Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kartlegge lavkostnadsmetoder for å måle levetid og helse i Caenorhabditis elegans

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64091
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

Caenorhabditis elegans fungerer som et utmerket modellsystem med robuste og rimelige metoder for å kartlegge helsespan, levetid og motstandskraft mot stress.

Abstract

Oppdagelsen og utviklingen av Caenorhabditis elegans som modellorganisme var innflytelsesrik i biologi, spesielt innen aldring. Mange historiske og moderne studier har identifisert tusenvis av levetidsendrende paradigmer, inkludert genetiske mutasjoner, transgent genuttrykk og hormesis, en gunstig, lavverdig eksponering for stress. Med sine mange fordeler, inkludert kort levetid, enkelt og rimelig vedlikehold, og fullt sekvensert genom med homologi til nesten to tredjedeler av alle menneskelige gener, har C. elegans raskt blitt vedtatt som en fremragende modell for stress og aldringsbiologi. Her kartlegges flere standardiserte metoder for å måle levetid og helse som enkelt kan tilpasses nesten alle forskningsmiljøer, spesielt de med begrenset utstyr og midler. Den utrolige nytten av C. elegans er omtalt, og fremhever kapasiteten til å utføre kraftige genetiske analyser i aldrende biologi uten behov for omfattende infrastruktur. Til slutt diskuteres begrensningene i hver analyse og alternative tilnærminger for vurdering.

Introduction

Siden tidspunktet for utgivelsen av 'The genetics of Caenorhabditis elegans', en av de mest innflytelsesrike artiklene av Sydney Brenner i 1974, har denne mikroskopiske ormen blitt ansett som et fremragende modellsystem for å studere biologiske mysterier1. I 1977 publiserte Michael R. Klass metoden for å måle levetiden til C. elegans og etablerte dette modellsystemet for å studere aldring2. Undersøkelsen for å forstå forholdet mellom stress og lang levetid har startet med identifisering av en enkelt mutasjon i alder-1-genet, noe som resulterte i en levetidsforlengelse i C. elegans3. Videre har moderne studier identifisert andre levetidsøkende mutasjoner, som avslørte langlivede mutante ormer som utviser økt motstand mot stress 4,5,6. Med sine mange fordeler, inkludert kort levetid, enkelt vedlikehold, fullstendig sekvensert genom som inneholder homologi til omtrent to tredjedeler av alle menneskelige sykdomsfremkallende gener, tilgjengelighet og enkel bruk av RNA-interferens (RNAi) biblioteker og fysiologisk likhet med mennesker 7,8,9, har C. elegans raskt blitt vedtatt som en fremragende modell for stress og aldringsbiologi.

Kanskje de største verktøyene til C. elegans er dens ekstremt lave vedlikeholdskostnader, enkel eksperimentering og mangfoldet av genetiske verktøy som er tilgjengelige for studier. C. elegans dyrkes vanligvis på et solid agarmedium med en E. coli matkilde. To vanlige E. coli-stammer er standard OP50, en B-stamme som kanskje er den mest brukte10, og HT115, en K-12-stamme som primært brukes til RNAi-eksperimenter11,12. HT115 K-12-stammen bærer en delesjon i RNAIII RNase, en mutasjon som er avgjørende for RNAi-metoder, hvor plasmider som uttrykker dsRNA som tilsvarer individuelle C. elegans-gener, brukes. DsRNA-fôringsvektorene tillater robust knockdown av C. elegans-gener uten behov for komplekse kryss eller genomredigering, da bakterier som bærer disse plasmidene kan mates direkte til nematoder. Tusenvis av disse bakterielle RNAi-vektorene finnes i HT115-bakgrunnen, inkludert det mest populære Vidal RNAi-biblioteket med >19 000 individuelle RNAi-konstruksjoner13 og Ahringer RNAi-biblioteket med 16 757 RNAi-konstruksjoner14. Imidlertid har OP50 og HT115 bakterielle dietter store forskjeller i metabolsk profil, inkludert forskjeller i vitamin B1215,16. Derfor anbefales det å utføre alle eksperimenter på en enkelt bakteriekilde, om mulig, for å unngå gen-diett-interaksjoner som kan introdusere flere forstyrrende faktorer som tidligere beskrevet 17,18,19. På grunn av sin letthet opprettholdes dyr på OP50 for alle eksperimentelle forhold beskrevet her, men alle eksperimenter utføres på HT115 som tidligere beskrevet20. Kort fortalt opprettholdes dyr ved OP50 og overføres til HT115 etter synkronisering (etter bleking) for konsistens mellom RNAi vs. ikke-RNAi eksperimenter. Alternativt kan en RNAi-kompetent OP50-stamme som bærer en lignende sletting av RNAIII RNase funnet i E. coli K12 HT115-stammen også brukes21.

Kanskje en stor begrensning for RNAi eksperimenter i C. elegans er bekymringen for knockdown effektivitet. Mens knockdown effektivitet kan valideres via qPCR eller western blotting, krever disse dyrt utstyr og reagenser og er begrenset til bulkanalyse. Dette er enda mer av en bekymring å se på bestemte celler, for eksempel nevroner, som er ildfaste (mindre følsomme) for RNAi. Mens RNAi-effektiviteten i spesifikke celler kan forbedres via overekspresjon av SID-1, transmembranproteinet som er essensielt for dsRNA-opptak22, er dette fortsatt begrenset til de celletypespesifikke uttrykksmønstrene til promotorene som brukes til disse konstruksjonene, og dermed er gen knockouts og mutasjoner det mest idiotsikre middelet for å tømme genfunksjoner. Utover RNAi-mediert knockdown er C. elegans også svært mottagelige for genomredigering med CRISPR-baserte strategier 23,24,25 og transgen konstruksjonsoveruttrykk gjennom mikroinjeksjoner, med mulighet for å integrere transgene konstruksjoner gjennom bestråling eller transposonbasert integrasjon 26,27,28,29 . Imidlertid krever disse metodene dyrt mikroinjeksjonsutstyr, og de høye kostnadene ved guide RNA eller Cas9 enzym kan forby disse metodene i institusjoner med begrenset finansiering. I stedet er tusenvis av transgene linjer og mutanter lett tilgjengelige for noen få dollar både på Caenorhabditis Genetics Center (CGC) og National Bioresource Project (NBRP). NBRP tilbyr isolerte mutanter for et stort antall C. elegans gener, inkludert publiserte og derfor verifiserte mutantstammer, mutanter avledet fra pilotprosjekter og mutanter som ennå ikke er karakterisert. I motsetning til dette er CGC et depot av for det meste publiserte og etablerte C. elegans linjer fra forskningsmiljøet. Begge sender stammer over hele verden til svært rimelige priser og tilbyr et bredt utvalg av alternativer for de med begrenset kapasitet til å syntetisere stammer internt.

Her tilbys en kuratert metodesamling, som sannsynligvis vil være de laveste kostnadsmetodene for å analysere levetid og helsespan i C. elegans. Alle metodene som presenteres her krever billig utstyr og forsyninger, og bruker bare stammer som er lett tilgjengelige fra CGC. Kanskje mest uoverkommelig for levetid og overlevelsesanalyser i C. elegans er kostnaden for Nematode Growth Media (NGM) plater. Siden C. elegans er hermafroditter og selvbefruktning, krever standard overlevelsesanalyser at voksne dyr kontinuerlig flyttes bort fra deres avkom for å unngå forurensning fra avkom. Ikke bare er denne prosessen tidkrevende, den kan bli dyr på grunn av nødvendigheten av omtrent 100 plater per tilstand for å kjøre en enkelt levetidsanalyse. Her er to alternativer gitt: utnyttelse av den temperaturfølsomme germline-mindre mutanten, glp-4 (bn2), eller kjemisk sterilisering ved bruk av 5-fluoro-2'-deoksyuridin (FUDR). glp-4 koder for en valylaminoacyl-tRNA-syntetase, og den temperaturfølsomme glp-4(bn2) er reproduktivt mangelfull ved restriktive temperaturer på grunn av redusert proteinoversettelse30,31. FUDR er en robust metode for kjemisk sterilisering av C. elegans ved å forhindre DNA-replikasjon, og dermed hemme reproduksjon32. Selv om FUDR kan være uoverkommelig dyrt for noen laboratorier, er det bare en liten mengde som kreves for å sterilisere ormer kjemisk, og stabiliteten i pulverform kan gjøre det mulig for de fleste grupper. Å bruke den temperaturfølsomme glp-4 (bn2) mutanten er absolutt det billigste alternativet, da det eneste kravet er en inkubator for å skifte dyrene til de restriktive 25 ° C; Det skal imidlertid bemerkes at vekst ved 25 °C kan forårsake mild varmestress33,34. Uansett metode kan bruk av sterile dyr redusere kostnadene for forbruksvarer som kreves for aldersrelaterte analyser.

For å studere aldring er standard levetidsanalyser konvensjonelle, da paradigmer som endrer levetiden har direkte innvirkning på aldring. Målinger av helsespan og stresstoleranse gir imidlertid ytterligere informasjon om organismenes helse. Her tilbys flere metoder for å måle healthspan: 1) fecundity som et mål på reproduktiv helse; 2) brødstørrelse som et mål på utviklingshelse og levedyktighet av lagt avkom; og 3) lokomotorisk oppførsel som et mål på muskelfunksjon og motilitet, som begge er direkte korrelert med aldring. I tillegg tilbys analyser av stresstoleranse: overlevelse til ER-stress, mitokondrielt / oksidativt stress og termisk stressoverlevelse. Faktisk viser dyr med økt motstand mot ER-stress35,36, mitokondrielt stress37 og termisk stress38 økt levetid. ER-stress påføres ved å utsette C. elegans for tunicamycin, som blokkerer N-bundet glykosylering og forårsaker akkumulering av feilfoldede proteiner39. Mitokondrielt/oksidativt stress induseres ved eksponering for paraquat, som induserer superoksiddannelse spesielt i mitokondriene40. Varmestress påføres ved inkubering av dyr ved 34-37 °C 33,41. Alle analysene som er beskrevet her, kan utføres med minimalt utstyr og midler, og tilbyr en rekke verktøy for å studere aldring i ulike grupper.

Protocol

1. Vekst og vedlikehold av C. elegans

  1. Helling Nematode Growth Media (NGM) plater
    1. Grow C. elegans på standard 2% agarplater med Nematode Growth Media (NGM) bestående av 1 mM CaCl2, 5 μg / ml kolesterol, 25 mM KPO4 (pH 6,0), 1 mM MgSO4, 0,25% w / v Peptone og 51,3 mM NaCl.
    2. For 1 liter NGM-agarplater måler du ut 2,5 g Peptone, 3,0 g NaCl og 20 g agar i en 1 L kolbe med en rørestang.
      MERK: Det anbefales å standardisere en bestemt agarkilde, da vi har sett variasjon i stivhet mellom merker, noe som kan påvirke reproduserbarheten. Her er Bacto-Agar strengt brukt. I tillegg anbefales det å legge agar direkte inn i kolben som autoklaveres, da agar ikke vil oppløses helt uten oppvarming, og overføring av oppløsning som inneholder agar vil føre til tap av agar og konsentrasjonsfeil.
    3. Tilsett dH2O opp til 970 ml.
      MERK: 30 ml flytende tilsetningsstoffer etter sterilisering vil bringe det endelige volumet til 1 L. I våre hender kreves ~951 ml dH2O for å nå 970 ml av det endelige volumet.
    4. Steriliser NGM-agar-løsning ved hjelp av en standard autoklav eller mediesilisator for effektiv sterilisering.
      MERK: På dette tidspunktet kan steril NGM-agar lagres i flere måneder ved romtemperatur. Hvis lagret, kan NGM-agar nytes i en mikrobølgeovn med 15-45 s pulser for å forhindre at løsningen koker over, eller i et oppvarmet vannbad.
    5. La oppløsningen røre til den er avkjølt til 60-75 °C. Omrøring under avkjøling er viktig for å forhindre ujevn avkjøling, noe som kan føre til at noe agar størkner.
    6. Mens løsningen avkjøles, varm et vannbad eller perlebad til 65-70 ° C.
    7. Når oppløsningen er avkjølt til 60-75 °C, tilsett flytende tilsetningsstoffer: 2,0 ml 0,5 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml kolesterol, 25 ml 1 M KPO4 (pH 6,0) og 0,5 M MgSO4 (se tabell 1 for oppskrifter på alle reagenser), og la oppløsningen blandes i ~5 minutter for å sikre fullstendig blanding.
      MERK: Legemidler kan også inkluderes i plater her (f.eks. tilsett 1 ml 100 mg / ml karbenicillin og 1 ml 1 M IPTG; tilsett 10 ml 2,5 mg / ml tunicamycin; tilsett 10 ml 400 mM paraquat).
    8. Senk kolben som inneholder NGM-agar i et vannbad på 65-70 °C for å forhindre at NGM-agar stivner mens den helles i plater.
    9. Pipetter 9-11 ml oppløsning i hver 60 mm plate, eller 20-30 ml oppløsning i hver 100 mm plate.
      MERK: Det anbefales å bruke det minste pipettevolumet som er tilgjengelig for å unngå NGM-lekkasjer forårsaket av luft som ekspanderer i pipetten. Pipettering av 1-2 ml mer media enn det som vil bli tilsatt hver plate for å unngå fullstendig tømming av pipetten, vil bidra til å forhindre bobledannelse. Alternativt kan plater helles for hånd direkte fra flasken i en tallerken, men pipettering anbefales på det sterkeste for å sikre plater med like stort volum. Like volumplater er viktig for å sikre lignende konsentrasjoner av løsninger ved bruk av metoder der løsninger påføres direkte på toppen av en plate (se trinn 1.1.17). Like volumer tillater også enkel mikroskopi for å opprettholde et lignende fokalplan over plater.
    10. Plasser pipetten tilbake i den oppvarmede oppløsningen for å opprettholde temperaturen og forhindre at NGM-agar størkner.
    11. Gjenta de to trinnene ovenfor for alle platene.
    12. La NGM-agarplater stivne over natten.
    13. Etter at platene har størknet, oppbevar plater i opptil 3 måneder ved 4 °C eller gå videre til trinn 1.1.14 for såing av plater med bakterier. Oppbevar plater i forseglede beholdere for å holde på fuktigheten for å opprettholde platekvaliteten.
    14. Dyrk en kultur av OP50 i lysogenibuljong (LB) eller tilsvarende valgfrie medier i 24-48 timer ved omgivelsestemperatur (~ 22-25 ° C) eller dyrk en kultur av HT115 i LB + antibiotika (ampicillin / karbo + tetracyklin anbefales for HT115) med risting ved 37 ° C i 12-16 timer.
      MERK: Det anbefales å dyrke OP50 ved romtemperatur fordi en mer aggressiv vekst av OP50 er funnet ved 37 ° C, noe som påvirker C. elegans levetid. I motsetning til dette har HT115 en langsommere veksthastighet og gjør mindre tette kulturer; Derfor anbefales det å dyrke HT115 ved 37 °C ved risting.
    15. Frø et volum på 100-200 μL av en mettet OP50 / HT115-kultur på en 60 mm plate, eller 1 ml for en 100 mm plate.
    16. La platene tørke over natten på en benk og la det tørke en ekstra dag hvis platene fortsatt er våte. Oppbevar plater i forseglede beholdere ved 4 ° C i ~ 2 måneder.
    17. Valgfritt: Tilsett legemidler direkte på sådde NGM-agarplater (f.eks. 100 μL 10 mg/ml FUDR-løsning) for å sterilisere ormer kjemisk.
  2. Opprettholde C. elegans aksjer
    1. Merk bunnen av en seedet NGM-agarplate riktig. Merk kantene på bunnen av platen for å hindre passasje av lys på standard disseksjon mikroskoper.
    2. Ved hjelp av en standard disseksjon mikroskop, øse bakterier av valget på C. elegans plukke.
      MERK: I denne protokollen ble det brukt en hakke bestående av en 90% / 10% platina / iridiumtråd festet til enden av en Pasteur-pipette av glass.
    3. Bruk bakteriene, samle 10-20 egg, L1, L2 eller L3 dyr, og overfør dem til en nylig merket frøet NGM-agarplate.
      MERK: Det er best å samle yngre dyr; Forfatternes erfaring er at for vanlige villtypedyr vil det å flytte 10-20 egg/ungdyr gjøre at tallerkenen kan vokse ved 15 °C uten sult. For transgene eller mutante dyr med nedsatt fecundity, bør flere dyr flyttes inn i platen.
    4. For dyr med vill type fecundity og dyrket ved 15 ° C, gjenta trinn 1.2.1-1.2.3 hver 7. dag for å opprettholde en ukentlig bestand. For dyr dyrket ved 20 °C, gjenta trinn 1.2.1-1.2.3 hver 4.-5 dag for å forhindre sult.
  3. Synkronisere ormer via Bleking
    MERK: En full, 60 mm NGM-agarplate (f.eks. 1 uke gamle lagerplater dyrket ved 15 °C) vil gi et tilstrekkelig antall dyr for de fleste standardanalyser som er beskrevet. Vanligvis vil en gravid voksen (voksen full av egg) gi 10-15 egg42, og en full, 60 mm NGM-agar plate har alt fra 100-200 gravide voksne, som gir ~ 1000-2000 egg.
    1. For større eksperimenter som krever flere dyr, kutt en full 60 mm NGM-agar i fire til seks like stykker og del dem på seedede 100 mm plater for utvidelse.
      MERK: Her refererer chunking til å kutte et stykke av NGM-agarplaten som inneholder ormer og flytte hele delen av agar + ormer på en ny tallerken, ormsiden ned for å la ormene krype på den nye platen. Som referanseramme vil dyr med vill type fecundity produsere en full 100 mm plate hvis de vokser ved 20 ° C i 2-3 dager etter bling.
    2. For å begynne å samle nematoder, hell en liten mengde M9-løsning (tabell 1) på plater som inneholder ormer, pass på at du ikke overfyller petriskålen. Virvle M9-løsningen forsiktig for å løsne ormer av bakterielle plener.
    3. Samle gravide voksne ormer med en serologisk pipette, pass på at du ikke stikker hull i agaren med pipettespissen.
      MERK: Glass serologiske pipetter anbefales, da C. elegans har en tendens til å holde seg til plast. Hvis glasspipetter ikke er tilgjengelige, anbefales det å starte med et større antall dyr enn nødvendig, da noen vil gå tapt på grunn av å feste seg til plastpipetter.
    4. Pellet dyrene ved sentrifugering i 30 s ved 1,100 x g. Aspirer supernatanten.
      MERK: C. elegans-pelleten er veldig løs, så pass på at du ikke rister eller forstyrrer pelleten mens du aspirerer supernatanten.
    5. Mens dyr sentrifugerer, tilbered 5 ml blekemiddelløsning per belastning (se tabell 1 for oppskriftsdetaljer); Bland 1,5 ml 6 % natriumhypokloritt (blekemiddel), 0,75 ml 5 M NaOH eller KOH og 2,75 ml dH2O.
      FORSIKTIG: Natriumhypokloritt og høykonsentrasjonshydroksidløsninger er etsende, og det anbefales derfor å bruke hansker og laboratoriefrakk ved håndtering.
    6. Tilsett 5 ml blekemiddelløsning til ormpelleten/M9-blandingen.
    7. Sjekk ormene under et dissekeringsmikroskop med noen minutters mellomrom til alle de voksne ormelegemene er oppløst og bare egg er igjen i blandingen. Rist ormen/blekemiddelblandingen kraftig for å fremskynde blekeprosessen.
      MERK: Å la egg være inne i en blekemiddelblanding i lengre perioder vil føre til skade på eggene og vil påvirke dyrenes levedyktighet. For villdyr tar bleking vanligvis 4-6 minutter med risting. Det anbefales derfor å sjekke dyrene under et mikroskop med 30 s intervaller fra 4 min-merket.
    8. Pelleter eggene ved å spinne ned egg/blekemiddelblandingen i 30 s ved 1,100 x g.
      MERK: Noen 15 ml koniske rør har gradient linjer på innsiden av røret. For disse rørene anbefales det å spinne egg med høyere hastighet (f.eks. 30 s ved 2000 x g) for å sikre at eggene pelleter til bunnen av røret og ikke forblir på gradientlinjer.
    9. Aspirer ut blekeløsningen.
      MERK: En eggpellets er stivere enn en ormpellets, men kan fortsatt lett forstyrres. Så pass på at du ikke rister røret etter sentrifugering.
    10. Vask egg ved å tilsette M9-oppløsning opp til 15 ml og invertere røret fire eller fem ganger for å sikre at eggene er fullstendig dispergert i M9-løsningen.
    11. Pellet egg ved sentrifugering for 30 s ved 1,100 x g og aspirere ut M9 løsning.
    12. Gjenta de to trinnene ovenfor i totalt fire vasker for å eliminere blekemiddel fra eggblandingen.
    13. Resuspender eggene i 100 μL til 2 ml M9 oppløsning (dvs. avhengig av totalt antall ormer bleket) etter sluttvask. Rist eggene grundig for å bryte opp klumper og sørg for at pelleten er helt resuspendert.
    14. Alternativt kan dyr bli L1 arrestert for en strammere temporal synkronisering; for L1-arrestering, tilsett M9-løsningen til eggpelleten til ~ 10 ml i et 15 ml konisk rør. La ormene spinne i en rotator i opptil 24 timer ved 20 °C eller omgivelsestemperatur. L1-dyr bruker vanligvis en halv dag mindre på å nå voksen alder sammenlignet med tidspunktet for egg beskrevet i trinn 1.3.16.
    15. Tilnærmet eggkonsentrasjonen (eller L1-konsentrasjonen; se trinn 1.3.14) ved å pipettere 4 μL egg/M9-blanding på en NGM-plate sådd med bakterier. Tell og beregn hvor mange egg som er til stede per μL belagt. Gjenta tellingen tre eller fire ganger for å forbedre tilnærmingen.
      MERK: Tilnærmet eggkonsentrasjonen vil sikre at nok dyr er belagt for passende prøvestørrelse for eksperimenter uten overplating, noe som vil føre til sult.
    16. Basert på tilnærmingen, plate riktig antall egg på NGM-agarplater sådd med bakterier av valg. For OP50-plater, plate maksimalt 200 dyr på en 60 mm plate og 1000 dyr på en 100 mm plate. For HT115-plater, plate maksimalt 150 dyr på en 60 mm plate og 600 dyr på en 100 mm plate.
      MERK: Dette er omtrentlige tall basert på laboratorieforholdene våre, og tallene kan endres basert på tykkelsen på bakterieplenen. Egg dyrket ved 15 °C vil ta ~5 dager å nå dag 1 voksen alder (~140 timer for å nå eggleggende maksimalt, gravid voksenstadium). Egg dyrket ved 20 ° C vil ta ~ 4 dager å nå dag 1 voksen alder (~ 96 timer for å nå egglegging maksimal, gravid voksen stadium). Egg dyrket ved 25 ° C vil ta ~ 3,5 dager å nå dag 1 voksen alder (~ 62 timer for å nå egglegging maksimal, gravid voksen stadium).
  4. Egglegging som en alternativ metode for å synkronisere C. elegans populasjoner
    1. Hvis blekingsprotokoller ikke er gjennomførbare (f.eks. ingen sentrifuge tilgjengelig), som en alternativ metode for å synkronisere populasjoner av C. elegans, utfør en eggleggingsprosedyre. Husk at denne protokollen er mer arbeidsintensiv og vil resultere i mindre utbytter av dyr.
    2. For egglegging, legg 8-12 gravide voksne på en standard NGM-agarplate sådd med valgte bakterier og dokumenter det nøyaktige antallet dyr som er plassert på en tallerken.
      MERK: Eggleggingsprosedyrer bør utføres ved temperaturen som skal brukes til eksperimentering.
    3. Tillat dyr å legge egg i 4-8 timer.
      MERK: Varigheten dyrene er igjen på platen kan justeres ved behov. For eksempel kan et større antall dyr legges på en tallerken for en kortere eggleggingsvarighet når mindre tid er tilgjengelig. C. elegans legger vanligvis egg i utbrudd, som kan estimeres med en hastighet på omtrent fem egg / t for dyr med vill type fecundity43. Følg anbefalingene i trinn 1.3.16 for å unngå overplating av dyr.
    4. Fjern alle voksne dyr fra platen.
      MERK: Alle voksne dyr som er igjen på tallerkenen vil fortsette å legge egg, noe som resulterer i en usynkronisert populasjon.
    5. Legg eggene ved 15 °C i ~5 dager eller 20 °C i ~4 dager for å nå dag 1 voksen alder.

2. Måling av levetid i C. elegans

  1. Standard levetid
    1. Forbered NGM-agarplater ved å så plater med 100 μL bakterier av valg. For konsistens, sørg for at de samme bakteriene brukes på tvers av alle replikasjoner. Siden ormer flyttes hver dag i eggleggingsstadiene i voksen alder, frø fem til syv sett med NGM-agarplater i løpet av levetiden, og to til fire plater per belastning for å dyrke dyr til voksen alder (dvs. hvis man bruker åtte plater med 15 dyr i levetid, må man frø 40-56 plater per tilstand).
    2. La platene tørke over natten før lagring.
      MERK: Det anbefales at platene oppbevares ved 4 °C, og at det nødvendige antall plater fjernes fra kjølelager daglig for å hindre bakterier i å lage tykke plener som kan gjøre det vanskelig å bevege seg/telle levetid. Sørg for at platene varmes opp før plating ormer.
    3. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4.
    4. Flytt 10-15 dag 1 voksne dyr på 8-12 plater hver. For en standard levetid, start med ~ 120 dyr for å sikre at prøvestørrelsen ikke faller for langt under 100 etter sensurhendelser (f.eks. åtte plater med 15 dyr = 120 dyr, 12 plater med 10 dyr = 120 dyr).
      MERK: I det nåværende tilfellet er 10-15 dyr et håndterbart antall for de fleste etterforskere, selv om seks plater med 20 dyr også er mulig å redusere kostnadene for forbruksvarer.
    5. For de første 7-8 dagene eller til avkom ikke lenger er synlige, flytt voksne dyr bort fra deres avkom hver 1-2 dag.
      MERK: Dyr kan flyttes annenhver dag for å spare materialer, men det må tas hensyn til at egg / larvedyr ikke overføres med den voksne for å forhindre forurensning av voksne bestander med avkom. I denne studien er den enkleste metoden å flytte dyr hver dag fra dag 1-3 når eggleggingen er maksimal, og deretter bytte til å flytte dyr annenhver dag i dag 5-8 når eggleggingen er minimal. Med denne metoden er det ikke viktig å hindre overføring av egg/larvedyr på dag 1-3 siden de voksne flyttes hver dag, og egg/larver ikke kan utvikle seg til voksen alder på 1 dag.
    6. Etter at dyr har sluttet å produsere avkom, score levetiden annenhver dag til alle dyrene har blitt scoret som døde eller sensurert. Fjern alle døde eller sensurerte dyr fra tallerkenen for å unngå forvirring og gjenfortelle det samme dyret.
      MERK: Døden er scoret som dyr som ikke viser noen bevegelse når de forsiktig berøres med en hakke. Sensur er scoret som dyr som er bagged, viser vulval / intestinal fremspring, eller krøp opp til sidene av platen der de tørker ut.
  2. Levetid med kjemisk sterilisering ved bruk av FUDR
    1. Forbered NGM-agarplater ved å så plater med 100 μL bakterier av valg. For konsistens, sørg for at de samme bakteriene brukes på tvers av alle replikasjoner. Frø 8-12 plater per belastning for levetidseksperimenter, og to til fire plater per stamme for å dyrke dyr til voksen alder. La platene tørke over natten.
    2. Tilsett 100 μL 10 mg/ml FUDR på midten av bakteriell plen for de 8-12 platene som skal brukes til levetidsanalyse. Husk å la to til fire tallerkener uten FUDR være startplater slik at dyrene kan vokse til voksen alder. La platene tørke over natten.
      FORSIKTIG: FUDR blokkerer DNA-syntese, og det anbefales derfor å bruke hansker ved håndtering.
    3. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4.
      MERK: Disse dyrene må dyrkes på tallerkener uten FUDR, da FUDR vil føre til at dyr arresteres/dør.
    4. Flytt 10-15 dag 1 voksne dyr på 8-12 plater hver, som inneholder FUDR. For en standard levetid, start med ~ 120 dyr for å sikre at prøvestørrelsen ikke faller for langt under 100 etter sensurhendelser (f.eks. åtte plater med 15 dyr = 120 dyr, 12 plater med 10 dyr = 120 dyr).
      MERK: Dyr kan også flyttes til FUDR på L4-stadiet hvis det er viktig at dannelse av avkom unngås helt, men dyr må ikke flyttes for tidlig, da dette vil føre til at dyr har høyere risiko for vulval / intestinal fremspring og vil øke sensuren.
    5. Score levetid annenhver dag til alle dyr har blitt scoret som døde eller sensurert. Fjern alle døde eller sensurerte dyr fra tallerkenen for å unngå forvirring og gjenfortelle det samme dyret.
      MERK: For FUDR-levetider kan ethvert avkom ignoreres, da de vil arrestere på L1-stadiet og til slutt dø.
  3. Levetid ved bruk av temperaturfølsomme sterile mutanter
    1. Forbered NGM-agarplater ved å så plater med 100 μL bakterier av valg. For konsistens, sørg for at de samme bakteriene brukes på tvers av alle replikasjoner. Frø 8-12 plater per belastning for levetidseksperimenter, og 2-4 plater per stamme for å dyrke dyr til voksen alder. La platene tørke over natten.
    2. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4. Husk å dyrke dyr ved den restriktive temperaturen på 25 °C for å sikre at dyrene er sterile.
    3. Flytt 10-15 dag 1 voksne dyr på 8-12 plater hver. For en standard levetid, start med ~ 120 dyr for å sikre at prøvestørrelsen ikke faller for langt under 100 etter sensurhendelser (f.eks. åtte plater med 15 dyr = 120 dyr, 12 plater med 10 dyr = 120 dyr).
    4. Score levetid annenhver dag til alle dyr har blitt scoret som døde eller sensurert. Fjern alle døde eller sensurerte dyr fra tallerkenen for å unngå forvirring og gjenfortelle det samme dyret.
      MERK: Når det gjelder kortvarige stammer, anbefales det å score levetid hver dag, da levetiden ved 25 ° C er mye kortere og dermed er det dynamiske området begrenset. Forfatteres erfaring er at dyr kan forskyves tilbake til 20 °C etter dag 2, og dyr vil forbli sterile hvis det er å foretrekke fremfor å score levetid ved 20 °C.

3. Måling av healthspan i C. elegans

  1. Målinger av bevegelsesadferd via juling
    1. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4.
    2. Flytt en liten koloni av dag 1 voksne ormer på en NGM-agarplate under et dissekeringsomfang på 10-20 μL M9-løsning. 10-15 dyr anbefales som et håndterbart antall dyr å telle.
    3. Fokuser på en orm om gangen, telle antall ganger prøven bytter fra en konkav til konveks formasjon i 15 s. Bruk en håndteller og en timer slik at fokus kan plasseres på ormen i løpet av analysen.
      MERK: En video av platen kan bli tatt opp for grundigere / enklere analyse. For eksempel er standard mikroskop okular vedlegg tilgjengelig for de fleste smarttelefoner og digitale kameraer ($ 15 - $ 30), og disse er et flott alternativ til video thrashing til en lav pris.
    4. Gjenta trinn 3.1.3 for de andre ormene i væsken, i gjennomsnitt en total motilitetshastighet for 10-15 ormer. Hvis du vil ha høyere utvalgsstørrelse, gjenta trinn 3.1.2-3.1.4.
    5. Alder ut ormer til ønsket alder. Lignende metoder for levetidsanalyser beskrevet i trinn 2.1-2.3 kan brukes til å aldre ormer. Gjenta trinn 3.1.2-3.1.4 for å analysere juling i ønsket alder.
      MERK: En alternativ metode for trinn 3.1.2 er å legge til ~ 30 μL eller mer av M9-løsningen på en gruppe ormer på en plate. Dette vil spare tid fra å måtte overføre ormer manuelt, men på grunn av tilfeldig sjanse for hvor ormene er på en enkelt plate, er det ingen garanti for at en gruppe ormer vil forbli på et enkelt punkt på platen.
  2. Målinger av fecundity (egg count) i C. elegans
    1. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4. Analyser for eggtelling starter på L4-stadiet, som er ~ 1 dag før dag 1 voksen alder (~ 3 dager ved 15 ° C eller ~ 2 dager ved 20 ° C etter L1-arrestasjon).
    2. Sett ut L4 ormer på separate NGM-agarplater sådd med valgte bakterier. Det anbefales at ~ 10-15 dyr brukes til en fecundity analyse.
      MERK: Det anbefales å fortynne de valgte bakteriene med 50% (dvs. ikke en mettet kultur) for å forbedre eggsynligheten i bakterieplenen.
    3. La dyr vokse over natten ved 20 °C. Sørg for at et nysådd parti tallerkener er klart til neste dag.
    4. På dag 1 i voksen alder, overfør voksne ormer til ferske NGM-agarplater sådd med de fortynnede bakteriene du velger.
      MERK: Det anbefales å bruke nysådde plater, eller å oppbevare tallerkener ved 4 °C til bruk for å forhindre tykke bakterieplener.
    5. Tell det totale antall egg som legges på hver NGM-agarplate.
      MERK: For å hjelpe til med å skanne platen, kan et rutenett trekkes på lokket på en tallerken og plasseres under platen som blir scoret for egg. Platen kan deretter skannes langs rutenettlinjene for å opprettholde orientering når platen flyttes og forhindre gjentelling av egg.
    6. Gjenta trinn 3.2.4-3.2.5 i 7-8 dager eller til eggene ikke lenger er synlige på tallerkenen.
      MERK: For dager 1-3 når eggleggingshastigheten er høy, anbefales det å flytte dyr minst hver 12. time og analyseegg teller to ganger om dagen. Dette øker imidlertid mengden arbeid og kostnader for forbruksvarer, og dermed kan bevegelige dyr og målinger begrenses til en gang per dag, men det må tas hensyn til at alle egg og klekkede dyr telles riktig. Eventuelle klekkede dyr regnes som egg med henblikk på denne analysen.
  3. Måling av brødstørrelse (utvikling) av C. elegans avkom
    1. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4. Analyser for brødstørrelse starter på L4-stadiet, som er ~ 1 dag før dag 1 voksen alder (~ 3 dager ved 15 ° C eller ~ 2 dager ved 20 ° C etter L1-arrestasjon).
    2. Sett ut L4 ormer på separate NGM-agarplater sådd med valgte bakterier. Det anbefales at ~ 10-15 dyr brukes til en fecundity analyse.
    3. La dyr vokse over natten ved 20 °C. Sørg for at et nysådd parti tallerkener er klart til neste dag.
    4. På dag 1 i voksen alder, overfør voksne ormer til ferske NGM-agarplater sådd med bakterier av valg.
    5. Hver 12-24 timer (2x om dagen eller 1x om dagen), overfør voksne ormer til friske NGM-agarplater frøet med valgte bakterier i 7-8 dager eller til avkom ikke lenger er synlige. Oppbevar alle tallerkenene som inneholder egg ved 20 °C.
    6. Gjenta trinn 3.3.5 i 7-8 dager eller til avkom ikke lenger er synlige. Oppbevar alle tallerkenene som inneholder egg ved 20 °C.
      MERK: Avkomplater kan også lagres ved 15 ° C for å forlenge tiden før de må scores.
    7. To dager etter overføring av ormer, telle det utviklede avkom på platene. Telle utviklende ormer på L4-stadiet (dvs. 2 dager etter klekking ved 20 ° C) eller tidligere for å sikre at F2-generasjonen (dvs. avkom av avkom) ikke forvirrer resultatene. Telle alle ormer som er i live.
      1. Fjern alle ormer fra platen når de telles. Vedlikehold platene i ytterligere 1-2 dager før du skårer dem igjen for å sikre at dyr med forsinket klekking/utvikling ikke går glipp av.
    8. Gjenta trinn 3.3.7 for hver eggleggingsplate som samles inn.
      MERK: Analysene av brødstørrelse kan utføres i forbindelse med eggtellingsanalyse (trinn 3.2) for å minimere arbeidskraft og kostnader for forbruksvarer ved å samle to sett med data fra ett eksperiment. Dette vil også muliggjøre direkte sammenligning av brødstørrelse og eggtall innenfor de samme dyrene.

4. Måling av stressmotstandskraft i C. elegans

  1. Målinger av ER-stressfølsomhet ved bruk av tunicamycin
    1. Forbered NGM-agarplater ved å så plater som inneholder tunicamycin (se trinn 1.1.7, MERK) med 100 μL bakterier etter eget valg.
      FORSIKTIG: Hansker bør brukes ved håndtering av tunicamycin.
    2. For konsistens, sørg for at de samme bakteriene brukes på tvers av alle replikasjoner. Frø 8-12 tunicamycinplater per stamme for overlevelsesanalyser, og to til fire plater uten tunicamycin per stamme for å dyrke dyr til voksen alder. La platene tørke over natten.
    3. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4.
      MERK: Dyr må dyrkes på tallerkener uten tunicamycin til dag 1 i voksen alder, da dyr vil arrestere /dø på tunicamycin.
    4. Flytt 10-15 dag 1 voksne dyr på 8-12 plater hver. For en standard overlevelsesanalyse, start med ~ 120 dyr for å sikre at prøvestørrelsen ikke faller for langt under 100 etter sensurhendelser (f.eks. Åtte plater med 15 dyr = 120 dyr, 12 plater med 10 dyr = 120 dyr).
      MERK: I likhet med FUDR-analyser kan tunicamycinoverlevelsesanalyser utføres uten bevegelige dyr, da tunicamycin forårsaker død / arrestasjon av L1-dyr. Når du utfører en DMSO-kontroll, vil imidlertid avkom utvikle seg på DMSO-plater, så dyr må flyttes daglig eller en steriliseringsteknikk vil være nødvendig (identiske metoder som brukes i avsnitt 2 for levetid kan brukes til overlevelsesanalyser).
    5. Overlevelsesanalyser er scoret på samme måte som levetider. Fjern alle døde eller sensurerte dyr fra tallerkenen for å unngå forvirring og gjenfortelle det samme dyret.
      MERK: Selv om det er mulig å score dyr annenhver dag, siden døden skjer raskt på tunicamycin, anbefales det å score overlevelsesanalyser daglig.
  2. Målinger av mitokondriell/oksidativ stressfølsomhet ved bruk av paraquat
    1. Forbered NGM-agarplater ved å så plater som inneholder paraquat (se trinn 1.1.7; MERK) med 100 μL bakterier av valg.
      FORSIKTIG: Hansker bør brukes ved håndtering av paraquat, da det er en miljøfare. Sjekk med institusjonens miljøhelse og sikkerhet for krav til kassering, da mange forskningsinstitusjoner vil kreve spesifikke kasseringsinstrukser for miljøfarer.
    2. For konsistens, sørg for at de samme bakteriene brukes på tvers av alle replikasjoner. Frø 8-12 plater per stamme for overlevelsesanalyser, og to til fire plater uten paraquat per belastning for å dyrke dyr til voksen alder. La platene tørke over natten.
    3. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4.
      MERK: Husk å dyrke dyr på tallerkener uten paraquat til dag 1 i voksen alder; Det er imidlertid nødvendig å utføre en steriliseringsteknikk eller flytte voksne bort fra avkom, da noen dyr kan utvikle seg til voksen alder på paraquatplater (se trinn 2.2-2.3).
    4. Flytt 10-15 dag 1 voksne dyr på 8-12 plater hver. For en standard overlevelsesanalyse, start med ~ 120 dyr for å sikre at prøvestørrelsen ikke faller for langt under 100 etter sensurhendelser (f.eks. åtte plater med 15 dyr = 120 dyr, 12 plater med 10 dyr = 120 dyr).
    5. Overlevelsesanalyser er scoret på samme måte som levetider. Fjern alle døde eller sensurerte dyr fra tallerkenen for å unngå forvirring og gjenfortelle det samme dyret.
      MERK: Selv om det er mulig å score dyr annenhver dag, siden døden skjer raskt på paraquat, anbefales det å score overlevelsesanalyser daglig. Dette gjelder spesielt ved bruk av glp-4(bn2)- dyr dyrket ved 25 °C, da døden vil inntreffe svært raskt.
  3. Målinger av varmespenningsfølsomhet (termotolerans) ved bruk av forhøyede temperaturer
    1. Samle en synkronisert populasjon av C. elegans ved hjelp av en standard blekingsanalyse som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4.
    2. Forvarm NGM-agarplater til 37 °C før dyr flyttes på plater ved å plassere plater i en inkubator på 37 °C i minst 1 time.
    3. Flytt 10-15 dag 1 voksne dyr på fire til seks forvarmede plater hver. For en standard termotolerans, start med ~ 60 dyr (f.eks. fire plater med 15 dyr = 60 dyr, seks plater med 10 dyr = 60 dyr)
    4. Plasser dyr i en inkubator på 37 °C og skår for død hver 2. time. Døden er definert som dyr som ikke viser noen bevegelse når de forsiktig berøres med en hakke. Fjern alle døde eller sensurerte dyr fra tallerkenen for å unngå forvirring og gjenfortelle det samme dyret.
    5. Sørg for at platene fjernes fra inkubatoren på 37 °C i så kort tid som mulig, da plater som blir liggende ved omgivelsestemperatur i lange perioder mens du skårer, vil endre resultatene av termotoleransen.
      MERK: Det anbefales å trekke ut bare en belastning om gangen for å score, da temperaturen på agaren ikke bør endres dramatisk i den tiden det tar å score en belastning.
    6. Median termotolerans oppnås vanligvis i 7-9 timer; så sørg for en riktig analyse ved 7 timer, 9 timer og 11 timer.
      MERK: Mens 1-5 timer kan hoppes over, på grunn av variasjon i inkubatorer, tykkelsen på platene og andre forstyrrende faktorer i hvert laboratorium, er det viktig at timingen titreres nøye i hvert laboratorium hvis tidspunkter er planlagt å bli hoppet over. Se referanse 44 for en fullstendig veiledning om termotolerans.
    7. Alternativt kan du utføre termotoleransanalysen ved 34 °C i stedet for 37 °C.
      MERK: Median termotolerans ved 34 ° C forekommer mye senere (10-14 timer i denne studien), noe som gjør det mulig å forberede termotoleransanalyser sent på kvelden (plassert i en 34 ° C inkubator), og for scoring å begynne tidlig neste dag. Dette gir mulighet for ~ 8 timer fortsatt scoring i stedet for den typiske 12 timers perioden som kreves for en 37 ° C termotoleransanalyse.

Representative Results

C. elegans er en utmerket modellorganisme for aldringsforskning på grunn av at et stort flertall av aldringsmekanismer blir bevart hos mennesker. Det er viktig at de har svært lave kostnader i vedlikehold og eksperimentering med minimale krav til utstyr og forbruksvarer, noe som gjør dem til et ettertraktet modellsystem for institusjoner med begrensede midler. Videre gjør en mengde enkle analyser med grunne læringskurver dem til et utmerket system for selv den yngste etterforskeren med liten eller ingen erfaring. Alle disse faktorene kombinert med den kraftige genetikken til C. elegans , inkludert enkel genomredigering, tusenvis av tilgjengelige mutanter og transgene dyr til nominelle kostnader, og tilgjengelige RNAi-biblioteker for genetisk knockdown av praktisk talt alle gener, gjør dem til et ideelt system for lavere institusjoner. Her kartlegges noen av de laveste kostnadsmetodene for å studere aldring i C. elegans , med hovedfokus på analyser med minimal utstyr og forbrukskostnader, samt grunne læringskurver. Faktisk ble hele protokollene og datainnsamlingen skrevet / utført av juniorforskere med <5 måneders forskningserfaring, for det meste studenter.

Levetidsstudier i C. elegans er veldig enkle på grunn av dyrs korte levetid, alt fra 14-20 dager. Det er viktig at levetidsanalyser er svært standardiserte og krever bare en inkubator, et standard disseksjonsmikroskop, en standard ormplukk og forbruksvarer for å forberede NGM-agarplater. Kanskje det mest kostnadsoverkommelige aspektet ved levetidsmålinger i C. elegans er forbruksvarer som kreves. Dette er fordi C. elegans er hermafroditter som selvbefrukter; Derfor må voksne som spores for levetidsanalyser flyttes bort fra avkom daglig. Dyr kan imidlertid steriliseres ved å utsette dem for FUDR eller bruke mutanter, for eksempel den temperaturfølsomme germline-less glp-4 (bn2) mutanten dyrket ved uoverkommelige 25 ° C for å redusere mengden forbruksvarer som kreves 30,31,32. Her ble levetidsanalyser utført med FUDR eller med glp-4 (bn2) germline-mindre mutanter, som viser lignende resultater som standard levetid utført på ikke-sterile dyr. Selv om levetiden til villtype ikke er identisk på grunn av effekten av FUDR45 eller vekst ved 25 °C på levetid2, viser det kortvarige hsf-1 knockdown-dyret pålitelig en signifikant reduksjon i levetiden for alle forhold (figur 1). hsf-1 koder for varmesjokkfaktor-1-transkripsjonsfaktoren, som er involvert i reguleringen av termisk stressrespons, og dens knockdown resulterer i en betydelig reduksjon i levetiden38,46.

Mens lang levetid er en viktig faktor å vurdere i aldringsbiologi, korrelerer ofte ikke lang levetid med økt helse, selv i C. elegans47. Som en komplementær tilnærming tilbyr vi derfor flere metoder for å måle organismenes helse, inkludert reproduktiv helse, bevegelsesadferd og stressmotstandskraft. Reproduktiv helse kan måles på en av to måter. For det første vil målinger av eggtelling gi en direkte måling av hvor mange egg som legges av en enkelt selvbefruktende hermafroditt. Men siden dyr produserer flere oocytter enn sædceller, legges også noen ubefruktede egg som aldri ville produsere levedyktig avkom, 48. Derfor, for å få en bedre forståelse av den sanne reproduksjonsevnen til et dyr, gir målinger av brødstørrelsen et mål på hvor mange levedyktige avkom som produseres. Ofte kan økt stressmotstand faktisk redusere reproduksjonsevnen, potensielt på grunn av den iboende effekten av opplevd stress på reproduksjon49. Tilsvarende er en signifikant reduksjon i både antall egg lagt og brødstørrelse funnet hos hsf-1 overuttrykksdyr sammenlignet med villtypekontroller (figur 2A, B). Faktisk viser noen hsf-1 overuttrykksdyr full sterilitet, noe som gir bevis på at reproduktiv helse kan være omvendt korrelert med lang levetid.

Mens reproduktiv helse er viktig for å forstå germline helse, funksjonell meiose og reproduksjonskapasitet, er det generelt ingen direkte sammenheng mellom lang levetid og brødstørrelse50. Således, som en komplementær tilnærming, tilbys lokomotorisk oppførsel som en gullstandardmetode for å analysere C. elegans healthspan under aldring51. Det er mange metoder for å måle bevegelsesadferd, men de fleste metoder krever sofistikerte kameraer, sporingsprogramvare eller dyre kjemikalier. I motsetning til dette krever thrashing-analyser praktisk talt ikke noe utstyr utover hva et standard C. elegans-laboratorium er utstyrt med: dissekering av mikroskop, ormplukk, pipette og forbruksvarer for å lage NGM-agarplater. Thrashing priser gir en pålitelig metode for å måle healthspan under aldring, målt ved en signifikant reduksjon i thrashing hos gamle dyr sammenlignet med unge dyr (figur 2C).

Til slutt er overlevelse til stressanalyser en ekstra fysiologisk måling av motstandskraft. Kapasiteten til å aktivere stressresponser avtar generelt under aldringsprosessen, noe som gjør dyrene mindre motstandsdyktige og mer følsomme for stress. Dermed kan stressmotstandskraft brukes som en pålitelig proxy for organismenes helse. Her tilbys metoder for å kartlegge følsomhet for 1) ER-stress som respons på tunicamycineksponering, et kjemisk middel som blokkerer N-bundet glykosylering og resulterer i akkumulering av feilfoldede proteiner i ER; 2) mitokondrielt / oksidativt stress gjennom eksponering for paraquat, et kjemisk middel som induserer superoksiddannelse i mitokondrier; og 3) termisk stress gjennom eksponering for forhøyede temperaturer. For tunicamycin og paraquat analyser, er stoffet innlemmet i NGM-agar plate under plateproduksjon. For høye konsentrasjoner av tunicamycin utvikler avkom generelt ikke, og steriliseringsteknikker trenger derfor ikke å brukes. Protokollen som presenteres her anbefaler 25 ng/μL som endelig konsentrasjon av tunicamycin, men for de med begrensede midler viser 10 ng/μL også en signifikant reduksjon i overlevelse (figur 3A). Begge konsentrasjonene begrenser avkommets utvikling, og dermed er det ikke nødvendig med steriliseringsmetoder, selv om DMSO-kontrollen vil kreve en steriliseringsteknikk eller bevegelse av dyr på nye plater. Dette skyldes at tunicamycintoksisitet forhindrer utvikling av avkom, men DMSO er praktisk talt ikke-giftig, noe som gjør at avkom kan utvikle seg fullt ut når det dyrkes på tunicamycin.

For paraquat-analyser er det nødvendig med enten en steriliseringsteknikk eller bevegelse av dyr, da paraquatbehandling ikke forhindrer avkom i å utvikle seg til voksen alder. Høye nivåer av paraquat (4 mM) forkorter levetiden betydelig, mens lave nivåer av paraquat (0,25 mM) øker levetiden på grunn av en hormetisk effekt (figur 3B), i samsvar med tidligere publiserte resultater52. Til slutt krever termotoleransanalyser bare en inkubator som kan nå 30-37 ° C, og det kreves ingen ekstra reagenser. Overekspresjon av hsf-1 øker termotoleransen ved 37 °C (figur 3C) som tidligere publisert53. Men som andre har vist tidligere og fra dagens data, er det store problemet med termotoleransanalyser deres variabilitet. Mange faktorer kan bidra til variabilitet innen termotoleransanalyser, inkludert forskjeller mellom inkubatorer og tiden dyr bruker utenfor inkubatoren mens de scorer termotolerans hver time. For en grundig retningslinje for termotolerans, se referansen 41.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning av levetidsmålinger med og uten sterilisering. (A) Levetid for villtype N2-nematoder dyrket på NGM-agarplater sådd med tom vektor (ev) eller hsf-1 RNAi-bakterier ved 20 °C. Dyr ble flyttet bort fra avkom på dagene 1, 3, 5 og 7 i voksen alder. (B) Levetid for villtype N2 nematoder dyrket på NGM-agar-FUDR-plater sådd med tom vektor (ev) eller hsf-1 RNAi bakterier ved 20 ° C. Dyr ble dyrket til voksen alder på standard ev eller hsf-1 RNAi-plater, og deretter flyttet til FUDR-plater på dag 1 i voksen alder. (C) Levetiden til glp-4 (bn2) mutante dyr dyrket på NGM-agarplater sådd med tom vektor (ev) eller hsf-1 RNAi ved 25 ° C. For alle forhold ble dyrene scoret for død hver 2. dag til alle dyrene ble registrert som døde eller sensurert. Dyr med bagging, fremspring eller eksplosjon av vulva, eller de som krøp opp sidene av platene og desiccated ble sensurert. All statistikk ble utført ved hjelp av Log-Rank Mantel-Cox testing og finnes i tabell 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eggtelling, stamfiskstørrelse og juling som målinger av healthspan. (A) Thrashing-analyser ble utført på glp-4 (bn2) mutante dyr dyrket på NGM-agarplater sådd med tom vektor ved 25 ° C på dag 1 (blå), dag 4 (rød) og dag 9 (grønn) dyr. Thrashing ble scoret i dyr plassert i M9-løsning på en NGM-agarplate, video spilt inn ved hjelp av et standard smarttelefonkamera montert på et okular av et standard dissekeringsomfang, og thrashing scoret i sakte film for nøyaktighet. n = 15 dyr per tilstand. (B) Eggtellinger ble målt i villtype N2 (blå) og sur-5p::hsf-1 (røde) dyr. Dyrene ble dyrket ved 20 °C og flyttet på ferske tallerkener, og eggene ble telt hver 12. Totalt antall egg som ble lagt ble summert. n = 7 dyr for villtype og 9 dyr for sur-5p::hsf-1. (C) Stamfiskanalyser ble målt på de samme dyrene som (B) hvor egg ble dyrket ved 20 °C i 2 dager for å tillate klekking, og alle klekkede egg ble talt. = p < 0,001 beregnet ved hjelp av ikke-parametrisk Mann-Whitney-testing. Hver prikk representerer et enkelt dyr, og linjer representerer median og interkvartilt område. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Stressmotstandskraft som en proxy for organismenes helse. (A) Overlevelsesanalyse av N2-dyr dyrket på den tomme vektoren RNAi-bakterier ved 20 ° C. Dyrene ble flyttet til plater som inneholdt enten 1 % DMSO, 10 ng/μL tunicamycin (TM) eller 25 ng/μL TM på dag 1 i voksen alder. (B) Overlevelsesanalyse av N2-dyr dyrket på den tomme vektoren RNAi-bakterier ved 20 °C. Dyr ble dyrket fra luken på plater som inneholdt enten vann, 0,25 mM paraquat (PQ) eller 4 mM PQ. For AB ble dyr scoret for død hver 2. dag til alle dyrene ble registrert som døde eller sensurert. Dyr med bagging, fremspring eller eksplosjon av vulva, eller de som krøp opp sidene av platene og desiccated ble sensurert. All statistikk ble utført med Log-Rank Mantel-Cox testing (tabell 2). (C) Samlede data for alle 37 °C termotoleransanalyser for villtype N2-dyr versus overekspresjon av hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Data er representert som prosent i live på tid = 9 timer av en termotoleransanalyse, med hver linje som representerer et matchet eksperiment utført samme dag. Dyrene ble dyrket på den tomme vektoren RNAi-bakterier ved 20 °C og flyttet til 37 °C på dag 1 i voksen alder for analyse. n = 60 dyr per stamme per replikasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reagent Oppskrift
Blekemiddel løsning 1,8 % (v/v) natriumhypokloritt, 0,375 M KOH
Carbenicillin 100 mg/ml stamløsning (1000x) i vann. Oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder eller -20 °C for langtidslagring
FUDR 10 mg/ml oppløsning i vann. Oppbevares ved -20 °C.
IPTG 1 M løsning i vann.
Lysogeni Kjøttkraft (LB) I denne protokollen ble kommersiell LB brukt (se Materialtabell), men alle standard LB hjemmelagde oppskrifter med Bacto-trypton, gjærekstrakt og NaCl er tilstrekkelige.
M9-løsning 22 mM KH2PO4 monobasisk, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Vekst Media (NGM) 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2 % (w/v) agar, 0,25 % (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl
NGM RNAi plater 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2 % (w/v) agar, 0,25 % (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml karbenicillin/ampicillin. Oppbevares ved 4 °C i mørke i opptil 3 måneder
NGM RNAi DMSO 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2 % (w/v) agar, 0,25 % (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml karbenicillin/ampicillin; 1% DMSO
(kontroll for tunikamycin)
NGM RNAi TM 1 mM CaCl2, 5 μg/ml kolesterol, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4, 2 % (w/v) agar, 0,25 % (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml karbenicillin/ampicillin; 1% DMSO, 25 ng / μL tunicamycin
Paraquat 400 mM løsning i vann – bør tilberedes fersk
Tetracycline 10 mg/ml stamløsning (500x) i 100 % etanol. Oppbevares ved -20 °C
Tunicamycin 2,5 mg/ml stamløsning i 100 % DMSO. Oppbevares ved -80 °C for langtidsoppbevaring. Dette er en 100x løsning (25 ng / μL arbeidsløsning)

Tabell 1. Oppskrifter for reagenser og medier for protokoller.

Tilsvarende figurpanel Stamme, behandling Median levetid # Dødsfall/# Totalt p-verdi
(Log-Rank)
1A N2, vektor RNAi, 20 °C 17 74/120 --
N2, HSF-1 RNAi, 20 °C 11 65/120 <0,001
1B N2, vektor RNAi, FUDR, 20 °C 19 120/120 --
N2, HSF-1 RNAi, FUDR, 20 °C 11 116/120 <0,001
1C N2, glp-4(bn2), vektor RNAi, 25 °C 13 115/121 --
N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C 4 120/120 < 0,001
2A N2, vektor RNAi, 20 °C, 1 % DMSO 19 85/120 --
N2, vektor RNAi, 20 °C, 10 ng/μL tunikamycin 15 109/120 <0,001
N2, vektor RNAi, 20 °C, 25 ng/μL tunikamycin 12 117/120 <0,001
2B N2, vektor RNAi, 20 °C 19 84/120 --
N2, vektor RNAi, 20 °C, 0,25 mM paraquat 24 91/120 <0,001
N2, vektor RNAi, 20 °C, 4 mM paraquat 6 50/120 <0,001

Tabell 2. Statistikk for levetid og stressmotstandskraft.

Discussion

Levetid, mest enkelt definert som livets varighet, er et klart binært fenomen i de fleste organismer - enten en organisme lever eller ikke. Lang levetid korrelerer imidlertid ikke alltid med en organismes helse. For eksempel er mitokondrielle hormesismodeller der eksponering for mitokondrielt stress dramatisk øker levetiden generelt noen av de lengstlevende dyrene, men viser forkrøplet vekst og redusert metabolsk funksjon37,54. På samme måte viser dyr med hyperaktive endoplasmatiske retikulumstressresponser også visse atferd og fenotyper som kan korreleres med redusert helse, til tross for at de har dramatisk forbedret proteinhomeostase og levetid36,49. Endelig er mange levetidsparadigmer i modellorganismer, inkludert økt HSF-1-funksjon55, økt XBP-1-funksjon56 og endret FoxO-signalering57, alle korrelert med økt kreftrisiko, og det er ubestridelig at forlenget levetid ikke er gunstig hvis en organisme er i konstant kamp med kreft og andre helsesykdommer. Derfor kan lang levetid ikke være en frittstående måling i aldrende biologi.

Dermed har begrepet healthspan vært et voksende felt i aldrende biologi. Healthspan, løst definert som den perioden av livet som man er sunn, er vanskeligere å fastslå enn lang levetid. Imidlertid, i motsetning til lang levetid, er begrepet "helse" komplisert, da det er mange forskjellige avlesninger for organismenes helse: på organismenivå er det muskelfunksjon / styrke, nevronal / kognitiv funksjon, reproduktiv helse, etc.; På mobilnivå er det proteinhomeostase, lipidhomeostase, glukosehomeostase, metabolisme, etc. I 2014 har aldrende biologer definitivt karakterisert biologiske kjennetegn ved aldring med den strukturerte definisjonen at det må være noe som naturlig brytes ned under aldring og kan eksperimentelt endres slik at eksperimentell forverring bør akselerere aldring og eksperimentell intervensjon bør bremse aldring. Disse ni kjennetegnene ved aldring inkluderer genomisk ustabilitet, telomerslitasje, epigenetiske endringer, tap av proteinhomeostase (proteostase), stamcelleutmattelse, endret intercellulær signalering, mitokondriell dysfunksjon, deregulert næringssensor og cellulær senescens58. Siden da hevder mange studier at andre faktorer bør inkluderes, inkludert ekstracellulære proteiner og systemisk fysiologi som immunitet og betennelse59. Til syvende og sist krever den komplekse definisjonen av healthspan at organismenes helse måles ved hjelp av flere forskjellige metoder.

I dette manuskriptet presenteres derfor flere metoder for å måle ulike aspekter ved healthspan ved hjelp av nematodemodellen C. elegans. Vi analyserer lokomotorisk oppførsel ved hjelp av thrashing analyser, reproduktiv helse ved hjelp av egg teller og brød størrelse, og følsomhet for stress. Faktisk er lokomotorisk oppførsel en gullstandardmetode for måling av healthspan, da organismer utviser betydelig tap av motilitet og bevegelse under aldring51. Tap av bevegelsesadferd kan tilskrives flere kjennetegn ved aldring, da muskelfunksjon i C. elegans er avhengig av riktig proteostase60, mitokondriell dysfunksjon61 og nevronmuskelsignalering62. Mens dette manuskriptet fokuserer på en måling av bevegelsesadferd, er det viktig å merke seg at mange andre metoder eksisterer, inkludert motilitet hos dyr på en solid agarplate, respons på berøring51 og kjemotaksisanalyser63. Imidlertid krever disse metodene generelt mer sofistikerte opptaksenheter, bruk av ormsporingsprogramvare eller bruk av dyre, farlige eller flyktige kjemikalier, som alle kan være uoverkommelige i enkelte forskningsinnstillinger.

I tillegg presenteres analyser for eggtelling og brødstørrelse som en metode for måling av reproduktiv helse og som den enkleste metoden for å måle celledeling i voksne ormer, siden voksne ormer er post-mitotiske og bare kimceller og embryoer gjennomgår celledeling i en voksen orm64. Som et mål på celledeling kan reproduktiv helse være relevant for de aldrende kjennetegnene ved cellulær senescens og stamcelleutmattelse. Reproduktiv helse kan påvirkes av mange faktorer, inkludert patogen infeksjon65 eller eksponering for stress49, selv om det ikke er noen direkte sammenheng mellom reproduktiv helse og lang levetid. Faktisk viser noen langlivede dyr en betydelig reduksjon i brødstørrelse49, og det er til og med mulig at det eksisterer en omvendt sammenheng mellom levetid og brødstørrelse50. Dette er ikke et fenomen som er spesifikt for C. elegans, da skadelige effekter av reproduksjon på lang levetid lenge har blitt observert hos mennesker66,følgesvenner 67 og mus68. Likevel gir vi eggtelling og brødstørrelse som en pålitelig og billig metode for å måle reproduktiv helse med forbehold om at reproduktiv helse kanskje ikke korrelerer med lang levetid eller helse.

Til slutt tilbys overlevelsesanalyser som et indirekte mål på organismenes helse. Det er viktig at cellulære stressresponser, inkludert respons på termisk stress69 og ER-stress35, raskt avtar under aldringsprosessen og har direkte relevans for det aldrende kjennetegnet for proteostase70,71. I motsetning til dette kan hyperaktiverende stressresponser øke levetiden betydelig ved å fremme motstandskraft mot stress 35,37,38. Mens denne studien fokuserer på de enkleste og laveste kostnadsmetodene, finnes det et stort antall alternative metoder for stressmotstandsanalyser for termotolerans41 og oksidativt stress66, som hver krever et annet sett med utstyr og forbruksvarer. Utover enkle eksponeringsstudier for stressorer, kan andre fysiologiske metoder utføres avhengig av tilgang til utstyr. For eksempel kan en ekstracellulær fluksanalysator overvåke mitokondriell funksjon og cellulær respirasjon73; fluorescerende disseksjonsmikroskoper vil tillate målinger av transkripsjonsreportere for aktivering av stressrespons20; og høyoppløselige sammensatte eller konfokale mikroskoper kan brukes til å måle organellmorfologi med fluorescerende prober for mitokondrier74, endoplasmatisk retikulum 75,76 og aktincytoskelett77.

Som en siste advarsel for målinger av lang levetid, mens kjemiske og genetiske metoder for sterilisering av ormer tilbys å redusere kostnadene betydelig, er det viktig å merke seg at begge kan påvirke levetiden direkte. For eksempel er eksponering for FUDR tidligere rapportert å påvirke både levetid og termotolerans45. Og mens glp-4 (bn2) mutanten i seg selv ikke har noen direkte effekter på levetiden, er vekst ved 25 ° C en mild varmespenning33,34 og kan dermed påvirke levetiden2. Det finnes andre metoder for sterilisering av C. elegans, inkludert auxinmediert sterilitet78 eller alternative temperaturfølsomme sperm-mangelfulle mutanter79. Imidlertid har alle metoder noen forbehold, og det bør tas hensyn til å utnytte den minst skadelige analysen for hvert laboratoriums vitenskapelige behov. En siste begrensning av levetidsstudier er potensiell variabilitet som kan oppstå på grunn av lave utvalgsstørrelser eller bare ved en objektiv feil av etterforskeren. Dette kan omgås ettersom ny teknologi er født i automatiserte levetidsteknologier80, men igjen er disse systemene kostbare og krever noe ingeniør- og beregningsutstyr og ferdigheter. Til syvende og sist er samlingen av metoder som tilbys her et pålitelig sett med verktøy som raskt kan tilpasses og læres i nesten hvilken som helst institusjon og gir et solid grunnlag for aldringsbiologi.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

G.G. støttes av T32AG052374 og R.H.S. støttes av R00AG065200 fra National Institute on Aging. Vi takker CGC (finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) for belastningene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APEX IPTG Genesee 18-242 for RNAi
Bacto Agar VWR 90000-764 for NGM plates
Bacto Peptone VWR 97064-330 for NGM plates
Calcium chloride dihydrate VWR 97061-904 for NGM plates
Carbenicillin VWR 76345-522 for RNAi
Cholesterol VWR 80057-932 for NGM plates
DMSO VWR BDH1115-1LP solvent for drugs
LB Broth VWR 95020-778 for LB
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-132 for NGM plates, M9
Paraquat Sigma-Aldrich 36541 for oxidative/mitochondrial stress
Potassium Chloride VWR 97061-566 for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic VWR EM-PX1570-2 for NGM plates
Potassium phosphate monobasic VWR EM-PX1565-5 for M9
S7E Dissecting Scope Leica 10450840 Standard dissecting microscope
Sodium Chloride VWR EM-SX0420-5 for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite VWR RC7495.7-32 for bleach solution
Sodium phosphate dibasic VWR 71003-472 for M9
Tetracycline hydrochloride VWR 97061-638 for RNAi
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-50MG for ER stress

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  3. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  4. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  5. Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
  6. Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, Suppl 1 10-16 (2014).
  7. Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
  8. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
  9. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  12. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  13. Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
  14. Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
  15. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  16. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  17. Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
  18. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  19. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
  20. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001 (2020).
  21. Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
  22. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  23. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  24. Kim, H. -M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  25. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  26. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19648/ (2006).
  27. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  28. Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
  29. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
  30. Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
  31. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), Cambridge, England. 755-766 (1992).
  32. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  33. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  35. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  36. Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489 (2020).
  37. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  38. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  39. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  40. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  41. Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  42. Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203 (2013).
  43. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  44. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), San Diego, Calif. 450-457 (2014).
  45. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964 (2014).
  46. Hsu, A. -L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  47. Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
  48. Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
  49. Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
  50. Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), Albany NY. 986-994 (2016).
  51. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  52. Lee, S. -J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
  53. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
  54. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  55. Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
  56. Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069 (2020).
  57. Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
  58. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  59. Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
  60. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  61. Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  62. Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
  63. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069 (2013).
  64. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  65. Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
  66. Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
  67. Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082 (2013).
  68. Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
  69. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  70. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  71. Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fragi.2022.860404 (2022).
  72. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086 (2017).
  73. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
  74. Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749 (2017).
  75. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  76. Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441 (2020).
  77. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
  78. Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
  79. Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
  80. Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Tags

Genetikk utgave 183 C. elegans stress aldring utfoldet proteinrespons endoplasmatisk retikulum mitokondrier varmesjokkrespons
Kartlegge lavkostnadsmetoder for å måle levetid og helse i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro Torres, T., Moaddeli, D.,… More

Castro Torres, T., Moaddeli, D., Averbukh, M., Coakley, A. J., Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (183), e64091, doi:10.3791/64091 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter