Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תוספי שומנים לאריכות ימים וניתוח שעתוק גנים ב - Caenorhabditis elegans

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64092
Automatic Translation
*1,2, 2,3,4, 2,4,5, *2
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לתוספי שומנים בתרביות נוזליות ובתרביות על צלחת עבור Caenorhabditis elegans, יחד עם מחקרי אורך וניתוח שעתוק גנים מכמות גדולה או כמה תולעים ורקמות תולעים.

Abstract

הזדקנות היא תהליך מורכב המאופיין בשינויים פיזיולוגיים מתקדמים הנובעים הן מתרומה סביבתית והן מתרומה גנטית. ליפידים חיוניים למרכיבים מבניים של קרומי התאים, לאגירת אנרגיה וכמולקולות איתות. ויסות חילוף החומרים והאיתותים של השומנים חיוני להפעלת מסלולים ברורים לאריכות ימים. התולעת העגולה Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מצוין וחזק לנתח את התרומה של מטבוליזם שומנים ואיתות בוויסות אריכות ימים. מחקרים רבים תיארו כיצד תוספי תזונה של מולקולות שומנים ספציפיות יכולים להאריך את תוחלת החיים של C. elegans ; עם זאת, הבדלים קלים בתנאי התוספים עלולים לגרום לבעיות שכפול בקרב מדענים במעבדות שונות. כאן, דווח על שתי שיטות מפורטות של תוספי תזונה עבור C. elegans המשתמשות בתוספי שומנים עם חיידקים שנזרעו על צלחות או תרחיף חיידקים בתרבית נוזלית. כמו כן מסופקים כאן הפרטים לביצוע בדיקות תוחלת חיים עם תוספת שומנים לכל החיים וניתוח qRT-PCR באמצעות ליזאט תולעת שלמה או רקמות מנותקות שמקורן בכמה תולעים. באמצעות שילוב של מחקרי אורך ומחקרי שעתוק על תוספי שומנים, מבחני ההזנה מספקים גישות מהימנות לנתח כיצד שומנים משפיעים על אריכות ימים והזדקנות בריאה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת גם לגישות סינון תזונתיות שונות כדי להעריך שינויים בתת-קבוצה של תעתיקים באמצעות מספר קטן של רקמות מנותחות או כמה בעלי חיים.

Introduction

שומנים
ליפידים הם מולקולות הידרופוביות או אמפיפתיות קטנות המסיסות בממיסים אורגניים אך אינן מסיסות במים 1,2. מולקולות ליפידים נפרדות נבדלות זו מזו בהתבסס על מספר הפחמן הכלול בשרשראות שלהן, מיקומן, מספר הקשרים הכפולים והמבנים הקשורים אליהן, כולל גליצרול או פוספטים. ליפידים ממלאים תפקידים מכריעים בתוך ובין תאים שונים כדי לווסת תפקודים אורגניזמיים, כולל דו-שכבתיות של ממברנות, אספקת אגירת אנרגיה ופעולה כמולקולות איתות 3,4.

ראשית, שומנים הם מרכיבים מבניים של ממברנות ביולוגיות, כולל קרום הפלזמה והממברנות התת-תאיות התוך-תאיות המפרידות בין התאים הפנימיים לבין הסביבה החוץ-תאית. שנית, שומנים הם הצורה העיקרית של אגירת אנרגיה בבעלי חוליות וחסרי חוליות. שומנים ניטרליים, כולל טריאצילגליצרולים, מאוחסנים לתקופה ממושכת ברקמות שונות, כולל ברקמת השומן. בנמטודה Caenorhabditis elegans, המעי הוא איבר אחסון השומן המטבולי העיקרי; תפקידו אינו מעורב רק בעיכול וספיגה של חומרים מזינים, אלא גם בתהליך של דטוקסיפיקציה, הדומה לפעילות של הפטוציטים של יונקים. רקמות אגירת שומן אחרות כוללות את הנבט, שבו שומנים חיוניים להתפתחות ביציות, ואת היפודרמיס, המורכב מתאי אפידרמיס דמויי עור 3,5. שלישית, בשנים האחרונות, עדויות נוספות מצביעות על כך שליפידים הם מולקולות איתות חזקות המעורבות באיתות תוך-תאי וחוץ-תאי על-ידי פעולה ישירה על מגוון קולטנים, כולל קולטנים מצומדים לחלבון G וקולטנים גרעיניים, או בעקיפין באמצעות אפנון נזילות הממברנה או שינויים לאחר תרגום 6,7,8,9 . מחקרים נוספים ימשיכו להבהיר את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של איתות שומנים בקידום אריכות ימים ותוחלת חיים.

אורגניזמי מודל חשובים כדי לענות על שאלות ביולוגיות ספציפיות שהן מורכבות מכדי לחקור בבני אדם. לדוגמה, התולעת העגולה C. elegans היא מודל מצוין לביצוע ניתוח גנטי לניתוח תהליכים ביולוגיים הרלוונטיים לתזונת האדם ולמחלות10. המסלולים המולקולריים המשומרים ביותר הרלוונטיים לפיזיולוגיה האנושית, לרקמות מורכבות, לדפוסי התנהגות ולשפע של כלים למניפולציה גנטית הופכים את C. elegans לאורגניזם מודל יוצא דופן11. לדוגמה, C. elegans מצוין בהעברת בדיקות גנטיות לזיהוי גנים ספציפיים לפנוטיפ, כמו גם בבדיקות גנטיות הפוכות ברחבי הגנום באמצעות הפרעת RNA12.

במעבדות, הנמטודות גדלות על צלחות אגר פטרי שנזרעו עם מדשאה של חיידקי Escherichia coli, המספקות מקרונוטריאנטים כגון חלבונים, פחמימות וחומצות שומן רוויות ובלתי רוויות כמקורות אנרגיה ואבני בניין, ומיקרונוטריאנטים כגון קו-פקטורים וויטמינים13. בדומה ליונקים, נמטודות מסנתזות מולקולות של חומצות שומן הן מחומצה פלמיטית והן מחומצה סטארית (מולקולות רוויות של 16 פחמן ו-18 פחמן, בהתאמה) שהן רוויות ברצף ומוארכות למגוון חומצות שומן חד-בלתי רוויות (MUFAs) וחומצות שומן רב-בלתי רוויות (PUFAs)14,15,16,17,18. באופן מעניין, C. elegans מסוגל לסינתזה דה נובו של כל חומצות השומן ואנזימי הליבה הנדרשים המעורבים בביוסינתזה של חומצות שומן, דה-סטורציה והתארכות, מה שמקל על הסינתזה של PUFAsארוכי שרשרת 19. בשונה ממינים אחרים של בעלי חיים, C. elegans יכולים להמיר חומצות שומן 18-פחמן ו-20-פחמן ω-6 לחומצות שומן ω-3 עם אנזימי ω-3 דסטוראז משלהם. בנוסף, לתולעים יש דסטוראז Δ12 המזרז היווצרות חומצה לינולאית (LA) מחומצה אולאית (OA, 18:1)20,21. רוב בעלי החיים או הצמחים חסרים גם Δ12 וגם ω-3 desaturases ולכן מסתמכים על צריכה תזונתית של ω-6 ו- ω-3 כדי להשיג את ה- PUFA שלהם, בעוד ש- C. elegans אינו זקוק לחומצות שומן תזונתיות22. מוטנטים מבודדים ללא אנזימי דסטוראז פונקציונליים שימשו לחקר התפקודים של חומצות שומן ספציפיות בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל רבייה, גדילה, אריכות ימים והעברה עצבית. ניתן לטפל בהשפעה של חומצות שומן בודדות על מסלולים ביולוגיים ספציפיים באמצעות גישה גנטית ותוספי תזונה16,17,23. עד כה, מחקר השומנים התמקד באפיון גנים המעורבים בסינתזה של שומנים, פירוק, אחסון ופירוק במצבים נוירולוגיים והתפתחותיים24. עם זאת, התפקידים של שומנים בוויסות אריכות ימים רק מתחילים להתגלות.

איתות שומנים בוויסות תוחלת החיים
ליפידים ממלאים תפקידים מכריעים בוויסות תוחלת החיים על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים ברקמות ובסוגי תאים שונים. מחקרים אחרונים הדגישו את התפקידים הפעילים של שומנים בוויסות שעתוק ותקשורת בין תאים באמצעות חלבונים קושרי שומנים או זיהוי קולטני ממברנה25. בנוסף, תוספי שומנים תזונתיים מציעים כלי מצוין לנתח כיצד חילוף החומרים של שומנים משפיע על תוחלת החיים של C. elegans. הוכח כי MUFAs ו-PUFA שונים מקדמים אריכות ימים על-ידי הפעלת גורמי שעתוק26,27.

מודלים של אריכות ימים, כולל איתות אינסולין/IGF-1 ואבלציה של תאים מבשרי נבט, קשורים למסלול הביוסינתזה של MUFA, ותוספי MUFA, כולל חומצה אולאית, חומצה פלמיטולאית וציס-vaccenic, מספיקים כדי להאריך את תוחלת החיים של C. elegans 26. למרות שאפקט אריכות הימים שהוענק על ידי ממשל MUFA דורש חקירה נוספת, המנגנון הבסיסי צפוי להיות מתווך על ידי גורם השעתוק SKN-1/Nrf2, שהוא מפעיל מרכזי של תגובת עקה חמצונית ותקנה לאריכות ימים28,29. בקרב MUFAs, קבוצה מסוימת של אתנולמידים אציליים שומניים הנקראים N-acylethanolamines (NAEs) ממלאת תפקידים מכריעים במנגנונים שונים כולל דלקת, אלרגיות, למידה, זיכרון ומטבוליזם של אנרגיה30. במיוחד, מולקולת השומנים המכונה אולאויל-אתנול-אמיד (OEA) זוהתה כרגולטור חיובי של אריכות ימים על ידי קידום הטרנסלוקציה של החלבון קושר השומנים 8 (LBP-8) לתוך הגרעין כדי להפעיל את קולטני ההורמון הגרעיני NHR-49 ו- NHR-807. תוספת של האנלוגי OEA KDS-5104 מספיקה להארכת תוחלת החיים, וגורמת לביטוי של גנים המעורבים בתגובות עקה חמצונית ובחמצון β מיטוכונדריאלי 7,8.

יחד עם זאת, תפקידם של PUFAs נקשר גם לרגולציה של אריכות ימים. מתן PUFA ω-3 חומצת שומן α-חומצה לינולנית (ALA) מקדם אריכות ימים על ידי הפעלת NHR-49/PPARα, גורמי שעתוק SKN-1/NRF וגרימת חמצון β מיטוכונדריאלי31. באופן מעניין, מוצרים מחומצנים של ALA, המכונים אוקסיליפינים, מפעילים את SKN-1/NRF, מה שמרמז על כך שגם PUFA וגם הנגזרות החמצוניות שלהם יכולים להעניק יתרונות לאריכות ימים23. תוספת של חומצת שומן ω-6 חומצה ארכידונית (AA) וחומצה דיהומו-γ-לינולנית (DGLA) מאריכה את תוחלת החיים באמצעות הפעלת אוטופגיה, מקדמת בקרת איכות חלבון וכתוצאה מכך פוגעת בצברי חלבון מבוזבזים ורעילים27,32. לאחרונה, ויסות איתות תאי לא אוטונומי המתווך על ידי החלבון קושר השומנים 3 (LBP-3) ו-DGLA הוכח כחיוני לקידום אריכות ימים על-ידי שליחת אותות היקפיים לנוירונים, מה שמרמז על תפקיד ארוך טווח של מולקולות שומנים בתקשורת בין רקמות ברמות מערכתיות33. המחקר הנוכחי מדווח על כל שלב לביצוע תוספי שומנים עם חיידקים שנזרעו על צלחות או תרחיף חיידקים בתרבית נוזלית. מתודולוגיות אלה משמשות להערכת תוחלת חיים וניתוח שעתוק, תוך שימוש בתכולת גוף שלמה או ברקמות מנותקות שמקורן בכמה תולעים. ניתן להתאים את הטכניקות הבאות למגוון מחקרים תזונתיים ולהציע כלי תקף לנתח כיצד חילוף החומרים של השומנים משפיע על אריכות ימים והזדקנות בריאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

איור 1 מתאר סכמת הזנה של שומנים באמצעות הגדרות ניסוי שונות.

1. הכנת חיידקים מותני שומנים

  1. הכן את תמיסת הבסיס להגבלה תזונתית של דילול חיידקים (BDR) על-ידי המסת 5.85 גרם של NaCl, 1.0 גרםשל K 2 HPO 4 ו-6.0 גרם של KH2PO4 (ראו טבלת חומרים) ב-999 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. התאם את ה- pH ל- 6.0 עם 0.5 M KOH, ולאחר מכן סנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.
    הערה: ניתן לאחסן את תמיסת ה-BDR בטמפרטורת החדר לאחסון לטווח ארוך.
  2. הכן את מדיום ה-BDR על-ידי הוספת 10 מיקרו-ליטר של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול (מומס באתנול עמיד בפני 200 מ"ל) לכל 10 מ"ל של תמיסת בסיס BDR.
  3. פסו את חיידקי OP50 (ראו טבלת חומרים) ממלאי של -80 מעלות צלזיוס לצלחות LB-agar ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: לאחר הדגירה במהלך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, ניתן לאחסן את צלחת OP50 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לקבלת תוצאות הזנה יציבות.
  4. יש לחסן את חיידקי OP50 מצלחת OP50 LB-agar למדיום LB ולדגירה בשייקר של 37°C למשך הלילה (16 שעות).
    הערה: הנפח הבינוני של LB הדרוש תלוי בהגדרות הניסוי. מומלץ להשתמש ב-200 μL של 5x חיידקים מרוכזים שנזרעו על כל אחת מהצלחות בגודל 6 ס"מ וב-1 מ"ל של 5x חיידקים מרוכזים עבור כל אחת מהצלחות בגודל 10 ס"מ וכל אחת מהן משוכפלת של תנאי ההזנה הנוזלית. לכן, 1 מ"ל ו 5 מ"ל של חיסון LB ראשוני חייב להיות מוכן עבור כל תרבית הזנה שומנים, בהתאמה.
  5. אסוף חיידקים באמצעות צנטריפוגה בגודל 4,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט.
  6. השהה את כדור החיידקים ב-20 מ"ל של בסיס BDR, וצנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופר-נטנט.
    הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לשטוף את שאריות של LB בכדור החיידקי.
  7. השהה כל כדור חיידקי במדיום BDR כדי ליצור מלאי חיידקי BDR פי 20. יש לדלל את מלאי חיידקי ה-BDR פי 20 עם מדיום BDR עד פי 5 לפני השימוש.
    הערה: השתמש בנפח של 1/20 של מדיום BDR של נפח LB המקורי כדי להגיע לריכוז של פי 20 עבור החיידקים. ניתן לאחסן את מלאי החיידקים פי 20 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
  8. הכינו תמיסת מלאי שומנים, תוך שימוש באתנול או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כממס בבקבוקון זכוכית חדש, ומלאו את בקבוקון הזכוכית בארגון או בחנקן כדי למנוע חמצון.
    הערה: ריכוז התמיסה במלאי הוא בדרך כלל בין 250 mM ל-1mM.
  9. העבירו את תמיסת מלאי השומנים לכמות הרצויה של תמיסת חיידקי BDR כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי בתנאי האכלה. מערבבים היטב על ידי מערבולת במשך 20 שניות.
    הערה: הריכוז הסופי של השומנים בהזנה הוא בדרך כלל 1 μM עד 1 mM, בהתאם לשומנים ולתנאי הבדיקה. מומלץ לערוך תחילה ניסוי פיילוט כדי לבדוק ריכוזים שונים הנעים בין 0.1 מיקרומטר ל-1 מ"מ אם עובדים עם שומנים חדשים. ערבבו את תמיסת מלאי השומנים עם חיידקי BDR מיד לפני זריעתו לצלחת או הכנסתו לתרביות תולעים נוזליות. הכינו את החיידקים המותנים בשומנים לא יותר משעה לפני ההזנה לתולעים.
  10. ערבבו את אותם נפחים של אתנול מסונן או DMSO (תלוי באיזה מהם משתמשים בקבוצת הזנת השומנים) עם חיידקי BDR כדי לשמש כבקרת הרכב.

2. הכנת C. elegans מסונכרנים לתוספת שומנים

  1. הכן מאגר M9 על ידי ערבוב (תוך שימוש בריכוזים הסופיים שצוינו) 22 mM KH 2 PO 4, 22 mM Na 2HPO 4, 85 mM NaCl ו-2mM MgSO 4 (ראה טבלת חומרים). אוטוקלאב את המאגר כדי לעקר.
  2. הכינו תמיסת אקונומיקה טרייה עם 60% אקונומיקה ביתית (v/v, ראו טבלת חומרים) וריכוז סופי של 1.6 M NaOH.
  3. אסוף בוגרים גרבידים בצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות 10 מ"ל של חיץ M9.
    הערה: מספר התולעים והלוחות הדרושים לסנכרון תלוי בהגדרות הניסוי (כלומר, מספר התנאים והשכפולים ושיטות ההזנה). באופן אידיאלי, כל צלחת מלאה של 6 ס"מ של תולעים בוגרות אמורה להיות מסוגלת להניב לפחות 600 תולעים L1 לאחר סנכרון.
  4. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות. הסר את supernatant ולשטוף את התולעים פעם נוספת עם 10 מ"ל של חיץ M9.
  5. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות. לשאוף את supernatant, משאיר aliquot 4 מ"ל בצינור חרוטי. יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת אקונומיקה ולנער במרץ במשך דקה אחת.
  6. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
  7. הסר את supernatant ולהוסיף 4 מ"ל של חיץ M9 ו 2 מ"ל של תמיסת אקונומיקה. לנער את הצינור עד גופי התולעת מומסים.
  8. סובבו את הביצים בטמפרטורה של 1,450 x גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את supernatant ולשטוף את הביצים עם 10 מ"ל של חיץ M9.
  10. חזור על שלבים 2.8 ו- 2.9 3x.
  11. להשעות את העוברים עם 6 מ"ל של חיץ M9. נדנדנדו את העוברים על מסובב בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לאפשר להם לבקוע ולהסתנכרן.
  12. מעבירים זחלי L1 לצלחות זרעים OP50. דגירה בטמפרטורה של 20°C למשך 48 שעות כדי לאסוף תולעי L4 מסונכרנות, 72 שעות עבור יום-1 מבוגרים, ו-96 שעות עבור יום-2 מבוגרים.
    הערה: לוחות OP50 מוכנים על ידי הוספת 1 מ"ל של 20x OP50 חיידקים לכל צלחת 10 ס"מ של מדיום גידול נמטודה (NGM)34. ניתן לזרוע 30,000 תולעי L1 לכל אחת מצלחות OP50 אם הן שואפות לקצור את התולעים בשלב L4, וניתן לזרוע 20,000 תולעי L1 לכל אחת מצלחות OP50 אם שואפים לקצור בוגרים של יום-1 במסגרות הניסוי הנוכחיות. זה עשוי להיות שונה עבור הגדרות מעבדה שונות, ולכן מומלץ לבדוק את מספרי התולעים שניתן לזרוע כדי לוודא שלתולעים נותר מספיק מזון לפני שהן נקטפות.
  13. אסוף תולעים בוגרות L4, יום-1 בוגרות או יום-2 בצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות 10 מ"ל של חיץ M9. השתמשו בעוד 5 מ"ל של חיץ M9 כדי לשטוף את שאריות התולעים מהצלחות.
  14. סובבו את התולעים ב-1,450 x גרם למשך 30 שניות והשליכו את הסופר-נטנט. לשטוף את כדור התולעת עם 10 מ"ל של מדיום BDR, צנטריפוגה ב 1,450 x גרם במשך 30 שניות, ולהשליך את supernatant.
  15. עבור תולעים בשיטת ההזנה הנוזלית, העבירו את מדיום ה-BDR לתולעים כדי להשיג ריכוז תולעים של 3,000 תולעים/מ"ל. עבור תולעים בשיטות האכלה בצלחת, הפחיתו את נפח מדיום ה-BDR שנוסף לתולעים כדי לקצר את זמן הייבוש בצלחת.

3. תוספת שומנים עבור C. elegans

  1. בצעו תוספי שומנים בתרבית נוזלית לפי השלבים הבאים.
    הערה: שיטה זו מתאימה לבדיקת שינויי שעתוק באמצעות תולעים בתפזורת בתוספת שומנים.
    1. העבירו את הכמות הרצויה של בקרת שומנים או רכב לכל אחת מהבארות בלוחית של 12 בארות. הכינו שלוש עד ארבע בארות לכל תנאי הזנה כשכפול ביולוגי.
    2. ערבבו את תרחיף התולעים משלב 2.15 עם 5x חיידקי BDR ביחס של 1:1 כדי להשיג ריכוז סופי של 1,500 תולעים/מ"ל ופי 2.5 לחיידקים.
    3. מעבירים 2 מ"ל מתערובת התולעת-חיידקים במדיום BDR לכל באר של צלחת 12 הבאר.
    4. עוטפים את צלחת 12 הבארות בנייר כסף ומנערים באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס ב-100 סל"ד לאורך הדגירה הרצוי.
      הערה: כדי לבדוק תנאי האכלה שונים, דגרו את השומנים עם תולעים לפרקי זמן שונים, כגון במשך 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות. בנוסף, ניתן לבדוק שלבי תולעים שונים לקבלת תוצאות מיטביות, כולל הזנת שומנים מהשלב הבוגר L4 או day-1.
  2. בצעו תוספי שומנים על צלחות האגר בגודל 10 ס"מ NGM בהתאם לשלבים הבאים.
    הערה: שיטה זו מתאימה לבדיקת שינויי שעתוק באמצעות תולעים בתפזורת בתוספת שומנים.
    1. זרעו 1 מ"ל של החיידקים המותנים בשומנים משלב 1.9 אל מרכז כל אחד מהלוחות באורך 10 ס"מ. כאשר הוכנו מספר גבוה של צלחות, מערבבים את הפתרון הסופי העובד מספר פעמים בין זריעה. יבשו את הצלחות בחושך באמצעות מכסה מנוע בטיחותי.
    2. העבר 3,000 תולעים משלב 2.15 לכל אחד מהלוחות באורך 10 ס"מ. יבשו את הצלחות במכסה מנוע בטיחותי עד שהתולעים יוכלו לזחול על הצלחות עם תוספי השומנים במקום לשחות.
    3. דגירה של התולעים על הלוחות המותנים בשומנים באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. יש להגן מפני אור אם משתמשים בשומנים רב בלתי רוויים.
      הערה: כדי לבדוק תנאי האכלה שונים, דגירה של השומנים עם תולעים לפרקי זמן שונים, כגון 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות. בנוסף, ניתן לבדוק שלבי תולעים שונים לקבלת תוצאות מיטביות, כולל הזנת שומנים בדם בשלב הבוגר L4 או יום-1.
  3. בצע תוספת שומנים על לוחות אגר NGM בגודל 6 ס"מ לניתוח שעתוק.
    הערה: שיטה זו מתאימה לבדיקת שינויי שעתוק בכמה תולעים בתוספת שומנים.
    1. זרע 300 μL של חיידקים מותנים בשומנים משלב 1.9 על מרכז כל צלחת בגודל 6 ס"מ. כאשר הוכנו מספר גבוה של צלחות, מערבבים את הפתרון הסופי העובד מספר פעמים בין זריעה. יבשו את הצלחות בחושך באמצעות מכסה מנוע בטיחותי.
    2. מעבירים עד 300 תולעים משלב 2.15 לכל אחת מהצלחות בקוטר 6 ס"מ. ייבשו את הצלחות במכסה המנוע עד שהתולעים יכולות לזחול על הצלחות עם תוספי השומנים במקום לשחות.
    3. דגירה של התולעים על הלוחות המותנים בשומנים באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. יש להגן מפני אור אם משתמשים בשומנים רב בלתי רוויים.
      הערה: כדי לבדוק תנאי האכלה שונים, דגרו את השומנים עם תולעים בנקודות זמן שונות, כגון 6 שעות, 12 שעות ו-24 שעות. בנוסף, ניתן לבדוק שלבי תולעים שונים לקבלת תוצאות מיטביות, כולל הזנת שומנים בדם בשלב הבוגר L4 או יום-1.
  4. יש לבצע נטילת תוסף שומנים על לוחות אגר NGM בקוטר 6 ס"מ לצורך בדיקת אורך חיים.
    1. זרע 200 μL של חיידקים מותנים בשומנים (עם ריכוז שומנים אחד ופי 5 חיידקים מרוכזים) על מרכז כל אחד מלוחות NGM בגודל 6 ס"מ. הכינו שלוש צלחות לכל תנאי האכלה.
      הערה: יש להכין את הצלחות טריות ביום השימוש (באופן אידיאלי ממש לפני השימוש).
    2. יבשו את הצלחות במכסה מנוע ביו-בטיחותי. יש לכבות את האורות במכסה המנוע ובחדר אם משתמשים בשומנים רב-בלתי רוויים.
    3. בחר 30-40 תולעי L4 מסונכרנות לכל אחד מהלוחות. שמור את הצלחות עם התולעים באינקובטור 20 מעלות צלזיוס. אם אתם ניזונים מליפידים רב-בלתי רוויים, שמרו את הצלחות בקופסה מוגנת אור באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן להשתמש ב-OP50 מלוח מעבר רגיל בקוטר 6 ס"מ (OP50 ללא תנאי) כדבק לאיסוף תולעים, אך חשוב מאוד לא להשאיר כמות גדולה של OP50 בלתי מותנית בצלחת הבדיקה.
    4. מעבירים את התולעים לצלחות חדשות וטריות מותנות בשומנים מדי יום או כל יומיים, בהתאם למצב ההזנה הרצוי. הישרדות הוא ניקוד באותו אופן כפי שתואר קודםלכן 4.

4. מיצוי RNA לניתוח שעתוק

  1. בצע מיצוי RNA ממספר גדול של תולעים שלמות.
    1. העבר תולעים בתרבית הנוזלית משלב 3.1 ל 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge. שטפו תולעים מלוחות 10 ס"מ משלב 3.2 באמצעות חיץ M9 והעבירו את התולעים במאגר M9 לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    2. צנטריפוגה קצרה של התולעים עם מיני צנטריפוגה שולחנית (ראו טבלת חומרים) במשך 10 שניות ושאפו במהירות את הסופר-נטנט.
    3. מעבירים שאריות תולעים מבארות ההזנה הנוזליות או שוטפים מהצלחות לאותו צינור ומסתובבים. הסר את הסופרנטנט.
    4. שטפו את כדורי התולעת ב-1 מ"ל של M9 קר כקרח, סובבו לזמן קצר במשך 10 שניות עם מיני צנטריפוגה, ושאפו את הסופר-נט. חזור על 1x או 2x בהתאם לשקיפות של הסופרנטנט.
    5. הניחו את צינורות המיקרוצנטריפוגה על קרח למשך 2 דקות והסירו כמה שיותר סופר-נטנט עם פיפטה של 200 μL, והשאירו כדור תולעת ארוז בנפח של לא יותר מ-15 μL.
    6. מעבירים 15 μL של תמיסת מיצוי RNA המכילה פנול וגואנידין איזותיוציאנט (טבלת חומרים) לכל אחד מצינורות המיקרוצנטריפוגה וטוחנים את התולעים עם מטחנת מנוע במשך כ-30 שניות עד שלא נראות תולעים שלמות.
      התראה: תמיסת מיצוי הרנ"א היא רעילה ודליקה, וכל שלב הכרוך במיכל פתוח עם מגיב זה חייב להיות מופעל במכסה מנוע כימי.
    7. העבר 285 μL מתמיסת מיצוי ה- RNA לצינור המיקרוצנטריפוגה תוך שטיפת כל תוכן תולעת מקצה מטחנת המנוע לצינור המיקרוצנטריפוגה. מערבולת לערבב היטב.
      הערה: זוהי נקודת השהיה. דגימות ניתן לאחסן בתמיסת מיצוי RNA ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. כאשר מוציאים את -80 מעלות צלזיוס, נותנים לדגימות להפשיר בטמפרטורת החדר.
    8. העבר 60 μL של כלורופורם לכל דגימה ומערבולת במרץ. תנו לדגימות לשקוע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
      התראה: כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל בו במכסה מנוע כימי.
    9. צנטריפוגה ב 21,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר בזהירות 140 μL של השכבה המימית בחלק העליון לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ונטול RNase באמצעות פיפטה של 200 μL, העברת 2x עם 70 μL בכל פעם.
      הערה: משלב זה והלאה, כל קצוות הפיפטה והמיכלים שיש להם מגע ישיר עם הדגימה צריכים להיות נטולי RNase. כמו כן, מומלץ להשתמש בתמיסת טיהור RNase כדי לנגב את כל הציוד ואת מרחב העבודה.
    10. העבר 140 μL של איזופרופנול לצינור הדגימה. מערבלים במרץ ונותנים לדגימה להתיישב בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 21,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהסיר בזהירות את כל supernatant.
    11. מעבירים 0.5 מ"ל של אתנול קר כקרח 80% אתנול (v/v) לצינור הדגימה עם גלולת RNA. מערבולת במרץ עד שכדור הרנ"א עוזב את תחתית הצינור וצף סביב בתמיסת האתנול. צנטריפוגה ב 21,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant.
    12. צנטריפוגה קצרה של צינורות הדגימה בצנטריפוגה המיני במשך 15 שניות כדי לסובב כל ממס שנדבק לדופן הצינור, ולאחר מכן להסיר את תמיסת האתנול הרבה ככל האפשר עם פיפטה.
    13. השאירו את מכסה הצינור פתוח לייבוש גלולת ה-RNA. אם הכדור נשטף ביסודיות עם תמיסת האתנול, שלב הייבוש צריך לקחת פחות מ -10 דקות.
      הערה: זוהי נקודת השהיה. גלולת RNA מיובשת יכולה להיות מאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
    14. ממיסים את גלולת הרנ"א היבש ב-40 מיקרון מים נטולי נוקלאז ומעבדים עם ערכה להסרת דנ"א בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
      הערה: מומלץ להמיס RNA במים נטולי נוקלאז תחילה. אם מערבבים 40 μL של מים עם חיץ 10x DNase לפני המעבר לצינור ה-RNA, כדור ה-RNA לא יתמוסס לחלוטין. דגימות הרנ"א צריכות להישמר על קרח בעת המסת גלולת הרנ"א במים. מחזורי הפשרה בהקפאה מפחיתים את איכות הרנ"א; לכן, המשך לשלב השעתוק ההפוך באותו יום של הטיפול ב- DNase.
  2. מיצוי RNA ממספר קטן של תולעים שלמות.
    1. בחרו 15-20 תולעים מהמדשאה החיידקית שלהן לתוך צלחת NGM חדשה ולא מעובדת כדי לסלק את החיידקים מהתולעת.
    2. על פי היצרן של ערכת qRT-PCR 2-step (ראה טבלת חומרים), להכין 20 μL של תמיסת ליזה סופית עבור כל דגימה על ידי ערבוב 0.2 μL של DNase עם 19.8 μL של תמיסת ליזה בצינורות PCR. מערבבים את תמיסת הליזיס על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
    3. מעבירים 15-20 תולעים מצלחת ה-NGM הלא ממומשת לתוך צינור ה-PCR המכיל 20 מיקרון של תמיסת התזה הסופית עם מספר מינימלי של חיידקים. לדגור את תגובת התזה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. Probe-sonicate (ראה טבלת חומרים) התולעים עם משרעת 30% באמצעות התוכנית הבאה: סוניקציה במשך 5 שניות, הפסקה במשך 5 שניות, וחזרה על 4x עם זמן סוניקציה כולל של 20 שניות. שמור את הדגימות באמבט מים קרים כקרח במהלך סוניקציה.
    5. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: הוסף עוד DNase לפני הדגירה אם הבקרה השלילית ללא RT מראה זיהום DNA ברמה מדאיגה.
    6. העבר 2 μL של תמיסת עצירה לתגובת הליזיס וערבב על ידי הקשה עדינה. דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להגדיר על קרח.
      הערה: ניתן להשאיר את הדגימות על קרח עד שעתיים לפני שתמשיך לשלב השעתוק ההפוך.
  3. בצע מיצוי RNA מרקמות תולעת לפי השלבים הבאים.
    1. בחרו כ-20 תולעים מהמדשאה החיידקית שלהן והניחו אותן על צלחת NGM טרייה שלא נזרעה כדי להסיר מהן את החיידקים.
    2. העבירו את 20 התולעים (עם כמה שפחות חיידקים) לזכוכית שעון המכילה 500 μL של תמיסת M9 המכילה 4 μM levamisole (ראו טבלת חומרים). האימוביליזציה תתרחש תוך שניות.
    3. כאשר התולעים משותקות, נתחו את הנבט או המעי באמצעות מחט של 25 גרם שניתן לחבר למזרק 1 מ"ל.
      1. תחת היקף הנתיחה, לבצע חתך במיקום של נורת הלוע השנייה כדי לאפשר שחול טבעי של המעי ואת הנבט. ניתן להבחין בקלות בין שתי הרקמות על סמך המורפולוגיה שלהן והניגודיות השונה שלהן. השתמש פינצטה או מחטים כדי להפריד בעדינות את הרקמות, הימנעות מפגיעה בהם.
        הערה: מומלץ לנתח תוך 5-10 דקות. אם החתך אינו מייצר שחול רקמה טוב, מומלץ לעבור לתולעת הבאה ולנתח כמה שיותר תוך 10 דקות. הליך זה דורש מסגרת זמן קצרה כדי למנוע שינויי תמלול מהסביבה.
    4. על פי יצרן ערכת qRT-PCR דו-שלבית, הכן 20 μL של תמיסת ליזיס סופית עבור כל דגימה על ידי ערבוב 0.2 μL של DNase I עד 19.8 μL של תמיסת ליזה בצינורות PCR. מערבבים את תמיסת הליזיס על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 5.
    5. השתמש פיפטה זכוכית autoclaved כדי להעביר את הרקמות מנותקות לתוך צינור PCR. הניחו את צינורות ה-PCR על קרח למשך 2 דקות כדי לאפשר שקיעת חומר בתחתית. הסר את הסופרנטנט, הוסף 20 μL של תמיסת ליזיס סופית לתוך צינור ה- PCR, וערבב על ידי הקשה.
    6. לדגור את תגובת התזה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר 2 μL של תמיסת עצירה לתגובת הליזיס וערבב על ידי הקשה. לדגור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן להשאיר את הדגימות על קרח עד שעתיים לפני שתמשיך לשלב השעתוק ההפוך.

5. תמלול לאחור ו- qRT-PCR

  1. בצע תמלול הפוך ו- qRT-PCR מתולעים בתפזורת.
    1. מדוד את ריכוז ה- RNA והכן 5 מיקרוגרם של RNA כולל לשעתוק הפוך.
    2. הכינו דגימת RNA מרוכזת על ידי ערבוב כמויות שוות של RNA מכל דגימה והתאמת ריכוז הרנ"א הסופי ל-0.556 גרם/ל' (5 מיקרוגרם/9 מיקרול). השתמש בדגימת ה-RNA המאוגדת עבור העקומה הסטנדרטית qRT-PCR ובקרות RT-negative.
    3. בצע תמלול הפוך בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). הפעל את בקרת האיכות הבאה בתגובות שעתוק לאחור לצד דגימות ה- RNA הבודדות.
      1. בצע שעתוק הפוך עם דגימת הרנ"א המאוגדת כתבנית (עבור עקומה סטנדרטית qRT-PCR).
      2. בצע שעתוק הפוך עם דגימת ה-RNA המאוגדת כתבנית, ללא הטרנסקריפטאז ההפוך (בקרת RT-שלילית; בקרת איכות עבור זיהום DNA פוטנציאלי בגנום).
      3. בצע שעתוק הפוך עם המים נטולי הנוקלאז כתבנית (בקרת RT-שלילית; בקרת איכות לזיהום RNA פוטנציאלי בריאגנטים).
        הערה: זוהי נקודת השהיה. דגימות ניתן להשאיר ב thermocycler לילה או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
    4. דלל את ה-cDNA שנוצר מדגימות ה-RNA המאוגדות ארבע פעמים, 20 פעמים, 100 פעמים ו-500 פעמים עם מים נטולי נוקלאז לקבלת עקומות סטנדרטיות qRT-PCR.
    5. דלל את ה-cDNA שנוצר מכל דגימת RNA 20-100 פעמים כדי להשתמש בו כתבניות לתגובות qRT-PCR.
      הערה: יחס הדילול תלוי בשפע הגן המעניין. עבור גנים בעלי ביטוי גבוה, כגון גנים של משק בית או egl-3 ו- egl-21 המשמשים במחקר זה, מומלץ דילול של פי 100. עבור גנים בעלי ביטוי נמוך, כגון lbp-8, מומלץ דילול של פי 20.
    6. בצע qRT-PCR עם ריאגנטים qRT-PCR בהתאם להוראות היצרן כדלקמן: 95 °C למשך 10 דקות, חזור על 40 פעמים עם 95 °C למשך 15 שניות ו- 60 °C למשך דקה אחת, ולאחר מכן תוכנית עקומת ההיתוך המוגדרת כברירת מחדל, והחזק ב- 8 °C לזמן בלתי מוגבל.
  2. בצע שעתוק לאחור ו- qRT-PCR מכמה תולעים או רקמות תולעים.
    1. העבר 25 μL של מאגר RT ו- 2.5 μL של תערובת אנזימי RT 20x מהערכה הדו-שלבית qPCR (ראה טבלת חומרים) לכל צינור המכיל ליזאט תולעת משלב 4.2.6 או שלב 4.3.6.
      הערה: בקרת RT-שלילית היא קריטית עבור qRT-PCR מכמה תולעים. כל ניסוי צריך לכלול דגימה של ליזאט תולעת (משלב 4.2.6) עם מאגר RT אך ללא אנזים RT כדי לבחון את זיהום הדנ"א בדגימות. אם יש בעיה בזיהום דנ"א, שקול להוסיף יותר DNase למאגר התזה או יותר DNase לדגימה לאחר שהתולעים שוכבות. לחלופין, ניתן לבצע בקרת RT-שלילית עבור כל דגימה על ידי שימוש במחצית מהליזאט בתגובת RT רגילה ובחצי השני בתגובת RT ללא טרנסקריפטאז הפוך.
    2. מערבבים על ידי הקשה עדינה. הסתובבו באמצעות מיני צנטריפוגה למשך 10 שניות.
    3. טען את הדגימות למכונת התרמוציקלר בהתאם להוראות היצרן: 37 °C למשך 60 דקות, 95 °C למשך 5 דקות ו- 8 °C לזמן בלתי מוגבל.
      הערה: זוהי נקודת השהיה. דגימות ניתן להשאיר ב thermocycler לילה או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
    4. שמור את כל הריאגנטים והדגימות על קרח והגן על ריאגנטים qRT-PCR מפני אור.
    5. הכינו צלחת qPCR של 96 בארות, ובכל באר ערבבו 6 μL של מים נטולי נוקלאזות, 10 μL של ריאגנט qRT-PCR, 2 μL של 5 μM תערובת פריימר (קדימה ואחורה), ו-2 μL של cDNA. כסו את משטח לוח ה-qPCR בעל 96 הבארות בסרט אופטי מגן ולחצו כלפי מטה כדי לאטום אותו.
    6. הפעל את תוכנית qRT-PCR על רוכב תרמי בהתאם להוראות היצרן כדלקמן: 50 °C למשך 2 דקות, 95 °C למשך 2 דקות, חזור על 40 פעמים עם 95 °C למשך 3 שניות ו- 60 °C למשך 30 שניות, ואחריו 8 °C לזמן בלתי מוגבל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימות של שינויי שעתוק באמצעות כמה תולעים שלמות עם תוספת שומנים
כדי לחקור אם הפרוטוקול לחילוץ ולתמלול מחדש של RNA לתוך cDNA מכמה תולעים שלמות ניתן לשחזור ולהשוואה עם הנתונים של תולעים בתפזורת,נעשה שימוש בזן תולעים בעל תוחלת חיים ארוכה המבטא יתר על המידה את החומצה הליזוזומלית ליפאז lipl-4 במעי 7,8,33,35. אינדוקציה שעתוק של הגנים לעיבוד נוירופפטידים egl-3 ו- egl-21 שדווחובמחקרים קודמים 7,8,33 אומתה (איור 2A,B). אינדוקציה זו מצביעה על כך ששיטת מיצוי הרנ"א מכמה בעלי חיים היא חלופה תקפה לטכניקות סינתזת cDNA סטנדרטיות מתרביות תולעים בתפזורת.

אימות הערכות שעתוק באמצעות רקמות תולעים מנותקות עם תוספת שומנים
ב- C. elegans, הסינתזה של PUFA של 20 פחמן תלויה בפעילות של ה- FAT-316,17 של דסטוראז. מחקרים קודמים דיווחו כי מוטציות של שומן-3 חסרות PUFA של 20 פחמן, כולל DGLA16. בעבר, התגלה כי אובדן של Δ6-desaturase FAT-3 בתולעי lipl-4g מדכא את אינדוקציה שעתוק של הגנים עיבוד נוירופפטידים egl-3 ו egl-2133. בנוסף, תוסף DGLA מציל אינדוקציהכזו 33. הגן המקודד egl-21 מתבטא בנוירונים, בעוד ש- egl-3 מזוהה הן בנוירונים והן במעיים 36,37. כדי לבחון עוד יותר אם תוסף DGLA משחזר את האינדוקציה של egl-3 ו- egl-21 במעי או בנוירונים, המעי נותח החוצה ורמות השעתוק שלהם הוערכו באמצעות ניתוח qRT-PCR המתואר בשלבים 4.3 ו-5.2 של פרוטוקול זה. DGLA נוספה במזון המקור במשך 12 שעות בבגרות של יום 1. לא נמצאה אינדוקציה שעתוק של egl-3 או egl-21 במעי (איור 2C), מה שעולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 36,38.

אימות בדיקת תוחלת חיים לאחר נטילת תוסף שומנים
הקשר בין PUFA של 20 פחמן לבין מנגנון אריכות הימים המשבית שומן-3 נחקר בעבר, במיוחד במעי של תולעי ליפל-4 גרם 33. נמצא כי ההפלה של שומן-3 מדכאת לחלוטין את הארכת תוחלת החיים שהוענקה על ידי lipl-433. כדי להעריך אם DGLA משחזר את אריכות הימים שהושפעה מ-lipl-4, DGLA קיבלה תוסף טרי כל יומיים לתוך מזון המקור ביום - 1 של הבגרות. נמצא כי לאחר הפלת שומן-3, תוסף ה-DGLA מציל את הארכת תוחלת החיים (איור 2D)33, מה שמצביע על הליך מוצלח של תוספי שומנים יחד עם בדיקת תוחלת החיים.

Figure 1
איור 1: סכמטי של הזנת שומנים באמצעות הגדרות ניסוי שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אימות של הערכת השעתוק של גנים המעבדים נוירופפטידים באמצעות אוכלוסייה גדולה של תולעים, כמה תולעים ורקמות מנותחות. (A) רנ"א המופק מאוכלוסייה גדולה של תולעים מראה את האינדוקציה של רמות התעתיק egl-3 ו-egl-21 של הגנים המעבדים נוירופפטידיםבחיות Lipl-4 Tg. קווי שגיאה מייצגים ±1 SEM. **** p < 0.0001 על-ידי מבחן t דו-זנבי של סטודנט. (B) מיצוי RNA מכמה תולעים מאשר את השראת רמות התעתיק egl-3 ו-egl-21 של גנים לעיבוד נוירופפטידים בתולעי Lipl-4 Tg. קווי שגיאה מייצגים ±1 SEM. **** p < 0.0001 על-ידי מבחן t דו-זנבי של סטודנט. (C) גנים לעיבוד נוירופפטידים עצביים egl-3 ו-egl-21 אינם מושרים במעיים מנותחים. קווי שגיאה מייצגים ±1 SEM. ניתוח סטטיסטי עם מבחן t דו-זנבי של סטודנט. (D) תוסף DGLA בריכוזים שונים, כולל 10 מיקרומטר, 100 מיקרומטר ו-1 mM מציל את השפעת אריכות הימים של lipl-4Tg על RNAi של שומן-3. p < 0.001 על ידי בדיקת דירוג יומן. נתון זה מעובד מתוך Savini et al.33. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תוספי שומנים שימשו במחקרי הזדקנות כדי להבהיר את ההשפעה הישירה של מיני שומנים מסוימים על הזדקנות בריאה 6,7,23,26,27,31. עם זאת, הליך נטילת תוספי שומנים יכול להיות מאתגר, וכל חוסר עקביות בין הניסויים יכול לגרום לתוצאות שאינן ניתנות לשחזור. כאן, הפרוטוקול המפורט הראשון שלב אחר שלב מתועד כדי להנחות מדענים חדשים כדי למנוע את המלכודות הפוטנציאליות הנגרמות על ידי אי דיוק טכני. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה יידונו בפירוט בפסקאות הבאות. ארגז הכלים לחקר השומנים מתרחב גם על ידי החדרת בידוד RNA ממעט תולעים ורקמות תולעים ספציפיות לאחר תוספת שומנים. כאשר שוקלים את המתודולוגיה לבחינת רמות התמליל, ה- qRT-PCR עם כמה תולעים או רקמות מנותקות יוצא מן הכלל לניתוח כמה תעתיקים או בחינת שינויים מסוימים בתעתוק ספציפי לרקמה. יתר על כן, באמצעות מתודולוגיות אלה יכול להתגבר על השלב של הגברת תולעת שיכול לקחת כ 5-6 ימים נוספים. יחד עם זאת, הזנת שומנים ואחריה מיצוי RNA בתפזורת היא חסכונית יותר ואלטרנטיבה תקפה כאשר יש צורך לנתח קבוצה גדולה יותר של גני מטרה.

מספר שלבים יכולים להיות קריטיים לשחזור השפעות ההזנה של השומנים. ההיבט הראשון קשור לתנאים החיידקיים. מומלץ להשתמש בצלחות חיידקים טריות שמשקלן אינו עולה על 7 ימים לחיסון. מומלץ להשתמש בחיידקים שהוכנו במדיום BDR תוך שבוע. חיידקים שעורבבו עם שומנים יש להשתמש מיד. שומנים עם חיידקים לא צריך להיות מאוחסן אפילו ב 4 מעלות צלזיוס, כמו חיידקים יהיה מטבוליזם השומנים. שלבי השטיפה בבסיס ה-BDR וההדחה מחדש במדיום ה-BDR הם קריטיים למחלות חיידקים, שכן חיידקים גודלו ב-LB, והוזנו ישירות לתולעים תמיד מבטלים את ההשפעות העמוקות של תוספי שומנים. הגורם השני קשור לתנאי התולעת. C. elegans חייבים להיות לא מורעבים לפחות שלושה דורות לפני שלב ההלבנה להכנת ביצים כדי להבטיח שהם במצב מטבולי בריא ויציב. הוא גם חיוני לתרבית C. elegans על צלחות אגר לפני נטילת תוסף שומנים; זה כולל לפני ואחרי שלב הסינכרון.

תולעים שהסתגלו לתרביות נוזליות לפרקי זמן ממושכים מורעבות חלקית; הרעבה מעלה את הבסיס לגנים התומכים באריכות ימים, מה שמוביל להשפעה מוחלשת של תוספי שומנים. אם הסחף המטבולי והשינויים באמצעות זחלי L1 עצורים הם חששות, חלופה תקפה תהיה לצלוח ישירות את הביצים. כאשר רק תולעים מעטות נדרשות לביצוע ניתוח תוחלת חיים או ביטוי גנים, ניתן לצלחת ביצים ישירות על צלחות מותנות שומנים ולסנכרן אותן מחדש על ידי בחירה ידנית בשלב L4 לניסויים הבאים. עם זאת, אם יש צורך בכמויות גדולות של תולעים כאשר בחירה ידנית של L4 אינה ישימה, ציפוי ביצים ישירות אינו אידיאלי. ביצים הבוקעות לאחר הלבנה ממבוגרים גרבידים יכולות להתרחש בנקודות זמן שונות ולגרום לאוכלוסייה להיות לא מסונכרנת, מה שיפריע לניתוח השעתוק. החלק הקריטי השלישי קשור לתנאי אחסון השומנים; כאשר נוטלים תוסף PUFA, נדרשת תשומת לב נוספת מכיוון שמולקולות אלה רגישות לאור ונוטות להתחמצן באוויר.

מחלות מרובות של הזנת שומנים, כולל שלבי התולעת, אורך התוספים והריכוזים, דורשות חקירה נוספת בעת בדיקת מולקולות שומנים חדשות. L4, יום-1 בוגר, ויום-2 תולעים בוגרות הן בדרך כלל נקודת המוצא לבדיקה בשלבי תולעים שונים. יש לציין כי כאשר מאכילים תולעי L4, אם זמן הדגירה מסתיים סביב שלב הנמטודה, צפויה וריאציה גדולה, אשר משפיעה מאוד על המשמעות והשכפול של התוצאות. אתגר נוסף לשימוש בתולעים בוגרות יום 1 או יום-2 קשור לצאצאים שיכולים לסבך את ניתוח ביטוי הגנים. במקרה זה, מיצוי RNA מכמה תולעים שלמות אמין יותר מאוכלוסיות בתפזורת. למולקולות שומנים שונות יש טווחי ריכוז שונים כדי לייצר השפעות פיזיולוגיות; לפיכך, סדרה של ריכוזים מ 1 μM עד 1 mM מוצע להיבדק.

ישנן מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון בעת בחירת שיטת ההאכלה. ראשית, כאשר שומנים אינם נספגים או נבלעים על-ידי התולעים, מאתגר להשתמש בשיטת נטילת תוספים כדי לבחון את ההשפעה הביולוגית שלהם ב-C. elegans. עם הטכנולוגיות הנוכחיות, ספקטרומטריית מסות או SRS בשילוב עם 13תרכובות שומנים המסומנות C או 2H39 הם כלים תקפים לבדיקת ספיגת השומנים לגוף התולעת. שנית, שיטות הזנה אלה אינן מותאמות לטכניקות חקירה בתפוקה גבוהה. עבור תוספי שומנים עם תולעים בתפזורת, הכנת דגימות משיטת ההזנה הנוזלית מהירה יותר מאשר האכלה בצלחת, מכיוון שניתן להעביר את התרביות הנוזליות ישירות לצינורות מיקרוצנטריפוגה במקום להישטף מצלחות ההזנה. כדי להבטיח שהרנ"א המופק נמצא במצב של קציר, מומלץ לא לתת ליותר מ-15-20 דקות לעבור בין הנקודה של הצבת התולעים על הקרח לטחינתן בתמיסת מיצוי ה-RNA. מומלץ לעבד פחות תנאים כל 15 דקות כאשר יש צורך לעבד מספר גבוה של דגימות. עבור מיצוי RNA של תולעת שלמה מכמה בעלי חיים, שלב בחירת הידיים הוא השלב המגביל את הקצב, ואילו עבור ניתוח רקמות, חיוני לפעול באופן יעיל בזמן כדי למנוע חשיפה ארוכת טווח לסביבה לא פיזיולוגית. בדומה למיצוי RNA בתפזורת, עדיף לקטוף תולעים או לנתח דגימות רקמה תוך 10 דקות.

למרות המגבלות, ניתן להשתמש בשיטות תוספי תזונה אלה מעבר למחקר השומנים כדי לסייע בזיהוי השפעות תזונתיות ותרופתיות כלשהן. ההליכים המדווחים כאן אינם מוגבלים רק למחקר הזדקנות אלא לפנוטיפים חלופיים להערכת כושר אברונים והומאוסטזיס מטבולי של תאים. שיטת התוסף עם אוכלוסייה בתפזורת יכולה להיות משולבת עם RNA-seq לניתוח תעתיק, ספקטרומטריית מסה לניתוח מטבולי ופרוטאומי, או כתם מערבי לניתוח סמני חלבון ספציפיים, בעוד שניתן לשלב את תוספת השומנים עם כמה תולעים עם הדמיה וניתוח התנהגותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים ל- P. Svay על התמיכה בתחזוקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), קרן מארס אוף דימס (MCW), קרן וולש (MCW), חוקר HHMI (M.C.W.) ועמית קדם-דוקטורט (M.S.) של NIH T32 ES027801. חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Pestle Genesee Scientific 93-165P15 For worm grinding with Trizol
Agarose Sigma A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix GenDEPOT R5600 For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR ThermoFisher A28567 For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge Benchmark Scientific C1248 For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip Branson Ultrasonic Corporation 100-132-888R
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cholesterol Sigma C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge Eppendorf 22620444R For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro Eppendorf 950030010 For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate Neta Scientific 665180 12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm Neta Scientific 664161 For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm Neta Scientific 628161 For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water ThermoFisher AM9937
Isoproanol Sigma PX1835-2
Levamisole hydrochloride VWR SPCML1054
lipl-4Tg MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22) MCW Lab N/A Transgenic C. elegans
Luria Broth Base ThermoFisher 12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode ThermoFisher 4483354 96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied BioSystem 4311971 For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System Sigma Z00Q0V0WW Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2 Caenorhabditis Genetics Center N/A C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher N/A For measuring RNA concentration
OP50 Caenorhabditis Genetics Center N/A Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) Sigma P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit ThermoFisher 4402953 For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4367659 For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach  KIK International LLC. 59647210143 6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution ThermoFisher AM9780
Sodium cloride (NaCl) Sigma S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) Sigma S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge Thermo 7500-4337 For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge Thermo 7500-7200 For worm egg preparation
TRIzol Reagent TheroFisher 15596018 RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit ThermoFisher AM1907 For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59 Denville Scientific INV S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor VWR 47747-370 For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 VWR N/A For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker WormStuff 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 190
תוספי שומנים לאריכות ימים וניתוח שעתוק גנים ב <em>- Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., … More

Savini, M., Lee, Y. T., Wang, M. C., Zhou, Y. Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (190), e64092, doi:10.3791/64092 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter