Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Lipidtilskud til lang levetid og gentranskriptionel analyse i Caenorhabditis elegans

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64092
* These authors contributed equally

Summary

Den nuværende protokol beskriver lipidtilskudsmetoder i flydende og on-plate kulturer for Caenorhabditis elegans, kombineret med langsgående undersøgelser og gentranskriptionel analyse fra bulk eller nogle få orme og ormvæv.

Abstract

Aldring er en kompleks proces præget af progressive fysiologiske ændringer som følge af både miljømæssige og genetiske bidrag. Lipider er afgørende for at udgøre strukturelle komponenter i cellemembraner, lagre energi og som signalmolekyler. Regulering af lipidmetabolisme og signalering er afgørende for at aktivere forskellige levetidsveje. Rundorm Caenorhabditis elegans er en fremragende og kraftfuld organisme til at dissekere bidraget fra lipidmetabolisme og signalering i levetidsregulering. Flere forskningsundersøgelser har beskrevet, hvordan kosttilskud af specifikke lipidmolekyler kan forlænge C. elegans levetid; Men, mindre forskelle i tilskud betingelser kan forårsage reproducerbarhed spørgsmål blandt forskere i forskellige laboratorier. Her rapporteres to detaljerede tilskudsmetoder til C. elegans ved anvendelse af lipidtilskud enten med bakterier podet på plader eller bakteriel suspension i flydende kultur. Også heri er detaljerne til at udføre levetidsanalyser med livslang lipidtilskud og qRT-PCR-analyse ved hjælp af et helt ormlysatat eller dissekeret væv afledt af nogle få orme. Ved hjælp af en kombination af langsgående undersøgelser og transkriptionelle undersøgelser af lipidtilskud giver fodringsassays pålidelige tilgange til at dissekere, hvordan lipider påvirker levetid og sund aldring. Denne metode kan også tilpasses til forskellige ernæringsmæssige screeningsmetoder til vurdering af ændringer i en delmængde af transkripter ved hjælp af enten et lille antal dissekerede væv eller nogle få dyr.

Introduction

Lipider
Lipider er små hydrofobe eller amfipatiske molekyler, der er opløselige i organiske opløsningsmidler, men uopløselige i vand 1,2. Forskellige lipidmolekyler adskiller sig fra hinanden baseret på antallet af carbonatomer indeholdt i deres kæder, placering, antal dobbeltbindinger og bundne strukturer, herunder glycerol eller fosfater. Lipider spiller afgørende roller inden for og på tværs af forskellige celler for at regulere organismefunktioner, herunder at udgøre membrandobbeltlag, tilvejebringe energilagring og fungere som signalmolekyler 3,4.

For det første er lipider strukturelle komponenter i biologiske membraner, herunder plasmamembranen og intracellulære subcellulære membraner, der adskiller de indre rum fra det ekstracellulære miljø. For det andet er lipider den vigtigste form for energilagring hos hvirveldyr og hvirvelløse dyr. Neutrale lipider, herunder triacylglyceroler, opbevares i en længere periode i forskellige væv, herunder i fedtvæv. I nematoden Caenorhabditis elegans er tarmen det vigtigste metaboliske fedtlagringsorgan; Dens funktion er ikke kun involveret i fordøjelse og absorption af næringsstoffer, men også i afgiftningsprocessen, der ligner aktiviteten af pattedyrs hepatocytter. Andre fedtopbevaringsvæv omfatter kimlinjen, hvor lipider er afgørende for udvikling af oocytter, og hypodermis, der består af hudlignende epidermale celler 3,5. For det tredje har flere beviser i de senere år antydet, at lipider er kraftige signalmolekyler involveret i intra- og ekstracellulær signalering ved direkte at virke på en række receptorer, herunder G-proteinkoblede og nukleare receptorer, eller indirekte via membranfluiditetsmodulation eller posttranslationelle modifikationer 6,7,8,9 . Yderligere undersøgelser vil fortsætte med at belyse de underliggende molekylære mekanismer for lipidsignalering til fremme af lang levetid og sundhed.

Modelorganismer er vigtige for at løse specifikke biologiske spørgsmål, der er for komplekse til at studere hos mennesker. For eksempel er rundorm C. elegans en fremragende model til gennemførelse af genetisk analyse for at dissekere biologiske processer, der er relevante for menneskelig ernæring og sygdom10. De højt bevarede molekylære veje, der er relevante for menneskelig fysiologi, komplekse væv, adfærdsmønstre og rigelige genetiske manipulationsværktøjer, gør C. elegans til en bemærkelsesværdig modelorganisme11. For eksempel er C. elegans fremragende til at videresende genetiske skærme til at identificere fænotypespecifikke gener såvel som i genom-dækkende omvendte genetiske skærme via RNA-interferens12.

I laboratorier dyrkes nematoderne på agar Petri-plader podet med en græsplæne af Escherichia coli-bakterier, der giver makronæringsstoffer som proteiner, kulhydrater og mættede og umættede fedtsyrer som energikilder og byggesten og mikronæringsstoffer såsom co-faktorer og vitaminer13. I lighed med pattedyr syntetiserer nematoder fedtsyremolekyler fra både palmitinsyre og stearinsyre (henholdsvis mættede 16-carbon- og 18-carbonmolekyler), der sekventielt desatureres og forlænges til en række mono-umættede fedtsyrer (MUFA'er) og flerumættede fedtsyrer (PUFA'er)14,15,16,17,18. Interessant nok er C. elegans i stand til de novo-syntese af alle de krævede fedtsyrer og kerneenzymer involveret i fedtsyrebiosyntese, desaturation og forlængelse, hvilket letter syntesen af langkædede PUFA'er19. Forskellig fra andre dyrearter kan C. elegans omdanne 18-carbon og 20-carbon ω-6 fedtsyrer til ω-3 fedtsyrer med sine egne ω-3 desaturase enzymer. Derudover har orme en Δ12 desaturase, der katalyserer dannelsen af linolsyre (LA) fra oliesyre (OA, 18: 1) 20,21. De fleste dyr eller planter mangler både Δ12 og ω-3 desaturaser og er derfor afhængige af diætindtagelse af ω-6 og ω-3 for at opnå deres PUFA'er, mens C. elegans ikke kræver diætfedtsyrer22. Isolerede mutanter, der mangler funktionelle desaturaseenzymer, er blevet brugt til at studere funktionerne af specifikke fedtsyrer i forskellige biologiske processer, herunder reproduktion, vækst, lang levetid og neurotransmission. Effekten af individuelle fedtsyrer på specifikke biologiske veje kan behandles ved hjælp af både en genetisk tilgang og kosttilskud16,17,23. Hidtil har lipidforskning fokuseret på at karakterisere gener involveret i lipidsyntese, nedbrydning, opbevaring og nedbrydning i neurologiske og udviklingsmæssige tilstande24. Imidlertid er lipidernes roller i levetidsregulering lige begyndt at blive afsløret.

