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Genetics

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64091
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Abstract

모델 유기체로서의 Caenorhabditis elegans의 발견과 개발은 생물학, 특히 노화 분야에서 영향을 미쳤습니다. 많은 역사적, 현대적 연구에서는 유전자 돌연변이, 트랜스제닉 유전자 발현, 스트레스에 대한 유익하고 낮은 등급의 노출인 hormesis를 포함한 수천 가지의 수명을 변화시키는 패러다임을 확인했습니다. 짧은 수명, 쉽고 저렴한 유지 보수, 모든 인간 유전자의 거의 삼분의 일에 대한 상동성을 가진 완전히 서열화 된 게놈을 포함한 많은 장점을 통해 C. elegans 는 스트레스 및 노화 생물학을위한 뛰어난 모델로 빠르게 채택되었습니다. 여기에서는 거의 모든 연구 환경, 특히 장비 및 자금이 제한된 연구 환경에 쉽게 적용 할 수있는 수명과 건강 상태를 측정하기 위해 몇 가지 표준화 된 방법이 조사됩니다. C. elegans 의 놀라운 유용성은 광범위한 인프라의 필요없이 노화 생물학에서 강력한 유전 분석을 수행 할 수있는 능력을 강조합니다. 마지막으로, 각 분석의 한계와 대안적인 접근법이 고려를 위해 논의된다.

Introduction

1974 년 시드니 브레너 (Sydney Brenner)가 가장 영향력있는 기사 중 하나 인 'Caenorhabditis elegans의 유전학'이 출판 된 이래로,이 현미경 웜은 생물학적 신비를 연구하는 뛰어난 모델 시스템으로 간주되어 왔습니다1. 1977년, 마이클 R. 클라스는 C. 엘레간스의 수명을 측정하는 방법을 발표하고 노화를 연구하기 위해 이 모델 시스템을 확립했다 2. 스트레스와 장수의 관계를 이해하기위한 조사는 1 세 유전자의 단일 돌연변이를 확인함으로써 시작되었으며, 이로 인해 C. elegans3의 수명 연장이 이루어졌습니다. 또한, 현대 연구는 스트레스에 대한 저항력을 증가시키는 오래 살았던 돌연변이 웜을 밝혀 낸 다른 수명을 증가시키는 돌연변이를 밝혀 냈습니다 4,5,6. 짧은 수명, 쉬운 유지, 모든 인간 질병 유발 유전자의 약 삼분의 일과의 상동성을 포함하는 완전히 서열화 된 게놈, RNA 간섭 (RNAi) 라이브러리의 가용성 및 용이성, 인간과의 생리적 유사성 7,8,9을 포함한 많은 장점을 통해 C. elegans는 스트레스 및 노화 생물학을위한 뛰어난 모델로 빠르게 채택되었습니다.

아마도 C. elegans의 가장 큰 유용성은 매우 낮은 유지 보수 비용, 실험 용이성 및 연구에 사용할 수있는 다양한 유전 도구입니다. C. 엘레간은 전형적으로 대장균 식품 공급원을 갖는 고체 한천 배지 상에서 성장한다. 일반적으로 사용되는 두 가지 대장균 균주는 표준 OP50, 아마도 가장 일반적으로 사용되는 B 균주 10 및 RNAi 실험 11,12 에 주로 사용되는K-12 균주HT115입니다. HT115 K-12 균주는 RNAi 방법에 필수적인 돌연변이인 RNAIII RNase에서 결실을 운반하며, 여기서 개별 C. 엘레간 유전자에 상응하는 dsRNA를 발현하는 플라스미드가 사용된다. dsRNA 공급 벡터는 이러한 플라스미드를 운반하는 박테리아가 선충류에 직접 공급될 수 있기 때문에 복잡한 교차 또는 게놈 편집 없이도 C. elegans 유전자의 강력한 녹다운을 허용합니다. 이러한 박테리아 RNAi 벡터의 수천은 HT115 배경에 존재하며, 여기에는 >19,000개의 개별 RNAi 구축물(13)을 갖는 가장 인기 있는 Vidal RNAi 라이브러리와 16,757개의 RNAi 구축물(14)이 있는 Ahringer RNAi 라이브러리가 포함된다. 그러나 OP50 및 HT115 박테리아 식단은 비타민 B1215,16의 차이를 포함하여 대사 프로파일에 큰 차이가 있습니다. 따라서 가능한 경우 단일 박테리아 공급원에 대한 모든 실험을 수행하여 앞서 설명한17,18,19와 같이 여러 가지 교란 요인을 도입 할 수있는 유전자 - 다이어트 상호 작용을 피하는 것이 좋습니다. 그것의 용이성으로 인해, 동물은 여기에 설명된 모든 실험 조건에 대해 OP50 상에서 유지되지만, 모든 실험은 앞서 설명된 바와 같이 HT115 상에서 수행된다20. 간략하게, 동물은 OP50에서 유지되고 RNAi 대 RNAi 실험 사이의 일관성을 위해 동기화 후 (표백 후) HT115로 옮겨진다. 대안적으로, 대장균 K12 HT115 균주에서 발견되는 RNAIII RNase의 유사한 결실을 운반하는 RNAi-적격 OP50 균주도 또한 사용될 수 있다(21).

아마도 C. elegans의 RNAi 실험에 대한 한 가지 주요 한계는 녹다운 효율성에 대한 우려입니다. 녹다운 효율은 qPCR 또는 웨스턴 블롯팅을 통해 검증할 수 있지만, 고가의 장비와 시약이 필요하며 대량 분석으로 제한됩니다. 이것은 RNAi에 불응성 (덜 민감한) 뉴런과 같은 특정 세포를 보는 것이 훨씬 더 우려됩니다. 특정 세포에서의 RNAi 효율은 dsRNA 흡수22에 필수적인 막횡단 단백질인 SID-1의 과발현을 통해 향상될 수 있지만, 이것은 여전히 이들 구축물에 사용되는 프로모터의 세포 유형-특이적 발현 패턴에 제한되며, 따라서 유전자 녹아웃 및 돌연변이는 유전자 기능을 고갈시키는 가장 확실한 수단이다. RNAi 매개 녹다운 외에도 C. elegans는 CRISPR 기반 전략 23,24,25 및 미세 주사를 통한 트랜스제닉 구축물 과발현을 통한 게놈 편집에 매우 적합하며, 조사 또는 트랜스포존 기반 통합을 통해 트랜스제닉 구축물을 통합할 수 있는 옵션 26,27,28,29 . 그러나 이러한 방법은 값 비싼 미세 주입 장비를 필요로하며, 가이드 RNA 또는 Cas9 효소의 높은 비용은 제한된 자금을 가진 기관에서 이러한 방법을 금지 할 수 있습니다. 대신, 수천 개의 트랜스제닉 라인과 돌연변이체는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)와 National Bioresource Project (NBRP)에서 몇 달러에 쉽게 구할 수 있습니다. NBRP는 공개되고 따라서 검증 된 돌연변이 균주, 파일럿 프로젝트에서 파생 된 돌연변이 및 아직 특성화되지 않은 돌연변이를 포함하여 많은 수의 C. elegans 유전자에 대해 분리 된 돌연변이를 제공합니다. 대조적으로, CGC는 연구 공동체에서 주로 출판되고 확립 된 C. elegans 라인의 보관소입니다. 둘 다 매우 합리적인 가격으로 전 세계적으로 균주를 운송하고 사내에서 균주를 합성 할 수있는 능력이 제한된 사람들에게 다양한 옵션을 제공합니다.

여기에서는 C. elegans의 수명과 건강 범위를 분석하기위한 가장 낮은 비용 방법 일 수있는 선별 된 방법 모음이 제공됩니다. 여기에 제시된 모든 방법은 저가의 장비와 소모품이 필요하며 CGC에서 쉽게 구할 수있는 균주 만 활용합니다. 아마도 C. elegans의 장수 및 생존 분석에서 가장 금지 된 것은 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트의 비용입니다. C. elegans는 hermaphrodite이고 자기 수정이기 때문에, 표준 생존 분석은 성인 동물이 자손의 오염을 피하기 위해 자손으로부터 지속적으로 멀리 이동하도록 요구합니다. 이 공정은 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 단일 수명 분석을 실행하기 위해 조건당 약 100개의 플레이트가 필요하기 때문에 비용이 많이 들 수 있습니다. 여기에서, 두 가지 대안이 제공된다: 온도-민감성 생식계열이 없는 돌연변이체, glp-4(bn2)의 활용, 또는 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUDR)을 이용한 화학적 멸균. glp-4는 발릴아미노아실 tRNA 신테타제를 코딩하고, 온도-민감성 glp-4(bn2)는 단백질 번역30,31 감소로 인해 제한적인 온도에서 생식적으로 결핍된다. FUDR은 DNA 복제를 방지하여 C. elegans를 화학적으로 살균하여 재생32를 억제하는 강력한 방법입니다. FUDR은 일부 실험실에서 엄청나게 비쌀 수 있지만 웜을 화학적으로 살균하는 데 소량 만 필요하며 분말 형태의 안정성으로 인해 대부분의 그룹에서 실현 가능할 수 있습니다. 온도에 민감한 glp-4 (bn2) 돌연변이를 활용하는 것은 동물을 제한적인 25 °C로 이동시키는 인큐베이터이기 때문에 확실히 가장 저렴한 옵션입니다. 그러나, 25°C에서의 성장은 가벼운 열 응력(33,34)을 야기할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 방법에 관계없이 멸균 동물을 사용하면 연령 관련 분석에 필요한 소모품 비용을 크게 줄일 수 있습니다.

노화를 연구하기 위해 표준 수명 분석은 수명을 변화시키는 패러다임이 노화에 직접적인 영향을 미치기 때문에 전통적입니다. 그러나 건강 범위 및 스트레스 내성의 측정은 유기체의 건강에 대한 추가 정보를 제공합니다. 여기에서, 건강 범위를 측정하기 위해 몇 가지 방법이 제공됩니다 : 1) 생식 건강의 척도로서의 번식력; 2) 해고 된 자손의 발달 건강과 생존 가능성의 척도로서의 새끼 크기; 3) 근육 기능과 운동성의 척도로서의 운동 적 행동, 둘 다 노화와 직접 관련이 있습니다. 또한, 응력 내성에 대한 분석이 제공됩니다 : ER 스트레스에 대한 생존, 미토콘드리아 / 산화 스트레스 및 열 스트레스 생존. 실제로, ER 스트레스35,36, 미토콘드리아 스트레스(37), 및 열 스트레스(38)에 대한 저항성이 증가된 동물은 증가된 수명을 나타낸다. ER 스트레스는 C. elegans를 tunicamycin에 노출시킴으로써 적용되며, 이는 N-연결된 글리코실화를 차단하고 미스폴딩된 단백질(39)의 축적을 야기한다. 미토콘드리아 / 산화 스트레스는 파라콰트에 노출되어 미토콘드리아에서 특히 수퍼 옥사이드 형성을 유도합니다40. 열 스트레스는 34-37°C에서 33,41의 동물 인큐베이션을 통해 가해진다. 여기에 설명 된 모든 분석은 최소한의 장비와 자금으로 수행 할 수 있으며 다양한 그룹에서 노화를 연구하기위한 다양한 도구를 제공합니다.

Protocol

1. C. elegans의 성장과 유지

  1. 쏟아지는 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트
    1. 1 mM CaCl2, 5 μg/mL콜레스테롤, 25 mM KPO4 (pH 6.0), 1 mM MgSO4, 0.25% w/v 펩톤 및 51.3 mM NaCl로 구성된 선충류 성장 배지 (NGM)로 표준 2% 한천 플레이트 상에서 C. 엘레간을 성장시킨다.
    2. NGM-한천 플레이트 1L에 대해, 2.5g의 펩톤, 3.0g의 NaCl 및 20g의 한천을 교반 막대가 있는 1L 플라스크에 넣고 측정한다.
      참고 : 브랜드 간의 강성이 다양하여 재현성에 영향을 줄 수 있으므로 특정 한천 소스를 표준화하는 것이 좋습니다. 여기에서는 Bacto-Agar가 엄격하게 사용됩니다. 또한, 한천은 가열하지 않고 완전히 용해되지 않으며 한천을 함유 한 용액을 옮기면 한천이 손실되고 집중력이 떨어질 수 있으므로 오토클레이브 플라스크에 직접 한천을 첨가하는 것이 좋습니다.
    3. 최대 970mL의dH2O를 첨가한다.
      참고 : 멸균 후 30mL의 액체 첨가제는 최종 부피를 1L로 가져옵니다. 우리 손에는 최종 부피의 970 mL에 도달하기 위해 ~ 951 mL의dH2O가 필요할 것입니다.
    4. 효율적인 살균을 위해 표준 오토클레이브 또는 미디어 멸균기를 사용하여 NGM-한천 용액을 멸균하십시오.
      참고: 이 시점에서 멸균 NGM-한천은 실온에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. NGM-한천을 보관하면 15-45 s 펄스의 전자 레인지에서 용액을 끓이거나 가열 된 수조에서 끓는 것을 방지 할 수 있습니다.
    5. 용액이 60-75°C로 냉각될 때까지 교반시킨다. 냉각하는 동안 교반하는 것은 고르지 않은 냉각을 방지하는 데 중요하며, 이로 인해 일부 한천이 응고될 수 있습니다.
    6. 용액이 냉각되는 동안, 수조 또는 비드 배쓰를 65-70°C로 가열한다.
    7. 용액이 60-75 °C로 냉각되면 0.5 M CaCl2 2.0 mL, 5 mg / mL 콜레스테롤 1mL, 1 M KPO4 (pH 6.0) 및 0.5 M MgSO4 (모든 시약에 대한 조리법은 표 1 참조) 등의 액체 첨가제를 첨가하고 용액이 ~ 5 분 동안 혼합되도록 허용하여 완전한 혼합을 보장합니다.
      참고: 약물은 여기에 플레이트에도 포함될 수 있습니다 (예 : 100 mg / mL 카베니실린 1 mL와 1 M IPTG 1 mL 추가, 2.5 mg / mL tunicamy신 10 mL 추가, 400 mM 파라콰트 10 mL 추가).
    8. NGM-한천을 함유하는 가라침 플라스크를 65-70°C 수조에서 플레이트에 붓는 동안 NGM-한천이 응고되는 것을 방지한다.
    9. 9-11 mL의 용액을 각 60 mm 플레이트에 넣거나 20-30 mL의 용액을 각 100 mm 플레이트에 넣습니다.
      참고: 피펫에서 팽창하는 공기로 인한 NGM 누출을 방지하기 위해 사용 가능한 가장 작은 피펫 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 피펫을 완전히 비우는 것을 피하기 위해 각 플레이트에 첨가되는 것보다 1-2 mL 더 많은 배지를 피펫팅하면 기포 형성을 방지하는 데 도움이됩니다. 또는 플레이트를 병에서 직접 플레이트에 직접 부을 수 있지만 동일한 부피의 플레이트를 보장하기 위해 피펫팅을 적극 권장합니다. 동일한 부피의 플레이트는 용액이 플레이트 위에 직접 적용되는 방법을 사용할 때 유사한 농도의 솔루션을 보장하는 데 중요합니다 (1.1.17 단계 참조). 동일한 부피는 또한 쉽게 현미경을 통해 플레이트 전체에 걸쳐 유사한 초점 평면을 유지할 수 있습니다.
    10. 온도를 유지하고 NGM-아가가 응고되는 것을 방지하기 위해 가열된 용액에 피펫을 다시 넣으십시오.
    11. 모든 플레이트에 대해 위의 두 단계를 반복합니다.
    12. NGM-한천 플레이트가 하룻밤 사이에 응고되도록 허용하십시오.
    13. 플레이트가 응고된 후, 플레이트를 4°C에서 최대 3개월 동안 저장하거나 박테리아로 플레이트를 시딩하기 위한 단계 1.1.14로 이동시킨다. 플레이트를 밀봉된 용기에 보관하여 습기를 유지하여 플레이트 품질을 유지합니다.
    14. OP50의 배양물을 주위 온도 (~ 22-25 °C)에서 24-48 시간 동안 리조제니 브로스 (LB) 또는 동등한 배지에서 성장시키거나 LB + 항생제 (암피실린 / 탄수화물 + 테트라 사이클린은 HT115에 권장됨)에서 HT115의 배양물을 37 °C에서 12-16 시간 동안 진탕하면서 성장시킨다.
      참고 : OP50의보다 공격적인 성장이 37 °C에서 발견되어 C. elegans 수명에 영향을 미치기 때문에 실온에서 OP50을 성장시키는 것이 좋습니다. 대조적으로, HT115는 성장 속도가 느리고 덜 조밀 한 배양물을 만듭니다. 따라서 HT115를 37 ° C에서 흔들면서 성장시키는 것이 좋습니다.
    15. 포화 OP50/HT115 배양물을 100-200 μL의 부피를 60 mm 플레이트 상에 시딩하거나, 100 mm 플레이트를 위해 1 mL를 시드한다.
    16. 접시를 벤치 탑에서 밤새 말리고 접시가 여전히 젖은 경우 건조하는 데 하루 더 허용하십시오. 플레이트를 밀봉 된 용기에 4 °C에서 ~ 2 개월 동안 보관하십시오.
    17. 선택 사항: 웜을 화학적으로 살균하기 위해 시딩된 NGM-한천 플레이트(예: 10mg/mL FUDR 용액 100μL)에 약물을 직접 첨가합니다.
  2. C. elegans 주식 유지
    1. 시드된 NGM-한천 플레이트의 바닥에 적절하게 라벨을 붙입니다. 표준 해부 현미경에서 빛의 통과를 방해하지 않도록 플레이트 하단의 가장자리에 라벨을 붙입니다.
    2. 표준 해부 현미경을 사용하여 C. elegans pick에 선택한 박테리아를 스쿱합니다.
      참고: 이 프로토콜에서는 유리 파스퇴르 피펫 끝에 부착된 90%/10% 백금/이리듐 와이어로 구성된 픽이 사용되었습니다.
    3. 박테리아를 사용하여 10-20 개의 알, L1, L2 또는 L3 동물을 수집하고 새로 표지 된 NGM-한천 플레이트로 옮깁니다.
      참고 : 어린 동물을 수집하는 것이 가장 좋습니다. 저자의 경험에 비추어 볼 때, 표준 야생형 동물의 경우 10-20 개의 달걀 / 어린 동물을 움직이면 접시가 기아없이 15 ° C에서 자랄 수 있습니다. 번식력이 감소한 트랜스제닉 또는 돌연변이 동물의 경우, 더 많은 동물을 플레이트로 옮겨야합니다.
    4. 야생형 번식력을 가진 동물의 경우 15°C에서 성장하고, 매주 스톡을 유지하기 위해 7일마다 1.2.1-1.2.3 단계를 반복한다. 20°C에서 자란 동물의 경우, 기아를 방지하기 위해 4-5일마다 1.2.1-1.2.3단계를 반복한다.
  3. 웜 동기화 via 표백
    참고: 전체 60 mm NGM-한천 플레이트 (예를 들어, 15°C에서 성장한 1주령 스톡 플레이트)는 기술된 대부분의 표준 검정을 위해 충분한 수의 동물을 제공할 것이다. 일반적으로 한 마리의 gravid 성인 (계란으로 가득 찬 성인)은 10-15 개의 알을 제공합니다.42, 그리고 전체 60mm NGM-한천 플레이트에는 100-200 명의 gravid 성인이 있으며 ~ 1000-2000 개의 알을 제공합니다.
    1. 더 많은 동물이 필요한 대규모 실험의 경우, 전체 60mm NGM-한천을 네 개에서 여섯 개의 동일한 조각으로 자르고 확장을 위해 시드 된 100mm 플레이트에 덩어리로 묶습니다.
      참고 : 여기서 청크는 웜이 포함 된 NGM-agar 플레이트 조각을 자르고 한천 + 웜의 전체 덩어리를 새 플레이트로 옮기고 웜 사이드를 아래로 이동하여 웜이 새 플레이트로 기어 들어갈 수 있도록하는 것을 말합니다. 참고로, 야생형 번식력을 갖는 동물은 청크 후 2-3일 동안 20°C에서 성장하면 전체 100 mm 플레이트를 생성할 것이다.
    2. 선충류를 수집하기 시작하려면 소량의 M9 용액 (표 1)을 웜이 들어있는 접시에 붓고 페트리 접시를 과도하게 채우지 않도록주의하십시오. M9 용액을 부드럽게 소용돌이 치며 박테리아 잔디밭에서 웜을 풀어냅니다.
    3. 혈청 학적 피펫으로 gravid 성인 웜을 수집하고, 피펫 팁으로 한천을 관통하지 않도록주의하십시오.
      참고 : 유리 혈청 학적 피펫은 C. elegans 가 플라스틱에 달라 붙는 경향이 있으므로 권장됩니다. 유리 피펫을 사용할 수없는 경우 플라스틱 피펫에 달라 붙기 때문에 일부는 손실되므로 필요한 것보다 더 많은 수의 동물로 시작하는 것이 좋습니다.
    4. 동물을 1,100 x g에서 30 s 동안 원심분리하여 펠릿화한다. 상층액을 흡인하십시오.
      참고 : C. elegans 펠렛은 매우 느슨하므로 상층액을 흡인하는 동안 펠렛을 흔들거나 방해하지 않도록주의하십시오.
    5. 동물들이 원심분리하는 동안, 균주 당 5mL의 표백 용액을 준비하십시오 (조리법 세부사항은 표 1 참조); 용액 5 mL에 대해 1.5 mL의 6% 차아염소산나트륨(표백제), 0.75 mL의 5 M NaOH 또는 KOH, 및 2.75 mL의dH2O를혼합한다.
      주의: 차아염소산나트륨과 고농도 수산화 용액은 부식성이 있으므로 취급 시 장갑과 실험실 코트를 착용하는 것이 좋습니다.
    6. 웜 펠릿/M9 혼합물에 표백 용액 5mL를 첨가합니다.
    7. 모든 성인 웜 몸체가 용해되고 계란 만 혼합물에 남을 때까지 몇 분마다 해부 현미경으로 웜을 확인하십시오. 웜 / 표백제 믹스를 격렬하게 흔들어 표백 과정을 가속화하십시오.
      참고 : 표백제 믹스 안에 알을 장기간 방치하면 알이 손상되고 동물의 생존력에 영향을 미칩니다. 야생형 동물의 경우, 표백은 보통 흔들림으로 4-6 분이 걸립니다. 따라서 4 분 표시부터 시작하여 30 초 간격으로 현미경으로 동물을 확인하는 것이 좋습니다.
    8. 계란 / 표백제 믹스를 1,100 x g에서 30 초 동안 회전시켜 달걀을 펠릿화 하십시오.
      참고: 일부 15mL 코니컬 튜브에는 튜브 내부에 그라디언트 라인이 있습니다. 이 튜브의 경우, 계란이 튜브의 바닥에 펠릿을 내고 그라디언트 라인에 남아 있지 않도록 더 빠른 속도 (예 : 2,000 x g에서 30 초)로 계란을 회전시키는 것이 좋습니다.
    9. 표백 용액을 흡인하십시오.
      참고 : 달걀 펠릿은 웜 펠릿보다 뻣뻣하지만 여전히 쉽게 파괴 될 수 있습니다. 따라서 원심 분리 후 튜브를 흔들지 않도록주의하십시오.
    10. M9 용액을 최대 15mL까지 첨가하고 튜브를 네 번 또는 다섯 번 뒤집어 계란이 M9 용액에 완전히 분산되도록하여 계란을 씻으십시오.
    11. 펠릿 알을 1,100 x g 에서 30 초 동안 원심분리하여 M9 용액을 흡인한다.
    12. 계란 믹스에서 표백제를 제거하기 위해 총 네 번의 세척에 대해 위의 두 단계를 반복하십시오.
    13. 최종 세척 후 난자를 100 μL의 M9 용액 2 mL에 재현탁시킨다 (즉, 표백된 웜의 총 수에 따라). 덩어리를 부수고 펠렛이 완전히 재현탁되었는지 확인하기 위해 계란을 완전히 흔든다.
    14. 대안적으로, 동물은 보다 엄격한 시간적 동기화를 위해 L1 체포될 수 있고; L1 포획을 위해, M9 용액을 15 mL 코니컬 튜브에서 ~10 mL의 달걀 펠릿에 첨가한다. 웜을 회전기에서 20°C 또는 주변 온도에서 최대 24시간 동안 회전시키십시오. L1 동물은 일반적으로 1.3.16 단계에서 설명한 알의 타이밍에 비해 성인기에 도달하는 데 반나절이 덜 걸립니다.
    15. 4μL의 난자/M9 혼합물을 박테리아가 뿌려진 NGM 플레이트에 피펫팅하여 계란 농도(또는 L1 농도; 단계 1.3.14 참조)를 근사화합니다. 도금 된 μL 당 얼마나 많은 계란이 존재하는지 계산하고 계산하십시오. 계수를 서너 번 반복하여 근사치를 향상시킵니다.
      참고 : 계란 농도를 근사화하면 오버플레이팅없이 실험에 적합한 샘플 크기에 충분한 동물이 도금되어 기아가 발생합니다.
    16. 근사치에 기초하여, 적절한 수의 알을 선택한 박테리아로 씨를 뿌린 NGM-한천 플레이트에 플레이트하십시오. OP50 플레이트의 경우, 60mm 플레이트에 최대 200마리의 동물을 플레이트에 장착하고 100mm 플레이트에 1,000마리의 동물을 플레이트에 플레이트에 플레이트합니다. HT115 플레이트의 경우, 60mm 플레이트에 최대 150마리의 동물을 플레이트에 플레이트하고 100mm 플레이트에 600마리의 동물을 플레이트에 플레이트합니다.
      참고 : 이들은 실험실 조건에 따라 대략적인 숫자이며 숫자는 박테리아 잔디의 두께에 따라 변경 될 수 있습니다. 15 °C에서 자란 계란은 성인 1 일째에 도달하는 데 ~ 5 일이 걸릴 것입니다 (알을 낳는 최대한, gravid 성인 단계에 도달하는 데 ~ 140 시간). 20 °C에서 자란 계란은 성인 1 일째에 도달하는 데 ~ 4 일이 걸릴 것입니다 (알을 낳는 최대한, gravid 성인 단계에 도달하는 데 ~ 96 시간). 25 °C에서 자란 계란은 성인 1 일째에 도달하는 데 ~ 3.5 일이 걸릴 것입니다 (알을 낳는 최대한, gravid 성인 단계에 도달하는 데 ~ 62 시간).
  4. C. elegans 개체군을 동기화하는 대체 방법으로 알을 낳습니다.
    1. 표백 프로토콜이 실현 가능하지 않은 경우 (예 : 원심 분리기를 사용할 수 없음), C. elegans의 개체군을 동기화하는 대체 방법으로 알을 낳는 절차를 수행하십시오. 이 프로토콜은 노동 집약적이며 동물의 수확량이 줄어들 것이라는 점을 명심하십시오.
    2. 알을 낳기 위해 8-12 마리의 포도 성인을 선택한 박테리아가 뿌려진 표준 NGM-한천 접시에 놓고 접시에 놓인 동물의 정확한 수를 문서화하십시오.
      참고 : 알을 낳는 절차는 실험에 사용될 온도에서 수행되어야합니다.
    3. 동물이 4-8 시간 동안 알을 낳도록 허용하십시오.
      참고 : 동물이 접시에 남아있는 지속 시간은 필요할 때 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 더 적은 시간을 사용할 수있을 때 더 많은 수의 동물을 더 짧은 알을 낳는 기간 동안 접시에 놓을 수 있습니다. C. elegans는 일반적으로 야생형 번식력43을 가진 동물에 대해 대략 다섯 개의 알/h의 비율로 추정될 수 있는 파열로 알을 낳는다. 1.3.16 단계의 권장 사항을 따라 동물이 과도하게 도금되지 않도록하십시오.
    4. 접시에서 모든 성인 동물을 제거하십시오.
      참고 : 접시에 남아있는 모든 성인 동물은 계속해서 알을 낳을 것이므로 동기화되지 않은 개체군이 생깁니다.
    5. 계란을 ~ 5 일 동안 15 °C에서 또는 ~ 4 일 동안 20 °C에서 1 일째 성인기에 도달하게하십시오.

2. C. elegans의 수명 측정

  1. 표준 수명
    1. 선택한 박테리아 100μL로 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비합니다. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 웜은 성인기의 알을 낳는 단계에서 매일 이동하기 때문에 수명 기간 동안 NGM-agar 플레이트의 5 ~ 일곱 세트를 시드하고 균주 당 두 개에서 네 개의 플레이트를 종결하여 동물을 성인기까지 성장시킵니다 (즉, 수명에 15 마리의 동물로 구성된 여덟 개의 플레이트를 사용하는 경우 조건 당 40-56 개의 플레이트를 뿌려야합니다).
    2. 접시를 보관하기 전에 밤새 말리십시오.
      참고 : 플레이트를 4 °C에서 보관하고 박테리아가 두꺼운 잔디밭을 만들어 이동 / 계산 수명을 어렵게 만드는 것을 방지하기 위해 필요한 수의 플레이트를 매일 냉장 보관에서 제거하는 것이 좋습니다. 웜을 도금하기 전에 플레이트가 예열되었는지 확인하십시오.
    3. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.
    4. 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 수명의 경우, 검열 사건 후 표본 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 ~120 마리의 동물로 시작하십시오 (예 : 15 마리의 동물 = 120 마리의 동물로 구성된 8 개의 판, 10 마리의 동물로 구성된 12 개의 판 = 120 마리의 동물).
      참고 : 현재의 경우 10-15 마리의 동물이 대부분의 조사자에게 관리 가능한 숫자이지만 20 마리의 동물로 구성된 여섯 개의 판이 소모품 비용을 줄일 수도 있습니다.
    5. 처음 7-8 일 동안 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 1-2 일마다 성인 동물을 자손으로부터 멀리 옮깁니다.
      참고 : 동물을 이틀에 한 번씩 움직여 재료를 절약 할 수 있지만 자손이있는 성인 개체군의 오염을 방지하기 위해 계란 / 애벌레 동물이 성인과 함께 옮겨지지 않도록주의해야합니다. 이 연구에서 가장 간단한 방법은 알을 낳는 것이 최대인 1-3 일에서 매일 동물을 이동 한 다음 알을 낳는 것이 최소화 된 5-8 일 동안 격일로 움직이는 동물로 전환하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 성인이 매일 움직이고 계란 / 애벌레가 1 일 안에 성인이 될 수 없기 때문에 1-3 일 동안 계란 / 애벌레 동물의 이동을 막을 필요는 없습니다.
    6. 동물들이 자손 생산을 중단 한 후, 모든 동물이 죽었거나 검열 된 것으로 점수 매겨질 때까지 격일로 수명을 채점하십시오. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.
      참고 : 죽음은 픽으로 부드럽게 만졌을 때 움직임이 보이지 않는 동물로 점수가 매겨집니다. 검열은 포장되거나, 외음부 / 장 돌출부를 나타내거나, 건조되는 판의 측면으로 기어 올라가는 동물로 점수가 매겨집니다.
  2. FUDR을 사용한 화학적 살균을 통한 수명
    1. 선택한 박테리아 100μL로 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비합니다. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 수명 실험을 위해 균주 당 8-12 플레이트를 시드하고, 균주 당 2 내지 네 개의 플레이트를 종자하여 동물을 성인기까지 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오.
    2. 수명 분석에 사용될 8-12 플레이트를 위해 박테리아 잔디밭 중앙에 100 μL의 100 μL를 첨가하십시오. 동물이 성인이 될 수 있도록 FUDR없이 두 개에서 네 개의 플레이트를 스타터 플레이트로 남겨 두는 것을 잊지 마십시오. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오.
      주의: FUDR은 DNA 합성을 차단하므로 취급 시 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.
    3. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.
      참고 :이 동물들은 FUDR이 동물을 체포 / 사망하게 할 것이므로 FUDR이없는 접시에서 자랄 필요가 있습니다.
    4. 10-15 일째 성인 동물을 FUDR이 들어있는 8-12 개의 플레이트 위로 옮깁니다. 표준 수명의 경우, 검열 사건 후 표본 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 ~120 마리의 동물로 시작하십시오 (예 : 15 마리의 동물 = 120 마리의 동물로 구성된 8 개의 판, 10 마리의 동물로 구성된 12 개의 판 = 120 마리의 동물).
      참고 : 자손 형성을 완전히 피해야하는 경우 L4 단계에서 동물을 FUDR로 옮길 수도 있지만 동물을 너무 일찍 이동해서는 안되며 동물이 외음부 / 장 돌출 위험이 높아지고 검열이 증가하게됩니다.
    5. 모든 동물이 사망 또는 검열 된 것으로 점수가 매겨질 때까지 격일로 수명을 채점하십시오. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.
      참고 : FUDR 수명의 경우, 자손은 L1 단계에서 체포되어 결국 사망하므로 무시할 수 있습니다.
  3. 온도에 민감한 멸균 돌연변이체를 사용한 수명
    1. 선택한 박테리아 100μL로 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비합니다. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 수명 실험을 위해 균주 당 8-12 플레이트를 시드하고, 균주 당 2-4 플레이트를 종자하여 동물을 성인기까지 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오.
    2. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 동물이 멸균 상태인지 확인하기 위해 25 °C의 제한 온도에서 동물을 키우는 것을 잊지 마십시오.
    3. 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 수명의 경우, 검열 사건 후 표본 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 ~120 마리의 동물로 시작하십시오 (예 : 15 마리의 동물 = 120 마리의 동물로 구성된 8 개의 판, 10 마리의 동물로 구성된 12 개의 판 = 120 마리의 동물).
    4. 모든 동물이 사망 또는 검열 된 것으로 점수가 매겨질 때까지 격일로 수명을 채점하십시오. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.
      참고: 수명이 짧은 균주를 처리할 때는 25°C의 수명이 훨씬 짧아서 동적 범위가 제한되므로 매일 수명을 점수화하는 것이 좋습니다. 저자의 경험에 따르면, 동물은 2 일째 후에 20 °C로 다시 이동 될 수 있으며, 20 °C에서 수명을 기록하는 것이 더 바람직하다면 동물은 멸균 상태를 유지합니다.

3. C. elegans의 건강 범위 측정

  1. 스래싱을 통한 운동 행동 측정
    1. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.
    2. 1 일째 성인 벌레의 작은 식민지를 해부 범위 아래의 NGM-한천 플레이트 위로 옮겨 M9 용액 10-20 μL로 옮깁니다. 10-15 마리의 동물을 관리 가능한 수의 동물로 간주하는 것이 좋습니다.
    3. 한 번에 하나의 웜에 초점을 맞추고, 표본이 오목한 형성에서 볼록한 형성으로 전환되는 횟수를 15 초 내에 계산하십시오. 핸드 카운터와 타이머를 사용하여 분석 기간 동안 웜에 초점을 맞출 수 있습니다.
      참고: 보다 철저하고 쉬운 분석을 위해 플레이트 비디오를 녹화할 수 있습니다. 예를 들어, 표준 현미경 접안 렌즈 부착물은 대부분의 스마트 폰 및 디지털 카메라 ($ 15- $ 30)에서 사용할 수 있으며 저렴한 비용으로 비디오 스래싱을 할 수있는 훌륭한 옵션입니다.
    4. 액체의 다른 웜에 대해 3.1.3 단계를 반복하여 10-15 개의 웜에 대한 총 운동률을 평균화하십시오. 표본 크기가 더 크려면 3.1.2-3.1.4단계를 반복합니다.
    5. 웜을 원하는 나이로 노화시킵니다. 단계 2.1-2.3에 기재된 수명 분석을 위한 유사한 방법이 웜을 노화시키기 위해 사용될 수 있다. 3.1.2-3.1.4단계를 반복하여 원하는 연령에서 스래싱을 분석합니다.
      참고: 3.1.2단계의 대체 방법은 플레이트의 웜 그룹에 ~30μL 이상의 M9 용액을 첨가하는 것입니다. 이렇게하면 웜을 수동으로 전송해야하는 시간을 절약 할 수 있지만 웜이 단일 플레이트에있는 위치의 무작위 기회로 인해 웜 그룹이 플레이트의 단일 지점에 남아있을 것이라는 보장은 없습니다.
  2. C. elegans의 번식력 (계란 수) 측정
    1. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 계란 수에 대한 분석은 L4 단계에서 시작하는데, 이는 성인 1 일 전 ~ 1 일 (15 °C에서 ~ 3 일 또는 L1 체포 후 20 °C에서 ~ 2 일).
    2. L4 웜을 선택한 박테리아가 뿌려진 별도의 NGM-한천 플레이트에 골라냅니다. ~ 10-15 마리의 동물을 번식력 분석에 사용하는 것이 좋습니다.
      참고 : 박테리아 잔디밭에서 계란 가시성을 향상시키기 위해 선택한 박테리아를 50 % (즉, 포화 배양물이 아닌)로 희석하는 것이 좋습니다.
    3. 동물을 20°C에서 하룻밤 동안 성장시키도록 허용한다. 새로 시드 된 플레이트 배치가 다음날 준비되었는지 확인하십시오.
    4. 성인기의 1 일째에, 성인 웜을 선택한 희석 된 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM-한천 플레이트에 옮기십시오.
      참고 : 갓 뿌린 접시를 사용하거나 두꺼운 박테리아 잔디를 예방하기 위해 사용할 때까지 플레이트를 4 °C에 보관하는 것이 좋습니다.
    5. 각 NGM-한천 접시에 놓인 알의 총 수를 계산하십시오.
      참고 : 플레이트 스캔을 돕기 위해 플레이트의 뚜껑에 그리드를 그려서 계란을 채점하는 플레이트 아래에 놓을 수 있습니다. 그런 다음 플레이트를 그리드 라인을 따라 스캔하여 플레이트가 움직일 때 방향을 유지하고 계란의 재계산을 방지 할 수 있습니다.
    6. 3.2.4-3.2.5 단계를 7-8 일 동안 반복하거나 접시에 계란이 더 이상 보이지 않을 때까지 반복하십시오.
      참고 : 알을 낳는 비율이 높은 1-3 일 동안, 적어도 12 시간마다 동물을 옮기는 것이 좋으며 하루에 두 번 달걀 수를 분석하는 것이 좋습니다. 그러나 이것은 소모품의 작업량과 비용을 증가시키므로 움직이는 동물과 측정은 하루에 한 번으로 제한 될 수 있지만 모든 알과 부화 된 동물이 제대로 계산되도록주의해야합니다. 부화 한 동물은이 분석의 목적을 위해 알로 계산됩니다.
  3. C. elegans 자손의 새끼 크기 (발달) 측정
    1. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다. 무리 크기에 대한 검정은 L4 단계에서 시작하는데, 이는 성인 1 일 전 ~ 1 일 (15 °C에서 ~ 3 일 또는 L1 체포 후 20 °C에서 ~ 2 일).
    2. L4 웜을 선택한 박테리아가 뿌려진 별도의 NGM-한천 플레이트에 골라냅니다. ~ 10-15 마리의 동물을 번식력 분석에 사용하는 것이 좋습니다.
    3. 동물을 20°C에서 하룻밤 동안 성장시키도록 허용한다. 새로 시드 된 플레이트 배치가 다음날 준비되었는지 확인하십시오.
    4. 성인기의 1 일째에, 성인 웜을 선택한 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM-한천 접시에 옮기십시오.
    5. 매 12-24 시간 (하루 2x 또는 하루 1x)마다 성인 웜을 7-8 일 동안 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 선택한 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM-한천 접시에 옮깁니다. 계란을 함유하는 모든 플레이트를 20°C에서 유지한다.
    6. 3.3.5단계를 7-8일 동안 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 반복한다. 계란을 함유하는 모든 플레이트를 20°C에서 유지한다.
      참고: 자손 플레이트는 또한 스코어링이 필요하기 전에 시간을 연장하기 위해 15°C에서 저장될 수 있다.
    7. 벌레를 옮긴 지 이틀 후, 판에 발달 된 자손을 세십시오. L4 단계 (즉, 20 °C에서 부화 후 2 일) 또는 그 이전에 발생하는 웜을 계산하여 F2 생성 (즉, 자손의 자손)이 결과를 혼란스럽게하지 않도록하십시오. 살아있는 모든 웜을 계산하십시오.
      1. 계산되는 동안 플레이트에서 모든 웜을 제거하십시오. 부화 / 발달이 지연된 동물을 놓치지 않도록 다시 채점하기 전에 플레이트를 1-2 일 동안 추가로 유지하십시오.
    8. 수집 된 모든 달걀 낳기 접시에 대해 3.3.7 단계를 반복하십시오.
      참고 : 새끼 크기 분석은 한 실험에서 두 세트의 데이터를 수집하여 소모품의 인건비와 비용을 최소화하기 위해 계란 수 분석 (3.2 단계)과 함께 수행 할 수 있습니다. 이것은 또한 동일한 동물 내에서 새끼 크기와 계란 수를 직접 비교할 수있게합니다.

4. C. elegans의 스트레스 탄력성 측정

  1. 튜니카마이신을 이용한 응급실 스트레스 민감도 측정
    1. 튜니카마이신을 함유한 플레이트(단계 1.1.7, 주 참조)를 100μL의 박테리아로 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비한다.
      주의: 튀니카마이신을 취급할 때는 장갑을 착용해야 합니다.
    2. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 종자 생존 분석을 위해 균주 당 8-12개의 튜니카마이신 플레이트를 시드하고, 균주 당 튜니카마이신이 없는 두 개 내지 네 개의 플레이트를 성인기까지 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오.
    3. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.
      참고 : 동물은 튜니카 마이신에서 체포 / 사망하기 때문에 성인기의 1 일째까지 tunicamycin이없는 접시에서 동물을 재배해야합니다.
    4. 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 생존 분석의 경우, 검열 사건 후 샘플 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 하기 위해 ~120마리의 동물로 시작한다(예를 들어, 15마리의 동물 = 120마리의 동물로 구성된 8개의 플레이트; 10마리의 동물로 구성된 12개의 플레이트 = 120개의 동물).
      참고 : FUDR 분석과 마찬가지로 tunicamycin은 L1 동물의 사망 / 체포를 유발하므로 동물을 움직이지 않고 tunicamycin 생존 분석을 수행 할 수 있습니다. 그러나 DMSO 조절을 수행 할 때 자손은 DMSO 플레이트에서 발생하므로 동물을 매일 이동해야하거나 멸균 기술이 필요합니다 (수명 섹션 2에서 사용 된 것과 동일한 방법을 생존 분석에 사용할 수 있음).
    5. 생존 분석은 수명과 유사하게 점수가 매겨진다. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.
      참고 : 격일로 동물을 채점하는 것이 가능하지만 tunicamycin에서 사망이 빠르게 발생하기 때문에 매일 생존 검정을 채점하는 것이 좋습니다.
  2. 파라콰트를 이용한 미토콘드리아/산화 스트레스 민감도 측정
    1. 파라콰트를 함유하는 플레이트를 시딩하여 NGM-한천 플레이트를 준비한다(단계 1.1.7 참조; 주) 100 μL의 박테리아가 선택되었다.
      주의: 장갑은 파라콰트를 취급할 때는 환경적으로 위험하므로 착용해야 합니다. 많은 연구 기관이 환경 위험에 대한 구체적인 폐기 지침을 요구하기 때문에 폐기 요구 사항에 대해서는 기관의 환경 보건 및 안전을 확인하십시오.
    2. 일관성을 위해 모든 반복실험에서 동일한 박테리아가 사용되는지 확인하십시오. 종자 생존 검정을 위해 균주 당 8-12 플레이트를 시드하고, 균주 당 파라콰트가 없는 두 개 내지 네 개의 플레이트를 성인기까지 동물을 성장시킨다. 접시를 하룻밤 사이에 말리십시오.
    3. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.
      참고 : 성인기의 1 일째까지 파라콰트없이 접시에 동물을 키우는 것을 잊지 마십시오. 그러나 일부 동물은 파라콰트 플레이트에서 성인기까지 발전 할 수 있으므로 살균 기술을 수행하거나 성인을 자손으로부터 멀어지게해야합니다 (2.2-2.3 단계 참조).
    4. 10-15 일째 성인 동물을 각각 8-12 개의 접시에 옮깁니다. 표준 생존 분석의 경우, 검열 사건 후 샘플 크기가 100 미만으로 너무 멀리 떨어지지 않도록 하기 위해 ∼120마리의 동물로 시작한다(예를 들어, 15마리의 동물 = 120마리의 동물로 구성된 8개의 플레이트; 10마리의 동물로 구성된 12개의 플레이트 = 120개의 동물).
    5. 생존 분석은 수명과 유사하게 점수가 매겨진다. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.
      참고 : 격일로 동물을 채점하는 것이 가능하지만 파라콰트에서 사망이 빠르게 발생하기 때문에 매일 생존 검정을 채점하는 것이 좋습니다. 이것은 특히 25°C에서 성장한 glp-4(bn2) 동물을 사용할 때 죽음이 매우 빠르게 일어나기 때문에 더욱 그러하다.
  3. 고온을 이용한 열응력 민감도(열포용성) 측정
    1. 단계 1.3 및 1.4에 기재된 바와 같은 표준 표백 검정을 사용하여 C. elegans 의 동기화된 집단을 수집한다.
    2. NGM-아가 플레이트를 37°C로 예열하고, 동물을 플레이트 상으로 옮기기 전에 플레이트를 적어도 1시간 동안 37°C 인큐베이터에 위치시킨다.
    3. 10-15 일 1 마리의 성인 동물을 각각 네 개에서 여섯 개의 미리 데운 접시에 옮깁니다. 표준 열관용의 경우, ~60마리의 동물로 시작하라(예를 들어, 15마리의 동물로 구성된 4개의 플레이트 = 60마리의 동물; 10마리의 동물로 구성된 6개의 플레이트 = 60마리의 동물)
    4. 동물을 37°C 인큐베이터에 넣고 매 2시간마다 사망률을 점수화한다. 죽음은 픽으로 부드럽게 만졌을 때 움직임이 없는 동물로 정의됩니다. 혼란을 피하고 동일한 동물을 이야기하기 위해 접시에서 모든 죽은 동물이나 검열 된 동물을 제거하십시오.
    5. 스코어링하는 동안 주위 온도에서 장시간 방치된 플레이트는 열관용 결과를 변경하므로 가능한 한 최소한의 시간 동안 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 제거해야 합니다.
      참고 : 한천의 온도가 하나의 균주를 득점하는 데 걸리는 시간에 극적으로 변하지 않아야하므로 한 번에 하나의 변형 만 꺼내서 득점하는 것이 좋습니다.
    6. 중간 열관용은 일반적으로 7-9 h에서 달성된다; 따라서 7 h, 9 h 및 11 h에서 적절한 분석을 확인하십시오.
      참고 : 인큐베이터의 변동성, 플레이트의 두께 및 각 실험실의 기타 혼란스러운 요인으로 인해 1-5 시간을 건너 뛸 수 있지만 시간대를 건너 뛸 계획이라면 각 실험실에서 타이밍을주의 깊게 적정하는 것이 중요합니다. 열저항에 대한 전체 가이드는 참조 44 를 참조하십시오.
    7. 대안적으로, 37°C 대신 34°C에서 열관용 분석을 수행한다.
      참고 : 34 °C에서의 중간 열관용은 훨씬 나중에 (이 연구에서 10-14 시간) 발생하며, 이는 열관용 분석이 밤늦게 준비 될 수있게 해줍니다 (34 ° C 인큐베이터에 배치), 스코어링은 다음날 일찍 시작됩니다. 이는 37°C 열관용 분석에 필요한 전형적인 12시간 주기보다는 ~8시간의 연속 스코어링을 허용한다.

Representative Results

C. elegans 는 인간과 함께 보존되는 노화 메커니즘의 대다수로 인해 노화 연구를위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 중요한 것은 장비 및 소모품에 대한 최소한의 요구 사항으로 유지 보수 및 실험 비용이 매우 저렴하여 자금이 제한된 기관을위한 탐나는 모델 시스템이된다는 것입니다. 또한, 얕은 학습 곡선을 가진 수많은 간단한 분석은 경험이 거의 없거나 전혀없는 가장 어린 조사관에게도 훌륭한 시스템입니다. 이러한 모든 요인들은 게놈 편집의 용이성, 명목상의 비용으로 수천 개의 사용 가능한 돌연변이 및 트랜스제닉 동물, 거의 모든 유전자의 유전 적 붕괴를위한 사용 가능한 RNAi 라이브러리를 포함하여 C. elegans 의 강력한 유전학과 결합하여 학부 기관에 이상적인 시스템이됩니다. 여기에서는 C. elegans 의 노화를 연구하는 가장 저렴한 방법 중 일부를 조사하여 주로 최소한의 장비와 소모품 비용뿐만 아니라 얕은 학습 곡선을 가진 분석에 중점을 둡니다. 사실, 프로토콜 및 데이터 수집의 전체는 <5 개월의 연구 경험을 가진 주니어 조사관, 주로 학부생에 의해 작성 / 수행되었습니다.

C. elegans의 장수 연구는 14-20 일에 이르는 동물의 수명이 짧기 때문에 매우 간단합니다. 중요한 것은 수명 분석이 고도로 표준화되어 있으며 NGM-한천 플레이트를 준비하기위한 인큐베이터, 표준 해부 현미경, 표준 웜 픽 및 소모품 만 필요하다는 것입니다. 아마도 C. elegans의 수명 측정에서 가장 비용이 많이 드는 측면은 소모품이 필요합니다. 이것은 C. elegans가 자기 비옥하게하는 헤르마프로디테스이기 때문입니다. 따라서 장수 분석을 위해 추적되는 성인은 매일 자손으로부터 멀어지게해야합니다. 그러나, 동물은 이들을 FUDR에 노출시키거나 25°C에서 성장한 온도 민감성 생식계열이 없는 glp-4(bn2) 돌연변이체와 같은 돌연변이체를 사용하여 멸균될 수 있으며, 필요한 소모품의 양을30,31,32로 감소시킬 수 있다. 여기서, 수명 분석은 FUDR 또는 glp-4(bn2) 생식계열이 없는 돌연변이체와 함께 수행되었으며, 이는 비멸균 동물에서 수행된 표준 수명과 유사한 결과를 보여준다. 야생형 수명은 FUDR 45 또는 수명 2에 대한 25°C에서의 성장의 영향으로 인해 동일하지않지만, 수명이 짧은 hsf-1 녹다운 동물은 모든 조건에서 수명이 크게 감소한 것을 확실하게 보여줍니다(그림 1). hsf-1은 열 스트레스 반응의 조절에 관여하는 열 충격 인자-1 전사 인자를 인코딩하며, 그 녹다운은 수명38,46의 현저한 감소를 초래한다.

장수는 노화 생물학에서 고려해야 할 중요한 요소이지만, 종종 수명은 C. elegans47에서도 건강 증가와 관련이 없습니다. 따라서 보완적인 접근 방식으로 우리는 생식 건강, 운동 행동 및 스트레스 탄력성을 포함하여 유기체 건강을 측정하는 몇 가지 방법을 제공합니다. 생식 건강은 두 가지 방법 중 하나로 측정 할 수 있습니다. 첫째, 난자 수를 측정하면 단일 자체 수정 hermaphrodite에 의해 얼마나 많은 알이 낳히는지 직접 측정 할 수 있습니다. 그러나 동물은 정자보다 더 많은 난모세포를 생산하기 때문에 생존 가능한 자손을 결코 생산하지 않는 수정되지 않은 난자도 배치됩니다48. 따라서 동물의 진정한 생식 능력을 더 잘 이해하기 위해 새끼 크기의 측정은 얼마나 많은 생존 가능한 자손이 생산되는지에 대한 척도를 제공합니다. 종종, 증가된 스트레스 회복력은 실제로 생식 능력을 감소시킬 수 있는데, 이는 잠재적으로 재생산에 대한 인지된 스트레스의 내재적 효과로 인한것이다(49). 유사하게, 알을 낳는 수와 새끼 크기 모두에서 유의한 감소가 야생형 대조군에 비해 hsf-1 과발현 동물에서 발견된다(도 2A,B). 사실, 일부 hsf-1 과발현 동물은 완전한 불임성을 나타내며, 생식 건강이 장수와 반비례 할 수 있다는 증거를 제공합니다.

생식 건강은 생식계열 건강, 기능적 meiosis 및 생식 능력을 이해하는 데 중요하지만, 일반적으로 장수와 새끼 크기50 사이에는 직접적인 상관 관계가 없습니다. 따라서, 보완적인 접근법으로서, 운동 행동은51 세 동안 C. elegans 건강 범위를 분석하기위한 황금 표준 방법으로 제공됩니다. 운동 행동을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있지만 대부분의 방법에는 정교한 카메라, 추적 소프트웨어 또는 값 비싼 화학 물질이 필요합니다. 대조적으로, 스래싱 분석법은 표준 C. elegans 실험실이 장착 한 것 이상의 장비가 거의 필요하지 않습니다 : 해부 현미경, 웜 픽, 피펫 및 NGM-한천 플레이트를 만들기위한 소모품. 스래싱 속도는 어린 동물에 비해 오래된 동물의 스래싱이 크게 감소하여 측정 된 노화 중 건강 상태를 측정하는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다 (그림 2C).

마지막으로, 스트레스 분석에 대한 생존은 탄력성의 추가적인 생리학적 측정이다. 스트레스 반응을 활성화시키는 능력은 일반적으로 노화 과정에서 감소하여 동물이 덜 탄력적이고 스트레스에 더 민감하게 만듭니다. 따라서, 스트레스 회복력은 유기체 건강을위한 신뢰할 수있는 프록시로 사용될 수 있습니다. 여기서, 1) 튜니카마이신 노출에 반응하여 ER 스트레스에 대한 민감성을 조사하기 위한 방법이 제공되며, 이는 N-연결된 글리코실화를 차단하고 ER에서 미스폴딩된 단백질의 축적을 초래하는 화학 작용제; 2) 미토콘드리아에서 수퍼 옥사이드 형성을 유도하는 화학 물질 인 파라콰트에 대한 노출을 통한 미토콘드리아 / 산화 스트레스; 3) 고온에 노출을 통한 열 응력. 튜니카마이신 및 파라콰트 분석의 경우, 약물은 플레이트 생산 동안 NGM-한천 플레이트에 통합됩니다. 고농도의 tunicamycin의 경우, 자손은 일반적으로 발달하지 않으므로 살균 기술을 사용할 필요가 없습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 튜니카마이신의 최종 농도로 25ng/μL를 권장하지만, 자금이 제한된 사람들에게는 10ng/μL가 생존율이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 3A). 두 농도 모두 자손 발달을 제한하므로 DMSO 제어에는 멸균 기술이나 동물을 새로운 판으로 이동시켜야하지만 멸균 방법이 필요하지 않습니다. 이것은 tunicamycin 독성이 자손의 발달을 막지 만, DMSO는 사실상 독성이 없기 때문에 자손이 tunicamycin에서 자랄 때 자손이 완전히 발달 할 수 있기 때문입니다.

파라콰트 분석의 경우, 파라콰트 치료가 자손이 성인기까지 발전하는 것을 막지 못하기 때문에 살균 기술이나 동물의 움직임이 필요합니다. 높은 수준의 파라콰트(4mM)는 수명을 상당히 단축시키는 반면, 낮은 수준의 파라콰트(0.25mM)는 이전에 발표된 결과(52)와 일치하는 호르몬 효과로 인해 수명을 증가시킨다(그림 3B). 마지막으로, 열관용 분석에는 30-37°C에 도달할 수 있는 인큐베이터만 필요하며 추가 시약은 필요하지 않습니다. hsf-1의 과발현은 이전에 발표된53과 같이 37°C에서 열관용을 증가시킨다(도 3C). 그러나 다른 사람들이 이전에 그리고 현재의 데이터에서 보여 주듯이, 열관용 분석의 주요 문제점은 가변성입니다. 많은 요인들이 인큐베이터 간의 차이와 동물이 매 시간마다 열관용을 채점하면서 인큐베이터 외부에서 보내는 시간을 포함하여 열관용 분석 내에서 변동성에 기여할 수 있습니다. 열관용에 대한 철저한 지침은 참조문헌 41을 참조한다.

Figure 1
그림 1: 멸균 유무에 관계없이 수명 측정의 비교. (A) 20°C에서 빈 벡터(ev) 또는 hsf-1 RNAi 박테리아로 시딩된 NGM-한천 플레이트에서 성장한 야생형 N2 선충류의 수명. 동물들은 성인기의 1일, 3일, 5일, 및 7일에 자손으로부터 멀어졌다. (b) 20°C에서 빈 벡터(ev) 또는 hsf-1 RNAi 박테리아로 시딩된 NGM-agar-FUDR 플레이트 상에서 성장한 야생형 N2 선충류의 수명. 동물을 표준 ev 또는 hsf-1 RNAi 플레이트 상에서 성인기까지 성장시킨 다음, 성인기의 1일째에 FUDR 플레이트로 이동시켰다. (c) 25°C에서 빈 벡터(ev) 또는 hsf-1 RNAi로 시딩된 NGM-한천 플레이트 상에서 성장한 glp-4(bn2) 돌연변이 동물의 수명. 모든 조건에 대해, 동물은 모든 동물이 사망 또는 검열된 것으로 기록될 때까지 매 2일마다 죽음에 대해 점수화되었다. 외음부의 배깅, 돌출 또는 폭발이있는 동물 또는 판의 측면을 기어 올라 건조시킨 동물은 검열되었습니다. 모든 통계는 Log-Rank Mantel-Cox 테스트를 사용하여 수행되었으며 표 2에서 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 달걀 계수, 새끼 크기 및 스래싱을 건강 기간의 측정으로서 측정함 . (A) Thrashing assay는 1일째(파란색), 4일째(적색) 및 9일째(녹색) 동물에 25°C에서 빈 벡터로 시딩된 NGM-한천 플레이트 상에서 성장한 glp-4(bn2) 돌연변이 동물에 대해 수행되었다. NGM-한천 플레이트의 M9 용액에 넣은 동물에서 스래싱을 채점하고, 표준 해부 범위의 아이피스에 장착된 표준 스마트폰 카메라를 사용하여 비디오를 촬영하고, 정확성을 위해 슬로우 모션으로 스래싱을 채점했습니다. n = 조건 당 15 마리의 동물. (B) 계란 카운트는 야생형 N2(파란색) 및 sur-5p::hsf-1 (적색) 동물에서 측정하였다. 동물을 20°C에서 성장시키고 신선한 플레이트 상으로 이동시키고, 12시간마다 알을 계수하였다. 누워있는 알의 총 수를 합산했다. n = 야생형의 경우 7 마리의 동물과 sur-5p의 경우 9 마리의 동물입니다 ::hsf-1. (C) 부화를 허용하기 위해 20°C에서 2일 동안 알을 성장시킨 (B)와 동일한 동물에서 Brood 검정을 측정하고, 부화한 모든 알을 계수하였다. = p < 0.001은 비모수 만-휘트니 검정을 사용하여 계산하였다. 각 점은 단일 동물을 나타내고 선은 중앙값 및 사분위수 범위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 유기체 건강에 대한 대리자로서의 스트레스 탄력성. (A) 20°C에서 빈 벡터 RNAi 박테리아 상에서 성장한 N2 동물의 생존 검정. 동물을 성인 1일째에 1% DMSO, 10ng/μL 튜니카마이신 (상표명) 또는 25ng/μLTM을 함유하는 플레이트로 옮겼다. (b) 20°C에서 빈 벡터 RNAi 박테리아 상에서 성장한 N2 동물의 생존 검정. 동물을 물, 0.25 mM 파라콰트 (PQ), 또는 4 mM PQ를 함유하는 플레이트 상에서 해치로부터 성장시켰다. A-B의 경우, 모든 동물이 사망 또는 검열된 것으로 기록될 때까지 2일마다 동물을 죽음에 대해 점수화하였다. 외음부의 배깅, 돌출 또는 폭발이있는 동물 또는 판의 측면을 기어 올라 건조시킨 동물은 검열되었습니다. 모든 통계는 로그-랭크 Mantel-Cox 테스트를 사용하여 수행되었다(표 2). (C) 야생형 N2 동물에 대한 모든 37°C 열관용 검정 대 hsf-1의 과발현에 대한 풀링된 데이터(sur-5p::hsf-1). 데이터는 열관용 분석의 시간 = 9h에서 생존 백분율로 표시되며, 각 라인은 같은 날에 수행된 매칭된 실험을 나타냅니다. 동물을 20°C에서 빈 벡터 RNAi 박테리아 상에서 성장시키고, 분석을 위해 성인기의 1일째에 37°C로 이동시켰다. n = 반복실험당 균주당 60마리의 동물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시약 처방
표백제 용액 1.8% (v/v) 차아염소산나트륨, 0.375 M KOH
카베니실린 물에 100 mg / mL 원액 (1000x). 최대 6개월 동안 4°C에서 보관하거나 장기간 보관을 위해 -20°C에서 보관하십시오.
푸드르 물에 10 mg / mL 용액. -20°C에서 보관한다.
증권 시세 표시기 물에 1 M 용액.
리소제니 국물 (LB) 이 프로토콜에서는 상업용 LB가 사용되었지만 (재료 표 참조), 박토 트립톤, 효모 추출물 및 NaCl을 사용하는 모든 표준 LB 수제 요리법으로 충분합니다.
M9 솔루션 22 mM KH2PO4 단염기성, 42.3 mMNa2HPO4, 85.6 mM NaCl,1 mMMgSO4
선충류 성장 미디어 (NGM) 1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토펩톤, 51.3 mM NaCl
NGM RNAi 플레이트 1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토-펩톤, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL 카베니실린/암피실린. 어둠 속에서 4 ° C에서 최대 3 개월 동안 보관하십시오.
NGM RNAi DMSO 1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토펩톤, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL 카베니실린/암피실린; 1% DMSO
(튀니카마이신에 대한 대조군)
NGM RNAiTM 1 mMCaCl2, 5 μg/mL 콜레스테롤, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mMMgSO4, 2% (w/v) 한천, 0.25% (w/v) 박토펩톤, 51.3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/mL 카베니실린/암피실린; 1% DMSO, 25 ng/μL 튜니카마이신
파라콰트 물 중 400 mM 용액 - 신선한 것을 준비해야합니다.
테트라 사이클린 100% 에탄올에 10mg/mL 원액(500x). -20 °C에서 보관
튀니카마이신 100% DMSO에 있는 2.5 mg/mL 원액. 장기간 보관을 위해 -80 °C에서 보관하십시오. 이것은 100x 용액 (25 ng / μL 작업 용액)입니다.

표 1. 프로토콜을위한 시약 및 매체에 대한 조리법.

해당 그림 패널 변형, 치료 중간 수명 # 사망자/# 합계 p-값
(로그 랭크)
1A N2, 벡터 RNAi, 20°C 17 74/120 --
N2, hsf-1 RNAi, 20°C 11 65/120 0.001<
1B N2, 벡터 RNAi, FUDR, 20°C 19 120/120 --
N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20°C 11 116/120 0.001<
1C N2, glp-4(bn2), 벡터 RNAi, 25°C 13 115/121 --
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25°C 4 120/120 < 0.001
2A N2, 벡터 RNAi, 20°C, 1% DMSO 19 85/120 --
N2, 벡터 RNAi, 20°C, 10 ng/μL 튜니카마이신 15 109/120 0.001<
N2, 벡터 RNAi, 20°C, 25 ng/μL 튜니카마이신 12 117/120 0.001<
2B N2, 벡터 RNAi, 20°C 19 84/120 --
N2, 벡터 RNAi, 20°C, 0.25 mM 파라콰트 24 91/120 0.001<
N2, 벡터 RNAi, 20°C, 4 mM 파라콰트 6 50/120 0.001<

표 2. 수명과 스트레스 회복력에 대한 통계.

Discussion

수명은 가장 간단하게 삶의 기간으로 정의되며, 대부분의 유기체에서 명확한 이진 현상입니다 - 유기체가 살아 있거나 그렇지 않습니다. 그러나 장수가 항상 유기체의 건강과 관련이있는 것은 아닙니다. 예를 들어, 미토콘드리아 스트레스에 노출되면 수명이 극적으로 증가하는 미토콘드리아 hormesis 모델은 일반적으로 가장 오래 살았던 동물 중 일부이지만 성장 둔화 및 대사 기능 저하를 나타냅니다37,54. 마찬가지로, 과민성 소포체 스트레스 반응을 보이는 동물은 또한 단백질 항상성 및 수명이 극적으로 개선되었음에도 불구하고 건강 감소와 상관관계가 있을 수 있는 특정 행동 및 표현형을 나타낸다(36,49). 마지막으로, HSF-1 기능 증가(55), XBP-1 기능 증가(56), 변경된 FoxO 신호전달(57)을 포함하는 모델 유기체의 많은 장수 패러다임은 모두 암 위험 증가와 상관관계가 있으며, 유기체가 암 및 기타 건강 질환과 지속적으로 투쟁하는 경우 연장된 수명이 유익하지 않다는 것은 논쟁의 여지가 없다. 따라서 수명은 노화 생물학에서 독립형 측정이 될 수 없습니다.

따라서 건강 기간의 개념은 노화 생물학에서 성장하는 분야였습니다. 건강하다는 삶의 기간으로 느슨하게 정의 된 건강 수명은 장수보다 확인하기가 더 어렵습니다. 그러나 장수와는 달리 "건강"의 개념은 유기체 건강에 대한 많은 다른 판독 값이 있기 때문에 복잡합니다 : 유기체 수준에는 근육 기능 / 강도, 신경 / 인지 기능, 생식 건강 등이 있습니다. 세포 수준에는 단백질 항상성, 지질 항상성, 포도당 항상성, 신진 대사 등이 있습니다. 2014년, 노화 생물학자들은 노화의 생물학적 특징을 노화 중에 자연적으로 분해되는 것이어야 하고 실험적 악화가 노화를 가속화하고 실험적 개입이 노화를 늦추어야 한다는 구조화된 정의와 함께 결정적으로 특징지었다. 노화의 이러한 아홉 가지 특징은 게놈 불안정, 텔로미어 감소, 후성유전학적 변화, 단백질 항상성 상실(프로테오스타시스), 줄기 세포 고갈, 세포간 신호전달 변화, 미토콘드리아 기능장애, 탈조절된 영양소 감지, 및 세포 노화58을 포함한다. 그 이후로, 수많은 연구들은 세포외 단백질과 면역과 염증과 같은 전신 생리학을 포함한 다른 요인들이 포함되어야 한다고 주장한다59. 궁극적으로, 건강 범위에 대한 복잡한 정의는 유기체 건강이 여러 가지 다른 방법을 사용하여 측정되도록 요구합니다.

따라서이 원고에서는 선충류 모델 인 C. elegans를 사용하여 건강 기간의 다양한 측면을 측정하기 위해 여러 가지 방법이 제시됩니다. 우리는 스래싱 분석을 사용하여 운동 행동, 계란 수와 새끼 크기를 사용한 생식 건강, 스트레스에 대한 민감도를 분석합니다. 실제로, 운동 행동은 유기체가51 세 동안 운동성과 운동의 상당한 손실을 나타내기 때문에 건강 범위를 측정하기위한 황금 표준 방법입니다. 운동 행동의 손실은 C. elegans의 근육 기능이 적절한 프로테오스타시스60, 미토콘드리아 기능 장애 61 및 뉴런 근육 신호 전달 (62)에 의존하기 때문에 노화의 여러 특징에 기인 할 수 있습니다. 이 원고는 운동 행동의 한 측정에 초점을 맞추지 만, 단단한 한천 판에서 동물의 운동성, 터치51에 대한 반응 및 화학 축성 분석(63)을 포함한 많은 다른 방법이 존재한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 방법에는 일반적으로 더 정교한 기록 장치, 웜 추적 소프트웨어 사용 또는 고가, 위험 또는 휘발성 화학 물질의 사용이 필요하며 이들 모두는 일부 연구 설정에서 금지 될 수 있습니다.

또한, 난자 수 및 새끼 크기에 대한 분석은 생식 건강을 측정하는 방법과 성체 웜의 세포 분열을 측정하는 가장 간단한 방법으로 제시되는데, 성충은 유사분열 후 생식 세포와 배아 만 성체 웜(64) 내에서 세포 분열을 겪기 때문입니다. 세포 분열의 척도로서, 생식 건강은 세포 노화 및 줄기 세포 고갈의 노화 특징과 관련 될 수 있습니다. 생식 건강은 병원성 감염(65) 또는 스트레스(49)에 대한 노출을 포함하는 많은 요인들에 의해 영향을 받을 수 있지만, 생식 건강과 장수 사이에는 직접적인 상관관계가 없다. 사실, 일부 장수 동물은 새끼 크기49에서 상당한 감소를 나타내며, 장수와 새끼 크기50 사이에 반비례 상관 관계가 존재할 수도 있습니다. 이것은 C. elegans에 특유한 현상이 아니며, 장수에 대한 번식의 해로운 영향은 인간66, 동반자 개 67 및 마우스68에서 오랫동안 관찰되어 왔기 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 생식 건강이 장수 또는 건강과 관련이 없을 수 있다는 경고와 함께 생식 건강을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 저렴한 방법으로 계란 수와 새끼 크기를 제공합니다.

마지막으로, 생존 분석은 유기체 건강의 간접적 인 척도로 제공됩니다. 중요하게도, 열 스트레스(69) 및 ER 스트레스(35)에 대한 반응을 포함하는 세포 스트레스 반응은 노화 과정 동안 급격히 감소하고 프로테오스타시스(proteostasis)70,71의 노화 특징과 직접적인 관련성을 갖는다. 대조적으로, 스트레스 반응을 과도하게 활성화시키는 것은 스트레스35,37,38에 대한 탄력성을 촉진함으로써 수명을 상당히 증가시킬 수 있다. 본 연구가 가장 단순하고 가장 낮은 비용의 방법에 초점을 맞추는 동안, 응력 복원력 분석을 위한 다수의 대안적인 방법들이 열관용(41) 및 산화 응력(66)에 대해 존재하며, 각각은 상이한 장비 및 소모품 세트를 필요로 한다. 스트레스 요인에 대한 간단한 노출 연구 외에도 장비에 대한 접근에 따라 다른 생리적 방법을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 세포외 플럭스 분석기는 미토콘드리아 기능 및 세포 호흡(73)을 모니터링할 수 있다; 형광 해부 현미경은 스트레스 반응 활성화를 위한 전사 리포터의 측정을 허용할 것이다(20); 고분해능 화합물 또는 공초점 현미경을 사용하여 미토콘드리아(74), 소포체(75,76), 및 액틴 세포골격(77)에 대한 형광 프로브를 사용하여 소기관 형태를 측정할 수있다.

장수 측정을위한 마지막 경고의 이야기로서, 웜을 살균하기위한 화학적 및 유전 적 방법이 비용을 크게 줄이기 위해 제공되지만, 둘 다 수명에 직접적인 영향을 줄 수 있다는 점에 유의해야합니다. 예를 들어, FUDR에 대한 노출은 수명과 내열성(45) 모두에 영향을 미치는 것으로 이전에 보고되었다. glp-4(bn2) 돌연변이체 자체는 수명에 직접적인 영향을 미치지 않지만, 25°C에서의 성장은 온화한 열 응력(33,34)이므로 수명2에 영향을 미칠 수 있다. C. elegans를 살균하기 위한 다른 방법들이 존재하는데, 여기에는 옥신-매개된 멸균성(78) 또는 대안적인 온도-민감성 정자-결핍 돌연변이체(79)가 포함된다. 그러나 모든 방법에는 몇 가지주의 사항이 있으며 각 실험실의 과학적 요구에 가장 해로운 분석을 활용하기 위해주의를 기울여야합니다. 수명 연구의 마지막 한계 중 하나는 낮은 표본 크기 또는 단순히 조사자의 객관적인 오류로 인해 발생할 수있는 잠재적 인 변동성입니다. 이것은 자동화 된 수명 기술(80)에서 새로운 기술이 탄생함에 따라 회피될 수 있지만, 다시 이러한 시스템은 비용이 많이 들고 일부 엔지니어링 및 전산 장비 및 기술을 필요로 한다. 궁극적으로, 여기에 제공된 방법의 수집은 거의 모든 기관에서 신속하게 적응하고 배울 수 있으며 노화 생물학을위한 견고한 토대를 제공 할 수있는 신뢰할 수있는 도구 세트입니다.

Disclosures

저자들은 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

G.G.는 T32AG052374에 의해 지원되며 R.H.S.는 국립 노화 연구소의 R00AG065200에 의해 지원됩니다. 균주에 대한 CGC (NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440)에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

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References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
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Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).

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