Summary
本研究提出了一种新的方案，通过传递到细胞质中的磁性微珠直接对细胞核施加机械力，并同时进行活细胞荧光成像。
Abstract
机械生物学的一个基本问题是活细胞如何在细胞生理学和病理学的背景下感知细胞外机械刺激。细胞外机械刺激的细胞机械感觉被认为是通过膜受体、相关的蛋白质复合物和细胞骨架。机械生物学的最新进展表明，细胞质本身的细胞核可以同时独立地感知机械刺激。然而，缺乏对细胞核如何感知、转导和响应机械刺激的机制理解，主要是因为通过传统工具访问和量化细胞核力学的技术挑战。本文描述了一种新型磁力致动器的设计、制造和实现，该致动器应用精确和非侵入性的 3D 机械刺激直接使细胞核变形。使用CRISPR / Cas9工程细胞，这项研究表明，该工具与高分辨率共聚焦荧光成像相结合，能够揭示单细胞中机械敏感yes相关蛋白（YAP）的实时动力学作为细胞核变形的函数。这种简单的方法有可能弥合机械生物学界当前的技术差距，并为细胞核机械转导与细胞功能之间关系中存在的知识差距提供答案。
Introduction
本研究旨在通过将直接施加机械力的磁致动器和同时成像结构和功能亚细胞变化的共聚焦荧光显微镜相结合，开发和应用一种新技术来阐明细胞核力学生物学。细胞感知细胞外生物物理信号，包括组织硬度1，2，3，4、间质流体压力和剪切应力5、6、7、表面拓扑/几何形状8、9、10、11、12 和拉伸/压缩应力 13，14，15，16.生物物理信号被转化为生化信号，并触发基因表达和细胞行为的潜在下游变化 - 这一过程称为机械转导17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27.为了研究机械转导过程，已经开发了无数技术来对细胞施加机械力，例如原子力显微镜28，细胞拉伸装置29，bio-MEMS（微机电系统）力传感器15，30，31，剪切流变学32和立体视觉系统33.最近的一篇综述总结了应用细胞外机械线索和干扰机械传感的方法34。迄今为止，这些方法中的大多数都对细胞质膜施加力，细胞通过膜受体（如整合素、钙粘蛋白、离子通道和 G 蛋白偶联受体）直接接收这些细胞外生物物理信号。随后，它们将信号传输到细胞内细胞骨架和细胞核。例如，使用yes相关蛋白（YAP）易位作为机械传感的指标，显示细胞从细胞膜感知底物刚度和细胞外张力的机械信号，并通过细胞骨架将它们传递到细胞核中以诱导YAP细胞质到细胞核易位28，35。
最近的证据表明，细胞核本身是一个独立的机械传感器8，36，37。对从细胞中收获的分离细胞核进行的实验证明了这一点，其中发现细胞核响应直接施加在它们上的机械力而自适应地改变其刚度36。在许多生理条件下，肿瘤和健康细胞中的细胞核都能感知细胞外生物物理信号并改变其机械性能和组装38，39，40。例如，在外渗时，肿瘤细胞的核硬度降低并保持柔软度超过24小时38。在通过密闭间质空间迁移的过程中，肿瘤细胞的细胞核经常失去并恢复其结构完整性39。然而，细胞核感知生物物理信号的方式尚不清楚，尽管已发现涉及几种核包膜蛋白和蛋白质家族，例如核粘连蛋白A / C和核骨架和细胞骨架（LINC）复合物38，41的接头。因此，可以直接向细胞核施加力的新型非侵入性方法将使力传递的效果与细胞 - 质膜和细胞骨架解耦，并将有助于阐明以前无法进入的核机械传感分子机制。
使用光镊操纵细胞器42 和注射到细胞43 中的微珠的研究表明，直接对细胞核施加力的技术能力。然而，光学镊子技术有几个局限性：（1）低通量光学镊子通常一次只能操作一个细胞或微珠;（2）核的潜在光损伤和温度伪影变形需要数十pN36，相应的必要激光功率约为每pN10 mW 44，45。这样的激光强度足以在实验过程中触发细胞中的光损伤并扰乱细胞功能46。
通过活细胞内的微珠施加的磁力显示出直接对细胞核施加力的潜力，并克服了光镊的局限性。一旦微珠被输送到细胞质中，磁场就可以以高通量的方式同时对多个微珠施加磁力。磁场不影响细胞功能47，但产生从pN到nN的力，足以诱发核变形36，48，49。迄今为止，磁性微珠的操作已应用于细胞质膜48，细胞质50内部，F-肌动蛋白51，细胞核内47和分离的细胞核36。然而，微珠的磁操作从未被用于在核包膜上施加直接的机械力来研究原子核中的机械转导。
在本文中，开发了一种简单的技术，将磁性微珠无创地递送到细胞质中，并使用这些微珠在细胞核上施加机械力（图1）。在这里，使用CRISPR / Cas9工程的内源性表达mNeonGreen21-10/11标记的YAP的人正常B2B细胞系来验证该方法。YAP是一种机械敏感蛋白，YAP的易位受核机械传感14，28的调节。选择CRISPR / Cas9调控的敲入方法用荧光蛋白（FP）mNeonGreen21-10/11标记内源性YAP。尽管已知CRISPR编辑具有不完全效率和脱靶效应，但先前出版物中的协议集成了荧光分选以选择正确的开放阅读框插入52，53，54。通过这种额外的选择层，在先前产生的20+细胞系中未观察到脱靶标记事件52，53，54，55。这是一种分裂的荧光蛋白构建体，但原则上，任何可表达的荧光标签都可以使用。这种标记方法优于转基因或抗体方法。首先，与转基因表达不同，标记蛋白保持单拷贝基因剂量并在天然基因调控网络的生理背景下表达，从而限制了蛋白质浓度、定位和相互作用的偏差。本研究中使用的标记方法比全FP标记实现了超过数量级的吞吐量和效率。它还避免了由于固定伪影和高质量、高特异性抗体的可用性有限而导致的与免疫荧光相关的挑战。其次，本文中使用的方法对细胞生理学的干扰最小，并且能够真实地实时揭示所有内源性YAPs。相比之下，其他常见的转基因方法通常会导致YAP的过表达。由此产生的人工分布可能引起细胞毒性并影响细胞的机械传感56，57，58。
本研究提出了一种方案，通过传递到细胞质中的磁性微珠直接对细胞核施加力，并同时进行活细胞荧光成像。总之，这里介绍的方案演示了如何（1）在细胞核外将磁性微珠递送到细胞中，（2）操纵微珠以在细胞核上施加磁力，（3）在操作过程中对细胞进行共聚焦荧光成像，以及（4）在整个力施加过程中定量分析YAP核/细胞质（N / C）比率。结果表明：（1）通过内吞作用，磁性微珠可以在7 h内无创递送到B2B细胞的细胞质中（图2和图3）;（2）直接施加在细胞核上的量化磁力（图4，图5和图6）可以触发CRISPR / Cas9工程B2B细胞中YAP N / C比率的各种变化（图7和图8）。
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Protocol
1. 维持 CRISPR/Cas9 工程化的 B2B 细胞
- 在补充有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的RPMI-1640的T25烧瓶中培养B2B细胞。
- 将B2B细胞保持在37°C的加湿培养箱中，并含有5%CO2。
- 当汇合度达到70%至80%时传代培养B2B细胞。
- 将B2B细胞系储存在RPMI-1640培养基中，在-80°C冰箱中含有10%（v / v）DMSO。
- 在实验中使用传代数小于10的B2B细胞。
2. 细胞培养
- 将细胞接种到玻璃底培养皿上。
- 将包含B2B细胞的烧瓶从培养箱移动到生物安全柜。
- 使用连接真空泵的吸气移液管除去烧瓶中的培养基。
- 用 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤烧瓶。
- 使用吸液移液器取出PBS。
- 加入 0.5 mL 的 0.05% 胰蛋白酶溶液，使细胞从烧瓶底物底部分离。
- 将烧瓶放入培养箱中5分钟。
- 将烧瓶移至生物安全柜。将 5 mL 新培养基加入烧瓶中，上下移液。
- 将 50 μL 培养基与细胞（300 个细胞/μL）沉积到玻璃底培养皿上。将 2 mL 培养基加入培养皿中。
- 将培养皿放入培养箱中。等待12小时让细胞附着。
- 用磁性微珠培养细胞。
- 称取0.2克平均直径为7μm的羰基铁微珠（以下称为7μm微珠，参见 材料表）。
- 使用移液器将微珠悬浮在 1 mL RPMI-1640 培养基中。
- 将带有B2B细胞的培养皿带到生物安全柜。
- 将 200 μL 含有微珠的培养基加入培养皿中。
注意：快速添加培养基以避免微珠沉淀。 - 将培养皿放回培养箱中，直到微珠被细胞内化。每6小时检查一次内化，以确定不同细胞系内化的最佳时间。
- 要检查内化，请执行共聚焦荧光成像以可视化微珠，细胞核和细胞边界。如果微珠被细胞内化，它将在细胞边界内。
3. 细胞核的可视化
- 在培养箱中加热1.5mL培养基15分钟。
- 关闭生物安全柜的灯。将含有细胞，加热培养基，核染色剂和盐酸维拉帕米的培养皿放入生物安全柜中。
注意：核染色成分对光敏感。操作过程中避免暴露在光线下。 - 用DMSO将1000倍核染色稀释至100倍。
- 用DMSO稀释100mM盐酸维拉帕米至10mM。
- 将 15 μL 100x 核染色剂和 15 μL 10 mM 盐酸维拉帕米加入 1.5 mL 培养基中。通过上下移液充分混合。
- 从培养皿中取出培养基。将含有核染色的培养基加入培养皿中。
- 将细胞放回培养箱中超过2小时。
4.磁力应用硬件的准备
- 使用丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）3D打印所有零件，并按照CAD设计进行组装（图1A）。CAD 设计包含在 材料表中。
- 使用双面胶带将磁铁连接到磁铁移动设备（图1A）。
- 将磁铁移动装置放在显微镜载物台旁边。使用三个旋钮调整磁铁的空间位置，直到它可以在 13 毫米到 120 毫米之间移动到培养皿上方。
注意：确保磁铁和培养皿之间的距离上限尽可能大，以避免对磁性微珠施加不必要的力。120 mm是该实验设置中的最大值。确保磁体不会干扰显微镜部件，包括物镜和电动载物台。 - 将磁铁设置为最高 z 位置（120 毫米处）。
5. 力施加和活细胞成像
- 设置用于长期成像的环境室
- 应用75%乙醇溶液彻底消毒并清洁环境室。
- 将环境室放在倒置显微镜的电动载物台上。
- 打开 CO 2 罐并将CO 2 流入速率设置为 160 mL/min。
- 将腔室的温度调节到44°C（顶部），42°C（浴）和40°C（阶段）。
- 将 20 mL 纯净水加入环境室的浴中，以保持 90% 的湿度。
- 从组织培养箱中取出含有靶细胞的玻璃底培养皿并将其放入腔室中。
- 应用环境室的金属夹固定培养皿位置。
注意：培养皿必须紧紧夹在腔室中，因为如果不夹紧，磁力可能会移动培养皿。 - 合上腔室的盖子。
- 优化成像参数
- 优化针孔尺寸：针孔阻挡失焦光子。较大的针孔尺寸会产生更多的失焦光子，但图像更亮。针孔尺寸越小，图像越集中、越暗。确保优化针孔尺寸，以获得具有适当信噪比的对焦共聚焦图像。
- 优化激光强度：激光强度决定了激发的强度，从而决定了发射光。低激光强度产生低信噪比。激光强度过高会导致光漂白。相应地调整激光强度。
- 优化步长和步长：步长和步长决定了 Z 堆栈中将拍摄的图像数量。更小的步长和更多的步长将提高Z-stack分辨率，但也会增加光漂白。在该实验中，对于具有~15μm细胞高度的细胞使用1μm步长。
- 优化曝光时间：曝光时间决定了细胞将暴露在激发激光下的时间。低曝光时间会降低信噪比。高曝光时间会导致光漂白。本实验使用每4秒1帧的曝光时间。
- 优化成像参数：迭代更改四个参数之一，保持其他参数一致。每次，测量每个图像的YAPN / C比率并比较YAPN / C比率变化以确定光漂白水平。重复优化过程，直到在信噪比、成像速度和光漂白之间取得平衡。
- 使用优化的成像参数定义成像配置，以便在实验过程中更快地进行成像设置。
注意：本研究中使用的配置在成像参数的第5.3节中描述。要优化第 5.3 节中配置的成像参数，请使用与步骤 5.2.5 中相同的方法。
- 小力施加和共聚焦成像
注意：本研究使用尼康Ti2-E显微镜进行成像，图像采集的详细步骤如下。- 打开倒置显微镜。打开软件应用程序 元素。
- 定义配置 magnetic_find。仅检查 FITC 频道。设置 PMT HV = 70，偏移 = 0，激光强度 = 10。通过单击 1/2 按钮将扫描速度设置为每 2 秒 1 帧。通过单击 1.2 A.U . 按钮将针孔大小设置为 1.2 AU。此配置将在步骤 5.3.5 中使用。
- 定义配置 magnetic_YAP_Nucleus。检查 FITC 频道。设置 PMT HV = 70，偏移 = 0，激光强度 = 10。通过单击1 /2 按钮将扫描速度设置为每4秒1帧。通过单击 1.2 A.U . 按钮将针孔大小设置为 1.2 AU。要对细胞核边界和核染色强度进行成像，请检查 Cy5 通道。设置 PMT HV = 70，偏移 = 0，激光强度 = 10。针孔尺寸针对 3D YAP 成像进行了优化。检查 Cy5 通道后，请勿再次单击 1.2 A.U. 按钮。此配置将在步骤 5.3.7 中使用。
- 如有必要，通过元素打开 DIA。打开 SpinView，使用明场，并调整对象的焦点以获得清晰的细胞聚焦图像。使用10倍物镜在三种条件下找到合适的多个单细胞：内部单个微珠，内部有多个微珠，内部没有任何微珠。切换到 40 倍物镜。使用适当的职位编号命名此职位。
- 打开 元素。单击 magnetic_find。单击 移除联锁 按钮。
- 单击扫描并调整焦平面的 Z 位置。单击顶部和底部按钮以设置所选单元格的 Z 堆栈的下限和上限。再次单击扫描停止扫描。
- 切换到 magnetic_YAP_Nucleus 配置。将文件名设置为 before_small_force.nd2。单击带有记录的 Z 堆栈的 运行 按钮。
- 切换到正确的光路并打开 DIA。打开 旋转视图 ，然后单击 录制 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁向下移动到培养皿底部上方 46 毫米。保存明场图像序列或视频。检查视频以确认微珠显示由磁力引起的位移。
- 重复步骤5.3.5-5.3.7;将文件名设置为 after_small_force.nd2。
- 切换到正确的光路并打开 DIA。接下来，打开 旋转视图 然后点击 记录 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁移动到培养皿底部上方 120 毫米处。保存明场图像序列或视频。
- 重复步骤 5.3.5-5.3.7，并将文件名设置为 before_large_force.nd2。
- 大力施加和共聚焦成像
- 取下环境室的盖子，使磁铁到达培养皿底部上方13毫米。
- 切换到正确的光路并打开 DIA。打开 旋转视图 ，然后单击 录制 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁向下移动到培养皿底部上方 13 毫米。保存明场图像序列或视频。检查视频以确认微珠显示由磁力引起的位移。
- 重复步骤 5.3.5-5.3.7，并将文件名设置为 after_large_force.nd2。
- 切换到正确的光路并打开 DIA。接下来，打开 旋转视图 然后点击 记录 按钮。同时，旋转磁铁移动装置的旋钮，将磁铁移动到培养皿底部上方 120 毫米处。保存明场图像序列或视频。
- 重复步骤5.3.5-5.3.7;将文件名设置为 retract_large_force.nd2。
- 关闭环境室的盖子。
- 对多个视图区域重复步骤 5.2 和 5.3，以在需要时获取更多数据。
6. 图像处理和数据分析
- YAP氮/碳比的量化
- 打开 斐济图片J.打开在步骤 5 中拍摄的 .nd2 图像。
- 单击 分析 > 设置测量值。检查 面积、 积分密度、 平均灰度值和 形状描述符。
- 使用 Cy5 通道识别细胞核。单击“ 手绘 选择”以使用自由选择工具勾勒出细胞核的轮廓。另外，检查 ImageJ 中的自动核掩模宏（请参阅 材料表）。
- 单击 FITC 通道中的分析>度量。平均值的测量值是平均核YAP强度DN。
- 使用 Cy5 通道识别细胞核。使用 FITC 通道识别小区。单击 手绘 选择以使用自由选择工具选择细胞质内的感兴趣区域并避开磁性微珠。这个感兴趣的区域不得包括细胞核。
- 单击 FITC 通道中的分析>度量。平均值的测量值是平均细胞质YAP强度DC。
- 计算 YAP N/C 比率 = D N / DC。
- 核形状和归一化核染色强度的量化
- 打开 斐济图片J.打开在步骤 5 中拍摄的 .nd2 图像。
- 单击 分析 > 设置测量值。检查 面积、 积分密度、 平均灰度值和 形状描述符。
- 使用 Cy5 通道识别细胞核。单击“ 手绘 选择”以使用自由选择工具勾勒出细胞核的轮廓。
- 单击在 Cy5 通道中 分析 > 测量 。 平均值 的测量值是核染色强度。 Circ的测量值。是核循环性。
- 为了比较不同力状态下的核染色强度，将所有核染色强度除以“before_small_force.nd2”中的核染色强度，以生成归一化核染色强度。
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Representative Results
磁力移动装置的设计及磁力的应用
为了通过磁微珠对原子核施加力，设计并建造了一个磁铁移动装置来控制磁铁的空间位置。磁铁移动设备包含一个中央框架、三个旋钮和导轨，用于以每个周期 1.59 mm 的空间分辨率在 x、y 和 z 方向上独立移动连接的磁铁（图 1A）。一旦磁体靠近输送到细胞中的7μm微珠（图1B），它就会磁力吸引微珠并在细胞核上施加力（图1C）。力的方向和大小由磁铁和微珠之间的相对位置控制。
在本文中，对微珠施加了两种不同大小的力：（1）当磁铁放置在电池上方46 mm处时，力相对较小;（2）当磁铁放置在电池上方13毫米处时，力相对较大。施加在微珠F上的磁力可以通过公式59计算：
，其中Nd是退磁因子（球体为0.33），μ是真空中的磁导率（铁为6.3×10-3 H/m），Vp 是微珠的体积（7μm微珠为178 μm 3）， H是单位A/m的磁场强度，H与单位特斯拉的磁通密度B成正比。由于作用在单个7μm微珠上的磁力预计非常小且难以被力传感器检测到，因此测量磁通密度B作为参考以指示施加在微珠上的磁力的大小。在培养皿底部的位置引入霍尔传感器以测量磁通密度，并将磁铁放置在距培养皿底部13 mm或46 mm的距离处。由于7μm微珠会影响磁场，因此使用和不使用微珠测量磁通密度。无论是否存在7μm微珠，都获得了相同的磁通密度：在13mm的距离处B = 60.1 mT，在46 mm的距离处B = 3.7 mT。该测量表明，本研究中使用的霍尔传感器无法检测到7 μm微珠对直径为12.7 mm，高度为12.7 mm的圆柱形磁铁（参见材料表）产生的磁场的影响。然而，距离为13 mm的情况的磁通密度比距离为46 mm的情况高约16倍。磁力的实验校准在下一节中描述（图6）。
将磁性微珠输送到细胞质中
将细胞接种在玻璃底培养皿上12小时后，将7μm微珠加入培养基中。微珠被细胞自发内化。由于微珠在FITC或Cy5通道的激光激发下不会发出荧光，因此可以通过YAP和细胞核荧光的共聚焦成像通过暗空洞的位置来识别内化微珠的位置。2D和3D图像都显示微珠在细胞质中，而在细胞核外（图2）。
微珠进入细胞的内化水平取决于细胞和微珠共培养的持续时间。因此，根据内化微珠的数量将细胞分为三种类型——无微珠、单微珠和多微珠（图3A）。在共培养7小时时，62%的细胞内化无微珠，15%的细胞内化单个微珠，23%的细胞内化多微珠（细胞总数= 13）。在共培养12小时时，53%的细胞内化无微珠，26%的细胞内化单个微珠，21%的细胞内化多微珠（细胞总数= 62）。在共培养24小时时，20%的细胞内化无微珠，28%的细胞内化单个微珠，53%的细胞内化多微珠（细胞总数= 40）（图3B）。
细胞质中的微珠不影响细胞核形状和YAP活性
为了研究微珠内化对核形状和蛋白质活性的影响，首先分别通过圆度和YAPN/C比量化了核形状和YAP活性。圆度的计算方法是 圆度 = 4μ（面积/周长2）。量化YAP N/C比率的详细步骤在先前的出版物60中描述。简而言之，通过将细胞核中的平均YAP强度除以细胞质中的平均YAP强度来计算YAP N / C比率。考虑到微珠和细胞的共培养即使没有微珠内化也会影响核形状的可能性，没有共培养的细胞（黑点，对照#1，圆度= 0.806±0.037，n = 20），与微珠共培养但没有内化的细胞（灰点，对照#2，圆度= 0.806±0.035，n = 22），细胞内化单个微珠（红点，单个微珠， 圆度= 0.793±0.048，n = 15）和细胞内化多微珠（蓝点，多微珠，n = 7）（图3C）进行比较。结果表明，在所有四组测试中，核循环性没有显着差异（图3C）。
接下来，为了检查YAPN / C比率是否受微珠内化的影响，仅将与微珠共培养但没有内化的细胞（灰点，对照#2，YAP N / C比= 1.155±0.074，n = 35）与具有单个或多个微珠内化的细胞（红点，具有微珠的细胞，YAP N / C比= 1.140±0.078）进行比较， n = 36），在共培养的第12小时（图3D）。没有比较没有共培养的细胞，因为带有微珠的培养皿显示出较低的细胞密度，这可能会影响YAP N / C比率12。结果显示两组之间的YAPN / C比率没有显着差异（p值= 0.667），表明微珠的内化不会影响YAP活性（图3D）。
磁力使原子核变形
首先，显示了原子核的变形。细胞核的变形是由微珠（图4A和图4A1-3）在含有细胞骨架的细胞中施加的压缩力引起的。这些数据（即，细胞核因微珠的压缩而变形）支持微珠确实在拥挤的细胞质中对细胞核施加力。补充材料中包括显示力施加过程的明场视频（补充视频 1）。其次，由于微珠可能同时对周围的细胞骨架施加力并间接使细胞核变形，因此在具有破坏肌动蛋白丝的细胞中重复压缩实验（处理Cyto D（2.5μM，1小时）;图 4B）。这项研究表明，肌动蛋白丝确实解聚了（图4B），并且细胞核被微珠变形（图4B1-3）。这些数据支持微珠在没有交织的周围细胞骨架的情况下直接向细胞核施加力。总的来说，这些数据表明协议和工具可以直接在原子核上施加力。
细胞内磁珠的空间和时间控制
为了实现微珠的空间控制，使用一对磁铁来移动微珠并控制其在细胞核上的凹痕位置（图5A）。磁珠只能以高达 2.2 μm 的位移移动（图 5A1-4），但可以在相应位置灵活地在细胞核上施加压痕。周围的肌动蛋白细胞骨架可能限制微珠的运动。因此，肌动蛋白细胞骨架被Cyto D处理（2.5μM，1小时）破坏，并且微珠位置纵但显示出相似的结果。因此，可以提出一个假设：微珠可能与细胞质中的细胞核和其他周围细胞器进行物理/化学结合，这限制了其较大的空间运动（>2.2μm）。
为了实现微珠的空间控制，使用了一对磁铁来控制微珠在原子核的同一位置施加和释放两次力（具有不同的力大小）（图5B和图5B1-B4）。当前一个施力和释放周期的持续时间为 12 秒。时间控制的速度由XYZ移动器的运行速度决定。
磁力校准
通过实验测量由校准原子力显微镜（AFM）施加的力来估计珠子施加到原子核上的力，该力导致原子核的类似变形。具体来说，肌动蛋白细胞骨架首先被CytoD溶解（2.5μM;1小时， 图4B），因为AFM在细胞的顶端表面上施加力，并且肌动蛋白皮层和细胞骨架的去除允许AFM尖端和细胞核之间更直接的接触。根据核形状和核染色强度与健康细胞中的核形状和核染色强度的比较，溶解肌动蛋白皮层和细胞骨架的细胞是活的（补充图1）。其次，使用与微珠具有相似尺寸和形状的未功能化AFM尖端（半球形，半径= 5μm）以力控制的方式压进细胞的顶端表面，并同时获取细胞和细胞核体的3D共聚焦图像（图6A）。选择从0.8 nN到2.0 nN的压缩力大小是因为，根据文献24，已知1.5 nN大小的力足以使原子核变形。第三，通过定量成像分析测量由AFM压痕引起的原子核的正常变形。此外，还获得了提供定量AFM力-位移关系的校准曲线（图6B）。第四，通过控制具有相似大小和形状（半径= 7μm; 图6C），并通过成像分析 测量 核膜的变形。珠子施加的力是根据AFM力-位移关系估计的。
例如， 在图6C中，磁性微珠（直径= ~7μm）在“大力”下引起的原子核变形约为1.5μm。 在图6D中，使用具有5μm半球形探针的AFM尖端在细胞核顶部压痕细胞以实现1.5μm的核变形。AFM记录的相应力为1.4 nN。因此，微珠施加的力估计为~1.4 nN。遵循相同的方法，“小力”下的磁力被校准为0.8 nN，并导致0.4μm的核压痕。
本研究认为，基于以下假设，AFM测量的力可以代表微珠施加的力：（1）不同细胞内细胞核的刚度相似。（2）原子核的机械性能不取决于施加压痕的核部位。磁力水平施加在原子核的侧面，而AFM力垂直施加在原子核的顶端侧。它们之间的机械差异被假定为可以忽略不计。（3）在AFM实验中，探针直接通过细胞膜和细胞骨架向细胞核施加力。在破坏肌动蛋白丝后，AFM施加到细胞核上的力类似于微珠施加到细胞核上的力，尽管膜仍然位于AFM探针和细胞核之间。
磁力触发 YAP N/C 比率的变化
为了证明施加在微珠上的磁力可以使细胞核变形并诱导YAP易位，将微珠内化的细胞的YAPN / C比率量化为三个阶段：（1）施加力之前，（2）施加力后，以及（3）释放力之后。当施加或释放力时，一些细胞显示出核形状和YAPN / C比率的变化（图7A，C）。YAP的强度变化可以通过两种可能的机制来归因于：（1）YAP-FP蛋白在施加力后从细胞质转移到细胞核中。在这种情况下，核染色不应显示信号变化。核染色强度不应发生很大变化;（2）YAP-FP蛋白在施加力后不会易位。观察到的YAP强度变化是由于力诱导的核体积变化和由此产生的YAP-FP浓度变化。在这种情况下，核染色强度应以与YAP核强度类似的趋势变化，因为染色染料的浓度也随着细胞核体积的变化而变化。因此，测量了来自红色通道（激发：650 nm;发射：681 nm）的核染色强度变化。绿色通道中YAP的强度变化，但红色通道中的细胞核染色没有强度变化。因此，第一种机制可能存在（图7B）。总的来说，结果表明，磁力诱导的核变形触发了YAP易位。
接下来，在两组细胞内量化YAPN / C比率的净变化：（1）未内化微珠的细胞（灰点，对照，n = 9）;（2）具有内化微珠的选定细胞，这些微珠显示YAPN / C比的变化（绿点表示小力，红点表示大力，n = 11）。在 0.8 nN 力下，具有内化微珠的细胞显示出净 YAP N/C 比率变化 = -0.030 ± 0.029， n = 11;对照单元显示净 YAP N/C 比率变化 = -0.003 ± 0.012，n = 9。在 1.4 nN 力下，具有内化微珠的细胞显示出净 YAP N/C 比率变化 = 0.011 ± 0.040，n = 11;对照细胞显示净 YAP N/C 比率变化 = 0.005 ± 0.005，n = 9（图 8A）。在 0.8 nN 力下，具有内化微珠的细胞显示出绝对净 YAP N/C 比率变化 = 0.057 ± 0.017， n = 11;对照单元显示净 YAP N/C 比率变化 = 0.021 ± 0.007，n = 9。差异显著（p 值 = 0.0093，**）。在 1.4 nN 力下，具有内化微珠的细胞显示出绝对净 YAP N/C 比率变化 = 0.070 ± 0.020， n = 11;对照单元显示净 YAP N/C 比率变化 = 0.010 ± 0.003，n = 9。差异是显著的（p 值 = 0.0007，****）（图 8B）。总之，这些结果证实了施加在细胞质内微珠上的磁力确实可以诱导YAP易位并改变YAPN / C比率。
图 1：磁性移动装置的设计以及磁性微珠在细胞中的力施加示意图。 （A） 用于固定磁铁并在 x、y 和 z 方向上移动的装置的三维示意图。该设备由一个宽 241.3 毫米、高 104.1 毫米的底座、两个旋钮、一个杆和一个磁铁组成。旋钮将在正确的操作旋转方向上花键，这将在相应的方向上提供运动。磁铁将降低/进一步升高到碟子附近，以在磁性微珠上施加不同大小和方向的磁力。（B）7μm铁微珠的扫描电子显微镜（SEM）图像示例。（C）当施加磁场时，在细胞质内传递的磁性微珠可以对细胞器（例如细胞核）施加力。请点击此处查看此图的大图。
图 2：显示磁性微珠（蓝色箭头指向的黑色空心）的代表性图像被内化 到细胞（由 YAP 表示）和细胞核外部。 （A） YAP（绿色）、细胞核（红色）和明场细胞的 X-Y 横截面。（B）细胞的3D重建。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：细胞内化的微珠不会影响细胞核形状和 YAP N/C 比 。 （A）无微珠、单微珠和多微珠内化的细胞的代表性明场和荧光图像。蓝色箭头表示微珠在细胞质内的位置。（B）在共培养的7小时（n = 13），12小时（n = 62）和24小时（n = 40）时，显示无微珠，单个微珠和多微珠内化的细胞百分比。（C）核循环性显示对照细胞和微珠内化细胞之间没有显着差异。对照#1（无微珠共培养）：圆度= 0.806±0.037，n = 20;对照#2（微珠共培养，无微珠内化）：循环度= 0.806 ± 0.035，n = 22;单个微珠内化：圆度= 0.793 ± 0.048，n = 15;多微珠内化：循环度 = 0.780 ± 0.061，n = 7。（D）YAP N / C比率显示对照细胞（微珠共培养，无微珠内化，YAP N / C比率= 1.155±0.074，n = 35）和具有微珠内化的细胞（YAP N / C比率= 1.140±0.078，n = 36）之间没有显着差异（p 值= 0.667）。 请点击此处查看此图的大图。
图4：对有和没有肌动蛋白丝的细胞核施加直接力。 （A）细胞显示肌动蛋白丝（黄色）。（答1）不施加力时的细胞核图像。（答2）施加力后的原子核图像。（答3）施加力之前和之后核边界的重叠图像显示了核压痕。（B）细胞在Cyto D处理（2.5μM，1小时）后显示破坏的肌动蛋白丝（黄色）。（地下一）不施加力时的细胞核图像。（地下2层）施加力后的原子核图像。（地下3层）施加力之前和之后的核边界重叠图像显示与破坏的肌动蛋白细胞骨架的核压痕。 请点击此处查看此图的大图。
图5：细胞内磁珠的空间和时间控制 。 （A）一对磁铁在空间上控制磁性微珠。（答1）位置 1 处细胞边界（绿线）、核边界（红线）和磁性微珠（黄线）的明场图像。（答2）磁性微珠在位置 1 处缩进细胞核。（答3）磁性微珠移动到位置2（黄线）。位置 1 显示为参考（黄色虚线）。（答4）磁性微珠在位置 2 处压进细胞核。（B）一对磁铁暂时控制磁性微珠。（地下一）在时间点I处未施加力的细胞的明场图像（B2）磁性微珠在时间点II处对细胞核施加力。（地下3层）磁性微珠在时间点III释放来自原子核的力。（B4）磁性微珠在时间点IV对原子核施加更大的力。 请点击此处查看此图的大图。
图6.使用AFM压痕校准微珠施加在细胞核上的力。 （A）校准过程示意图。磁性微珠在细胞核上施加水平压缩（左），AFM探针在细胞核上垂直缩进。（B）AFM压痕力与核变形。（C）磁微珠受力前后原子核变形（1.5μm）的代表性图像。（D）在1.4 nN力下AFM压痕前后相似原子核变形（1.5μm）的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：显示 YAP N/C 比率变化的代表性数据是由磁力施加和释放引起的 。 （A）细胞在不受力、推开和力关闭时细胞的YAP（绿色）和细胞核（红色）荧光图像的X-Y横截面。在强制开启条件下，细胞质YAP强度在黄色箭头指向的位置降低，而核YAP强度增加。YAP N/C 比率增加。（B） YAP N/C 比率在力打开时增加（从 1.0791 增加到 1.2327），在力关闭时降低（从 1.2327 增加到 1.1548）。归一化核染色强度随力施加 （1.00117） 和释放 （0.95578） 而变化较小。（C）细胞的YAP的X-Z横截面（绿色）和细胞核（红色）图像在无力，力打开和强制关闭。 请单击此处查看此图的大图。
图 8：施加磁力引起的 YAP N/C 比率变化。 （A） 在 0.8 nN 力下，具有内化微珠的细胞显示净 YAP N/C 比率变化 = -0.030 ± 0.029， n = 11;对照单元显示净 YAP N/C 比率变化 = -0.003 ± 0.012，n = 9。在 1.4 nN 力下，具有内化微珠的细胞显示出净 YAP N/C 比率变化 = 0.011 ± 0.040，n = 11;对照单元显示净 YAP N/C 比率变化 = 0.005 ± 0.005，n = 9。（B）在0.8 nN力下，具有内化微珠的细胞显示出绝对净YAP N / C比率变化= 0.057±0.017，n = 11;对照单元显示净 YAP N/C 比率变化 = 0.021 ± 0.007，n = 9。差异显著（p 值 = 0.0093，**）。在 1.4 nN 力下，具有内化微珠的细胞显示出绝对净 YAP N/C 比率变化 = 0.070 ± 0.020， n = 11;对照单元显示净 YAP N/C 比率变化 = 0.010 ± 0.003，n = 9。差异显著（p 值 = 0.0007，****） 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：核形状和核染色强度。 （a）未经Cyto D治疗，（b）使用Cyto D治疗和（c）死细胞。 请点击此处下载此文件。
补充视频1：显示施力过程的明场视频。请点击此处下载此视频。
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Discussion
磁性微珠的内化（第2.2节）至关重要，因为细胞外微珠不能直接对细胞核施加力。力施加和成像（第5.3节）是本实验中的关键步骤，使细胞核变形并引起有意义的生物学后果所需的力可能取决于样品。该实验中的力大小（0.8 nN和1.4 nN）可以进一步增加，以触发不太敏感的细胞中的核机械传感。
为了以高通量定量方式施加磁力，单个微珠的内化是一种理想的方法。在这项研究中，具有单个微珠内化的细胞百分比在12小时（26%）和24小时（28%）相似，而没有微珠内化的细胞在12小时（53%）高于24小时（20%）（图3B）。认为12 h是施力实验的最佳时间，因为可以包含更多的单个微珠，并且可以控制细胞。对于不同的细胞系和微珠大小，应测试共培养时间和微珠浓度，以确定相应的最佳条件。
在实验中，微珠没有被涂覆以特异性地与细胞核结合。因此，从微珠直接传递到原子核的力可能只是压缩的。结果表明，YAPN / C比率增加和减少细胞群（图8A）。一个可能的原因是，通过微珠 施加 的磁力可能引起细胞骨架内的正或负张力变化并调节YAPN/C比值的增加或减少，分别28。先前的研究表明，对原子核的压缩力会导致YAP N / C比增加28。在未来的实验中，为了研究细胞核的直接力传感，可以破坏细胞骨架以消除从细胞骨架到细胞核的力传递。
当前的方法有两个潜在的缺点。首先，在这些实验中，利用3D移动器（图1A）来调整磁珠的运动，通过实时共聚焦成像进行监测，旨在对细胞核施加压缩力。然而，由于核膜的滑性和细胞质中的复杂环境，珠子施加力的方向可能不是纯粹的压缩（即，不是绝对垂直于核膜表面）。这种缺陷会导致剪切力施加到核膜上。其次，本研究中使用的当前微珠不与抗体偶联以与细胞核结合，因为磁珠的空间迁移率在当前实验中至关重要，以证明非接触式磁致动器的优势。因此，目前的方法不能对核膜施加张力。
未来，（1）具有抗奈斯普林-1抗体的磁珠将偶联以特异性结合细胞核。这可以保证微珠和目标蛋白质之间的直接和比力传递。（2）通过操纵嵌入荧光珠的软水凝胶中的单个磁性微珠来校准力的方向。荧光珠的3D位移可用于计算水凝胶的变形场，并确定力方向作为外加磁场的函数。微珠与原子核化学键合后，施加已知方向的力将确定力类型（拉伸、压缩或剪切）。（3）核染色的3D成像将用于构建细胞核的3D模拟FEM模型。力方向可以通过比较施加磁力前后的核变形来验证。
本研究中开发的独特技术提供了几个潜在的优势：（1）与AFM探针的垂直压痕相比，磁性微珠可以在任何方向上施加力。在2D底物表面上培养的细胞在质膜和核包膜的垂直和水平表面上可能具有异质的蛋白质分布和取向。水平施加力可能会引起以前未观察到的机械感应响应。（2）一旦微珠被功能包被与原子核结合，推力和拉力都可以直接施加在原子核上，以进一步研究由于力方向不同的差分核机械传感。（3）通过控制微珠与某些核包膜蛋白的特异性结合，可以阐明以前研究不足的核力传感机制。新出现的证据表明，原子核很可能是机械传感器36，而核机械传感是YAP易位28的最直接调节器。积极研究了核调控YAP易位的机理，提出了原子核中机械传感器或参数的候选者，包括核孔径28、核形状25、61、LINC复合物和核包膜张力20。操纵磁性微珠为通过直接对LINC复合物施加力和核包膜张力和形状的受控调节来详细探索这些机制提供了可能性。（4）除了对细胞核施加力外，微珠还适合被设计成与质膜的内侧结合，以揭示膜蛋白的细胞内结构域及其复合物如何响应生物物理信号。
总之，本文展示了一种方法，该方法（1）在不影响细胞形态和蛋白质功能的情况下将微粒铁微珠递送到细胞质中，（2）通过磁性微珠对细胞核施加力，以及（3）在施加力期间进行共聚焦荧光活细胞成像。这些非侵入性工具为单细胞细胞器的直接表观遗传操作、基于超分辨率成像的细胞核机械转导询问以及详细探索力调节的 3D 染色体组织（结合 Hi-C：高分辨率染色体确认捕获）以及在细胞生理学和病理生物学背景下的重编程开辟了可能性。
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Disclosures
没有需要声明的利益冲突。
Acknowledgments
该项目由UF佳得乐奖启动包（X.T.），UFHCC飞行员奖（X.T.和Dietmar Siemann博士），UF机会种子基金（X.T.）和UFHCC大学学者计划（H.Y.Wang）资助。我们衷心感谢Jonathan Licht博士（UFHCC），Rolf Renne博士（UFHCC），Christopher Vulpe博士（UFHCC），Blanka Sharma博士（BME），Mark Sheplak博士（MAE和ECE），Daniel Ferris博士（BME），Malisa Sarntinoranont博士（MAE），Ashok Kumar博士（MAE），Benjamin Keselowsky博士（BME），Brent Gila博士（RSC），Philip Feng博士（ECE）的智力讨论和技术支持， Gregory A. Hudalla博士（BME），Steven Ghivizzani博士（OSSM），Yenisel Cruz-Almeida博士（CDBS），Roger Fillingim博士（CD-BS），Robert Caudle博士（OMS），John Neubert博士（DN-OR），Justin Hiliard博士（神经外科），田和博士（哈佛大学），谭友华博士（香港理工大学），Jessie L-S Au博士（定量系统药理学研究所），David Hahn博士（亚利桑那大学）， 尼康支持团队（Jose Serrano-Velez博士、Larry Kordon博士和Jon Ekman博士）。我们非常感谢Tang's，Yamaguchi's，Sharma's，Au's，Siemann's和Guan研究实验室的所有成员以及UF MAE部门的所有工作人员的有效支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
| 7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
| A1R confocal system | Nikon | ||
| Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
| Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
| NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
| XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |
References
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