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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/64090
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill
* These authors contributed equally

Summary

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Abstract

La mayoría de las células pueden detectar y cambiar su forma para llevar a cabo procesos celulares fundamentales. En muchos eucariotas, el citoesqueleto de septina es un componente integral en la coordinación de cambios de forma como la citocinesis, el crecimiento polarizado y la migración. Las septinas son proteínas formadoras de filamentos que se ensamblan para formar diversas estructuras de orden superior y, en muchos casos, se encuentran en diferentes áreas de la membrana plasmática, especialmente en regiones de curvatura positiva a escala micrométrica. El monitoreo del proceso de ensamblaje de la septina in vivo se ve obstaculizado por las limitaciones de la microscopía de luz en las células, así como por la complejidad de las interacciones tanto con las membranas como con los elementos citoesqueléticos, lo que dificulta la cuantificación de la dinámica de la septina en los sistemas vivos. Afortunadamente, ha habido un progreso sustancial en la última década en la reconstitución del citoesqueleto de septina en un sistema libre de células para diseccionar los mecanismos que controlan el ensamblaje de la septina a altas resoluciones espaciales y temporales. Los pasos centrales del ensamblaje de la septina incluyen la asociación y disociación del heterooligómero de la septina con la membrana, la polimerización en filamentos y la formación de estructuras de orden superior a través de interacciones entre filamentos. Aquí, presentamos tres métodos para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla. Estos métodos se pueden utilizar para determinar los parámetros biofísicos de las septinas en diferentes etapas de ensamblaje: como octamperadores individuales que se unen a la membrana, como filamentos y como ensamblajes de filamentos. Utilizamos estos parámetros combinados con mediciones de muestreo de curvatura y adsorción preferencial para comprender cómo opera la detección de curvatura en una variedad de escalas de longitud y tiempo.

Introduction

Las formas de las células y muchos de sus compartimentos internos dependen de las membranas lipídicas que las rodean. Las membranas son estructuras viscoelásticas que pueden deformarse a través de interacciones con proteínas, clasificación de lípidos y fuerzas internas y externas que actúan para generar una variedad de formas 1,2,3,4. Estas formas a menudo se describen en términos de curvatura de la membrana. Las células utilizan un conjunto diverso de proteínas capaces de ensamblar preferentemente o "detectar" curvaturas de membrana particulares para garantizar un control espacio-temporal definido sobre procesos que incluyen tráfico celular, citocinesis y migración 5,6. La dinámica de la maquinaria celular en la membrana es notablemente difícil de observar debido a la dificultad de equilibrar el tiempo y la resolución espacial con la salud celular. Si bien las técnicas de superresolución pueden ofrecer una visión detallada de tales estructuras, requieren adquisiciones prolongadas que no son susceptibles a las escalas de tiempo de ensamblaje / desmontaje para la mayoría de la maquinaria. Además, la complejidad molecular de estos ensamblajes en su entorno nativo y la multitud de funciones que puede desempeñar un solo componente hacen que los sistemas de reconstitución mínima sean una herramienta valiosa para estudiar la capacidad funcional de las moléculas.

Se han desarrollado miméticos mínimos de membrana para estudiar las propiedades de la membrana y las interacciones proteína-membrana fuera de la célula. Los miméticos de membrana varían desde bicapas lipídicas independientes, como liposomas o vesículas unilamelares gigantes, hasta bicapas lipídicas soportadas (SLB)7,8,9,10. Los SLB son membranas biomiméticas ancladas al soporte subyacente, típicamente compuestas de vidrio, mica o sílice 11,12. Se puede utilizar una variedad de geometrías, incluidas superficies planas, esferas, varillas e incluso sustratos ondulados o micropatronados para sondear las interacciones proteína-membrana en curvaturas cóncavas y convexas simultáneamente1 3,14,15,16,17,18 . La formación de bicapa comienza con la adsorción de vesículas sobre una superficie hidrófila, seguida de fusión y ruptura para formar una bicapa continua (Figura 1)19. Las bicapas soportadas son particularmente susceptibles a la luz y la microscopía electrónica, proporcionando una mejor resolución temporal y espacial de lo que a menudo se puede lograr en las células. Los SLB curvos proporcionan especialmente un medio atractivo para sondear la sensibilidad a la curvatura de la proteína en ausencia de una deformación significativa de la membrana, lo que permite distinguir entre la detección de curvatura y la inducción de curvatura, que a menudo son imposibles de separar en sistemas independientes.

Las septinas son una clase de proteínas citoesqueléticas formadoras de filamentos bien conocidas por su capacidad de ensamblarse en membranas curvadas positivamente 6,18,20. En el transcurso del ciclo celular en la levadura, las septinas se ensamblan en un anillo y deben reorganizarse para formar las estructuras de reloj de arena y doble anillo asociadas con la aparición de brotes y la citocinesis, respectivamente21. Si bien se ha realizado un hermoso trabajo utilizando microscopía electrónica de réplica de platino para observar la arquitectura de la septina en diferentes etapas del ciclo celular22, observar el ensamblaje de la septina a lo largo del tiempo utilizando la microscopía de luz en la levadura se ha encontrado con una resolución espacial limitada. Trabajos previos sobre septinas utilizando monocapas lipídicas visualizadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) fueron capaces de reconstituir varias estructuras de septina interesantes como anillos, haces y gasas23. Sin embargo, las técnicas EM también están limitadas en su resolución temporal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia. Con el fin de resolver mejor los parámetros cinéticos del proceso multiescala de ensamblaje de septina, recurrimos a la mimética de membrana soportada, donde se puede controlar cuidadosamente la geometría de la membrana, las condiciones de la muestra y la modalidad de imagen.

Los protocolos descritos aquí utilizan SLB planos o curvos, proteína purificada y una combinación de técnicas de microscopía. La microscopía confocal de fluorescencia cuantitativa y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) se utilizaron para medir tanto la unión de proteínas a granel en varias curvaturas de membrana, como para medir la cinética de unión de moléculas individuales. Además, este protocolo ha sido adaptado para ser utilizado con microscopía electrónica de barrido (SEM) para examinar la ultraestructura de proteínas en diferentes curvaturas de membrana. Si bien el enfoque de estos protocolos está en el citoesqueleto de septina, los protocolos se pueden modificar fácilmente para investigar la sensibilidad a la curvatura de cualquier proteína que el lector encuentre interesante. Además, aquellos que trabajan en campos como la endocitosis o el tráfico vesicular pueden encontrar estas técnicas útiles para sondear los ensamblajes dependientes de la curvatura de complejos multiproteicos.

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Protocol

NOTA: La formación de bicapas lipídicas soportadas requiere la preparación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) monodispersadas. Consulte un protocolo24 publicado anteriormente sobre la formación de SUV. Brevemente, todos los SUV están formados por sonicación de sonda durante 12 minutos en total a una amplitud del 70% a través de períodos de sonicación de 4 minutos seguidos de períodos de descanso de 2 minutos en agua helada. Las soluciones SUV deben estar bien clarificadas y monodispersadas en tamaño. Las distribuciones de tamaño de los SUV se pueden medir, por ejemplo, mediante dispersión dinámica de luz25.

1. Bicapas lipídicas planas

  1. Limpieza por plasma de las diapositivas
    NOTA: La limpieza por plasma elimina los contaminantes orgánicos y aumenta la hidrofilicidad del vidrio, asegurando una adsorción lipídica eficiente. Los siguientes pasos pueden cambiar o necesitar ser optimizados dependiendo del limpiador de plasma y las cubiertas de vidrio utilizadas.
    1. Purgue el limpiador de plasma durante 5 minutos con oxígeno para eliminar el aire de las líneas y la cámara. Esto es para garantizar que, cuando se ejecuta el limpiador de plasma, haya principalmente oxígeno en las líneas y la cámara, proporcionando preparaciones bicapa más consistentes.
    2. Durante la purga, transmita un gas inerte, como N2 o Ar, sobre los portaobjetos de vidrio de la micro cubierta para eliminar el polvo y las partículas.
      OPCIONAL: Los portaobjetos de vidrio de la cubierta se pueden lavar rociando cada lado con 100% de isopropanol seguido de agua. Repita el lavado con agua de isopropanol 3x y luego séquelo con una corriente de N2 .
    3. Coloque los portaobjetos de vidrio de cubierta seca en una cuna de cerámica. Coloque la cuna en la parte posterior de la cámara de plasma de modo que las cubiertas estén paralelas con el borde largo de la cámara (esto las mantiene en su lugar durante la limpieza con plasma). Haga funcionar el limpiador de plasma durante 15 minutos con oxígeno a máxima potencia.
  2. Preparación de la cámara
    NOTA: El método descrito aquí utiliza cámaras caseras de tubos de PCR de plástico para soportar los volúmenes de reacción, pero otros materiales de baja adherencia, como los pozos de silicona, también pueden ser adecuados.
    1. Usando una cuchilla de afeitar o tijeras, corte la tapa justo debajo de la parte esmerilada de un tubo de PCR de 0,2 ml (Figura 2).
    2. Pintar el borde del tubo de PCR con adhesivo activado por UV, evitando el interior del tubo. Coloque suavemente el pegamento del tubo de PCR en el centro de una funda limpia con plasma.
      NOTA: Para evitar el pegamento dentro de la cámara, use la cantidad mínima de pegamento para obtener un sello y trátelo rápidamente con UV sin golpear o perturbar la cámara.
    3. Coloque la cámara bajo luz UV de longitud de onda larga durante 5-7 minutos para curar el adhesivo.
  3. Formación de bicapas
    NOTA: Los SUV monodispersados deben usarse en este paso para una formación eficiente de bicapas. La Tabla 1 proporciona recetas para todos los tampones utilizados en la formación de bicapa, incluidas las concentraciones de tampón stock y final.
    1. Añadir 40 μL de tampón bicapa lipídico soportado (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; Tabla 1), 10 μL de 5 mM DE SUVs, y 1 μL de 100 mM de CaCl2 al pozo. Agite suavemente las cámaras de lado a lado para interrumpir los SUV y luego incube a 37 ° C durante 20 minutos.
      NOTA: Para limitar la evaporación, incubar en una placa de Petri cubierta con una toallita húmeda.
  4. Eliminar el exceso de lípidos
    NOTA: Este paso elimina el exceso de SUV y actúa como un paso de intercambio de búfer. Es muy importante no raspar la bicapa con la punta de la pipeta durante el lavado; si el vidrio está expuesto, las setinas y muchas otras proteínas se unirán irreversiblemente, reduciendo la concentración efectiva de proteínas.
    1. Después de la incubación, enjuague la bicapa 6x con 150 μL de SLBB, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para mezclar cada vez mientras evita las burbujas.
      NOTA: Añadir 150 μL directamente a los 50 μL de tampón y SUV ya presentes para un total de 200 μL en el pozo de reacción.
    2. Cuando esté listo para comenzar a incubar con las septinas o una proteína diferente de su elección, lave la bicapa 6x con 150 μL de tampón de reacción (RXN: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1.4 mg / mL BSA, 0.14% metilcelulosa, 1 mM BME).
      NOTA: Para obtener los mejores resultados, haga que el tampón de reacción sea fresco y tenga mucho cuidado al mezclar bien la reacción para evitar burbujas.
    3. En el último paso de lavado, retire 125 μL de tampón de reacción, dejando 75 μL en el pozo. Añadir 25 μL de septinas diluidas en tampón de almacenamiento de septina (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) a la concentración deseada e imagen por microscopía TIRF26.
      NOTA: Al configurar este ensayo por primera vez o incorporar una nueva composición lipídica, es una buena práctica asegurarse de que los lípidos se difundan libremente en la superficie utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). Si bien la tasa de recuperación será diferente para diferentes composiciones de lípidos e inherentemente más baja que para los sistemas independientes, los lípidos no deben estar inmóviles.

Tampón bicapa lipídico compatible (SLBB)
Acción Volumen Concentración final
2 M KCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 200 μL 20 metros
500 mM MgCl2 20 μL 1 mM
Agua 8 ml
Búfer previo a la reacción (PRB)
Acción Volumen Concentración final
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 500 μL 50 metros
Agua 9,33 ml
Tampón de reacción
Acción Volumen Concentración final
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 300 μL 50 metros
10 mg/ml de BSA 1,39 ml 1,39 mg/ml
1% Metilcelulosa 1,39 ml 0.0014
Agua Hasta 10 ml
Bme 0,7 μL 1 mM
Búfer de almacenamiento de septina (SSB)
Acción Volumen Concentración final
2 M KCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 500 μL 50 metros
Agua Hasta 10 ml
Bme 0,7 μL 1 mM

Tabla 1: Componentes tampón para la preparación de la bicapa lipídica soportada y las reacciones. Se muestran los volúmenes de soluciones de stock que se incorporan a los tampones y las concentraciones finales de cada componente. SLB y PRB se pueden almacenar a temperatura ambiente y reutilizar entre experimentos. El tampón de reacción y el SSB se actualizan para cada experimento.

2. Bicapas lipídicas esféricas soportadas

NOTA: Este protocolo utiliza microesferas de sílice suspendidas en agua ultrapura al 10% de densidad. Para cualquier trabajo sobre los parámetros cinéticos del ensamblaje de proteínas, es importante controlar estrictamente el área de superficie total de la membrana entre los experimentos y las curvaturas. La Tabla 2 muestra los volúmenes corregidos de perlas y tampón para mantener 5 mm2 del área total de superficie de la membrana. Este protocolo amplía un método publicado anteriormente 8,18.

  1. Formación de bicapas
    NOTA: En cuanto a las bicapas planas, es importante tener SUV de alta calidad para una formación de bicapa robusta. La Tabla 2 enumera el volumen de perlas de una solución de densidad del 10% y sus respectivos volúmenes SLBB que se utilizan para obtener un área de superficie final de 5 mm2 para un rango de diámetros de perlas.
    1. Las microesferas de sílice (también conocidas como cuentas) tienden a asentarse y agruparse; para mezclar las cuentas y romper cualquier racimo, vórtice la botella durante 15 s, luego bañe el sonicato durante 1 minuto y el vórtice nuevamente durante 15 s.
    2. Mezclar el volumen apropiado de perlas (Tabla 2) con el volumen correspondiente de SLBB y 10 μL de SUV de 5 mM en un tubo de microcentrífuga de baja adherencia de 0,5 mL.
    3. Mece la mezcla de perlas y lípidos de extremo a extremo durante 1 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que esta incubación se realiza en un rotador para evitar la sedimentación.
  2. Preparar cámaras en cubiertas PEGylated
    NOTA: En cuanto a las bicapas planas, se utilizan cámaras caseras de tubos de PCR de plástico para soportar los volúmenes de reacción, pero otros materiales de baja adherencia, como los pozos de silicona, pueden funcionar igual de bien.
    1. Mientras las cuentas se balancean, descongele un cobertor PEGylated a temperatura ambiente. Corte un tubo de PCR de 0,2 ml y péguelo a la funda como se describe en el paso 1.2. Para diapositivas de 24 mm x 50 mm, hasta 10 cámaras pueden caber de manera factible en una diapositiva.
      NOTA: Este protocolo utiliza fundas de vidrio PEGiladas de 24 mm x 50 mm que se preparan con anticipación. Brevemente, las cubiertas de vidrio se limpian a fondo a través de la sonicación en acetona, metanol y 3 M KOH. Los tripslips se funcionalizan con n-2-aminoetil-3-aminopropiltrimetoxisilano y se unen covalentemente al valerato de succinimidil mPEG. Las cubiertas PEGylated terminadas se almacenan selladas al vacío a -80 °C. Para un protocolo de pasivación similar, véase el trabajo de Gidi et al.27. Si bien aquí se sugieren las cubiertas de vidrio PEGilado, otros medios de pasivación, como los métodos BSA o poli-L-lisina, pueden ser efectivos.
  3. Eliminar el exceso de lípidos
    NOTA: Este paso funciona para eliminar el exceso de SUV y realizar un intercambio de búfer. Las perlas se lavan 4 veces en total con tampón previo a la reacción (PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). La Tabla 3 enumera las velocidades de centrifugado en RCF para un rango de diámetros de perlas.
    1. Cuentas de espín en el RCF designado durante 30 s (Tabla 3). Si usa varios tamaños de cuentas, mantenga las cuentas balanceándose hasta que sea el momento de lavarlas.
      NOTA: No vale la pena sedimentar cuentas más grandes en el mismo espín que cuentas más pequeñas con la velocidad de sedimentación de cuentas más pequeña para ahorrar tiempo. Esto puede hacer que las cuentas se peguen entre sí y comprometan la integridad de la bicapa.
    2. Después del primer giro, retire 50 μL de sobrenadante y agregue 200 μL de PRB. Después del segundo y tercer giro, retire 200 μL y agregue 200 μL de PRB. Después del cuarto giro, retire 200 μL y agregue 220 μL de PRB. Pipete vigorosamente para cada lavado.
      NOTA: El volumen final de resuspensión es diferente al de los lavados. No vórtice las perlas después de la incubación con los lípidos, ya que esto puede dejar huecos en las bicapas. Para evitar la sedimentación mientras trabaja con los otros tamaños de perlas o configura otras partes del ensayo, coloque las mezclas de perlas de nuevo en el rotador de extremo a extremo.
  4. Preparación de la reacción
    NOTA: Esta reacción está diseñada para preservar el área total de superficie de la membrana de la reacción a 5 mm2 y para producir una condición de reacción final de 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg / mL BSA, 0.1% metilcelulosa y 1 mM BME.
    1. Si está haciendo un ensayo de competencia con múltiples tamaños de cuentas, haga una mezcla 1: 1 mezclando volúmenes iguales de cada tamaño de cuenta. Luego, mezcle 29 μL de la mezcla de cuentas deseada (o de una sola cuenta) con 721 μL de tampón RXN.
      NOTA: Es importante mezclar bien las cuentas en cada paso con una pipeta para evitar grupos densos de cuentas; esto dará como resultado una distribución de cuentas más uniforme y un área de superficie total precisa.
    2. Mezcle 75 μL de perlas diluidas y 25 μL de proteína diluida en SSB a los pocillos.
      NOTA: Los autores suelen obtener imágenes de complejos de septina de levadura a 1-50 nM.
    3. Si mide las septinas en un estado estacionario, incube a temperatura ambiente durante 1 h y luego tome una imagen mediante microscopía casi TIRF o confocal.
Diámetro de la perla (μm) Volumen de perlas bien mezcladas (μL) Volumen del búfer SLB (μL) Volumen de SUV (μL)
6.46 8.94 61.1 10
5.06 7 63 10
3.17 4.39 65.6 10
0.96 1.33 68.7 10
0.54 0.75 69.3 10
0.31 0.43 69.6 10

Tabla 2: Volúmenes normalizados de microesferas. Con el fin de mantener un área de superficie igual de cada tamaño de perla y para mantener el área de superficie total de la membrana consistente entre los experimentos, se calcularon los volúmenes para cada tamaño de cuenta y el amortiguador que normalizaron el área de superficie total.

Diámetro de la perla (μm) Velocidad de sedimentación (RCF)
0.31 4.5
0.54 4.5
0.96 2.3
3.17 0.8
5.06 0.3

Tabla 3: Velocidades de sedimentación para microesferas de diámetros variables. Para cada diámetro de perla, se utilizaron las velocidades mínimas de sedimentación mostradas para granular las perlas para eliminar los liposomas no unidos.

3. Bicapas lipídicas soportadas por varillas

NOTA: A diferencia de los otros ensayos presentados aquí, el ensayo de varilla no permite un control cuidadoso del área total de superficie de la membrana. Uno puede ser consistente en cantidades y volúmenes entre experimentos, pero debido a que esto resulta en varillas de diferentes longitudes y diámetros, es difícil extrapolar el área total de superficie de la membrana en la reacción. Por lo tanto, si bien este es un excelente ensayo para explorar la detección de curvatura con múltiples curvaturas en una sola superficie y ha sido útil para explorar la ultraestructura de la septina, no se recomienda para mediciones cinéticas. Este método fue reportado previamente18 y se está ampliando aquí.

  1. Obtención de varillas de borosilicato a partir de filtros de microfibra de vidrio
    1. Rasgue un solo filtro de microfibra de vidrio GF/C de 42,5 mm de grado en trozos pequeños y colóquelos en un vaso de precipitados de 100 ml con 60 ml de etanol al 100%. Baño-sonicado hasta que la solución se vuelva opaca; esto puede tomar tan poco como 20-30 minutos con un filtro finamente triturado.
      NOTA: Sonicar a fondo para romper grandes trozos; cuanto más disociado/opaco, mejor.
    2. Cubra la solución con una película y guárdela a temperatura ambiente durante la noche.
  2. Formación de bicapas en las varillas
    NOTA: Este paso se realiza con exceso de lípidos para lograr una cobertura completa de la varilla, ya que es imposible cuantificar el área de superficie total en este método.
    1. Al día siguiente, la solución de etanol se asentará (paso 3.1.2.), así que mézclela bien antes de usarla. Combine 10 μL de solución de varilla y 70 μL de SLBB.
    2. Girar a máxima velocidad en una mini centrífuga durante 30 s y retirar 50 μL del sobrenadante. Resuspend en otros 50 μL de SLBB y repita el centrifugado durante un total de cuatro lavados para diluir el etanol.
      NOTA: Los soportes de varilla no formarán un pellet sólido en la parte inferior del tubo. En cambio, se untan a lo largo del lado del tubo; esto hace que sean difíciles de conservar completamente al lavarse. Dado que el área de superficie total en este ensayo no está controlada, está bien si se alteran.
    3. Combine 10 μL de solución de varilla bien mezclada con 50 μL de SUV de 5 mM y 20 μL de SLBB. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente, girando de extremo a extremo como cuando se forman bicapas en las microesferas.
  3. Eliminar el exceso de lípidos
    1. Similar al paso 3.2.2., haga girar la solución de varilla lipídica a máxima velocidad en una mini centrífuga durante 30 s para granular las varillas recubiertas de membrana de la solución.
    2. Después del primer giro, retire 50 μL del sobrenadante y agregue 200 μL de PRB. Después del segundo y tercer giro, retire 200 μL y agregue 200 μL de PRB. Después del cuarto giro, retire 200 μL, agregue 220 μL de PRB y pipete vigorosamente para mezclar.
  4. Preparación de la reacción
    1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle 721 μL de tampón de reacción con 29 μL de solución de varilla. Mezclar bien.
    2. En un tubo de PCR de 0,2 ml, combine 75 μL de varillas en tampón de reacción y 25 μL de septinas a la concentración deseada, diluidas en SSB. Deje que se incube a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
  5. Preparación para la microscopía electrónica de barrido
    1. Después de la incubación, agregue la mezcla de varilla de septina de 100 μL en un recubierto de 12 mm redondo con PEG e incube a temperatura ambiente durante 1 h en una placa de Petri cerrada.
    2. Fije la muestra llenando el fondo de la placa de Petri (10 ml debería ser suficiente) con glutaraldehído al 2,5% en 0,05 M de cacodilato de sodio (NaCo), pH 7,4, durante 30 min. Aspire el líquido con una pipeta de vidrio. Lavar la muestra incubándola con 10 mL de 0,05 M de NaCo durante 5 min y repetir para un total de dos lavados.
    3. Postfix en tampón de cacodilato OsO4 al 0,5% durante 30 min, y luego lavar 3x en 0,05 M NaCo (5 min/lavado).
    4. Incubar la muestra con ácido tánico al 1% durante 15 min, y luego lavar en NaCo 3x. Incubar durante 15 min en OsO4 al 0,5% y lavar 3x con NaCo.
    5. Deshidratar las muestras utilizando concentraciones crecientes de etanol: 30% EtOH durante 5 min, 2x; 50% EtOH durante 5 min; 75% EtOH durante 5 min; y 100% EtOH durante 5 min, 2x. Siga con otra incubación de 10 minutos.
    6. Incubar en líquido de transición (hexametildisilazano) 3x (5 min, 10 min, luego 5 min).
    7. Deje secar al aire, luego coloque las muestras en un desecador hasta que se rocíen. Recubrir la capa de 4 nm con una aleación de oro / paladio y luego obtener una imagen en un microscopio electrónico de barrido.

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Representative Results

Después de la preparación de cada SLB, las septinas o la proteína de interés pueden incubarse con el soporte deseado y obtener imágenes a través de TIRFM, microscopía confocal o SEM. Los resultados que se muestran aquí utilizan septinas expresadas y purificadas recombinantemente a partir de E. coli17. Utilizando TIRFM en SLB planos, es posible determinar la longitud de los filamentos y su flexibilidad, medir los coeficientes de difusión y observar el ensamblaje a lo largo del tiempo28,29. Para recopilar las mediciones de la más alta calidad, primero es necesario determinar la calidad de las bicapas, especialmente cuando se preparan por primera vez o cuando se cambian las composiciones lipídicas. Una inspección visual de la distribución de proteínas en las bicapas por TIRFM puede ayudar a identificar regiones de la bicapa que han sido rayadas o están mal formadas. La distribución de proteínas debe ser homogénea (Figura 3A), y no debe haber agujeros o huecos en la bicapa (Figura 3B). Es mejor evitar las membranas con agujeros, que pueden formarse por contaminación por polvo o manchas por el manejo de deslizamientos, ya que esto puede cambiar la distribución de proteínas en otras áreas de la bicapa. Para visualizar la membrana en sí, se pueden incorporar trazas de rodamina-PE en LOS SUV para la formación de bicapas. En las bicapas de alta calidad, el campo aparecerá uniforme (imágenes no mostradas), pero si los liposomas son viejos o si los lavados no son lo suficientemente estrictos, los liposomas desahogados y tubulados pueden acumularse en la superficie (Figura 3C). Además, mientras que los soportes sólidos dificultarán la difusión libre de lípidos8, los lípidos no deben estar inmóviles. Los experimentos FRAP se pueden utilizar para evaluar la movilidad de los lípidos en bicapas planas, que pueden variar según la composición y deben mostrar tasas de recuperación del orden de los segundos30.

Los soportes esféricos se pueden utilizar para examinar la unión a proteínas en membranas de curvaturas definidas, ya sea de forma aislada (una curvatura) o con varias curvaturas de membrana en el mismo pozo para observar la competencia entre curvaturas 6,18. El TIRFM cercano en perlas > 1 μm también se puede utilizar para medir el número de eventos de asociación para un área determinada27. Al igual que con las bicapas planas, utilizamos rodamina-PE para buscar una deposición suave de la bicapa (Figura 4A), es decir, sin grupos de lípidos, que indican liposomas multilamelaridad o desatrasura (Figura 4B), y sin huecos en la bicapa (Figura 4C). Para medir la adsorción total de proteínas o la adsorción de proteínas a lo largo del tiempo en superficies curvas, es necesario aislar perlas individuales entre sí para crear un volumen discreto para el cual se pueda medir la intensidad lipídica y la intensidad de la septina. Por lo tanto, las cuentas deben estar bien separadas en lugar de agruparse como en la Figura 4D. Abordamos las opciones de solución de problemas para todos estos problemas potenciales en la sección de discusión.

Este ensayo SLB también se puede aplicar a soportes de varilla, que ofrecen un entorno para que las proteínas muestreen múltiples curvaturas en una sola superficie. El emparejamiento de este ensayo con la microscopía electrónica de barrido permite al usuario examinar la preferencia de curvatura, la alineación y la distribución de longitud de las septinas18 u otras proteínas de interés. Si bien es similar a los otros ensayos presentados aquí, el ensayo de varilla no permite un control cuidadoso del área total de superficie de la membrana debido a la naturaleza heterogénea del sustrato que se deriva del papel de filtro. Las propiedades del material del papel de filtro utilizado aquí dan como resultado varillas de diferentes longitudes y diámetros (Figura 5A); esto es útil para explorar la detección y organización de la curvatura de proteínas en superficies curvas (Figura 5B), pero debido a que la relación entre la proteína y la membrana no se puede controlar, las varillas son de utilidad limitada para generar curvas de unión a la saturación o medir parámetros como las constantes de unión.

Figure 1
Figura 1: Descripción general de la formación de bicapas lipídicas soportadas en soportes con varias curvaturas. Los SUV se incuban con soportes sólidos de diferentes geometrías para cambiar las curvaturas disponibles para el muestreo en una membrana determinada. Los SUV se adsorben en la superficie de soporte sólido y se rompen para crear bicapas lipídicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema de configuración de la cámara de reacción. Para preparar cámaras personalizadas, se corta un tubo pcr de 0,2 ml donde el tubo comienza a disminuir y en la tapa (líneas discontinuas rojas). El borde sin cortar del tubo cortado se recubre con una capa delgada de pegamento activado por UV (azul) y se coloca pegamento hacia abajo en una cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Micrografías TIRF representativas de bicapas planas. (A) Una imagen representativa de una bicapa lipídica de alta calidad (75% DOPC, 25% Soy PI) con septinas no polimerizables unidas (verde). La proteína no se agrupa en ninguna región específica, y no hay liposomas unidos a la membrana ni agujeros. (B) Esta bicapa fue hecha con cubiertas de vidrio mal limpias y exhibe lo que parecen ser "agujeros" (flechas blancas) en la membrana donde hay menos septinas. Las septinas se pueden ver apiñadas en los bordes de estos defectos en la bicapa (denotadas por las flechas blancas en la región ampliada a la derecha). (C) Una imagen representativa de una bicapa de baja calidad utilizando trazas de rodamina-PE. Los liposomas sin brotar y los lípidos tubulados son visibles en la superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Micrografías representativas de microesferas recubiertas de lípidos. Se mezclaron imágenes representativas de ensayos de competencia donde se mezclaron perlas recubiertas de lípidos (75% DOPC, 25% Soy PI, 0.1% Rhodamine PE) con diámetros de 0.3 μm, 0.5 μm, 1 μm, 3 μm y 5 μm. Todas las imágenes son proyecciones Z máximas. (A) Imagen representativa de una mezcla de alta calidad de microesferas recubiertas de lípidos. Los soportes esféricos están recubiertos uniformemente por la membrana, y hay pocos grupos de cuentas. (B) Imagen representativa del recubrimiento desigual de la membrana, probablemente causado por un lavado insuficiente del exceso de lípidos. (C) Imagen representativa de cuentas con huecos en la cobertura de la membrana (flechas blancas) debido a un manejo inadecuado. (D) Imagen representativa de cuentas densamente agrupadas, probablemente causada por una mezcla insuficiente durante todo el procedimiento, especialmente cuando se combinan las diferentes cuentas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Micrografías electrónicas representativas de varillas recubiertas de lípidos y septina. (A) Imagen SEM que muestra la distribución de longitudes y diámetros de varillas recubiertas de lípidos (75% DOPC, 25% Soy PI, 0.1% Rhodamine PE). (B) El borde de una varilla aislada recubierta de membrana con filamentos de septina alineados a lo largo del eje de curvatura positiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las membranas celulares adquieren muchas formas, curvaturas y propiedades fisicoquímicas diferentes. Para estudiar la maquinaria a escala nanométrica a través de la cual las células construyen ensamblajes a escala micrométrica, es necesario diseñar sistemas de reconstitución mínimos de mimética de membrana. Este protocolo presenta técnicas que controlan con precisión tanto la curvatura como la composición de la membrana, al tiempo que permiten al usuario tomar fácilmente mediciones cuantitativas de fluorescencia utilizando técnicas de microscopía ampliamente disponibles.

Los componentes más críticos de este protocolo son el montaje de pozos en la superficie adecuada y el manejo de los lípidos. Los pozos aquí descritos están hechos a mano con tubos de PCR y adhesivos activados por UV; es importante no obtener pegamento dentro del área de reacción durante el montaje. Esto se puede verificar durante el experimento mediante imágenes a lo largo de los bordes del pozo y buscando una alta adsorción de proteínas en el vidrio de la cubierta. El usuario puede optar por utilizar materiales alternativos para los pozos, como la silicona, que se puede pedir comercialmente, pero el método presentado proporciona pozos resistentes que no se desplazarán ni tendrán fugas y pueden soportar mayores volúmenes de reacción. La superficie del vidrio de la cubierta, en nuestras manos, ha sido muy importante para formar bicapas planas. La optimización de los tiempos de limpieza por plasma o incluso la marca del vidrio de la cubierta puede ser necesaria para ver la formación uniforme de las bicapas, ya que el tratamiento de la superficie y la carga adecuados son críticos para la adsorción y fusión de vesículas 31,32,33. Al establecer estos experimentos por primera vez o trabajar con nuevas composiciones lipídicas, se deben utilizar experimentos de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) para evaluar la fluidez de la membrana en comparación con los sistemas independientes30. Se espera que los sistemas de apoyo sean menos fluidos que sus homólogos independientes, pero noinmóviles 12.

Al evaluar la calidad de la bicapa por fluorescencia, es importante buscar liposomas o defectos en la bicapa (Figura 3C), ya que pueden alterar la adsorción local de proteínas. Se pueden considerar las siguientes opciones de solución de problemas. a) Se puede ajustar la preparación del SUV para mejorar la calidad de la bicapa. La sonicación, la congelación-descongelación y la extrusión son métodos de uso común que pueden variar en facilidad y éxito según las composiciones lipídicas. En nuestras manos, una solución SUV totalmente clarificada con una distribución de tamaño monodispersada da como resultado las bicapas más homogéneas. La dispersión dinámica de la luz (DLS) se puede utilizar para evaluar la distribución del tamaño25. b) Se puede aumentar la diferencia en la concentración de sal entre el interior de los SUV y el tampón externo. Al reducir la concentración de iones internos (o aumentar la externa), el estrés osmótico en los SUV aumenta la probabilidad de ruptura31. Alternativamente, la alteración del catión monovalente presente puede cambiar la cinética de la formación de SLB y ayudar a optimizar los SLB de nuevas composiciones lipídicas34. c) Se puede aumentar el número o la fuerza de los lavados. En la experiencia de los autores, la mezcla vigorosa durante los lavados conduce a bicapas más limpias y no parece ser perjudicial; en cambio, el mayor problema proviene de raspar accidentalmente la bicapa con puntas de pipeta, que aparecerán como una herida en la membrana. Para las bicapas curvas, es mejor minimizar el manejo con puntas de pipeta estrechas y mezclar suavemente al realizar los pasos de lavado, especialmente para perlas más grandes (>1 μm), ya que la membrana puede cortarse a partir de las perlas de vidrio. Si se observan huecos persistentes en las bicapas de membrana esférica (Figura 4C), aumentar el ancho de las puntas de la pipeta (cortando el extremo de la punta o comprando puntas anchas) y reduciendo el manejo tanto como sea posible, sin dejar de mezclar completamente las soluciones de perlas, puede ayudar. Un problema técnico común con esta técnica es la tendencia de las cuentas a agruparse (Figura 4D). Esto se puede resolver parcialmente aumentando el tiempo de sonicación antes de la formación de la bicapa; sin embargo, algunos grupos son inevitables, ya que las perlas recubiertas de membrana también pueden tender a agruparse con el tiempo en el pozo. Las cuentas agrupadas deben evitarse para los análisis cuantitativos.

Las limitaciones a las mediciones cuantitativas de la dinámica de una sola molécula en bicapas planas incluyen la necesidad de permanecer en bajas concentraciones para rastrear y contar con precisión las partículas. Sin embargo, esto se puede rectificar mediante el etiquetado de la proteína de interés durante la adquisición para reducir el número de partículas visibles durante el seguimiento35. Además, los SLB esféricos y de varilla se desarrollaron específicamente para cuantificar la sensibilidad a la curvatura de las proteínas en membranas a escala micrométrica, y las microesferas de sílice utilizadas aquí solo están disponibles hasta 100 nm de diámetro, momento en el que son puntillas limitadas por difracción cuando se ven por microscopía de luz. Por lo tanto, aquellos que buscan evaluar la especificidad precisa de la curvatura en diámetros más pequeños no podrán hacerlo utilizando este método. Sin embargo, esta técnica aún proporcionará información valiosa sobre la tendencia de la preferencia de curvatura y permitirá la disección de ensamblajes dependientes de la curvatura.

En comparación con los sistemas de bicapa lipídica independientes, esta técnica es susceptible a una amplia gama de condiciones tampón y no requiere un cuidadoso equilibrio osmótico durante la preparación. Además, debido a que utiliza soportes de vidrio, las bicapas se hunden fácilmente en el fondo del pozo, eliminando la necesidad de amarre o el uso de sacarosa u otros agentes espesantes36. Si bien los sistemas de bicapa lipídica independiente proporcionan un medio útil para investigar la deformación de la membrana por proteínas de unión a la membrana, es difícil estudiar la relación entre la curvatura de la membrana y el ensamblaje complejo. A diferencia de los sistemas de membrana fácilmente deformables, este enfoque permite al usuario utilizar una variedad de composiciones lipídicas sin la forma intrínseca de las especies de lípidos individuales que dictan la geometría global de la membrana. Por último, los SLB en forma de varilla permiten el muestreo de múltiples curvaturas en la misma membrana continua para proteínas de interés (Figura 5B), lo que es excepcionalmente informativo para evaluar ensamblajes dependientes de la curvatura o la colocalización de múltiples componentes.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención no. R01 GM-130934 y National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. y K.S.C. fueron apoyados en parte por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales bajo el premio T32 GM119999.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural Watson 137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes USA Scientific 1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips Thermo Scientific 152450 Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
Egg Liss Rhodamine PE Avanti Polar Lipids 810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade VWR 16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer VWR 11652
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-223EA
HEPES Sigma Aldrich H3375-1KG
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191
Magnesium chloride VWR 7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers Matsunami Discontinued 22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres Bangs Laboratories, Inc. Depends on size: SS0200*-SS0500* Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive Norland Thorlabs NOA 68 Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide Millipore Sigma 20816-12-0
Parafilm VWR 52858-000
Plasma Cleaner Plasma Etch PE-25 Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride VWR 0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm   VWR 64-0712
Sonicator bath Branson 1510R-MT Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI Avanti Polar Lipids 840044
Tabletop centrifuge Eppendorf 22331
UV Lamp Spectroline ENF-260C 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper VWR 28455-030 42.5 mm diameter, Grade GF/C

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References

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Bioquímica Número 185
Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas
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Curtis, B. N., Vogt, E. J. D., Cannon, K. S., Gladfelter, A. S. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (185), e64090, doi:10.3791/64090 (2022).

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