska förändringsfunktioner och tillgången på många reagenser, inklusive monoklonala antikroppar24. Tekniken som beskrivs här ger en unik möjlighet för övervakning efter transplantation, såsom elektrokardiografi eller intravital avbildning, inklusive tvåfotonmikroskopi (figur 3) eller seriell icke-invasiv PET-avbildning13,14,15,25. Denna metod ger en ytlig plats för hjärttransplantatet som är lättare att stabilisera för intravital avbildning, vilket undviker komplexiteten som är inneboende i buktransplantationsmetoden på grund av den djupare placeringen av transplantatet och de omgivande bukorganen. Dessutom är denna teknik särskilt användbar i samband med återtransplantation. Retransplantationsmodeller representerar kraftfulla verktyg för att identifiera bosatta celler i transplanterade hjärttransplantat som förmedlar alloimmuna svar. Medan vi tidigare har använt denna teknik i en mushjärttransplantationsmodell för att bedöma kortsiktiga resultat, kan detta tillvägagångssätt utökas i framtida experiment för att utforska långsiktiga resultat16. För detta ändamål har de nuvarande undersökningarna hittills utnyttjat en kort period av kall ischemi (cirka 20 min). Framtida studier skulle kunna undersöka effekten av långvarig förkylning eller varm ischemi på kort- och långsiktiga resultat för att närmare efterlikna klinisk transplantation.
Flera kritiska steg i denna teknik måste övervägas. Tidigare metoder innebär att manschetten sätts in på den mindre yttre halsvenen i den stora lumen i donatorns lungartär 6,8. Placeringen av den större manschetten på donatorns lungartär för att upprätta korrekt orientering med blodflödet gör det något svårare att sätta in manschetten i den mindre yttre halsvenen. Att fästa kanten på venen på den underliggande vävnaden och endast delvis skära venens främre vägg underlättar manschettinsättningen. Dessutom kan manschettplacering på mottagarens gemensamma halspulsåder vara ganska utmanande på grund av fartygets lilla kaliber. Som sådan har tidigare tekniker rapporterat användningen av mindre manschetter (t.ex. 26 G) för denna anastomos12. Det nuvarande tillvägagångssättet använder dock en större 24 G manschett för att säkerställa adekvat transplantatperfusion, vilket vi tror kan erbjuda vissa överlevnadsfördelar. Att välja större mottagarmöss kan hjälpa nybörjare mikrokirurger. Ankarsuturer avlägsnas efter reperfusion, och transplantatet fixeras inte i rätt riktning som andra har beskrivit3. Därför är det viktigt att kontrollera att transplantatet är korrekt placerat och orienterat före stängning av livmoderhalshuden för att förhindra vridning eller vridning (tabell 1). Excision av den högra submandibulära körteln utförs för att ge tillräckligt med utrymme för hjärttransplantatet, vilket undviker transplantatkompression efter hudförslutning.
Modellen som beskrivs här erbjuder flera fördelar. Genom att placera manschetterna på donatorns lungartärstam och mottagarens gemensamma halspulsåder, överensstämmer manschettorienteringen med blodflödets riktning. Detta minskar sannolikheten för turbulent flöde och trombbildning. För det andra används en större 20 G lungartärmanschett för att säkerställa riklig återgång av blodflödet till mottagaren. För det tredje placeras en större 24 G manschett på den gemensamma halspulsådern för att säkerställa adekvat perfusion av transplantatet. Slutligen används 10-0 nylonankarsuturer för att fixera transplantatet till underliggande vävnader och underlätta manschettinsättning. Dessa modifieringar hjälper till att övervinna de tekniska utmaningarna i proceduren, förhindra anastomotisk turbulens och minska postoperativa komplikationer som trombbildning.
En viktig begränsning av alla mushjärttransplantationsmodeller är att fysiologiskt blodflöde inte återställs genom hjärtats kamrar. Istället förlitar sig dessa modeller på cirkulation genom kranskärlen. Konsekvenserna av detta retrograda flödesmönster på transplantatets cellulära skada och immunsvar har inte tydligt avgränsats; Det är emellertid möjligt att mekaniska skjuvkrafter som härrör från denna icke-fysiologiska cirkulation påverkar immunsvaren. En kirurgisk modell för hjärttransplantation hos möss som återställer fysiologiskt blodflöde har ännu inte utvecklats och skulle kräva betydande tekniska framsteg. Det observeras att en liten andel möss (<3%) upplever övergående oregelbundet beteende (t.ex. springer i cirklar) efter proceduren. Detta beteende varar i cirka 1-2 timmar före upplösning. Med tanke på att detta beteende inte observeras efter andra förfaranden som använder samma bedövningsregim, kan det vara relaterat till övergående cerebral ischemi på grund av blodflödesförändringar efter cervikal hjärttransplantation. Full återhämtning har skett hos alla möss utan att några kroniska underskott observerats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
DK stöds av National Institutes of Health-bidrag 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review-bidrag 1I01BX002730 och The Foundation for Barnes-Jewish Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Yu, Y., et al. Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (180), e63504 (2022).
- Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2499-2508 (2012).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).
- Li, W., et al. Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis. Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Ma, Y., et al. Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation. Journal of Visualized Experiments. (160), e61103 (2020).
- Latchana, N., Peck, J. R., Whitson, B., Black, S. M. Preservation solutions for cardiac and pulmonary donor grafts: a review of the current literature. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1143-1149 (2014).
- Hartley, C. J., et al. Doppler velocity measurements from large and small arteries of mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), 269-278 (2011).
- Bovenkamp, P. R., et al. Velocity mapping of the aortic flow at 9.4 T in healthy mice and mice with induced heart failure using time-resolved three-dimensional phase-contrast MRI (4D PC MRI). MAGMA. 28 (4), 315-327 (2015).
- Wang, H. Small animal models of xenotransplantation. Methods in Molecular Biology. 885, 125-153 (2012).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
