Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الجمع بين مشغل القوة المغناطيسية 3D والتصوير الفلوري متعدد الوظائف لدراسة علم الأحياء الميكانيكي للنواة

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا جديدا لتطبيق القوة الميكانيكية مباشرة على نواة الخلية من خلال الميكروبيدات المغناطيسية التي يتم توصيلها إلى السيتوبلازم وإجراء تصوير فلوري متزامن للخلايا الحية.

Abstract

السؤال الأساسي في علم الأحياء الميكانيكي هو كيف تستشعر الخلايا الحية المحفزات الميكانيكية خارج الخلية في سياق فسيولوجيا الخلية وعلم الأمراض. يعتقد أن الإحساس الميكانيكي الخلوي للمنبهات الميكانيكية خارج الخلية يكون من خلال مستقبلات الغشاء ، ومركب البروتين المرتبط به ، والهيكل الخلوي. تظهر التطورات الحديثة في علم الأحياء الميكانيكي أن نواة الخلية في السيتوبلازم نفسها يمكنها أن تستشعر بشكل مستقل المحفزات الميكانيكية في وقت واحد. ومع ذلك ، هناك نقص في الفهم الميكانيكي لكيفية استشعار نواة الخلية للمحفزات الميكانيكية وتحويلها والاستجابة لها ، ويرجع ذلك أساسا إلى التحديات التقنية في الوصول إلى ميكانيكا النواة وقياسها بواسطة الأدوات التقليدية. تصف هذه الورقة تصميم وتصنيع وتنفيذ مشغل قوة مغناطيسية جديد يطبق محفزات ميكانيكية 3D دقيقة وغير جراحية لتشويه نواة الخلية مباشرة. باستخدام الخلايا المهندسة بتقنية كريسبر / كاس 9 ، توضح هذه الدراسة أن هذه الأداة ، جنبا إلى جنب مع التصوير الفلوري متحد البؤر عالي الدقة ، تمكن من الكشف عن ديناميكيات الوقت الفعلي لبروتين مرتبط ب نعم حساس ميكانيكيا (YAP) في الخلايا المفردة كدالة لتشوه النواة. هذه الطريقة البسيطة لديها القدرة على سد الفجوة التكنولوجية الحالية في مجتمع علم الأحياء الميكانيكي وتقديم إجابات لفجوة المعرفة الموجودة في العلاقة بين النقل الميكانيكي للنواة ووظيفة الخلية.

Introduction

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير وتطبيق تقنية جديدة لتوضيح البيولوجيا الميكانيكية للنواة من خلال الجمع بين المشغلات المغناطيسية التي تطبق القوة الميكانيكية مباشرة على نواة الخلية والمجهر الفلوري متحد البؤر الذي يصور في وقت واحد التغيرات الهيكلية والوظيفية تحت الخلوية. تستشعر الخلايا الإشارات الفيزيائية الحيوية خارج الخلية بما في ذلك تصلب الأنسجة1،2،3،4 ، وضغط السائل الخلالي وإجهاد القص5،6،7 ، وطوبولوجيا / هندسة السطح8،9،10،11،12 ، وإجهاد التوتر / الضغط13،14 ، 15,16. يتم تحويل الإشارات الفيزيائية الحيوية إلى إشارات كيميائية حيوية وتؤدي إلى تغييرات محتملة في التعبير الجيني وسلوكيات الخلية - وهي عملية تعرف باسم النقل الميكانيكي 17،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27 . لدراسة عمليات النقل الميكانيكي ، تم تطوير عدد لا يحصى من التقنيات لتطبيق القوة الميكانيكية على الخلايا ، مثل مجهر القوة الذرية28 ، وجهاز تمدد الخلية29 ، ومستشعر قوة MEMS الحيوي (الأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة)15،30،31 ، ريولوجيا القص 32 ، ونظام الرؤية الاستريو 33 . تلخص مراجعة حديثة مناهج تطبيق الإشارات الميكانيكية خارج الخلية والتدخل في الاستشعار الميكانيكي34. حتى الآن ، تطبق معظم هذه الطرق القوة على غشاء بلازما الخلية ، وتتلقى الخلايا مباشرة هذه الإشارات الفيزيائية الحيوية خارج الخلية عبر مستقبلات الغشاء مثل الأنتغرين والكادهيرين والقنوات الأيونية والمستقبلات المقترنة بالبروتين G. بعد ذلك ، ينقلون الإشارة إلى الهيكل الخلوي داخل الخلايا والنواة. على سبيل المثال ، باستخدام إزفاء البروتين المرتبط ب yes (YAP) كمؤشر على الاستشعار الميكانيكي ، تظهر الخلايا أنها تستشعر الإشارات الميكانيكية لتصلب الركيزة والتوتر خارج الخلية من غشاء الخلية وتنقلها عبر الهيكل الخلوي إلى النواة للحث على انتقال السيتوبلازم YAP إلى النواة28,35.

تشير الأدلة الحديثة إلى أن نواة الخلية نفسها عبارة عن مستشعر ميكانيكي مستقل8،36،37. وقد ثبت ذلك من خلال التجارب التي أجريت على النواة المعزولة التي تم حصادها من الخلايا ، حيث تم الكشف عن أن النوى تغير صلابتها بشكل تكيفي استجابة للقوة الميكانيكية المطبقة عليها مباشرة36. خلال العديد من الحالات الفسيولوجية ، تستشعر النوى في كل من الورم والخلايا السليمة الإشارات الفيزيائية الحيوية خارج الخلية وتغير خصائصها الميكانيكية وتجميعها38،39،40. على سبيل المثال ، عند التسرب ، ينخفض الصلابة النووية للخلايا السرطانية ويحافظ على ليونة لأكثر من 24 ساعة38. أثناء الهجرة عبر الفضاء الخلالي الضيق ، تفقد نوى الخلايا السرطانية بشكل متكرر وتستعيد سلامتها الهيكلية39. ومع ذلك ، فإن الطريقة التي تستشعر بها النواة الإشارة الفيزيائية الحيوية غير معروفة ، على الرغم من أنه تم العثور على العديد من بروتينات الغلاف النووي وعائلات البروتينات ، مثل Lamin A / C ورابط الهيكل النووي والهيكل الخلوي (LINC)المعقدة 38,41. ومن ثم ، فإن الطرق الجديدة غير الغازية التي يمكنها تطبيق القوة مباشرة على النواة ستفصل تأثير انتقال القوة من غشاء بلازما الخلية والهيكل الخلوي ، وستساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي كان يتعذر الوصول إليها سابقا للاستشعار الميكانيكي النووي.

أظهرت الأبحاث التي استخدمت ملاقط بصرية لمعالجة العضيات42 والميكروبيدات المحقونة في الخلايا43 القدرة التكنولوجية على تطبيق القوة مباشرة على النواة. ومع ذلك ، فإن تقنية الملقط البصري لها العديد من القيود: (1) غالبا ما تتلاعب الملقط البصري منخفض الإنتاجية بخلية واحدة أو ميكروبيدات واحدة فقط في كل مرة. و (2) يتطلب التلف الضوئي المحتمل وتشوه القطع الأثرية في درجة الحرارة النووية عشرات pN36 ، وتبلغ طاقة الليزر اللازمة المقابلة حوالي 10 ميغاواط لكل pN44,45. شدة الليزر هذه كافية لإحداث تلف ضوئي في الخلايا واضطراب وظائف الخلية أثناء التجربة46.

تظهر القوة المغناطيسية المطبقة من خلال الميكروبيدات داخل الخلايا الحية إمكانية تطبيق القوة مباشرة على النواة وتتغلب على قيود الملقط البصري. بمجرد تسليم الميكروبيدات إلى السيتوبلازم ، يمكن للمجال المغناطيسي أن يمارس قوة مغناطيسية على ميكروبيدات متعددة في وقت واحد بطريقة عالية الإنتاجية. لا يؤثر المجال المغناطيسي على وظائف الخلية47 ، ولكنه يولد قوة من pN إلى nN ، وهو ما يكفي للحث على التشوه النووي36،48،49. حتى الآن ، تم تطبيق التلاعب بالميكروبيدات المغناطيسية على غشاء بلازما الخلية48 ، داخل السيتوبلازم50 ، على F-actin51 ، داخل النواة47 ، وعلى النواةالمعزولة 36. ومع ذلك ، لم يتم استخدام التلاعب المغناطيسي للميكروبيدات لتطبيق قوة ميكانيكية مباشرة على الغلاف النووي لدراسة النقل الميكانيكي في النواة.