Lipidsignalering i levetidsregulering
Lipider spiller afgørende roller i levetidsregulering ved at aktivere cellulære signalkaskader i forskellige væv og celletyper. Nylige undersøgelser har fremhævet lipidernes aktive roller i modulerende transkription og cellecellekommunikation via lipidbindende proteiner eller genkendelse af membranreceptorer25. Derudover tilbyder diætlipidtilskud et glimrende værktøj til at dissekere, hvordan lipidmetabolisme påvirker levetiden i C. elegans. Forskellige MUFA'er og PUFA'er har vist sig at fremme lang levetid ved at aktivere transkriptionsfaktorer26,27.

Levetidsmodeller, herunder insulin / IGF-1-signalering og ablation af kimlinjeprækursorceller, er forbundet med MUFA-biosyntesevejen, og MUFA-tilskud, herunder oliesyre, palmitolsyre og cis-vaccensyre, er tilstrækkelig til at forlænge C. elegans levetid26. Selvom den levetidseffekt, der tildeles af MUFA-administrationen, kræver yderligere undersøgelse, vil den underliggende mekanisme sandsynligvis blive formidlet af SKN-1/Nrf2-transkriptionsfaktoren, som er en nøgleaktivator for oxidativ stressrespons og levetidsregulering28,29. Blandt MUFA'er spiller en bestemt klasse af fede acylethanolamider kaldet N-acylethanolaminer (NAE'er) afgørende roller i forskellige mekanismer, herunder inflammation, allergier, læring, hukommelse og energimetabolisme30. Især lipidmolekylet kendt som oleoylethanolamid (OEA) er blevet identificeret som en positiv regulator af lang levetid ved at fremme translokationen af det lipidbindende protein 8 (LBP-8) i kernen for at aktivere de nukleare hormonreceptorer NHR-49 og NHR-807. Tilskud af OEA-analogen KDS-5104 er tilstrækkelig til at forlænge levetiden og inducerer ekspression af gener involveret i oxidative stressresponser og mitokondrie β-oxidation 7,8.

Samtidig har PUFA'ernes rolle også været knyttet til regulering af levetiden. Administration af PUFA ω-3 fedtsyre α-linolensyre (ALA) fremmer levetiden ved at aktivere NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF transkriptionsfaktorer og inducere mitokondrie β-oxidation31. Interessant nok aktiverer peroxiderede produkter af ALA, kaldet oxylipiner, SKN-1 / NRF, hvilket tyder på, at både PUFA'er og deres oxidative derivater kan give levetidsfordele23. Tilskud af ω-6 fedtsyre arachidonsyre (AA) og dihomo-γ-linolensyre (DGLA) forlænger levetiden via autofagiaktivering, hvilket fremmer proteinkvalitetskontrol og resulterer i nedbrydning af spildte og giftige proteinaggregater27,32. For nylig har en celle-ikke-autonom signalregulering medieret af det lipidbindende protein 3 (LBP-3) og DGLA vist sig at være afgørende for at fremme lang levetid ved at sende perifere signaler til neuroner, hvilket tyder på en langtrækkende rolle af lipidmolekyler i intervævskommunikation på systemiske niveauer33. Den nuværende undersøgelse rapporterer hvert trin til at udføre lipidtilskud med bakterier podet på plader eller bakteriel suspension i flydende kultur. Disse metoder bruges til at vurdere levetid og transkriptionel analyse, anvende hele kropsindhold eller dissekeret væv afledt af nogle få orme. Følgende teknikker kan tilpasses en række ernæringsmæssige undersøgelser og tilbyde et gyldigt værktøj til at dissekere, hvordan lipidmetabolisme påvirker lang levetid og sund aldring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 1 viser et skema over lipidfodring ved hjælp af forskellige eksperimentelle indstillinger.

1. Fremstilling af lipidkonditionerede bakterier

  1. Forbered baseopløsningen Bakteriel fortynding kostbegrænsning (BDR) ved at opløse 5,85 g NaCl, 1,0 g K 2 HPO 4og 6,0 g KH2PO4 (se Materialetabel) i 999 ml deioniseret vand. Juster pH til 6,0 med 0,5 M KOH, og filtrer derefter gennem et filter på 0,22 μm.
    BEMÆRK: BDR-opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur til langtidsopbevaring.
  2. Bdr-mediet fremstilles ved at tilsætte 10 μL 5 mg/ml kolesterol (opløst i 200-resistent ethanol) til hver 10 ml BDR-baseopløsning.
  3. Stribe OP50-bakterierne (se materialetabel) fra -80 °C til LB-agarplader og inkuberes ved 37 °C natten over.
    BEMÆRK: Efter inkubationen natten over ved 37 °C kan OP50-pladen opbevares ved 4 °C i op til 1 uge for stabile fodringsresultater.
  4. Pod OP50-bakterierne fra OP50 LB-agarpladen til LB-medium og inkuberes i en 37 ° C shaker natten over (16 timer).
    BEMÆRK: Den nødvendige LB-mellemvolumen afhænger af de eksperimentelle indstillinger. Det anbefales at bruge 200 μL 5x koncentrerede bakterier podet på hver af 6 cm pladerne og 1 ml 5x koncentrerede bakterier til hver af de 10 cm plader og hver replikat af væskefodringsbetingelserne. Således skal der fremstilles henholdsvis 1 ml og 5 ml indledende LB-podning for hver lipidfodringskultur.
  5. Opsamling bakterier ved centrifugering ved 4.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.
  6. Bakteriepelleten ophænges i 20 ml BDR-base, og centrifugeres ved 4.000 x g i 10 min. Kassér supernatanten.
    BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at vaske resterne af LB i bakteriepelleten af.
  7. Suspender hver bakteriepellet i BDR-mediet for at lave en 20x BDR-bakteriebestand. Fortynd 20x BDR-bakterielageret med BDR-medium til 5x før brug.
    BEMÆRK: Brug et 1/20 volumen BDR-medium af det originale LB-volumen for at nå en 20x koncentration for bakterierne. 20x bakteriebestanden kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
  8. Forbered en lipidstamopløsning ved hjælp af ethanol eller dimethylsulfoxid (DMSO) som opløsningsmiddel i et nyt autoklaveret glashætteglas, og fyld hætteglasset med argon eller nitrogen for at forhindre oxidation.
    BEMÆRK: Stamopløsningskoncentrationen er normalt mellem 250 mM og 1 mM.
  9. Overfør lipidstamopløsningen til den ønskede mængde BDR-bakterieopløsning for at opnå den ønskede endelige koncentration under fodringsbetingelser. Bland grundigt ved hvirvlning i 20 s.
    BEMÆRK: Den endelige koncentration af lipiderne i fodring er normalt 1 μM til 1 mM, afhængigt af lipid- og testbetingelserne. Det anbefales at køre et pilotforsøg først for at teste forskellige koncentrationer fra 0,1 μM til 1 mM, hvis man arbejder med nye lipider. Bland lipidstamopløsningen med BDR-bakterier umiddelbart før du poder den på pladen eller sætter den i flydende ormkulturer. Forbered de lipidkonditionerede bakterier ikke længere end 1 time, før de fodres til ormene.
  10. Bland de samme mængder filtreret ethanol eller DMSO (afhængigt af hvilken der bruges til lipidfodringsgruppen) med BDR-bakterier for at tjene som køretøjets kontrol.

2. Fremstilling af synkroniserede C. elegans til lipidtilskud

  1. M9-bufferen fremstilles ved at blande (ved hjælp af specificerede slutkoncentrationer) 22 mM KH 2 PO 4, 22 mM Na 2 HPO 4, 85 mM NaCl og2mM MgSO 4 (se materialetabel). Autoklave bufferen til sterilisering.
  2. Forbered en frisk blegemiddelopløsning med 60% husblegemiddel (v / v, se materialetabel) og en endelig koncentration på 1,6 M NaOH.
  3. Saml gravide voksne i et 15 ml konisk rør ved hjælp af 10 ml M9 buffer.
    BEMÆRK: Antallet af orme og plader, der er nødvendige til synkronisering, afhænger af de eksperimentelle indstillinger (dvs. antal betingelser og replikater og fodringsmetoder). Ideelt set bør hver fuld 6 cm plade af voksne orme kunne give mindst 600 L1 orme efter synkronisering.
  4. Drej ormene ned ved 1.450 x g i 30 s. Fjern supernatanten og skyl ormene endnu en gang med 10 ml M9 buffer.
  5. Drej ormene ned ved 1.450 x g i 30 s. Aspirer supernatanten og efterlader en 4 ml aliquot i det koniske rør. Tilsæt 2 ml blegemiddelopløsning og ryst kraftigt i 1 min.
  6. Drej ormene ned ved 1.450 x g i 30 s ved stuetemperatur.
  7. Fjern supernatanten og tilsæt 4 ml M9 buffer og 2 ml blegemiddelopløsning. Ryst røret, indtil ormlegemerne er opløst.
  8. Drej æggene ned ved 1.450 x g i 30 s ved stuetemperatur.
  9. Fjern supernatanten og vask æggene med 10 ml M9 buffer.
  10. Gentag trin 2.8 og 2.9 3x.
  11. Suspender embryonerne med 6 ml M9-buffer. Piv embryonerne på en rotator ved 20 °C i 2 dage for at lade dem klække og synkronisere.
  12. Overfør L1 larver til OP50 frøplader. Inkuberes ved 20 °C i 48 timer for at opsamle synkroniserede L4-orme, 72 timer for dag-1 voksne og 96 timer for dag-2 voksne.
    BEMÆRK: OP50 plader fremstilles ved at tilføje 1 ml 20x OP50 bakterier til hver 10 cm nematode vækstmedium (NGM) plade34. 30.000 L1-orme kan sås til hver af OP50-pladerne, hvis de sigter mod at høste ormene på L4-stadiet, og 20.000 L1-orme kan sås til hver af OP50-pladerne, hvis de sigter mod at høste dag 1-voksne i de nuværende eksperimentelle indstillinger. Det kan være anderledes for forskellige laboratorieindstillinger, så det anbefales at teste de ormnumre, der kan sås for at sikre, at ormene har nok mad tilbage, før de høstes.
  13. Saml L4, dag-1 voksen eller dag-2 voksne orme i et 15 ml konisk rør ved hjælp af 10 ml M9 buffer. Brug yderligere 5 ml M9-buffer til at skylle de resterende orme af pladerne.
  14. Drej ormene ned ved 1.450 x g i 30 s og kassér supernatanten. Ormpellet vaskes med 10 ml BDR-medium, centrifuge ved 1.450 x g i 30 s, og supernatanten kasseres.
  15. For orme i væskefodringsmetoden overføres BDR-mediet til ormene for at opnå en ormkoncentration på 3.000 orme / ml. For orme i fodringsmetoder på pladen skal du reducere mængden af BDR-medium, der tilsættes ormene, for at reducere tørretiden på pladen.

3. Lipidtilskud til C. elegans

  1. Udfør lipidtilskud i flydende kultur ved at følge nedenstående trin.
    BEMÆRK: Denne metode er velegnet til test af transkriptionelle ændringer ved hjælp af bulkorme suppleret med lipider.
    1. Overfør den ønskede mængde lipid eller køretøjskontrol til hver af brøndene i en 12-brøndsplade. Forbered tre til fire brønde til hver fodringstilstand som en biologisk replikation.
    2. Bland ormssuspensionen fra trin 2,15 med 5x BDR-bakterier i forholdet 1:1 for at opnå en endelig koncentration på 1.500 orme/ml og 2,5x for bakterier.
    3. Overfør 2 ml orm-bakterieblanding i BDR-medium til hver brønd i 12-brøndspladen.
    4. Pak 12-brøndspladen med folie og ryst i en 20 ° C inkubator ved 100 o / min for den ønskede inkubationslængde.
      BEMÆRK: For at teste forskellige fodringsbetingelser skal du inkubere lipiderne med orme i forskellige tidsrum, såsom i 6 timer, 12 timer og 24 timer. Derudover kan forskellige ormstadier testes for optimale resultater, herunder lipidfodring fra L4- eller dag-1-voksenstadiet.
  2. Udfør lipidtilskud på 10 cm NGM agar plader ved at følge nedenstående trin.
    BEMÆRK: Denne metode er velegnet til test af transkriptionelle ændringer ved hjælp af bulkorme suppleret med lipider.
    1. Frø 1 ml af de lipidkonditionerede bakterier fra trin 1,9 på midten af hver af de 10 cm plader. Når der er forberedt et stort antal plader, skal du pakke den endelige arbejdsløsning flere gange mellem såning. Tør pladerne i mørke ved hjælp af en biosikkerhedshætte.
    2. Overfør 3.000 orme fra trin 2,15 til hver af de 10 cm plader. Tør pladerne i en biosikkerhedshætte, indtil ormene kan kravle på de lipidsupplerede plader i stedet for at svømme.
    3. Inkuber ormene på de lipidkonditionerede plader i en 20 ° C inkubator i den ønskede tid. Beskyt mod lys, hvis du bruger polyumættede lipider.
      BEMÆRK: For at teste forskellige fodringsbetingelser inkuberes lipiderne med orme i forskellige tidsperioder, såsom 6 timer, 12 timer og 24 timer. Derudover kan forskellige ormstadier testes for optimale resultater, herunder lipidfodring på L4- eller dag-1-voksenstadiet.
  3. Udfør lipidtilskud på 6 cm NGM agarplader til transkriptionel analyse.
    BEMÆRK: Denne metode er velegnet til test af transkriptionelle ændringer i nogle få orme suppleret med lipider.
    1. Frø 300 μL lipidkonditionerede bakterier fra trin 1,9 på midten af hver af 6 cm plade. Når der er forberedt et stort antal plader, skal du pakke den endelige arbejdsløsning flere gange mellem såning. Tør pladerne i mørke ved hjælp af en biosikkerhedshætte.
    2. Overfør op til 300 orme fra trin 2,15 til hver af de 6 cm plader. Tør pladerne i en biosikkerhedshætte, indtil orme kan kravle på de lipidsupplerede plader i stedet for at svømme.
    3. Inkuber ormene på de lipidkonditionerede plader i en 20 ° C inkubator i den ønskede tid. Beskyt mod lys, hvis du bruger polyumættede lipider.
      BEMÆRK: For at teste forskellige fodringsbetingelser skal du inkubere lipiderne med orme på forskellige tidspunkter, såsom 6 timer, 12 timer og 24 timer. Derudover kan forskellige ormstadier testes for optimale resultater, herunder lipidfodring på L4- eller dag-1-voksenstadiet.
  4. Udfør lipidtilskud på 6 cm NGM agarplader til langsgående levetidsanalyse.
    1. Frø 200 μL lipidkonditionerede bakterier (med 1x lipidkoncentration og 5x koncentrerede bakterier) på midten af hver af de 6 cm NGM-plader. Forbered tre plader til hver fodringstilstand.
      BEMÆRK: Pladerne skal tilberedes frisk på brugsdagen (ideelt lige før brug).
    2. Tør pladerne i en biosikkerhedshætte. Hold lyset i emhætten og rummet slukket, hvis du bruger flerumættede lipider.
    3. Vælg 30-40 synkroniserede L4-orme til hver af pladerne. Opbevar pladerne med ormene i en 20 °C inkubator. Hvis du fodrer med flerumættede lipider, skal du opbevare pladerne i en lysbeskyttet kasse i 20 °C inkubatoren.
      BEMÆRK: Det er muligt at bruge OP50 fra en normal 6 cm passageplade (ubetinget OP50) som lim til at samle orme op, men det er afgørende ikke at efterlade en stor del af den ubetingede OP50 i analysepladen.
    4. Overfør ormene til nye, frisklavede lipidkonditionerede plader dagligt eller hver anden dag, afhængigt af den ønskede fodringstilstand. Overlevelse scores på samme måde som tidligere beskrevet4.

4. RNA-ekstraktion til transkriptionel analyse

  1. Udfør RNA-ekstraktion fra et stort antal hele orme.
    1. Overfør orme i væskekulturen fra trin 3,1 til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Orme vaskes af 10 cm pladerne fra trin 3.2 ved hjælp af M9-buffer, og ormene overføres i M9-buffer til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Centrifuger kortvarigt ormene med en bordplade minicentrifuge (se Materialetabel) i 10 s og opsuger hurtigt supernatanten.
    3. Overfør rester af orme fra de flydende fodringsbrønde eller vask fra tallerkenfodringerne til det samme rør og spin ned. Fjern supernatanten.
    4. Vask ormpillerne med 1 ml iskold M9, drej kort i 10 s med en minicentrifuge, og opsug supernatanten. Gentag 1x eller 2x afhængigt af supernatantens gennemsigtighed.
    5. Sæt mikrocentrifugerørene på is i 2 minutter, og fjern så meget supernatant som muligt med en 200 μL pipette, hvilket efterlader en pakket ormepille på højst 15 μL volumen.
    6. Overfør 15 μL RNA-ekstraktionsopløsning indeholdende phenol og guanidinisothiocyanat (materialetabel) til hvert af mikrocentrifugerørene, og mal ormene med en motorkværn i ca. 30 s, indtil der ikke er synlige intakte orme.
      FORSIGTIG: RNA-ekstraktionsopløsningen er giftig og brandfarlig, og ethvert trin, der involverer en åben beholder med dette reagens, skal betjenes i en kemisk hætte.
    7. Overfør 285 μL af RNA-ekstraktionsopløsningen til mikrocentrifugerøret, mens du skyller ethvert ormindhold fra motorkværnspidsen til mikrocentrifugerøret. Vortex at blande grundigt.
      BEMÆRK: Dette er et pausepunkt. Prøver kan opbevares i RNA-ekstraktionsopløsningen ved -80 °C i et par måneder. Når prøverne tages ud af -80 °C, optøes ved stuetemperatur.
    8. Der overføres 60 μL chloroform til hver prøve og hvirvel kraftigt. Lad prøverne sætte sig ved stuetemperatur i 10 min.
      FORSIGTIG: Kloroform er giftigt og skal håndteres i en kemisk hætte.
    9. Centrifuge ved 21.000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Overfør forsigtigt 140 μL af det vandige lag på toppen til et nyt og RNase-frit mikrocentrifugerør ved hjælp af en 200 μL pipette, der overføres 2x med 70 μL hver gang.
      BEMÆRK: Fra dette trin fremad skal alle pipettespidser og beholdere, der har direkte kontakt med prøven, være RNase-fri. Det foreslås også at bruge RNase-dekontamineringsløsning til at tørre alt udstyr og arbejdsområdet af.
    10. Der overføres 140 μL isopropanol til prøverøret. Hvirvel kraftigt og lad prøven sætte sig ved stuetemperatur i 10 min. Der centrifugeres ved 21.000 x g i 20 minutter ved 4 °C, og alle supernatanter fjernes forsigtigt.
    11. Overfør 0,5 ml iskold 80% ethanol (v/v) til prøverøret med RNA-pellet. Vortex kraftigt, indtil RNA-pellet forlader bunden af røret og flyder rundt i ethanolopløsningen. Der centrifugeres ved 21.000 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes.
    12. Prøverørene centrifugeres kortvarigt i minicentrifugen i 15 s for at spinde ethvert opløsningsmiddel, der klæber til rørvæggen, og fjern derefter så meget ethanolopløsning som muligt med en pipette.
    13. Lad rørhætten være åben for at tørre RNA-pelleten. Hvis pelleten blev vasket grundigt med ethanolopløsningen, skal tørringstrinnet tage mindre end 10 minutter.
      BEMÆRK: Dette er et pausepunkt. Den tørrede RNA-pellet kan opbevares ved -80 °C i op til 1 måned.
    14. Opløs den tørre RNA-pellet med 40 μL nukleasefrit vand og behandl med et DNA-fjernelsessæt i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel).
      BEMÆRK: Det anbefales at opløse RNA i nukleasefrit vand først. Hvis 40 μL vand blandes med 10x DNasebufferen, inden det overføres til RNA-røret, opløses RNA-pellet ikke fuldstændigt. RNA-prøverne skal opbevares på is, når RNA-pellet opløses i vand. Fryse-optøningscyklusser reducerer RNA-kvaliteten; Fortsæt derfor til det omvendte transkriptionstrin samme dag som DNase-behandlingen.
  2. RNA-ekstraktion fra et lille antal hele orme.
    1. Pluk 15-20 orme fra deres bakterieplæne i en frisk useedet NGM-plade for at fjerne bakterierne fra ormen.
    2. Ifølge producenten af qRT-PCR 2-trinssættet (se Materialetabel) fremstilles 20 μL endelig lyseopløsning for hver prøve ved at blande 0,2 μL DNase med 19,8 μL lysisopløsning i PCR-rør. Bland lysisopløsningen ved at pipettere op og ned 5x.
    3. Overfør 15-20 orme fra den useedede NGM-plade til PCR-røret indeholdende 20 μL af den endelige lysisopløsning med det mindste antal bakterier. Inkuber lysisreaktionen i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Sonde-sonikat (se Materialetabel) ormene med 30% amplitude ved hjælp af følgende program: sonikering i 5 s, pause i 5 s og gentag 4x med en samlet sonikeringstid på 20 s. Opbevar prøverne i et iskoldt vandbad under sonikering.
    5. Inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
      BEMÆRK: Tilføj mere DNase før inkubation, hvis den ikke-RT negative kontrol viser DNA-forurening på et bekymrende niveau.
    6. Der overføres 2 μL stopopløsning til lysisreaktionen, og blandes ved forsigtigt at banke på. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur, og sæt derefter på is.
      BEMÆRK: Prøverne kan efterlades på is i op til 2 timer, før de fortsætter til det omvendte transkriptionstrin.
  3. Udfør RNA-ekstraktion fra ormvæv ved at følge nedenstående trin.
    1. Pluk omkring 20 orme fra deres bakterieplæne og læg dem på en frisk usedet NGM-plade for at fjerne bakterierne fra dem.
    2. De 20 orme (med så få bakterier som muligt) flyttes til et urglas indeholdende 500 μL M9-opløsning indeholdende 4 μM levamisol (se Materialetabel). Immobiliseringen vil ske inden for få sekunder.
    3. Når ormene er immobiliseret, dissekeres kimlinjen eller tarmen ved hjælp af en 25 G nål, der kan fastgøres til 1 ml sprøjten.
      1. Under dissektionsomfanget skal du udføre et snit i positionen af den anden svælgpære for at tillade naturlig ekstrudering af tarmen og kimlinjen. De to væv kan let skelnes ud fra deres morfologi og forskellige kontrast. Brug pincet eller nåle til forsigtigt at adskille vævene og undgå at beskadige dem.
        BEMÆRK: Det anbefales at dissekere inden for 5-10 min. Hvis snittet ikke producerer en god vævsekstrudering, foreslås det at flytte til den næste orm og dissekere så mange som muligt inden for 10 minutter. Denne procedure kræver en kort tidsramme for at undgå transkriptionelle ændringer fra miljøet.
    4. Ifølge qRT-PCR 2-trins kitproducenten skal du forberede 20 μL endelig lysisopløsning for hver prøve ved at blande 0,2 μL DNase I til 19,8 μL lysisopløsning i PCR-rørene. Bland lysisopløsningen ved at pipettere op og ned 5x.
    5. Brug en autoklaveret glaspipette til at overføre det dissekerede væv til et PCR-rør. Sæt PCR-rørene på is i 2 minutter for at tillade materialeaflejring i bunden. Fjern supernatanten, tilsæt 20 μL endelig lyseopløsning i PCR-røret, og bland ved at tappe.
    6. Inkuber lysisreaktionen i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør derefter 2 μL stopopløsning til lysisreaktionen og bland ved at tappe. Inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Prøverne kan efterlades på is i op til 2 timer, før de fortsætter til det omvendte transkriptionstrin.

5. Omvendt transkription og qRT-PCR

  1. Udfør omvendt transkription og qRT-PCR fra bulkorme.
    1. Mål RNA-koncentrationen og forbered 5 μg total RNA til omvendt transkription.
    2. Forbered en poolet RNA-prøve ved at blande lige store mængder RNA fra hver prøve og justere den endelige RNA-koncentration til 0,556 g / L (5 μg / 9 μL). Brug den samlede RNA-prøve til qRT-PCR-standardkurven og RT-negative kontroller.
    3. Udfør omvendt transkription i henhold til producentens anvisninger (se Materialetabel). Kør følgende kvalitetskontrol reverse transkriptionsreaktioner sammen med de enkelte RNA-prøver.
      1. Udfør omvendt transkription med den samlede RNA-prøve som skabelon (for qRT-PCR-standardkurve).
      2. Udfør omvendt transkription med den samlede RNA-prøve som skabelon uden omvendt transkriptase (RT-negativ kontrol; kvalitetskontrol for potentiel genom-DNA-kontaminering).
      3. Udfør omvendt transkription med det nukleasefrie vand som skabelon (RT-negativ kontrol; kvalitetskontrol for potentiel RNA-kontaminering i reagenser).
        BEMÆRK: Dette er et pausepunkt. Prøver kan efterlades i termocyklisten natten over eller opbevares ved -20 °C i et par måneder.
    4. Fortynd cDNA genereret fra de samlede RNA-prøver fire gange, 20 gange, 100 gange og 500 gange med nukleasefrit vand til qRT-PCR-standardkurver.
    5. Fortynd cDNA genereret fra hver RNA-prøve 20-100 gange til brug som skabeloner til qRT-PCR-reaktionerne.
      BEMÆRK: Fortyndingsforholdet afhænger af overfladen af genet af interesse. For højt udtrykte gener, såsom husholdningsgener eller egl-3 og egl-21, der anvendes i denne undersøgelse, anbefales en 100x fortynding. For lavt udtrykte gener, såsom lbp-8, anbefales en 20x fortynding.
    6. Udfør qRT-PCR med qRT-PCR-reagenser i henhold til producentens anvisninger som følger: 95 °C i 10 minutter, gentag 40 gange med 95 °C i 15 s og 60 °C i 1 min. efterfulgt af standardsmeltekurveprogrammet, og hold det ved 8 °C på ubestemt tid.
  2. Udfør omvendt transkription og qRT-PCR fra et par orme eller ormvæv.
    1. Der overføres 25 μL RT-buffer og 2,5 μL 20x RT-enzymblanding fra qPCR 2-trinssættet (se Materialetabel) til hvert rør indeholdende ormlysat fra enten trin 4.2.6 eller trin 4.3.6.
      BEMÆRK: En RT-negativ kontrol er kritisk for qRT-PCR fra nogle få orme. Hvert forsøg skal omfatte en prøve af ormlysat (fra trin 4.2.6) med RT-buffer, men uden RT-enzym for at undersøge DNA-kontamineringen i prøverne. Hvis DNA-forurening er et problem, kan du overveje at tilføje mere DNase til lysebufferen eller mere DNase til prøven, efter at ormene er lyseret. Alternativt kan man udføre RT-negativ kontrol for hver prøve ved at bruge halvdelen af lysatet i en normal RT-reaktion og den anden halvdel i en RT-reaktion uden omvendt transkriptase.
    2. Bland ved forsigtigt at banke. Drej ned ved hjælp af en minicentrifuge i 10 s.
    3. Prøverne lægges i termocykelmaskinen i overensstemmelse med producentens anvisninger: 37 °C i 60 min., 95 °C i 5 min. og 8 °C på ubestemt tid.
      BEMÆRK: Dette er et pausepunkt. Prøver kan efterlades i termocyklisten natten over eller opbevares ved -20 °C i et par måneder.
    4. Opbevar alle reagenser og prøver på is, og beskyt qRT-PCR-reagenserne mod lys.
    5. Forbered en 96-brønds qPCR-plade, og bland i hvert brønd 6 μL nukleasefrit vand, 10 μL qRT-PCR-reagens, 2 μL 5 μM primerblanding (fremad og omvendt) og 2 μL cDNA. Dæk qPCR-pladens overflade med 96 brønde med en beskyttende optisk film, og tryk ned for at forsegle.
    6. Kør qRT-PCR-programmet på en termisk cyklist efter producentens anvisninger som følger: 50 °C i 2 min., 95 °C i 2 min., gentag 40 gange med 95 °C i 3 s og 60 °C i 30 s efterfulgt af 8 °C på ubestemt tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering af transkriptionelle ændringer ved hjælp af et par hele orme ved lipidtilskud
For at undersøge, om protokollen til ekstraktion og retrotransskribering af RNA til cDNA fra nogle få hele orme er reproducerbar og sammenlignelig med data fra bulkorme, blev en langlivet ormstamme, der overudtrykte lysosomalsyrelipasen lipl-4 i tarmen, anvendt 7,8,33,35. Den transkriptionelle induktion af neuropeptidbehandlingsgenerne egl-3 og egl-21 rapporteret i tidligere undersøgelser 7,8,33 blev valideret (figur 2A,B). Denne induktion indikerer, at RNA-ekstraktionsmetoden fra nogle få dyr er et gyldigt alternativ til standard cDNA-synteseteknikker fra bulkormkulturer.

Validering af transkriptionelle evalueringer ved hjælp af dissekeret ormvæv ved lipidtilskud
I C. elegans er syntesen af 20-carbon PUFA'er afhængig af aktiviteten af desaturase FAT-316,17. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at fedt-3-mutanter mangler 20-carbon PUFA'er, herunder DGLA16. Tidligere blev det opdaget, at tabet af Δ6-desaturase FAT-3 i lipl-4g orme undertrykker transkriptionel induktion af neuropeptidbehandlingsgenerne egl-3 og egl-2133. Derudover redder DGLA-tilskud sådan induktion33. Genet, der koder for egl-21, udtrykkes i neuroner, mens egl-3 detekteres i både neuroner og tarme36,37. For yderligere at teste, om DGLA-tilskud genopretter induktionen af egl-3 og egl-21 i tarmen eller i neuronerne, blev tarmen dissekeret, og deres transkriptionsniveauer blev vurderet ved hjælp af qRT-PCR-analyse beskrevet i trin 4.3 og 5.2 i denne protokol. DGLA blev suppleret i kildeføden i 12 timer på dag-1 voksenalderen. Der blev ikke fundet transkriptionel induktion af hverken egl-3 eller egl-21 i tarmen (figur 2C), hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund36,38.

Validering af levetid assay på lipid tilskud
Forholdet mellem 20-carbon PUFA'er og levetidsmekanismen, der inaktiverer fedt-3 , blev tidligere undersøgt, specifikt i tarmen af lipl-4g orme33. Det blev konstateret, at fat-3 knockdown fuldt ud undertrykker levetidsforlængelsen tildelt af lipl-433. For at vurdere, om DGLA genopretter den levetid, der er forårsaget af lipl-4, blev DGLA suppleret frisk hver anden dag til kildeføden på dag 1 i voksenalderen. Det blev konstateret, at DGLA-tilskuddet ved fedt-3 knockdown redder levetidsforlængelsen (figur 2D)33, hvilket indikerer en vellykket lipidtilskudsprocedure kombineret med levetidsanalysen.

Figure 1
Figur 1: Skematisk for lipidfodring ved hjælp af forskellige eksperimentelle indstillinger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Validering af neuropeptidbehandlingsgenernes transkriptionelle evaluering ved hjælp af en stor population af orme, nogle få orme og dissekerede væv. (A) RNA ekstraheret fra en stor population af orme viser induktionen af neuropeptidbehandlingsgenernes egl-3 og egl-21 transkriptionsniveaueri lipl-4 Tg dyr. Fejllinjer repræsenterer ±1 SEM. **** p < 0,0001 ved tosidet studerendes t-test. (B) RNA-ekstraktion fra nogle få orme bekræfter induktionen af neuropeptidbehandlingsgeners egl-3- og egl-21-transkriptionsniveauer i lipl-4 Tg-orme. Fejllinjer repræsenterer ±1 SEM. **** p < 0,0001 ved tosidet elevens t-test. (C) Neuronale neuropeptidbehandlingsgener egl-3 og egl-21 induceres ikke i dissekerede tarme. Fejllinjer repræsenterer ±1 SEM. Statistisk analyse med to-halet Student's t-test. (D) DGLA-tilskud ved forskellige koncentrationer, herunder 10 μm, 100 μm og 1 mM redder lipl-4Tg levetidseffekten på fedt-3 RNAi. p < 0,001 ved log-rank test. Dette tal er tilpasset fra Savini et al.33. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lipidtilskud har været ansat i aldringsforskning for at belyse den direkte virkning af visse lipidarter på sund aldring 6,7,23,26,27,31. Men, lipid tilskud procedure kan være udfordrende, og enhver inkonsekvens mellem eksperimenter kan forårsage ikke-reproducerbare resultater. Her dokumenteres den første detaljerede trin-for-trin protokol for at guide nye forskere til at undgå de potentielle faldgruber forårsaget af teknisk upræcision. De kritiske trin i denne protokol vil blive diskuteret i detaljer i de følgende afsnit. Lipidforskningsværktøjskassen udvides også ved at indføre RNA-isolering fra kun få orme og specifikt ormvæv efter lipidtilskud. Når man overvejer metoden til at undersøge transkriptionsniveauer, er qRT-PCR med et par orme eller dissekerede væv fremragende til analyse af et par transkriptioner eller undersøgelse af visse vævsspecifikke transkriptionelle ændringer. Desuden kan brug af disse metoder overvinde trinnet med ormforstærkning, der kan tage ca. 5-6 ekstra dage. Samtidig er lipidfodring efterfulgt af bulk RNA-ekstraktion mere omkostningseffektiv og et gyldigt alternativ, når et større sæt målgener skal analyseres.

Flere trin kan være kritiske for reproducerbarheden af lipidfodringseffekter. Det første aspekt er relateret til bakterielle tilstande. Det anbefales at bruge friske bakterieplader, der ikke er ældre end 7 dage til podning. Det anbefales at bruge bakterier fremstillet i BDR-medium inden for 1 uge. Bakterier, der er blevet blandet med lipider, skal bruges med det samme. Lipider med bakterier bør ikke opbevares selv ved 4 ° C, da bakterierne vil metabolisere lipiderne. Vasketrinnene i BDR-basen og resuspension i BDR-mediet er kritiske for bakterieforhold, da bakterier blev dyrket i LB og fodret direkte til orme eliminerer altid de dybe virkninger af lipidtilskud. Den anden faktor er forbundet med ormforhold. C. elegans skal ikke sultes i mindst tre generationer før blegningstrinnet til ægforberedelse for at sikre, at de er i en sund og stabil metabolisk tilstand. Det er også afgørende at dyrke C. elegans på agar plader forud for lipid tilskud; Dette omfatter før og efter synkroniseringstrinnet.

Orme, der er tilpasset flydende kulturer i længere tid, sultes delvist; sult hæver basislinjen for pro-levetid gener, hvilket fører til en svækket effekt af lipidtilskud. Hvis den metaboliske drift og ændringer ved hjælp af arresterede L1 larver er bekymringer, ville et gyldigt alternativ være at direkte plade æggene. Når kun få orme er nødvendige for at udføre levetids- eller genekspressionsanalyse, er det muligt at plade æg direkte på lipidkonditionerede plader og synkronisere dem igen ved håndplukning på L4-stadiet til efterfølgende eksperimenter. Men hvis der er behov for store mængder orme, når håndplukning af L4 ikke er anvendelig, er plettering af æg direkte ikke ideel. Æg, der klækkes efter blegning fra gravide voksne, kan forekomme på forskellige tidspunkter og få befolkningen til at være usynkroniseret, hvilket ville forstyrre transkriptionsanalysen. Den tredje kritiske del er knyttet til lipidopbevaringsbetingelserne; når man supplerer PUFA'er, er der behov for ekstra opmærksomhed, da disse molekyler er følsomme over for lys og tilbøjelige til oxidation i luften.

Flere lipidfodringsbetingelser, herunder ormstadier, tilskudslængde og koncentrationer, kræver yderligere undersøgelse, når man tester nye lipidmolekyler. L4, dag-1 voksen og dag-2 voksne orme er normalt udgangspunktet for test på forskellige ormstadier. Især når der fodres L4-orme, hvis inkubationstiden slutter omkring nematodesmeltningsfasen, forventes en stor variation, hvilket i høj grad påvirker resultaternes betydning og reproducerbarhed. En yderligere udfordring ved brug af dag-1 eller dag-2 voksne orme er relateret til afkom, der kan komplicere genekspressionsanalysen. I dette tilfælde er RNA-ekstraktion fra nogle få hele orme mere pålidelig end bulkpopulationer. Forskellige lipidmolekyler har forskellige koncentrationsintervaller for at producere fysiologiske virkninger; således foreslås en række koncentrationer fra 1 μM til 1 mM at blive testet.

Der er et par begrænsninger, der skal overvejes, når du vælger fodringsmetoden. For det første, når lipider ikke kan absorberes eller indtages af ormene, er det udfordrende at bruge en tilskudsmetode til at teste deres biologiske virkning i C. elegans. Med nuværende teknologier er massespektrometri eller SRS kombineret med 13C- eller 2H-mærkede lipidforbindelser39 gyldige værktøjer til at teste lipidoptagelse i ormlegemet. For det andet er disse fodringsmetoder ikke optimeret til undersøgelsesteknikker med høj kapacitet. Til lipidtilskud med bulkorme er prøveforberedelse fra væskefodringsmetoden hurtigere end fodring på tallerkenen, fordi de flydende kulturer kan overføres direkte til mikrocentrifugerør i stedet for at vaske af fra fodringspladerne. For at sikre, at det ekstraherede RNA er i høsttilstanden, foreslås det ikke at lade mere end 15-20 minutter passere mellem punktet for at sætte ormene på is for at male dem i RNA-ekstraktionsopløsningen. Det anbefales at behandle færre forhold hvert 15. minut, når et stort antal prøver skal behandles. For hele orm RNA-ekstraktion fra nogle få dyr er håndplukningstrinnet det hastighedsbegrænsende trin, mens det for dissekering af væv er afgørende at handle på en tidseffektiv måde for at undgå langvarig eksponering for et ikke-fysiologisk miljø. I lighed med bulk RNA-ekstraktion foretrækkes det at plukke orme eller dissekere vævsprøver inden for 10 minutter.

På trods af begrænsningerne, disse tilskudsmetoder kan bruges ud over lipidforskning for at hjælpe med at identificere eventuelle ernæringsmæssige og medicinske virkninger. De procedurer, der rapporteres her, er ikke kun begrænset til aldringsforskning, men alternative fænotyper til vurdering af organelle fitness og cellemetabolisk homeostase. Tilskudsmetoden med bulkpopulation kan kombineres med RNA-seq til transkriptomanalyse, massespektrometri til metabolomisk og proteomisk analyse eller Western blot til analyse af specifikke proteinmarkører, mens lipidtilskuddet med nogle få orme kan kombineres med billeddannelse og adfærdsanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker P. Svay for vedligeholdelsesstøtte. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI-efterforsker (MCW) og NIH T32 ES027801 prædoktorand (MS). Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Pestle Genesee Scientific 93-165P15 For worm grinding with Trizol
Agarose Sigma A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix GenDEPOT R5600 For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR ThermoFisher A28567 For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge Benchmark Scientific C1248 For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip Branson Ultrasonic Corporation 100-132-888R
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cholesterol Sigma C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge Eppendorf 22620444R For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro Eppendorf 950030010 For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate Neta Scientific 665180 12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm Neta Scientific 664161 For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm Neta Scientific 628161 For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher AM9937
Isoproanol Sigma PX1835-2
Levamisole hydrochloride VWR SPCML1054
lipl-4Tg MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22) MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
Luria Broth Base ThermoFisher 12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode ThermoFisher 4483354 96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied BioSystem 4311971 For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System Sigma Z00Q0V0WW Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2 Caenorhabditis Genetics Center N/A C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher N/A For measuring RNA concentration
OP50 Caenorhabditis Genetics Center N/A Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) Sigma P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit ThermoFisher 4402953 For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4367659 For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach  KIK International LLC. 59647210143 6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution ThermoFisher AM9780
Sodium cloride (NaCl) Sigma S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) Sigma S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge Thermo 7500-4337 For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge Thermo 7500-7200 For worm egg preparation
TRIzol Reagent TheroFisher 15596018 RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit ThermoFisher AM1907 For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59 Denville Scientific INV S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor VWR 47747-370 For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 VWR N/A For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker WormStuff 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

Tags

Biologi udgave 190
Lipidtilskud til lang levetid og gentranskriptionel analyse i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., More

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter