Summary
無細胞再構成は、細胞骨格アセンブリを理解するための重要なツールであり、過去10年間の研究は、最小限の系におけるセプチンダイナミクスを研究するためのアプローチを確立した。ここでは、異なる膜コンテキストでセプチンアセンブリを観察するための3つの相補的な方法、すなわち平面二重層、球状支持体、およびロッド支持体を提示する。
Abstract
ほとんどの細胞は、基本的な細胞プロセスを実行するために、その形状を感知し、変化させることができます。多くの真核生物において、セプチン細胞骨格は、サイトカイン、分極成長、および遊走のような形状変化を調整する上で不可欠な構成要素である。セプチンは、多様な高次構造を形成するために集合するフィラメント形成タンパク質であり、多くの場合、原形質膜のさまざまな領域、特にミクロンスケールの正の曲率の領域に見られる。 インビボ でのセプチン集合のプロセスをモニタリングすることは、細胞における光学顕微鏡検査の限界、ならびに膜および細胞骨格要素の両方との相互作用の複雑さによって妨げられ、生体系におけるセプチン動態を定量化することを困難にしている。幸いなことに、過去10年間に、セプチンの集合を制御するメカニズムを高い空間的および時間的分解能で解剖するために、無細胞系でセプチン細胞骨格を再構成することにおいて大きな進歩があった。セプチン集合のコアステップには、セプチンヘテロオリゴマーの膜との会合および解離、フィラメントへの重合、およびフィラメント間の相互作用を介した高次構造の形成が含まれる。ここでは、異なるコンテキストでセプチンアセンブリを観察するための3つの方法、すなわち平面二重層、球状支持体、およびロッド支持を提示する。これらの方法は、集合のさまざまな段階におけるセプチンの生物物理学的パラメータを決定するために使用することができる:膜を結合する単一の八量体として、フィラメントとして、およびフィラメントの集合体として。これらのパラメータを曲率サンプリングおよび優先吸着の測定と組み合わせて使用し、曲率センシングがさまざまな長さおよび時間スケールでどのように動作するかを理解します。
Introduction
細胞の形状とその内部区画の多くは、それらを囲む脂質膜に依存しています。膜は粘弾性構造であり、タンパク質との相互作用、脂質選別、および作用する内的および外的力を介して変形して様々な形状を生成することができる1、2、3、4。これらの形状は、しばしば膜曲率の観点から記述される。細胞は、特定の膜曲率を優先的に組み立てることができる多様なタンパク質スイートを使用して、細胞輸送、サイトカイン、および遊走を含むプロセスに対する定義された時空間制御を保証する5,6。膜における細胞機構のダイナミクスは、時間と空間分解能と細胞の健康とのバランスをとることが困難であるため、観察することが著しく困難である。超解像技術はそのような構造の詳細なビューを提供することができますが、ほとんどの機械の組み立て/分解の時間スケールに適さない長い取得を必要とします。さらに、ネイティブ環境におけるこれらのアセンブリの分子の複雑さと、単一のコンポーネントが果たすことができる多数の役割により、最小限の再構成システムは分子の機能的能力を研究するための貴重なツールになります。
最小限の膜模倣体は、細胞外の膜特性およびタンパク質 - 膜相互作用を研究するために開発されている。膜模倣体は、リポソームまたは巨大な単層小胞などの自立脂質二重層から、支持脂質二重層(SLB)までさまざまである7、8、9、10。SLBは、下層の支持体に固定された生体模倣膜であり、典型的には、ガラス、マイカ、またはシリカ11、12から構成される。平面表面、球体、棒状体、さらには起伏のある基板またはマイクロパターン化された基質を含む様々な形状を使用して、凹面曲率と凸曲率の両方で同時にタンパク質膜相互作用をプローブすることができる1 3,14,15,16,17,18.二重層形成は、親水性表面への小胞吸着から始まり、続いて融合および破裂して連続的な二重層を形成する(図1)19。支持された二重層は、光および電子顕微鏡に特に適しており、細胞でしばしば達成可能なよりも優れた時間と空間分解能の両方を提供する。湾曲したSLBは、特に、著しい膜変形がない場合にタンパク質の曲率感度をプローブする魅力的な手段を提供し、自立系では分離が不可能な曲率センシングと曲率誘導を区別することができます。
セプチンは、正に湾曲した膜上に集合する能力でよく知られているフィラメント形成細胞骨格タンパク質のクラスである6,18,20。酵母における細胞周期の過程で、セプチンはリングに集合し、それぞれ芽の出現およびサイトカインに関連する砂時計および二重リング構造を形成するために再配列しなければならない21。プラチナレプリカ電子顕微鏡を使用して、さまざまな細胞周期段階22でセプチン構造を観察する美しい研究が行われてきましたが、酵母の光学顕微鏡を使用してセプチンアセンブリを経時的に観察することは、限られた空間分解能で満たされました。透過型電子顕微鏡(TEM)によって可視化された脂質単層を用いたセプチンに関する以前の研究は、環、束、およびガウゼ23などのいくつかの興味深いセプチン構造を再構成することができた。しかしながら、EM技術は、蛍光顕微鏡法とは異なり、その時間分解能において同様に制限される。セプチンアセンブリのマルチスケールプロセスの動力学パラメータをよりよく解決するために、我々は、膜形状、サンプル条件、およびイメージングモダリティを慎重に制御できる支持された膜模倣体に目を向けた。
ここで説明するプロトコルは、平面または湾曲したSLB、精製タンパク質、および顕微鏡技術の組み合わせを使用する。定量的蛍光共焦点顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)を使用して、様々な膜曲率へのバルクタンパク質結合の両方を測定し、ならびに単一分子の結合動態を測定した。さらに、このプロトコルは、異なる膜曲率上のタンパク質超微細構造を調べるために走査型電子顕微鏡(SEM)と共に使用されるように適合されている。これらのプロトコルの焦点はセプチン細胞骨格にありますが、プロトコルは簡単に変更して、読者が興味深いと感じるタンパク質の曲率感度を調べることができます。さらに、エンドサイトーシスや小胞性トラフィッキングなどの分野で働いている人は、これらの技術が多タンパク質複合体の曲率依存性アセンブリをプローブするのに有用であると感じるかもしれません。
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Protocol
注:支持された脂質二重層を形成するには、単分散の小さな単層小胞(SUV)の調製が必要です。SUV編成については、以前に公表されたプロトコル24 を参照してください。簡単に言えば、すべてのSUVは、氷水中で2分の休息期間が続く4分の超音波処理期間を介して70%の振幅で合計12分間のプローブ超音波処理によって形成されます。SUVソリューションは、サイズが十分に明確化され、単分散されていなければなりません。SUVのサイズ分布は、例えば、動的光散乱25によって測定することができる。
1. 平面脂質二重層
- スライドのプラズマ洗浄
注:プラズマ洗浄は、有機汚染物質を除去し、ガラスの親水性を高め、効率的な脂質吸着を保証します。次の手順は、使用するプラズマクリーナーとガラスカバースリップに応じて変更または最適化する必要があります。- プラズマクリーナーを酸素で5分間パージして、ラインとチャンバから空気を除去します。これは、プラズマクリーナーが稼働しているときに、ラインとチャンバに主に酸素があり、より一貫した二重層調製物を提供するためです。
- パージ中に、N2 やArなどの不活性ガスをマイクロカバースライドガラスの上に流して、ほこりや微粒子を除去します。
オプション:カバースライドガラスは、100%イソプロパノールとそれに続く水で両側を噴霧することによって洗浄することができる。イソプロパノール - 水洗浄を3倍繰り返してから、N2 流で乾燥させます。 - 乾いたカバーガラススライドをセラミッククレードルに配置します。カバースリップがチャンバの長い端と平行になるように、クレードルをプラズマチャンバの背面に配置します(これにより、プラズマ洗浄中に所定の位置に保たれます)。プラズマクリーナーを最大出力で酸素で15分間運転します。
- チャンバーの準備
注:ここで説明する方法は、プラスチックPCRチューブの自家製チャンバーを使用して反応量をサポートしますが、シリコーンウェルなどの他の低接着性材料も適している場合があります。- カミソリの刃またははさみを使用して、0.2 mL PCRチューブのつや消し部分のすぐ下のキャップを切り落とします(図2)。
- PCRチューブのリムをUV活性化接着剤で塗装し、チューブの内側を避けます。PCR チューブを接着して、プラズマ洗浄カバースリップの中央にそっと置きます。
注:チャンバー内の接着剤を避けるには、最小限の接着剤を使用してシールを取得し、チャンバーをぶつけたり邪魔したりすることなく、速やかにUVで処理してください。 - チャンバーを長波長UV光の下に5〜7分間置き、接着剤を硬化させる。
- 二重層形成
注:効率的な二重層形成のために、このステップでは単分散SUVを使用する必要があります。 表1 は、ストックおよび最終バッファー濃度を含む、二重層形成に使用されるすべてのバッファーのレシピを提供します。- 40 μLの担持脂質二重層バッファー(SLBB:300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; 表1)、ウェルに5 mM SUVを10 μL、および100 mM CaCl2を 1 μL入れた。チャンバーを左右に静かに振ってSUVを乱し、37°Cで20分間インキュベートします。
注:蒸発を制限するには、濡れた拭き取りで覆われたペトリ皿でインキュベートしてください。
- 40 μLの担持脂質二重層バッファー(SLBB:300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; 表1)、ウェルに5 mM SUVを10 μL、および100 mM CaCl2を 1 μL入れた。チャンバーを左右に静かに振ってSUVを乱し、37°Cで20分間インキュベートします。
- 余分な脂質を洗い流す
メモ: この手順は、余分な SUV を削除し、バッファ交換ステップとして機能します。洗濯中にピペットチップで二重層をこすらないことが非常に重要です。ガラスが露出すると、セプチンおよび他の多くのタンパク質が不可逆的に結合し、有効タンパク質濃度を低下させる。- インキュベーション後、二重層6xを150μLのSLBBですすぎ、泡を避けながら毎回混合するように上下にピペッティングします。
注: 反応ウェルに既に存在するバッファーおよび SUV の 50 μL に直接 150 μL を合計 200 μL 加えます。 - セプチンまたは選択した別のタンパク質とのインキュベーションを開始する準備ができたら、2層6xを150 μLの反応バッファー(RXN:33.3 mM KCl、50 mM HEPES、pH 7.4、1.4 mg/mL BSA、0.14% メチルセルロース、1 mM BME)で洗浄します。
注:最良の結果を得るには、反応バッファーを新鮮にし、泡を避けるために反応によく混合する際には十分に注意してください。 - 最後の洗浄ステップで、125 μL の反応バッファーを除去し、75 μL をウェルに残します。セプチン保存緩衝液(SSB:300 mM KCl、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM BME)で希釈した25 μLのセプチンを所望の濃度で加え、TIRF顕微鏡26により画像化した。
注:このアッセイを初めて設定する場合、または新しい脂質組成物を組み込む場合は、フォトブリーチング後の蛍光回収(FRAP)を使用して、脂質が表面上で自由に拡散していることを確認することをお勧めします。回収率は脂質組成によって異なり、自立系よりも本質的に低くなりますが、脂質は不動であってはなりません。
- インキュベーション後、二重層6xを150μLのSLBBですすぎ、泡を避けながら毎回混合するように上下にピペッティングします。
| サポートされている脂質二重層バッファー(SLBB) | ||
| 株式 | 容積 | 最終濃度 |
| 2 M KCl | 1.5 ミリリットル | 300 ミリワット |
| 1 M ヘーペス | 200 μL | 20 ミリリットル |
| 500 mM ミリグラム 2 | 20 μL | 1 ミリリットル |
| 水 | 8 mL | |
| 反応前バッファー (PRB) | ||
| 株式 | 容積 | 最終濃度 |
| 2 M KCl | 166 μL | 33.3 ミリ |
| 1 M ヘーペス | 500 μL | 50 ミリワット |
| 水 | 9.33 mL | |
| 反応バッファー | ||
| 株式 | 容積 | 最終濃度 |
| 2 M KCl | 166 μL | 33.3 ミリ |
| 1 M ヘーペス | 300 μL | 50 ミリワット |
| 10 ミリグラム/mL BSA | 1.39 mL | 1.39 ミリグラム/mLの |
| 1% メチルセルロース | 1.39 mL | 0.0014 |
| 水 | 10 mLまで | |
| ティッカー | 0.7 μL | 1 ミリリットル |
| セプチンストレージバッファ(SSB) | ||
| 株式 | 容積 | 最終濃度 |
| 2 M KCl | 1.5 ミリリットル | 300 ミリワット |
| 1 M ヘーペス | 500 μL | 50 ミリワット |
| 水 | 10 mLまで | |
| ティッカー | 0.7 μL | 1 ミリリットル |
表1:担持脂質二重層および反応の調製のための緩衝液成分。 緩衝液に組み込まれたストック溶液の量および各成分の最終濃度が示されている。SLBおよびPRBは室温で保存することができ、実験間で再利用することができる。反応緩衝液およびSSBは、実験ごとに新鮮にされる。
2. 球状担持脂質二重層
注:このプロトコルは、10%の密度で超純水に懸濁されたシリカミクロスフェアを使用しています。タンパク質集合の速度論的パラメータに関するいかなる研究においても、実験と曲率の間の全膜表面積を厳密に制御することが重要です。表2は、5mm2の総膜表面積を維持するためにビーズおよび緩衝液の補正体積を示す。このプロトコルは、以前に公開された方法8,18を拡張しています。
- 二重層形成
注:平面二重層に関しては、堅牢な二重層形成のために高品質のSUVを持つことが重要です。 表 2 に、10% 密度溶液からのビーズの体積と、ビーズ直径の範囲について 5 mm2 の最終表面積を得るために使用されるそれぞれの SLBB 体積を示します。- シリカミクロスフェア(ビーズとも呼ばれる)は、一緒に沈降して凝集する傾向があります。ビーズを混ぜてクラスターを分解するには、ボトルを15秒間ボルテックスし、1分間バス超音波処理し、再び15秒間ボルテックスします。
- 適切な容量のビーズ(表2)を、対応する容量のSLBBおよび10 μLの5 mM SUVと0.5 mLの低接着性微量遠心チューブで混合します。
- ビーズ - 脂質混合物を室温で1時間エンドオーバーエンドで揺動させる。沈降を防ぐために、このインキュベーションが回転子上で行われていることを確認してください。
- ペグ化カバースリップにチャンバーを準備する
注:平面二重層に関しては、プラスチックPCRチューブの自家製チャンバーを使用して反応量をサポートしますが、シリコーンウェルなどの他の低接着性材料も同様に機能します。- ビーズが揺れている間に、室温でペグ化カバースリップを解凍します。0.2 mL PCR チューブを切り取り、ステップ 1.2 の説明に従ってカバースリップに接着します。24 mm x 50 mm スライドの場合、最大 10 個のチャンバーを 1 つのスライドに収めることができます。
メモ: このプロトコルでは、事前に用意されている 24 mm x 50 mm のペグ化ガラスカバースリップを使用します。簡単に言えば、ガラスカバースリップは、アセトン、メタノール、および3 M KOH中の超音波処理によって徹底的に洗浄されます。カバースリップは、次いで、n−2−アミノエチル−3−アミノプロピルトリメトキシシランで官能化され、mPEGスクシンイミジル吉草酸塩に共有結合で連結される。完成したペグ化カバースリップは、-80°Cで真空シールされて保管されます。 同様のパッシベーションプロトコルについては、Gidi et al.27 の研究を参照してください。ここではペグ化ガラスカバースリップが推奨されていますが、BSA法やポリL-リジン法などの他の不動態化手段が効果的である可能性があります。
- ビーズが揺れている間に、室温でペグ化カバースリップを解凍します。0.2 mL PCR チューブを切り取り、ステップ 1.2 の説明に従ってカバースリップに接着します。24 mm x 50 mm スライドの場合、最大 10 個のチャンバーを 1 つのスライドに収めることができます。
- 余分な脂質を洗い流す
メモ: この手順は、余分な SUV を取り外し、バッファ交換を実行するために機能します。ビーズを前反応緩衝液(PRB:33.3 mM KCl、50 mM HEPES、pH 7.4)で合計4倍洗浄する。 表 3 に、ビーズ直径の範囲の RCF のスピン速度を示します。- 指定されたRCFでビーズを30秒間スピンします(表3)。複数のビーズサイズを使用する場合は、洗浄する時間になるまでビーズを揺らし続けます。
注:時間を節約するために、小さなビーズと同じスピンで大きなビーズを沈降させる価値はありません。これにより、ビーズが互いにくっつき、二重層の完全性が損なわれる可能性があります。 - 最初のスピンの後、50 μLの上清を取り除き、200 μLのPRBを加えます。2 番目と 3 番目のスピンの後、200 μL を取り出し、200 μL の PRB を追加します。4回目のスピンの後、200 μLを取り出し、220 μLのPRBを加えます。洗浄のたびに勢いよくピペットをピペットでつまむ。
メモ: 最終的な再懸濁量は、洗浄液とは異なります。脂質とのインキュベーション後にビーズをボルテックスしないでください、これは二重層に隙間を残すことができます。他のビーズサイズでの作業中、またはアッセイの他の部分をセットアップしている間の沈降を避けるには、ビーズ混合物をエンドオーバーエンド回転子に戻します。
- 指定されたRCFでビーズを30秒間スピンします(表3)。複数のビーズサイズを使用する場合は、洗浄する時間になるまでビーズを揺らし続けます。
- 反応の準備
注:この反応は、反応の全膜表面積を5 mm2 で保持し、100 mM KCl、50 mM HEPES、1 mg/mL BSA、0.1% メチルセルロース、および 1 mM BMEの最終反応条件を生成するように設計されています。- 複数のビーズサイズで競合アッセイを行う場合は、各ビーズサイズの等量を一緒に混合して1:1混合物を作ります。次いで、29 μLの所望のビーズ混合物(または単一のビーズ)を721 μLのRXN緩衝液と混合する。
注:ビーズの密集したクラスターを避けるために、各ステップでビーズをピペットと完全に混合することが重要です。これにより、より均一なビード分布と正確な総表面積が得られます。 - 75 μL の希釈ビーズと 25 μL の SSB で希釈したタンパク質をウェルに混合します。
注:著者らは通常、酵母セプチン複合体を1~50nMで画像化した。 - 定常状態でセプチンを測定する場合は、室温で1時間インキュベートし、その後、TIRF付近顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化します。
- 複数のビーズサイズで競合アッセイを行う場合は、各ビーズサイズの等量を一緒に混合して1:1混合物を作ります。次いで、29 μLの所望のビーズ混合物(または単一のビーズ)を721 μLのRXN緩衝液と混合する。
| ビーズ直径(μm) | よく混合されたビーズの体積(μL) | SLBバッファーの量(μL) | SUVの台数(μL) |
| 6.46 | 8.94 | 61.1 | 10 |
| 5.06 | 7 | 63 | 10 |
| 3.17 | 4.39 | 65.6 | 10 |
| 0.96 | 1.33 | 68.7 | 10 |
| 0.54 | 0.75 | 69.3 | 10 |
| 0.31 | 0.43 | 69.6 | 10 |
表2:ミクロスフェアの正規化された体積。 各ビーズサイズの等しい表面積を維持し、実験間で全膜表面積の一貫性を保つために、各ビーズサイズおよび総表面積を正規化した緩衝液の体積を計算した。
| ビーズ径(μm) | 沈降速度(RCF) |
| 0.31 | 4.5 |
| 0.54 | 4.5 |
| 0.96 | 2.3 |
| 3.17 | 0.8 |
| 5.06 | 0.3 |
表3:様々な直径の微小球の沈降速度。 各ビーズ直径について、示された最小沈降速度を、未結合リポソームを洗い流すためのビーズをペレット化するために使用した。
3. ロッド支持脂質二重層
注:ここで紹介する他のアッセイとは対照的に、ロッドアッセイでは、膜表面積全体を慎重に制御することはできません。実験間で量と体積は一貫している可能性がありますが、これは異なる長さと直径の棒をもたらすため、反応中の膜表面積全体を外挿することは困難です。したがって、これは単一の表面上の複数の曲率を有する曲率センシングを探索するための優れたアッセイであり、セプチン超構造を探索するのに有用であったが、速度論的測定には推奨されない。この方法は以前に報告され18 であり、ここで拡張されています。
- ガラスマイクロファイバーフィルターからのホウケイ酸ロッドの入手
- 42.5 mm グレードの GF/C ガラスマイクロファイバーフィルターを 1 枚ずつ細かく引き裂き、60 mL の 100% エタノールを入れた 100 mL ビーカーに入れます。溶液が不透明になるまで浴槽超音波処理する。これは、細かく細断されたフィルターでわずか20〜30分かかることがあります。
注:大きな塊を分割するために徹底的に超音波処理します。解離/不透明であればあるほど良いです。 - 溶液をフィルムで覆い、溶液を室温で一晩保存する。
- 42.5 mm グレードの GF/C ガラスマイクロファイバーフィルターを 1 枚ずつ細かく引き裂き、60 mL の 100% エタノールを入れた 100 mL ビーカーに入れます。溶液が不透明になるまで浴槽超音波処理する。これは、細かく細断されたフィルターでわずか20〜30分かかることがあります。
- ロッドに二重層を形成する
注:このステップは、この方法では総表面積を定量化することができないため、完全なロッドカバレッジを達成するために過剰な脂質で実行されます。- 翌日、エタノール溶液が落ち着きますので(ステップ3.1.2)、よく混ぜてから使用してください。10 μL のロッド溶液と 70 μL の SLBB を組み合わせます。
- ミニ遠心分離機で最高速度で30秒間スピンし、50μLの上清を除去します。さらに50μLのSLBBに再懸濁し、エタノールを希釈するために合計4回の洗浄のためにスピンを繰り返した。
メモ:ロッドサポートは、チューブの底部に固体ペレットを形成しません。彼らは代わりにチューブの側面に沿って塗りつぶされます。これにより、洗濯時に完全に保存することが難しくなります。このアッセイでは総表面積は制御されていないので、それらが乱れていれば問題ありません。 - 10 μL のよく混合されたロッド溶液を、50 μL の 5 mM SUV および 20 μL の SLBB と組み合わせます。室温で1時間インキュベートし、微小球上に二重層を形成するときのように端を端から端まで回転させる。
- 余分な脂質を洗い流す
- ステップ3.2.2と同様に、脂質ロッド溶液をミニ遠心分離機で最高速度で30秒間回転させ、膜被覆ロッドを溶液からペレット化します。
- 最初のスピンの後、50 μLの上清を取り除き、200 μLのPRBを加えます。2 番目と 3 番目のスピンの後、200 μL を取り出し、200 μL の PRB を追加します。4回目のスピン後、200 μLを取り出し、220 μLのPRBを加え、激しくピペットで混合した。
- 反応の準備
- 1.5 mL の微量遠心チューブで、721 μL の反応バッファーと 29 μL のロッド溶液を混合します。よく混ぜる。
- 0.2 mL PCR チューブで、75 μL のロッドを反応バッファーに入れ、25 μL のセプチンを SSB で希釈して所望の濃度で組み合わせます。室温で少なくとも1時間インキュベートする。
- 走査型電子顕微鏡の準備
- インキュベーション後、100 μLのセプチンロッド混合物を丸いPEGコーティングされた12 mmカバースリップ上に加え、閉じたペトリ皿中で室温で1時間インキュベートする。
- シャーレの底(10mLで十分です)に0.05 Mカコジル酸ナトリウム(NaCo)、pH 7.4の2.5%グルタルアルデヒドを30分間充填してサンプルを固定します。ガラスピペットで液体を吸引します。サンプルを 10 mL の 0.05 M NaCo で 5 分間インキュベートして洗浄し、合計 2 回の洗浄を繰り返します。
- 0.5% OsO4 カコジル酸緩衝液に 30 分間接尾辞を置き、次いで 0.05 M NaCo で 3 倍洗浄します (5 分/洗浄)。
- サンプルを1%タンニン酸で15分間インキュベートし、NaCo 3xで洗浄します。0.5%OsO4 中で15分間インキュベートし、NaCoで3倍洗浄します。
- エタノール濃度の増加を用いてサンプルを脱水する:30%EtOHを5分間、2倍;50%EtOHを5分間;75%EtOHを5分間;100%EtOHを5分間、2倍にした。さらに10分間のインキュベーションに従ってください。
- 転移液(ヘキサメチルジシラザン)中で3x(5分、10分、次いで5分)インキュベートする。
- 風乾させ、スパッタコーティングされるまでサンプルをデシケータに入れます。4nm層を金/パラジウム合金でスパッタコートし、走査型電子顕微鏡で画像化します。
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Representative Results
各SLBの調製に続いて、セプチンまたは目的のタンパク質を所望の支持体と共にインキュベートし、TIRFM、共焦点顕微鏡、またはSEMを介して画像化してもよい。ここで示した結果は、大腸菌17から組換え発現・精製したセプチンを用いた。平面SLBにTIRFMを使用すると、フィラメントの長さとその柔軟性を決定し、拡散係数を測定し、時間の経過とともにアセンブリを観察することができます28,29。最高品質の測定値を収集するためには、特に初めてそれらを調製するとき、または脂質組成を変更するときに、二重層の品質を確認することが最初に必要である。TIRFMによる二重層上のタンパク質分布の目視検査は、傷がついているか、または奇形である二重層の領域を特定するのに役立つ。タンパク質分布は均質であるべきであり(図3A)、二重層に穴や隙間があってはならない(図3B)。二重層の他の領域におけるタンパク質分布を変化させる可能性があるため、ほこりの汚染またはスライド処理からの汚れから形成される可能性のある穴のある膜を避けることが最善である。膜自体を視覚化するために、微量のローダミン-PEをSUVに組み込んで二重層を形成することができます。高品質の二重層では、フィールドも現れますが(画像は示されていません)、リポソームが古い場合や洗浄が十分に厳格でない場合、未破裂のリポソームや細管リポソームが表面に蓄積する可能性があります(図3C)。さらに、固体支持体は脂質8の自由拡散を妨げるが、脂質は不動であってはならない。FRAP実験は、平面二重層上の脂質の移動度を評価するために使用することができ、これは組成によって変化し得、30秒のオーダーで回復率を示すべきである。
球状支持体は、定義された曲率の膜上のタンパク質結合を単離して(1つの曲率で)または同じウェル内の複数の膜曲率で調べて、曲率間の競合を観察するために使用することができる6,18。ビーズ>1μm上の近TIRFMはまた、所与の領域27についての会合事象の数を測定するために使用され得る。平面二重層と同様に、ローダミン-PEを使用して、滑らかな二重層堆積(図4A)、すなわち、多層または非破裂リポソームを示す脂質凝集塊なし(図4B)、および二重層に隙間がない(図4C)。曲面上の総タンパク質吸着量またはタンパク質吸着量を経時的に測定するためには、個々のビーズを互いに単離して、合計脂質強度および合計セチン強度を測定できる離散的な体積を作成する必要がある。したがって、ビーズは図4Dのように一緒に凝集するのではなく、十分に分離されている必要があります。これらすべての潜在的な問題のトラブルシューティングオプションについては、ディスカッションセクションで説明します。
このSLBアッセイは、タンパク質が単一の表面上で複数の曲率をサンプリングするための環境を提供するロッド支持体にも適用できます。このアッセイを走査型電子顕微鏡と組み合わせることで、ユーザーはセプチン18 または他の目的のタンパク質の曲率選好、整列、および長さ分布を調べることができます。ここで提示する他のアッセイと同様であるが、ロッドアッセイは、濾紙に由来する基質の不均一性のために、全膜表面積の慎重な制御を可能にしない。ここで使用されるろ紙の材料特性は、異なる長さおよび直径のロッドをもたらす(図5A)。これは、曲面上のタンパク質の曲率センシングと組織化の探索に有用ですが(図5B)、膜に対するタンパク質の比率を制御することができないため、ロッドは飽和結合曲線の生成や結合定数などのパラメータの測定にはあまり役に立ちません。
図1:様々な曲率を有する支持体上の支持脂質二重層形成の概要。 SUVは、所定の膜でのサンプリングに利用可能な曲率を変更するために、異なる形状の固体支持体でインキュベートされる。SUVは固体支持体表面に吸着して破裂し、脂質二重層を生成する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:反応室設置の概略図カスタムチャンバーを準備するために、0.2 mL PCR チューブを、チューブがテーパリングし始める場所とキャップ(赤い破線)で切断します。次に、切断されたチューブの切断されていないリムをUV活性化接着剤(青色)の薄い層でコーティングし、カバースリップ上に接着剤を下ろす。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:平面二重層の代表的なTIRF顕微鏡写真(A)非重合性セプチンが結合した高品質の脂質二重層(75%DOPC、25%大豆PI)の代表的な画像(緑色)。タンパク質は特定の領域にクラスタリングしておらず、膜に付着したリポソームも穴もありません。(B)この二重層は、洗浄が不十分なガラスカバースリップで作られ、セプチンが少ない膜に「穴」(白い矢印)のように見えるものを示す。セプチンは、二重層のこれらの欠陥の端に混雑しているのを見ることができます(右側のズーム領域の白い矢印で示されています)。(C)微量ローダミン-PEを用いた低品質二重層の代表的な画像。非破裂リポソームおよび細管脂質は、表面に目に見える。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:脂質被覆ミクロスフェアの代表的な顕微鏡写真。 直径0.3 μm、0.5 μm、1 μm、3 μm、および 5 μm の脂質被覆ビーズ(75% DOPC、25% Soy PI、0.1% Rhodamine PE)を混合した競合アッセイの代表的な画像。すべての画像は最大 Z 投影です。(a)脂質被覆ミクロスフェアの高品質混合物の代表的な画像。球状の支持体は膜によって均一にコーティングされ、ビーズクラスターはほとんどありません。(b)膜コーティングの不均一な代表的な画像は、過剰な脂質の不十分な洗浄によって引き起こされる可能性が高い。(C)不適切な取り扱いにより膜被覆率に隙間(白矢印)があるビーズの代表画像。(d)密集したビーズの代表的な画像は、特に異なるビーズを一緒に組み合わせる場合、手順全体を通して不十分な混合によって引き起こされる可能性が高い。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)脂質被覆ロッド(75%DOPC、25%大豆PI、0.1%ローダミンPE)ロッドの長さおよび直径の分布を示すSEM画像。(B)正の曲率の軸に沿って整列したセプチンフィラメントを有する単離された膜被覆ロッドの縁。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細胞膜は、多くの異なる形状、曲率、および物理化学的特性を帯びる。細胞がマイクロメートルスケールのアセンブリを構築するナノメートルスケールの機械を研究するためには、膜模倣体の最小限の再構成システムを設計する必要がある。このプロトコルは、膜曲率と組成の両方を正確に制御する技術を提示しながら、広く利用可能な顕微鏡技術を使用して定量的な蛍光測定を簡単に行うことができます。
このプロトコルの最も重要な構成要素は、適切な表面にウェルを組み立て、脂質を処理することです。ここで説明するウェルは、PCRチューブとUV活性化接着剤を使用して手作りされています。組み立て中に反応領域の内部に接着剤が入らないことが重要です。これは、ウェルの端に沿ってイメージングし、カバーガラスへの高いタンパク質吸着量を探すことによって、実験中に確認することができます。ユーザーは、商業的に注文できるシリコーンなどのウェルに代替材料を使用することを選択できますが、提示された方法は、シフトまたは漏れず、より大きな反応量をサポートできる頑丈なウェルを提供します。私たちの手の中のカバーガラスの表面は、平面状の二重層を形成するために非常に重要でした。プラズマ洗浄時間またはカバーガラスのブランドの最適化は、適切な表面処理および電荷が小胞の吸着および融合に重要であるため、二重層の形成さえも見るために必要であり得る31、32、33。これらの実験を初めてセットアップする場合、または新しい脂質組成物を扱う場合、光退色後の蛍光回収(FRAP)実験を使用して、自立系30と比較して膜の流動性を評価するべきである。サポートシステムは、自立型のサポートシステムよりも流動的ではありませんが、不動ではないと予想されます12。
蛍光によって二重層の質を評価する場合、これらは局所的なタンパク質吸着を変化させる可能性があるため、破裂していないリポソームまたは二重層の欠陥を探すことが重要です(図3C)。次のトラブルシューティング オプションが考慮されます。a)SUVの準備を調整して、二重層の品質を向上させることができます。超音波処理、凍結融解、および押出は、脂質組成に基づいて容易さと成功が変化する可能性があるすべての一般的に使用される方法です。私たちの手では、単分散サイズ分布を持つ完全に明確にされたSUVソリューションは、最も均質な二重層をもたらします。動的光散乱(DLS)は、サイズ分布25を評価するために使用することができる。b)SUVの内部と外部バッファの塩分濃度の差を増やすことができます。内部イオン濃度を低下させる(または外部イオン濃度を増加させる)ことによって、SUVに対する浸透圧ストレスは、破裂31の可能性を増加させる。あるいは、存在する一価カチオンを変化させることは、SLB形成の動態を変化させ、新規脂質組成物34のSLBsの最適化を助け得る。c)洗濯の数や力を増やすことができます。著者の経験では、洗浄中の激しい混合はよりクリーンな二重層につながり、破壊的であるようには見えない。代わりに、最大の問題は、膜にガッシュとして現れるピペットチップで二重層を誤ってこすり落とすことから来ています。湾曲した二重層の場合、膜がガラスビーズから剪断される可能性があるため、特に大きな(>1μm)ビーズの場合、洗浄ステップを実行するときに、狭いピペットチップでの取り扱いを最小限に抑え、穏やかに混合することが最善です。球状膜二重層に持続的な隙間が観察される場合(図4C)、ビーズ溶液を完全に混合しながら、ピペットチップの幅を広げ(チップの端を切り取るか、広いチップを購入することによって)、取り扱いを可能な限り減らすことができます。この技術の一般的な技術的問題の1つは、ビーズが一緒に凝集する傾向です(図4D)。これは、二重層形成前の超音波処理時間を増加させることによって部分的に解決することができる。しかし、膜被覆ビーズもウェル内で時間の経過とともに一緒に凝集する傾向があるため、いくつかのクラスタリングは避けられない。凝集したビーズは、定量分析では避けるべきです。
平面二重層上の単一分子ダイナミクスの定量的測定の限界には、粒子を正確に追跡および計数するために低濃度にとどまる必要性が含まれる。しかしながら、これは、追跡35の間に目に見える粒子の数を減らすために、獲得中に目的のタンパク質を過小標識することによって修正することができる。さらに、球状および棒状SLBは、マイクロメートルスケールの膜上のタンパク質の曲率感度を定量化するために特別に開発され、ここで使用されるシリカ微小球は直径100nmまでしか入手できず、その時点で光学顕微鏡で見ると回折制限されたパンクタである。したがって、より小さな直径で正確な曲率特異性を評価しようとする人は、この方法を使用してそれを行うことはできません。ただし、この手法は、曲率選好の傾向に関する貴重な情報を提供し、曲率に依存するアセンブリの解剖を可能にします。
自立脂質二重層システムと比較して、この技術は広範囲の緩衝条件に順応性があり、調製中に慎重な浸透圧バランスを必要としません。さらに、ガラス支持体を使用するので、二重層はウェルの底に容易に沈み込み、テザリングの必要性、またはスクロースもしくは他の増粘剤36の使用を排除する。自立型脂質二重層系は、膜結合タンパク質による膜変形を調べる有用な手段を提供するが、膜曲率と複雑な集合体との関係を研究することは困難である。容易に変形可能な膜システムとは異なり、このアプローチは、ユーザが、膜のグローバル幾何学的形状を決定する個々の脂質種の固有の形状なしに、様々な脂質組成物を使用することができる。最後に、棒状のSLBは、目的のタンパク質について同じ連続膜上の複数の曲率のサンプリングを可能にし(図5B)、曲率依存アセンブリまたは複数の成分の共局在を評価するために一意に有益です。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(NIH)グラント番号によって支援されました。R01 GM-130934と国立科学財団(NSF)グラントMCB-2016022。B.N.C.、E.J.D.V.、K.S.C.は、国立総合医科学研究所からの助成金T32 GM119999の助成金によって部分的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22x22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
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