في هذا البحث ، تم تطوير تقنية بسيطة لتوصيل الميكروبيدات المغناطيسية بشكل غير جراحي إلى السيتوبلازم واستخدام هذه الميكروبيدات لتطبيق القوة الميكانيكية على النواة (الشكل 1). هنا ، يتم استخدام خطوط خلايا B2B البشرية الطبيعية المصممة بواسطة CRISPR / Cas9 والتي تعبر داخليا عن mNeonGreen21-10 / 11 الموسومة YAP للتحقق من صحة الطريقة. YAP هو بروتين حساس للميكانيكا ، ويتم تنظيم نقل YAP بواسطة الاستشعار الميكانيكي النووي14,28. تم اختيار نهج الضربة القاضية المنظم بواسطة CRISPR / Cas9 لوضع علامة على YAP الداخلي ببروتين فلوري (FP) mNeonGreen21-10 / 11. على الرغم من أنه من المعروف أن تحرير كريسبر له كفاءة غير مكتملة وتأثير خارج الهدف ، إلا أن البروتوكولات في المنشورات السابقة دمجت الفرز الفلوري لتحديد إدراج إطار القراءة المفتوح الصحيح52،53،54. مع هذه الطبقة الإضافية من التحديد ، لم يلاحظ أي حدث وضع علامات خارج الهدف في 20+ خط خلية تم إنشاؤه مسبقا52،53،54،55. هذا هو بناء بروتين الفلورسنت المنقسم ، ولكن من حيث المبدأ ، يمكن أن تكون أي علامة فلورية قابلة للتعبير قابلة للاستخدام. يتفوق نهج وضع العلامات هذا على طرق التحوير أو الأجسام المضادة. أولا ، على عكس التعبير الجيني المعدل ، يحافظ البروتين الموسوم على جرعة جينية أحادية النسخة ويعبر في السياق الفسيولوجي للشبكة التنظيمية للجينات الأصلية ، مما يحد من الانحرافات في تركيز البروتين وتوطينه وتفاعله. تحقق طريقة وضع العلامات المستخدمة في هذه الدراسة إنتاجية وكفاءة أعلى من ترتيب الحجم مقارنة بوضع علامات FP الكاملة. كما أنه يتجنب التحديات المرتبطة بالتألق المناعي بسبب القطع الأثرية للتثبيت والتوافر المحدود للأجسام المضادة عالية الجودة وعالية النوعية. ثانيا ، النهج المستخدم في هذه الورقة يقلل من الاضطراب في فسيولوجيا الخلية ويتيح الكشف في الوقت الفعلي عن جميع YAPs الداخلية بشكل أصلي. في المقابل ، غالبا ما تؤدي طرق التحوير الشائعة الأخرى إلى الإفراط في التعبير عن YAP. يمكن أن يتسبب التوزيع الاصطناعي الناتج في السمية الخلوية ويؤثر على الاستشعار الميكانيكي للخلايا56،57،58.

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتطبيق القوة مباشرة على النواة من خلال الميكروبيدات المغناطيسية التي يتم توصيلها إلى السيتوبلازم وإجراء تصوير فلوري متزامن للخلايا الحية. باختصار ، توضح البروتوكولات المعروضة هنا كيفية (1) توصيل الميكروبيدات المغناطيسية إلى الخلية أثناء وجودها خارج النواة ، (2) معالجة الميكروبيدات لتطبيق القوة المغناطيسية على النواة ، (3) إجراء تصوير فلوري متحد البؤر للخلايا أثناء التلاعب ، و (4) تحليل كمي لنسبة YAP النووية / السيتوبلازم (N / C) طوال عملية تطبيق القوة. تشير النتائج إلى أنه (1) من خلال الالتداخل الخلوي ، يمكن توصيل الميكروبيدات المغناطيسية بشكل غير جراحي إلى سيتوبلازم خلايا B2B في غضون 7 ساعات (الشكل 2 والشكل 3) ؛ و (2) يمكن للقوة المغناطيسية الكمية المطبقة مباشرة على النواة (الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6) وحدها أن تؤدي إلى تغييرات متنوعة في نسبة YAP N / C في خلايا B2B المصممة بواسطة CRISPR / Cas9 (الشكل 7 والشكل 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. صيانة خلايا B2B المصممة هندسيا CRISPR / Cas9

  1. خلايا B2B في قارورة T25 مع RPMI-1640 تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية و 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين.
  2. الحفاظ على خلايا B2B في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  3. الاستزراع الفرعي لخلايا B2B عندما يصل التقاء 70٪ إلى 80٪.
  4. قم بتخزين خط الخلايا B2B في وسط استزراع RPMI-1640 مع 10٪ (v / v) DMSO في مجمد -80 درجة مئوية.
  5. استخدم خلايا B2B برقم مرور أقل من 10 في التجارب.

2. ثقافة الخلية

  1. بذر الخلايا على طبق بتري ذو قاع زجاجي.
    1. انقل القارورة التي تحتوي على خلايا B2B إلى الداخل من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية.
    2. قم بإزالة وسط الاستزراع في القارورة باستخدام ماصة شفط مع مضخة تفريغ متصلة.
    3. اغسل القارورة ب 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    4. قم بإزالة PBS باستخدام ماصة الاستنشاق.
    5. أضف 0.5 مل من محلول التربسين 0.05٪ لفصل الخلايا من قاع ركيزة القارورة.
    6. ضع القارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
    7. انقل القارورة إلى خزانة السلامة البيولوجية. أضف 5 مل من وسط الاستزراع الجديد إلى القارورة وماصة المحلول لأعلى ولأسفل.
    8. قم بإيداع 50 ميكرولتر من الوسط مع الخلايا (300 خلية / ميكرولتر) على طبق بتري ذو القاع الزجاجي. أضف 2 مل من وسط الاستزراع إلى طبق بتري.
    9. ضع طبق بتري في الحاضنة. انتظر لمدة 12 ساعة حتى يتم إرفاق الخلايا.
  2. زراعة الخلايا مع الميكروبيدات المغناطيسية.
    1. يزن 0.2 غرام من ميكروبيدات حديد الكربونيل ذات القطر المتوسط 7 ميكرومتر (يشار إليها فيما يلي باسم ميكروبيدات 7 ميكرومتر ، انظر جدول المواد).
    2. استخدم ماصة لتعليق الميكروبيدات في 1 مل من وسط الاستزراع RPMI-1640.
    3. خذ طبق بتري مع خلايا B2B إلى خزانة السلامة البيولوجية.
    4. أضف 200 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على ميكروبيدات إلى طبق بتري.
      ملاحظة: أضف الوسط بسرعة لتجنب ترسيب الميكروبيدات.
    5. ضع طبق بتري مرة أخرى في الحاضنة حتى يتم استيعاب الميكروبيدات بواسطة الخلايا. تحقق من الاستيعاب كل 6 ساعات لتحديد الوقت الأمثل لاستيعاب خطوط الخلايا المختلفة.
    6. للتحقق من الاستيعاب ، قم بإجراء تصوير مضان متحد البؤر لتصور حدود الميكروبيدات والنووية والخلية. إذا تم استيعاب الميكروبيدات بواسطة الخلية ، فستكون داخل حدود الخلية.

3. تصور النواة

  1. قم بتسخين 1.5 مل من وسط الثقافة في الحاضنة لمدة 15 دقيقة.
  2. أطفئ ضوء خزانة السلامة البيولوجية. خذ طبق بتري الذي يحتوي على الخلية ، ووسط الثقافة الدافئ ، والبقع النووية ، وفيراباميل حمض الهيدروكلوريك في خزانة السلامة البيولوجية.
    ملاحظة: مكونات التلوين النووي حساسة للضوء. تجنب التعرض للضوء أثناء التشغيل.
  3. تمييع 1000x بقعة نووية بواسطة DMSO إلى 100x.
  4. تمييع 100 مليمول فيراباميل حمض الهيدروكلوريك بواسطة DMSO إلى 10 ملليمتر.
  5. أضف 15 ميكرولتر من 100x صبغة نووية و 15 ميكرولتر من 10 mM فيراباميل هيدروكلورايد إلى 1.5 مل من وسط الثقافة. تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل.
  6. قم بإزالة وسط الثقافة من طبق بتري. أضف وسط الاستزراع الذي يحتوي على تلطيخ نووي في طبق بتري.
  7. ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لأكثر من 2 ساعة.

4. إعداد أجهزة تطبيق القوة المغناطيسية

  1. 3D طباعة جميع الأجزاء باستخدام أكريلونيتريل بوتادين ستايرين (ABS) وتجميعها وفقا لتصميم CAD (الشكل 1A). يتم تضمين تصميم CAD في جدول المواد.
  2. استخدم شريطا على الوجهين لتوصيل المغناطيس بجهاز تحريك المغناطيس (الشكل 1 أ).
  3. اضبط جهاز تحريك المغناطيس بجوار مرحلة المجهر. استخدم المقابض الثلاثة لضبط الموقع المكاني للمغناطيس حتى يتمكن من التحرك فوق طبق بتري بين 13 مم و 120 مم.
    ملاحظة: تأكد من أن الحد الأعلى للمسافة بين المغناطيس وطبق بتري كبير قدر الإمكان لتجنب تطبيق القوة غير المرغوب فيها على الميكروبيدات المغناطيسية. 120 مم هي القيمة القصوى في هذا الإعداد التجريبي. تأكد من أن المغناطيس لا يتداخل مع أجزاء المجهر ، بما في ذلك الأهداف والمراحل الآلية.
  4. اضبط المغناطيس على أعلى موضع z (عند 120 مم).

5. تطبيق القوة والتصوير بالخلايا الحية

  1. إعداد غرفة البيئة للتصوير طويل الأمد
    1. ضع محلول الإيثانول بنسبة 75٪ لتعقيم وتنظيف غرفة البيئة تماما.
    2. ضع غرفة البيئة على المرحلة الآلية من المجهر المقلوب.
    3. افتح خزان CO 2 واضبط معدل تدفق CO2 على 160 مل / دقيقة.
    4. اضبط درجة حرارة الغرفة على 44 درجة مئوية (أعلى) و 42 درجة مئوية (حمام) و 40 درجة مئوية (مرحلة).
    5. أضف 20 مل من الماء النقي إلى حمام غرفة البيئة للحفاظ على رطوبة 90٪.
    6. أخرج طبق بتري ذو القاع الزجاجي الذي يحتوي على خلايا مستهدفة من حاضنة زراعة الأنسجة وضعه في الغرفة.
    7. ضع المشبك المعدني لغرفة البيئة لإصلاح موضع طبق بتري.
      ملاحظة: يجب تثبيت طبق بتري بإحكام في الحجرة لأن القوة المغناطيسية قد تحرك الطبق إذا لم يتم تثبيته.
    8. أغلق غطاء الغرفة.
  2. تحسين معلمات التصوير
    1. تحسين حجم الثقب: يحجب الثقب الفوتونات خارج التركيز. ينتج عن حجم الثقب الأكبر المزيد من الفوتونات خارج التركيز البؤري ولكن صورة أكثر إشراقا. ينتج عن حجم الثقب الأصغر صورة أكثر تركيزا وخفوتا. تأكد من تحسين حجم الثقب للحصول على صور متحدة البؤر داخل التركيز البؤري مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المناسبة.
    2. تحسين شدة الليزر: تحدد شدة الليزر شدة الإثارة وبالتالي انبعاث الضوء. تعطي شدة الليزر المنخفضة نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة. ارتفاع شدة الليزر سوف يسبب التبييض الضوئي. اضبط شدة الليزر وفقا لذلك.
    3. تحسين حجم الخطوة والخطوات: تحدد الخطوات وحجم الخطوة عدد الصور التي ستلتقطها في Z-stack. ستؤدي أحجام الخطوات الأصغر والمزيد من الخطوات إلى زيادة دقة Z-stack ولكنها ستزيد أيضا من التبييض الضوئي. في هذه التجربة ، تم استخدام حجم خطوة 1 ميكرومتر للخلايا ذات ارتفاع الخلية ~ 15 ميكرومتر.
    4. تحسين وقت التعرض: يحدد وقت التعرض المدة التي ستتعرض فيها الخلية لليزر الإثارة. سيؤدي وقت التعرض المنخفض إلى تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سيؤدي وقت التعرض العالي إلى التبييض الضوئي. تم استخدام وقت التعرض 1 إطار لكل 4 ثوان في هذه التجربة.
    5. تحسين معلمات التصوير: قم بتغيير إحدى المعلمات الأربعة بشكل متكرر وحافظ على اتساق المعلمات الأخرى. في كل مرة ، قم بقياس نسبة YAP N / C لكل صورة وقارن تغيير نسبة YAP N / C لتحديد مستوى التبييض الضوئي. كرر عملية التحسين حتى تحقيق التوازن بين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وسرعة التصوير والتبييض الضوئي.
    6. حدد تكوينات التصوير باستخدام معلمات التصوير المحسنة لإعدادات تصوير أسرع أثناء التجارب.
      ملاحظة: تم وصف التكوينات المستخدمة في هذه الدراسة في القسم 5.3 من معلمات التصوير. لتحسين معلمات التصوير للتكوينات في القسم 5.3 ، استخدم نفس الطريقة كما في الخطوة 5.2.5.
  3. تطبيق القوة الصغيرة والتصوير متحد البؤر
    ملاحظة: تم استخدام مجهر نيكون Ti2-E للتصوير في هذه الدراسة، وترد أدناه الخطوات التفصيلية للحصول على الصور.
    1. افتح المجهر المقلوب. افتح عناصر تطبيق البرنامج.
    2. تحديد التكوين magnetic_find. تحقق فقط من قناة FITC. اضبط PMT HV = 70 ، الإزاحة = 0 ، شدة الليزر = 10. اضبط سرعة المسح على إطار واحد لكل 2 ثانية بالنقر فوق الزر 1/2 . اضبط حجم الثقب على 1.2 AU بالنقر فوق الزر 1.2 A.U. سيتم استخدام هذا التكوين في الخطوة 5.3.5.
    3. تحديد التكوين magnetic_YAP_Nucleus. تحقق من قناة FITC. اضبط PMT HV = 70 ، الإزاحة = 0 ، شدة الليزر = 10. اضبط سرعة المسح على إطار واحد لكل 4 ثوان بالنقر فوق الزر 1/2 . اضبط حجم الثقب على 1.2 AU بالنقر فوق الزر 1.2 A.U. لتصوير حدود النواة وشدة البقع النووية ، تحقق من قناة Cy5. اضبط PMT HV = 70 ، الإزاحة = 0 ، شدة الليزر = 10. تم تحسين حجم الثقب للتصوير 3D YAP. لا تنقر فوق الزر 1.2 A.U . مرة أخرى بعد التحقق من قناة Cy5. سيتم استخدام هذا التكوين في الخطوة 5.3.7.
    4. قم بتشغيل DIA من خلال العناصر إذا لزم الأمر. افتح SpinView ، واستخدم مجالا ساطعا ، واضبط تركيز الكائن للحصول على صورة واضحة في التركيز للخلايا. استخدم هدفا 10x للعثور على خلايا مفردة متعددة مناسبة في ثلاثة شروط: مع وجود ميكروبيدات واحدة بالداخل ، مع وجود ميكروبيدات متعددة بالداخل ، وبدون أي ميكروبيدات بالداخل. قم بالتبديل إلى هدف 40x. قم بتسمية هذا المنصب برقم الوظيفة المناسب.
    5. العناصر المفتوحة. انقر فوق magnetic_find. انقر فوق الزر "إزالة التعشيق".
    6. انقر فوق مسح ضوئي واضبط الموضع Z للمستوى البؤري. انقر فوق الزرين العلوي والسفلي لتعيين الحد الأدنى والأعلى لمكدس Z للخلايا المحددة. أوقف المسح الضوئي بالنقر فوق مسح ضوئي مرة أخرى.
    7. قم بالتبديل إلى تكوين magnetic_YAP_Nucleus . قم بتعيين اسم الملف ك before_small_force.nd2. انقر فوق الزر "تشغيل " باستخدام مكدس Z المسجل.
    8. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . في هذه الأثناء ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس لأسفل إلى 46 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو. تحقق من الفيديو للتأكد من أن الميكروبيدات تظهر الإزاحة التي تسببها القوة المغناطيسية.
    9. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 ؛ قم بتعيين اسم الملف إلى after_small_force.nd2.
    10. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. بعد ذلك ، افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . وفي الوقت نفسه ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس حتى 120 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو.
    11. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 وقم بتعيين اسم الملف إلى before_large_force.nd2.
  4. تطبيق القوة الكبيرة والتصوير متحد البؤر
    1. قم بإزالة غطاء غرفة البيئة للسماح للمغناطيس بالوصول إلى 13 مم فوق قاع طبق بتري.
    2. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . في هذه الأثناء ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس لأسفل إلى 13 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو. تحقق من الفيديو للتأكد من أن الميكروبيدات تظهر الإزاحة التي تسببها القوة المغناطيسية.
    3. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 وقم بتعيين اسم الملف إلى after_large_force.nd2.
    4. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. بعد ذلك ، افتح SpinView وانقر على زر التسجيل . وفي الوقت نفسه ، قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس لتحريك المغناطيس حتى 120 مم فوق قاع طبق بتري. احفظ تسلسل صور المجال الساطع أو الفيديو.
    5. كرر الخطوات 5.3.5-5.3.7 ؛ قم بتعيين اسم الملف إلى retract_large_force.nd2.
    6. أغلق غطاء غرفة البيئة.
  5. كرر الخطوتين 5.2 و5.3 لحقول عرض متعددة للحصول على مزيد من البيانات إذا لزم الأمر.

6. معالجة الصور وتحليل البيانات

  1. القياس الكمي لنسبة YAP N / C
    1. افتح فيجي ImageJ. افتح صور .nd2 التي تم التقاطها في الخطوة 5.
    2. انقر فوق تحليل > تعيين القياسات. تحقق من المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية وواصفات الشكل.
    3. استخدم قناة Cy5 لتحديد النواة. انقر فوق التحديدات اليدوية لاستخدام أداة التحديد الحر لتحديد النواة. تحقق أيضا من ماكرو القناع النووي التلقائي في ImageJ (انظر جدول المواد).
    4. انقر فوق تحليل > القياس في قناة FITC. القيمة المقاسة للمتوسط هي متوسط شدة YAP النووية DN.
    5. استخدم قناة Cy5 لتحديد النواة. استخدم قناة FITC لتحديد الخلية. انقر فوق التحديدات اليدوية لاستخدام أداة التحديد الحر لتحديد منطقة ذات أهمية داخل السيتوبلازم وتجنب الميكروبيدات المغناطيسية. يجب ألا تتضمن منطقة الاهتمام هذه النواة.
    6. انقر فوق تحليل > القياس في قناة FITC. القيمة المقاسة للمتوسط هي متوسط كثافة YAP السيتوبلازمية DC.
    7. احسب نسبة YAP N / C = D N / DC.
  2. القياس الكمي للشكل النووي وكثافة البقع النووية الطبيعية
    1. افتح فيجي ImageJ. افتح صور .nd2 التي تم التقاطها في الخطوة 5.
    2. انقر فوق تحليل > تعيين القياسات. تحقق من المساحة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية وواصفات الشكل.
    3. استخدم قناة Cy5 لتحديد النواة. انقر فوق التحديدات اليدوية لاستخدام أداة التحديد الحر لتحديد النواة.
    4. انقر فوق تحليل > القياس في قناة Cy5. القيمة المقاسة للمتوسط هي شدة البقع النووية. القيمة المقاسة للسيرك. هي دائرية نووية.
    5. لمقارنة شدة البقع النووية في حالة قوة مختلفة ، يتم تقسيم كل شدة البقع النووية على شدة البقع النووية في "before_small_force.nd2" لتوليد كثافة البقع النووية الطبيعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تصميم جهاز تحريك مغناطيسي وتطبيق القوة المغناطيسية
لتطبيق القوة على النواة من خلال الميكروبيدات المغناطيسية ، تم تصميم وبناء جهاز تحريك مغناطيسي للتحكم في الموقع المكاني للمغناطيس. يحتوي جهاز تحريك المغناطيس على إطار مركزي وثلاثة مقابض وقضبان لتحريك المغناطيس المرفق في اتجاهات x و y و z بشكل مستقل بدقة مكانية تبلغ 1.59 مم لكل دورة (الشكل 1 أ). بمجرد تحريك المغناطيس بالقرب من الميكروبيدات 7 ميكرومتر التي يتم تسليمها إلى الخلايا (الشكل 1 ب) ، فإنه يجذب الميكروبيدات مغناطيسيا ويطبق القوة على النواة (الشكل 1 ج). يتم التحكم في اتجاه القوة وحجمها من خلال الموضع النسبي بين المغناطيس والميكروبيدات.

في هذه الورقة ، تم تطبيق مقدارين مختلفين من القوة على الميكروبيدات: (1) قوة صغيرة نسبيا عندما تم وضع المغناطيس 46 مم فوق الخلية. و (2) قوة كبيرة نسبيا عند وضع المغناطيس 13 مم فوق الخلية. يمكن حساب القوة المغناطيسية المطبقة على الميكروبيدات F بالمعادلة59: Equation 1، حيث Nd هو عامل إزالة المغناطيسية (0.33 للكرة) ، μ هي النفاذية في الفراغ (6.3 × 10-3H / m للحديد) ، Vp هو حجم الميكروبيدات (178 μم3 لميكروبيدات 7 ميكرومتر) ، و H هي شدة المجال المغناطيسي بالوحدة A / m. H تتناسب مع كثافة التدفق المغناطيسي B مع وحدة تسلا. نظرا لأنه كان من المتوقع أن تكون القوة المغناطيسية المؤثرة على ميكروبيدات واحدة 7 ميكرومتر صغيرة للغاية ويصعب اكتشافها بواسطة محول قوة ، فقد تم قياس كثافة التدفق المغناطيسي B كمرجع للإشارة إلى حجم القوة المغناطيسية المطبقة على الميكروبيدات. تم إدخال مستشعر هول في موقع قاع طبق بتري لقياس كثافة التدفق المغناطيسي ، وتم وضع المغناطيس على مسافة 13 مم أو 46 مم من قاع طبق بتري. نظرا لأن الميكروبيدات 7 ميكرومتر تؤثر على المجال المغناطيسي ، فقد تم قياس كثافة التدفق المغناطيسي مع وبدون ميكروبيدات. بغض النظر عن وجود ميكروبيدات 7 ميكرومتر ، تم الحصول على نفس كثافة التدفق المغناطيسي: B = 60.1 mT على مسافة 13 مم و B = 3.7 mT على مسافة 46 مم. يوضح هذا القياس أن تأثير الميكروبيدات 7 ميكرومتر على المجال المغناطيسي الناتج عن المغناطيس الأسطواني بقطر 12.7 مم وارتفاع 12.7 مم (انظر جدول المواد) لم يكن قابلا للاكتشاف بواسطة مستشعر هول المستخدم في هذه الدراسة. ومع ذلك ، كانت كثافة التدفق المغناطيسي في العلبة بمسافة 13 مم أعلى بحوالي 16 مرة من تلك التي تبلغ مسافتها 46 مم. يتم وصف المعايرة التجريبية للقوة المغناطيسية في القسم التالي (الشكل 6).

توصيل الميكروبيدات المغناطيسية إلى السيتوبلازم
بعد 12 ساعة من بذر الخلايا على طبق بتري ذو القاع الزجاجي ، تتم إضافة 7 ميكروبيدات ميكروبيدات إلى وسط الاستزراع. يتم استيعاب الميكروبيدات تلقائيا من قبل الخلايا. نظرا لأن الميكروبيدات لا تنبعث منها مضان تحت إثارة الليزر في قناة FITC أو Cy5 ، يمكن تحديد موقع الميكروبيدات الداخلية من خلال موقع الجوف الداكن مع التصوير البؤري لتألق YAP والنواة. تظهر كل من الصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد أن الميكروبيدات موجودة في السيتوبلازم أثناء وجودها خارج النواة (الشكل 2).

تعتمد مستويات استيعاب الميكروبيدات في الخلايا على مدة الزراعة المشتركة للخلايا والميكروبيدات. وهكذا ، تم تصنيف الخلايا إلى ثلاثة أنواع وفقا لكمية الميكروبيدات الداخلية - لا ميكروبيدات ، ميكروبيدات مفردة ، وميكروبيدات متعددة (الشكل 3 أ). في 7 ساعات من الثقافة المشتركة ، 62٪ من الخلايا لم تستوعب أي ميكروبيدات ، و 15٪ من الخلايا استوعبت ميكروبيدا واحدا ، و 23٪ من الخلايا استوعبت ميكروبيدات متعددة (إجمالي عدد الخلايا = 13). في 12 ساعة من الثقافة المشتركة ، 53٪ من الخلايا لم تستوعب أي ميكروبيدات ، و 26٪ من الخلايا استوعبت ميكروبيدا واحدا ، و 21٪ من الخلايا استوعبت ميكروبيدات متعددة (إجمالي عدد الخلايا = 62). في 24 ساعة من الثقافة المشتركة ، لم تستوعب 20٪ من الخلايا أي ميكروبيدات ، و 28٪ من الخلايا استوعبت ميكروبيدا واحدا ، و 53٪ من الخلايا استوعبت ميكروبيدات متعددة (إجمالي عدد الخلايا = 40) (الشكل 3 ب).

لا تؤثر الميكروبيدات الموجودة في السيتوبلازم على الشكل النووي ونشاط YAP
لدراسة تأثير استيعاب الميكروبيدات على الشكل النووي ونشاط البروتين ، تم تحديد الشكل النووي أولا عن طريق الدائرية ونشاط YAP بنسبة YAP N / C ، على التوالي. يتم حساب الدائرية بواسطة الدائرية = 4μ (المساحة / المحيط2). تم وصف الخطوات التفصيلية لتحديد نسبة YAP N / C في منشور سابق60. باختصار ، تم حساب نسبة YAP N / C بقسمة متوسط شدة YAP في النواة على متوسط شدة YAP في السيتوبلازم. بالنظر إلى إمكانية أن يؤثر الاستزراع المشترك للميكروبيدات والخلايا على الشكل النووي حتى لو لم يتم استيعاب أي ميكروبيدات ، فإن الخلايا التي لا تحتوي على زراعة مشتركة (النقاط السوداء ، التحكم # 1 ، الدائرية = 0.806 ± 0.037 ، ن = 20) ، الخلايا المستزرعة مع الميكروبيدات ولكن بدون استيعاب (النقاط الرمادية ، التحكم # 2 ، الدائرية = 0.806 ± 0.035 ، ن = 22) ، الخلايا التي تستوعب ميكروبيدا مفردا (النقاط الحمراء ، الميكروبيدات المفردة ، تمت مقارنة الدائرية = 0.793 ± 0.048 ، ن = 15) ، والخلايا التي تستوعب الميكروبيدات المتعددة (النقاط الزرقاء ، الميكروبيدات المتعددة ، ن = 7) (الشكل 3 ج). تظهر النتيجة أنه من بين جميع المجموعات الأربع التي تم اختبارها ، لم يكن للدائرية النووية فرق كبير (الشكل 3C).

بعد ذلك ، لفحص ما إذا كانت نسبة YAP N / C تتأثر باستيعاب الميكروبيدات ، تمت مقارنة الخلايا المستزرعة مع الميكروبيدات ولكن بدون استيعاب (النقاط الرمادية ، التحكم # 2 ، نسبة YAP N / C = 1.155 ± 0.074 ، n = 35) فقط مع الخلايا ذات الاستيعاب الداخلي أحادي أو متعدد الميكروبيدات (النقاط الحمراء ، الخلية ذات الميكروبيدات ، نسبة YAP N / C = 1.140 ± 0.078 ، n = 36) في الساعة 12من الثقافة المشتركة (الشكل 3D). لم تتم مقارنة الخلايا التي لا تحتوي على ثقافة مشتركة لأن الطبق الذي يحتوي على ميكروبيدات يظهر كثافة خلية أقل ، مما قد يؤثر على نسبة YAP N / C12. لا تظهر النتيجة أي فرق كبير (قيمة p = 0.667) في نسبة YAP N / C بين المجموعتين ، مما يشير إلى أن استيعاب الميكروبيدات لا يؤثر على نشاط YAP (الشكل 3D).

القوة المغناطيسية تشوه النواة
أولا، يظهر تشوه النواة. يحدث تشوه النواة بسبب قوة الضغط التي تطبقها الميكروبيدات (الشكل 4A والشكل 4A1-3) في الخلايا التي تحتوي على الهيكل الخلوي. تدعم هذه البيانات (أي تشوه النواة بسبب ضغط الميكروبيد) أن الميكروبيدات تطبق بالفعل قوة على النواة في السيتوبلازم المزدحم. يتم تضمين مقطع فيديو ساطع المجال يوضح عملية تطبيق القوة في المواد التكميلية (الفيديو التكميلي 1). ثانيا ، لأنه من الممكن أن يطبق الميكروبيدات القوة في وقت واحد على الهيكل الخلوي المحيط ويشوه النواة بشكل غير مباشر ، تكررت تجارب الضغط في الخلايا التي تحتوي على خيوط الأكتين المعطلة (علاج Cyto D (2.5 ميكرومتر ، 1 ساعة) ؛ الشكل 4 ب). تظهر هذه الدراسة أن خيوط الأكتين قد تم تفكيكها بالفعل (الشكل 4 ب) ، وأن النواة مشوهة بواسطة الميكروبيدات (الشكل 4B1-3). تدعم هذه البيانات أن الميكروبيدات تطبق قوة مباشرة على النواة في حالة عدم وجود هيكل خلوي متشابك. بشكل جماعي ، تظهر هذه البيانات أن البروتوكولات والأدوات يمكنها تطبيق قوة مباشرة على النواة.

التحكم المكاني والزماني للميكروبيدات المغناطيسية داخل الخلايا
لتحقيق التحكم المكاني في الميكروبيدات ، تم استخدام زوج من المغناطيس لتحريك الميكروبيدات والتحكم في موقع المسافة البادئة على النواة (الشكل 5 أ). لا يمكن تحريك الخرزة إلا مع ما يصل إلى 2.2 ميكرومتر من الإزاحة (الشكل 5A1-4) ، ولكن يمكنها تطبيق المسافة البادئة بمرونة على النواة في المواقع المقابلة. قد يقيد الهيكل الخلوي الأكتين المحيط حركة الميكروبيدات. لذلك ، تعطل الهيكل الخلوي الأكتين عن طريق علاج Cyto D (2.5 ميكرومتر ، 1 ساعة) ، وتم التلاعب بموقع الميكروبيدات ولكنه أظهر نتائج مماثلة. لذلك ، يمكن اقتراح فرضية: قد ترتبط الميكروبيدات فيزيائيا / كيميائيا بالنواة والعضيات المحيطة الأخرى في السيتوبلازم ، مما يحد من حركتها المكانية الكبيرة (>2.2 ميكرومتر).

لتحقيق التحكم المكاني في الميكروبيدات ، تم استخدام زوج من المغناطيسات التي تتحكم في الميكروبيدات لتطبيق وإطلاق القوة مرتين (مع حجم قوة مختلف) في نفس موقع النواة (الشكل 5B والشكل 5B1-B4). المدة الزمنية الحالية لدورة واحدة من تطبيق القوة وإطلاقها هي 12 ثانية. يتم تحديد سرعة التحكم الزمني من خلال سرعة تشغيل المحرك XYZ.

معايرة القوة المغناطيسية
تم تقدير القوة المطبقة بالخرزة على النواة عن طريق القياس التجريبي للقوة المطبقة بواسطة مجهر القوة الذرية المعاير (AFM) الذي يسبب تشوها مشابها للنواة. على وجه التحديد ، تم إذابة الهيكل الخلوي الأكتين لأول مرة بواسطة CytoD (2.5 ميكرومتر ؛ 1 ساعة ، الشكل 4B) لأن AFM يطبق القوة على السطح القمي للخلية ، وإزالة قشرة الأكتين والهيكل الخلوي يسمح بمزيد من الاتصال المباشر بين طرف AFM ونواة الخلية. الخلايا التي تم إذابة قشرة الأكتين والهيكل الخلوي لها حية بناء على مقارنة الشكل النووي وشدة التلوين النووي مع تلك الموجودة في الخلايا السليمة (الشكل التكميلي 1). ثانيا ، تم استخدام طرف AFM غير الوظيفي (شبه كروي ، نصف القطر = 5 ميكرومتر) الذي له حجم وشكل مماثل لتلك الموجودة في الميكروبيدات لوضع مسافة بادئة للسطح القمي للخلية بطريقة يتم التحكم فيها بالقوة والحصول في نفس الوقت على صور متحدة البؤر ثلاثية الأبعاد للخلية وأجسام النواة (الشكل 6 أ). تم اختيار حجم قوة الانضغاط من 0.8 nN إلى 2.0 nN لأنه ، بناء على الأدبيات24 ، كان من المعروف أن القوة التي تبلغ مقدارها 1.5 nN تشوه النواة بشكل كاف. ثالثا ، تم قياس التشوه الطبيعي للنواة الناجم عن المسافة البادئة AFM من خلال تحليل التصوير الكمي. أيضا ، تم الحصول على منحنى المعايرة الذي يوفر علاقة إزاحة القوة AFM الكمية (الشكل 6B). رابعا ، تم تطبيق قوة ضغط على السطح الجانبي للنواة عن طريق التحكم في الخرز الصغير الذي له حجم وشكل مماثل (نصف القطر = 7 ميكرومتر ؛ نصف القطر = 7 ميكرومتر). الشكل 6C) ، وتم قياس تشوه الغشاء النووي عن طريق تحليل التصوير. يتم تقدير القوة المطبقة بالخرز بناء على علاقة القوة والإزاحة AFM.

على سبيل المثال ، في الشكل 6C ، يبلغ تشوه النواة الناجم عن الميكروبيدات المغناطيسية (القطر = ~ 7 ميكرومتر) عند "قوة كبيرة" حوالي 1.5 ميكرومتر. في الشكل 6D ، تم استخدام طرف AFM يحتوي على مسبار نصف كروي 5 ميكرومتر لوضع مسافة بادئة للخلية الموجودة أعلى النواة لتحقيق تشوه نووي 1.5 ميكرومتر. القوة المقابلة التي سجلتها AFM هي 1.4 nN. وبالتالي ، تقدر القوة التي تطبقها الميكروبيدات ب ~ 1.4 nN. باتباع نفس النهج ، تتم معايرة القوة المغناطيسية عند "القوة الصغيرة" على أنها 0.8 نانونيوتن ، وتسببت في مسافة بادئة نووية 0.4 ميكرومتر.

تعتبر هذه الدراسة أن القوة المقاسة AFM يمكن أن تمثل القوة المطبقة بالميكروبيدات بناء على الافتراضات التالية: (1) تصلب النواة داخل الخلايا المختلفة مشابه. (2) لا تعتمد الخواص الميكانيكية للنواة على المواقع النووية التي تم تطبيق المسافة البادئة عليها. يتم تطبيق القوة المغناطيسية أفقيا على الجوانب الجانبية للنواة ، بينما يتم تطبيق قوة AFM عموديا على الجوانب القمية للنواة. يفترض أن الفرق الميكانيكي بينهما لا يكاد يذكر. (3) في تجارب AFM ، يطبق المسبار القوة مباشرة عبر غشاء الخلية والهيكل الخلوي على النواة. بعد تعطيل خيوط الأكتين ، تشبه القوة المطبقة AFM على النواة القوة المطبقة بالميكروبيدات على النواة ، على الرغم من أن الغشاء لا يزال موجودا بين مسبار AFM والنواة في الحالة الأولى.

تؤدي القوة المغناطيسية إلى تغيير نسبة YAP N / C
لإثبات أن القوة المغناطيسية المطبقة على الميكروبيدات يمكن أن تشوه النواة وتحفز إزفاء YAP ، تم تحديد نسبة YAP N / C للخلايا ذات استيعاب الميكروبيدات على ثلاث مراحل: (1) قبل تطبيق القوة ، (2) بعد تطبيق القوة ، و (3) بعد إطلاق القوة. أظهرت بعض الخلايا تغيرا في الشكل النووي ونسبة YAP N / C عند تطبيق القوة أو إطلاقها (الشكل 7A ، C). يمكن أن تعزى تغيرات الشدة في YAP من خلال آليتين محتملتين: (1) تنتقل بروتينات YAP-FP من السيتوبلازم إلى النواة بعد تطبيق القوة. في هذه الحالة ، يجب ألا يظهر التلوين النووي أي تغييرات في الإشارة. يجب ألا تتغير شدة التلوين النووي بشكل كبير ؛ (2) لا تنتقل بروتينات YAP-FP بعد تطبيق القوة. ترجع التغيرات الملحوظة في شدة YAP إلى تغير الحجم النووي الناجم عن القوة وتغيير تركيز YAP-FP الناتج. في هذه الحالة ، يجب أن تتغير شدة التلوين النووي في اتجاه مماثل لشدة YAP النووية لأن تركيز صبغة التلوين يتغير أيضا مع تغير حجم النواة. لذلك ، تم قياس تغير شدة التلوين النووي من القناة الحمراء (الإثارة: 650 نانومتر ؛ الانبعاث: 681 نانومتر). تتغير الشدة في YAP في القناة الخضراء ، ولكن لا توجد تغييرات في شدة تلطيخ النواة في القناة الحمراء. وبالتالي ، من المحتمل أن تكون الآلية الأولى موجودة (الشكل 7 ب). بشكل جماعي ، تظهر النتائج أن التشوه النووي الناجم عن القوة المغناطيسية يؤدي إلى إزفاء YAP.

بعد ذلك ، تم تحديد التغير الصافي لنسبة YAP N / C داخل مجموعتين من الخلايا: (1) الخلايا التي لا تحتوي على ميكروبيدات داخلية (النقاط الرمادية ، التحكم ، n = 9) ؛ (2) الخلايا التي لا تحتوي على ميكروبيدات داخلية (النقاط الرمادية ، التحكم ، n = 9) ؛ (2) الخلايا غير المتضمنة (النقاط الرمادية ، المجموعة الضابطة ، n = 9) ؛ (2) الخلايا غير الميكروبية الداخلية (النقاط الرمادية ، الضابطة ، n = 9) ؛ (2) الخلايا غير المقيدة بالميكروبيدات (النقاط و (2) خلايا مختارة ذات ميكروبيدات داخلية تظهر تغيرا في نسبة YAP N / C (نقاط خضراء للقوة الصغيرة ، نقاط حمراء للقوة الكبيرة ، n = 11). عند قوة 0.8 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي YAP N / C تغير النسبة = -0.030 ± 0.029 ، ن = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = -0.003 ± 0.012 ، ن = 9. عند قوة 1.4 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.011 ± 0.040 ، n = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.005 ± 0.005 ، ن = 9 (الشكل 8 أ). عند قوة 0.8 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي مطلق YAP N / C تغير النسبة = 0.057 ± 0.017 ، ن = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.021 ± 0.007 ، ن = 9. الفرق كبير (قيمة p = 0.0093 ، **). عند قوة 1.4 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي مطلق YAP N / C تغير النسبة = 0.070 ± 0.020 ، ن = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.010 ± 0.003 ، ن = 9. الفرق كبير (قيمة p = 0.0007 ، ***) (الشكل 8 ب). معا ، تؤكد هذه النتائج أن القوة المغناطيسية المطبقة على الميكروبيدات داخل السيتوبلازم يمكن أن تحفز بالفعل إزفاء YAP وتغيير نسبة YAP N / C.

Figure 1
الشكل 1: تصميم جهاز الحركة المغناطيسية وتطبيق القوة التخطيطية في الخلية بواسطة الميكروبيدات المغناطيسية . (أ) رسم تخطيطي ثلاثي الأبعاد للجهاز تم تنفيذه لتثبيت المغناطيس وتحريكه في اتجاهات x و y و z. يتكون الجهاز من قاعدة بعرض 241.3 مم وارتفاع 104.1 مم ومقبضين وقضيب ومغناطيس. سيتم تجبير المقابض في اتجاه دوران العملية الصحيح ، مما سيوفر الحركة في الاتجاه المقابل. سيتم خفض المغناطيس أقرب / رفع أكثر إلى الطبق لتطبيق قوة مغناطيسية بحجم واتجاه مختلفين على الميكروبيدات المغناطيسية. (ب) مثال على صورة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لميكروبيدات الحديد 7 ميكرومتر. (ج) يمكن للميكروبيدات المغناطيسية الموصلة داخل السيتوبلازم أن تؤثر بقوة على العضيات مثل النواة عند تطبيق مجال مغناطيسي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: الصور التمثيلية التي تظهر الميكروبيدات المغناطيسية (مجوفة سوداء مدببة بسهم أزرق) يتم استيعابها في الخلية (المشار إليها بواسطة YAP) وخارج النواة . (أ) المقطع العرضي X-Y لخلية YAP (خضراء) ونواة (حمراء) ومجال ساطع. ب: إعادة بناء الخلية 3D. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: لا تؤثر الميكروبيدات التي تستوعبها الخلايا على الشكل النووي ونسبة YAP N / C. (أ) صور تمثيلية للمجال الساطع والتألق للخلايا التي لا تحتوي على ميكروبيدات ، وميكروبيدات مفردة ، واستيعاب متعدد الميكروبيدات. تشير الأسهم الزرقاء إلى موضع الميكروبيدات داخل السيتوبلازم. (ب) عند 7 ساعات (ن = 13) ، 12 ساعة (ن = 62) ، و 24 ساعة (ن = 40) من الثقافة المشتركة ، النسبة المئوية للخلايا التي لا تظهر أي ميكروبيدات ، ميكروبيدات واحدة ، واستيعاب متعدد الميكروبيدات. (ج) لا تظهر الدائرية النووية فرقا معنويا بين الخلايا الضابطة والخلايا التي تستوعب الميكروبيدات داخليا. التحكم # 1 (بدون زراعة الميكروبيدات المشتركة): الدائرية = 0.806 ± 0.037 ، ن = 20 ؛ التحكم # 2 (مع ثقافة الميكروبيدات المشتركة ، بدون استيعاب الميكروبيد): الدائرية = 0.806 ± 0.035 ، ن = 22 ؛ استيعاب ميكروبيدات واحدة: الدائرية = 0.793 ± 0.048 ، ن = 15 ؛ استيعاب متعدد الميكروبيدات: الدائرية = 0.780 ± 0.061 ، ن = 7. (D) لا تظهر نسبة YAP N / C أي فرق كبير (قيمة p = 0.667) بين الخلايا الضابطة (مع الاستزراع المشترك للميكروبيدات ، بدون استيعاب الميكروبيدات ، نسبة YAP N / C = 1.155 ± 0.074 ، n = 35) والخلايا ذات استيعاب الميكروبيدات (نسبة YAP N / C = 1.140 ± 0.078 ، ن = 36). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تأثير القوة المباشرة على النواة مع خيوط الأكتين وبدونها. (أ) تظهر الخلايا خيوط الأكتين (صفراء). (أ 1) صورة للنواة عندما لا يتم تطبيق أي قوة. (أ 2) صورة للنواة بعد تطبيق القوة. (أ 3) تظهر الصورة المتداخلة للحدود النووية قبل وبعد تطبيق القوة المسافة البادئة النووية. (ب) تظهر الخلايا خيوط أكتين مضطربة (صفراء) بعد المعالجة Cyto D (2.5 ميكرومتر ، 1 ساعة). (ب1) صورة للنواة عندما لا يتم تطبيق أي قوة. (ب2) صورة للنواة بعد تطبيق القوة. (ب3) تظهر الصورة المتداخلة للحدود النووية قبل وبعد تطبيق القوة المسافة البادئة النووية مع الهيكل الخلوي الأكتين المعطل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: التحكم المكاني والزماني للميكروبيدات المغناطيسية داخل الخلايا. (أ) يتحكم زوج من المغناطيسات مكانيا في الميكروبيدات المغناطيسية. (أ 1) صورة المجال الساطع لحدود الخلية (الخط الأخضر) والحدود النووية (الخط الأحمر) والميكروبيدات المغناطيسية (الخط الأصفر) في الموضع 1. (أ 2) الميكروبيدات المغناطيسية المسافات البادئة النواة في الموضع 1. (أ 3) يتم نقل الميكروبيدات المغناطيسية إلى الموضع 2 (الخط الأصفر). يظهر الموضع 1 كمرجع (خط أصفر متقطع). (أ 4) الميكروبيدات المغناطيسية المسافات البادئة النواة في الموضع 2. (ب) يتحكم زوج من المغناطيسات زمنيا في الميكروبيدات المغناطيسية. (ب1) صورة المجال الساطع لخلية بدون قوة مطبقة عند النقطة الزمنية I. (B2) تطبق الميكروبيدات المغناطيسية قوة على النواة عند النقطة الزمنية II. (ب3) تطلق الميكروبيدات المغناطيسية القوة من النواة عند النقطة الزمنية III. (ب4) تطبق الميكروبيدات المغناطيسية قوة أكبر على النواة عند النقطة الزمنية الرابعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6. معايرة القوة المطبقة بالميكروبيدات على النواة باستخدام المسافة البادئة AFM. (أ) رسم تخطيطي لعملية المعايرة. يطبق الميكروبيدات المغناطيسية ضغطا أفقيا على النواة (يسار) ، ومسافات بادئة لمسبار AFM عموديا على النواة. (ب) قوة المسافة البادئة AFM مقابل التشوه النووي. (ج) صورة تمثيلية لتشوه النواة (1.5 ميكرومتر) قبل وبعد تطبيق القوة بواسطة الميكروبيدات المغناطيسية. (د) صورة تمثيلية لتشوه نواة مماثل (1.5 ميكرومتر) قبل وبعد المسافة البادئة AFM بقوة 1.4 nN. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: البيانات التمثيلية التي توضح أن تغير نسبة YAP N / C ناتج عن تطبيق القوة المغناطيسية وإطلاقها . (أ) المقطع العرضي X-Y لصورة الفلورسنت YAP (الخضراء) والنواة (الحمراء) للخلية بدون قوة ، وقوة تشغيل ، وقوة قبالة. في حالة القوة ، تنخفض شدة YAP السيتوبلازمية في الموقع المشار إليه بسهم أصفر بينما تزداد شدة YAP النووية. YAP N / C نسبة يزيد. (B) تزداد نسبة YAP N / C عند القوة (من 1.0791 إلى 1.2327) وتنخفض عند القوة (من 1.2327 إلى 1.1548). تظهر شدة البقع النووية الطبيعية تغيرا طفيفا مع تطبيق القوة (1.00117) والإطلاق (0.95578). (ج) المقطع العرضي X-Z لصورة YAP (الخضراء) والنواة (الحمراء) للخلية بدون قوة ، وقوة على ، وقوة قبالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: تغير نسبة YAP N / C الناجم عن تطبيق القوة المغناطيسية. (أ) عند قوة 0.8 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي تغير نسبة YAP N / C = -0.030 ± 0.029 ، ن = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = -0.003 ± 0.012 ، ن = 9. عند قوة 1.4 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.011 ± 0.040 ، n = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.005 ± 0.005 ، ن = 9. (B) عند قوة 0.8 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي مطلق YAP N / C تغير النسبة = 0.057 ± 0.017 ، ن = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.021 ± 0.007 ، ن = 9. الفرق كبير (قيمة p = 0.0093 ، **). عند قوة 1.4 nN ، تظهر الخلايا ذات الميكروبيدات الداخلية صافي مطلق YAP N / C تغير النسبة = 0.070 ± 0.020 ، ن = 11 ؛ تظهر خلايا التحكم صافي تغير نسبة YAP N / C = 0.010 ± 0.003 ، ن = 9. الفرق كبير (قيمة p = 0.0007 ، ***) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: الشكل النووي وشدة التلوين النووي. (أ) بدون علاج Cyto D ، (ب) مع علاج Cyto D و (C) خلية ميتة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 1: فيديو مجال ساطع يظهر عملية تطبيق القوة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد استيعاب الميكروبيدات المغناطيسية (القسم 2.2) أمرا بالغ الأهمية لأن الميكروبيدات خارج الخلية لا يمكنها تطبيق القوة مباشرة على النواة. يعد تطبيق القوة والتصوير (القسم 5.3) من الخطوات الحاسمة في هذه التجربة ، وقد تعتمد القوة اللازمة لتشويه النواة والحث على عواقب بيولوجية ذات مغزى على العينة. يمكن زيادة حجم القوة في هذه التجربة (0.8 nN و 1.4 nN) لتحفيز الاستشعار الميكانيكي النووي في الخلايا الأقل حساسية.

لتطبيق القوة المغناطيسية بطريقة كمية ذات إنتاجية عالية ، يعد استيعاب ميكروبيدات واحدة طريقة مثالية. في هذه الدراسة ، كانت النسبة المئوية للخلايا ذات الاستيعاب أحادي الميكروبيدات متشابهة في 12 ساعة (26٪) و 24 ساعة (28٪) ، في حين أن الخلايا التي لا تحتوي على استيعاب ميكروبيدات كانت أعلى عند 12 ساعة (53٪) من تلك الموجودة في 24 ساعة (20٪) (الشكل 3 ب). يعتبر أن 12 ساعة هي الوقت الأمثل لتجربة تطبيق القوة لأنه يمكن تضمين المزيد من الميكروبيدات الفردية ، ويمكن التحكم في الخلايا. بالنسبة لخطوط الخلايا المختلفة وأحجام الميكروبيدات ، يجب اختبار وقت الاستزراع المشترك وتركيز الميكروبيدات لتحديد الظروف المثلى المقابلة.

في التجارب ، لم تكن الميكروبيدات مغلفة لترتبط على وجه التحديد بالنواة. ومن ثم، فإن القوة التي تنتقل مباشرة من الميكروبيدات إلى النواة تكون على الأرجح ضاغطة فقط. تظهر النتائج أن نسبة YAP N / C تزيد وتقلل من عدد الخلايا (الشكل 8 أ). أحد الأسباب المحتملة هو أن القوة المغناطيسية المطبقة عبر الميكروبيدات قد تسبب تغيرا إيجابيا أو سلبيا في التوتر داخل الهيكل الخلوي وتنظم نسبة YAP N / C لزيادة أو نقصان ، على التوالي28. تظهر الأبحاث السابقة أن قوة الضغط على النواة تؤدي إلى زيادة في نسبة YAP N / C28. في التجارب المستقبلية ، من أجل دراسة استشعار القوة المباشرة للنواة ، يمكن تعطيل الهيكل الخلوي للقضاء على انتقال القوة من الهيكل الخلوي إلى النواة.

هناك عيبان محتملان في الأساليب الحالية. أولا ، في هذه التجارب ، تم استخدام المحرك ثلاثي الأبعاد (الشكل 1 أ) لضبط حركة الخرز ، والتي تتم مراقبتها بواسطة التصوير متحد البؤر في الوقت الفعلي وتهدف إلى تطبيق قوة ضغط على النواة. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة الزلقة للغشاء النووي والبيئة المعقدة في السيتوبلازم ، قد لا يكون اتجاه القوة المطبقة على الخرز ضاغطا بحتا (أي ليس عموديا تماما على سطح الغشاء النووي). يمكن أن يتسبب هذا النقص في تطبيق قوة قص على الغشاء النووي. ثانيا ، لا يتم اقتران الميكروبيدات الحالية المستخدمة في هذه الدراسة مع الجسم المضاد للارتباط بالنواة ، لأن الحركة المكانية للخرزات أمر بالغ الأهمية في التجربة الحالية لإثبات ميزة المحرك المغناطيسي غير الملامس. ومن ثم ، فإن الطريقة الحالية لا يمكنها تطبيق التوتر على الغشاء النووي.

في المستقبل ، سيتم اقتران (1) حبات مع الجسم المضاد للنسبرين -1 لترتبط على وجه التحديد مع النواة. هذا يمكن أن يضمن انتقال القوة المباشر والمحدد بين الميكروبيدات والبروتينات المستهدفة. (2) سيتم معايرة اتجاه القوة عن طريق التلاعب بالميكروبيدات المغناطيسية المفردة في هيدروجيل ناعم مضمن مع حبات الفلورسنت. يمكن استخدام إزاحة 3D من حبات الفلورسنت لحساب مجال تشوه هيدروجيل وتحديد اتجاه القوة كدالة للمجال المغناطيسي المطبق. بعد ارتباط الميكروبيدات كيميائيا بالنواة ، فإن تطبيق قوة ذات اتجاه معروف سيحدد نوع القوة (شد أو ضغط أو قص). (3) سيتم استخدام التصوير ثلاثي الأبعاد للتلطيخ النووي لبناء نموذج محاكاة ثلاثية الأبعاد FEM للنواة. يمكن التحقق من اتجاه القوة من خلال مقارنة التشوه النووي قبل وبعد تطبيق القوة المغناطيسية.

توفر التقنية الفريدة التي تم تطويرها في هذه الدراسة العديد من المزايا المحتملة: (1) مقارنة بالمسافة البادئة الرأسية بواسطة مجسات AFM ، يمكن للميكروبيدات المغناطيسية تطبيق القوة في أي اتجاه. قد يكون للخلايا المستزرعة على أسطح الركيزة 2D توزيع بروتين غير متجانس وتوجيه على أسطحها الرأسية والأفقية لغشاء البلازما والغلاف النووي. قد يؤدي تطبيق القوة أفقيا إلى استجابات استشعار ميكانيكية لم تتم ملاحظتها من قبل. (2) بمجرد أن يتم طلاء الميكروبيدات وظيفيا لترتبط بالنوى ، يمكن تطبيق كل من قوى الدفع والسحب مباشرة على النواة لمزيد من الدراسة للاستشعار الميكانيكي النووي التفاضلي بسبب اتجاهات القوة المميزة. (3) من خلال التحكم في الارتباط المحدد للميكروبيدات ببعض بروتينات الغلاف النووي ، يمكن توضيح آليات استشعار القوة النووية التي لم يتم التحقيق فيها من قبل. تظهر الأدلة الناشئة أن النواة من المحتمل أن تكون مستشعرا ميكانيكيا36 ، وأن الاستشعار الميكانيكي النووي هو المنظم الأكثر مباشرة لإبعاد YAP28. تتم دراسة آلية إزفاء YAP المنظم نوويا بنشاط ويتم اقتراح العديد من المرشحين لأجهزة الاستشعار الميكانيكية أو المعلمات في النواة ، بما في ذلك حجم المسام النووية28 ، والشكل النووي 25,61 ، ومجمع LINC ، وتوتر المغلف النووي20. إن التلاعب بالميكروبيدات المغناطيسية يفتح إمكانية الاستكشاف التفصيلي لهذه الآليات عن طريق تطبيق القوة المباشرة على اللوائح المعقدة والخاضعة للرقابة LINC لتوتر وشكل الغلاف النووي. (4) بالإضافة إلى تطبيق القوى على النواة ، فإن الميكروبيدات مناسبة أيضا ليتم هندستها لترتبط بالجانب الداخلي لغشاء البلازما للكشف عن كيفية استجابة المجالات داخل الخلايا للبروتينات الغشائية ومجمعها للإشارات الفيزيائية الحيوية.

باختصار ، أظهر هذا البحث طريقة (1) توصيل ميكروبيدات حديدية صغيرة الحجم إلى السيتوبلازم دون التأثير على التشكل النووي ووظائف البروتين ، (2) يطبق القوة على النواة بواسطة الميكروبيدات المغناطيسية ، و (3) يقوم بتصوير الخلايا الحية الفلورية متحدة البؤر أثناء تطبيق القوة. تفتح هذه الأدوات غير الغازية إمكانيات التلاعب اللاجيني المباشر للعضيات في الخلايا المفردة ، والاستجواب القائم على التصوير الفائق الدقة للنقل الميكانيكي للنواة ، والاستكشاف التفصيلي لتنظيم كروموسوم 3D المنظم بالقوة (بالاشتراك مع Hi-C: التقاط تأكيد كروموسوم عالي الدقة) وإعادة البرمجة في سياقات فسيولوجيا الخلية والبيولوجيا المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgments

يتم تمويل هذا المشروع من قبل حزمة بدء جائزة UF Gatorade (X. T.) ، وجائزة UFHCC التجريبية (X. T. والدكتور ديتمار سيمان) ، وصندوق UF Opportunity Seed Fund (X. T.) ، وبرنامج علماء جامعة UFHCC (H. Y. Wang). نحن نقدر بصدق المناقشات الفكرية والدعم الفني من الدكتور جوناثان ليخت (UFHCC) ، الدكتور رولف رين (UFHCC) ، الدكتور كريستوفر فولبي (UFHCC) ، الدكتورة بلانكا شارما (BME) ، الدكتور مارك شيبلاك (MAE و ECE) ، الدكتور دانيال فيريس (BME) ، الدكتورة ماليسا سارنتينورانونت (MAE) ، الدكتور أشوك كومار (MAE) ، الدكتور بنيامين كيسيلوفسكي (BME) ، الدكتور برنت جيلا (RSC) ، الدكتور فيليب فنغ (ECE) ، الدكتور غريغوري أ. هودالا (BME) ، الدكتور ستيفن غيفزاني (OSSM) ، الدكتور ينيسل كروز ألميدا (CDBS) ، الدكتور روجر فيلينجيم (CD-BS) ، الدكتور روبرت كودل (OMS) ، الدكتور جون نيوبرت (DN-OR) ، الدكتور جاستن هيليارد (جراحة المخ والأعصاب) ، الدكتور تيان هي (جامعة هارفارد) ، الدكتور يوهوا تان (جامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية) ، الدكتور جيسي L-S Au (معهد علم الأدوية للأنظمة الكمية) ، الدكتور ديفيد هان (جامعة أريزونا) ، وفريق دعم نيكون (الدكاترة خوسيه سيرانو فيليز ولاري كوردون وجون إيكمان). نحن ممتنون للغاية للدعم الفعال من جميع أعضاء مختبرات أبحاث Tang's و Yamaguchi و Sharma's و Au's و Siemann و Guan وجميع موظفي قسم UF MAE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 185، علم الأحياء الميكانيكي للنواة، القوة المغناطيسية، كريسبر/كاس9، النقل الميكانيكي، المادة الفعالة اللينة، البروتين المرتبط بنعم (YAP)، التصوير الوظيفي الفلوري، معالجة التصوير الرقمي، علم البصريات الوراثي، علم التخلق
الجمع بين مشغل القوة المغناطيسية 3D والتصوير الفلوري متعدد الوظائف لدراسة علم الأحياء الميكانيكي للنواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter