Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שילוב של מפעיל כוח מגנטי תלת-ממדי והדמיה פלואורסצנטית רב-תפקודית לחקר גרעין המכנוביולוגיה

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

מחקר זה מציג פרוטוקול חדש להפעלת כוח מכני ישירות על גרעין התא באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים.

Abstract

שאלה בסיסית במכנוביולוגיה היא כיצד תאים חיים חשים גירויים מכניים חוץ-תאיים בהקשר של פיזיולוגיה ופתולוגיה של התא. תחושת המכנו התאית של גירויים מכניים חוץ-תאיים היא ככל הנראה דרך קולטני הממברנה, קומפלקס החלבונים הקשורים ושלד הציטוסקלטון. ההתקדמות האחרונה במכנוביולוגיה מדגימה כי גרעין התא בציטופלסמה עצמה יכול לחוש באופן עצמאי גירויים מכניים בו זמנית. עם זאת, הבנה מכניסטית של האופן שבו גרעין התא חש, מתמר ומגיב לגירויים מכניים לוקה בחסר, בעיקר בגלל האתגרים הטכניים בגישה ובכימות מכניקת הגרעין על ידי כלים קונבנציונליים. מאמר זה מתאר את התכנון, הייצור והיישום של מפעיל כוח מגנטי חדש המפעיל גירויים מכניים תלת-ממדיים מדויקים ולא פולשניים כדי לעוות ישירות את גרעין התא. באמצעות שימוש בתאים מהונדסים של CRISPR/Cas9, מחקר זה מדגים כי כלי זה, בשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית ברזולוציה גבוהה, מאפשר את גילוי הדינמיקה בזמן אמת של חלבון רגיש למכנו (YAP) בתאים בודדים כפונקציה של עיוות גרעין. לשיטה פשוטה זו יש פוטנציאל לגשר על הפער הטכנולוגי הנוכחי בקהילת המכנוביולוגיה ולספק תשובות לפער הידע הקיים ביחס בין גרעין המכנוטרנסדוקציה לתפקוד התא.

Introduction

מחקר זה נועד לפתח וליישם טכניקה חדשה להבהרת גרעין המכנוביולוגיה על ידי שילוב של המפעילים מגנטיים המפעילים כוח מכני ישירות על גרעין התא ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית המדמה בו זמנית את השינויים התת-תאיים המבניים והתפקודיים. התאים חשים אותות ביופיזיים חוץ-תאיים, כולל קשיחות רקמות 1,2,3,4, לחץ נוזל בין-תאי ולחץ גזירה 5,6,7, טופולוגיה/גיאומטריה של פני השטח 8,9,10,11,12, ולחץ מתח/דחיסה13,14, 15,16. אותות ביופיזיים מומרים לאותות ביוכימיים ומעוררים שינויים פוטנציאליים במורד הזרם של ביטוי גנים והתנהגויות תאים - תהליך המכונה מכנינוטרנסדוקציה 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . כדי לחקור תהליכי מכני-טרנסדוקציה, פותחו מספר עצום של טכניקות להפעלת כוח מכני על התאים, כגון מיקרוסקופיה של כוח אטומי28, מכשיר מתיחה של תאים29, חיישן כוח ביו-MEMS (מערכות מיקרו-אלקטרו-מכניות) 15,30,31, ריאולוגיה גזירה 32 ומערכת ראייה סטריאופונית 33 . סקירה שפורסמה לאחרונה מסכמת את הגישות להפעלת רמזים מכניים חוץ-תאיים ולהפריע למכניוסנסינג34. נכון להיום, רוב השיטות הללו מפעילות כוח על קרום הפלזמה של התא, והתאים מקבלים ישירות את האותות הביופיזיים החוץ-תאיים האלה באמצעות קולטני ממברנה כגון אינטגרין, קדהרין, תעלות יונים וקולטנים מצומדים לחלבון G. לאחר מכן, הם מעבירים את האות לשלד התוך תאי ולגרעין. לדוגמה, באמצעות טרנסלוקציה של חלבון הקשור כן (YAP) כאינדיקטור לחישת מכנו, תאים נראים חשים את האותות המכניים של נוקשות המצע והמתח החוץ-תאי מקרום התא ומעבירים אותם דרך השלד הציטוסקולרי לתוך הגרעין כדי לגרום לטרנסלוקציה של ציטופלסמה לגרעין YAP28,35.

עדויות עדכניות מצביעות על כך שגרעין התא עצמו הוא חיישן מכנו עצמאי 8,36,37. זה הוכח על ידי ניסויים שבוצעו על הגרעין המבודד שנקטף מתאים, שם התגלה כי גרעינים באופן אדפטיבי לשנות את הנוקשות שלהם בתגובה לכוח המכני המופעל ישירות עליהם36. בתנאים פיזיולוגיים רבים, גרעינים הן בתאים סרטניים והן בתאים בריאים חשים אותות ביופיזיקליים חוץ-תאיים ומשנים את תכונותיהם המכניות ואת מכלוליהם38,39,40. לדוגמה, עם האקסטרווזה, הנוקשות הגרעינית של תאי הגידול פוחתת ושומרת על רכות במשך יותר מ-24 שעות38. במהלך נדידה דרך חלל ביניים סגור, גרעיני תאי הגידול מאבדים לעתים קרובות ומשחזרים את שלמותם המבנית39. עם זאת, האופן שבו הגרעין חש את האות הביופיזי אינו ידוע, אם כי נמצאו מעורבים מספר חלבונים בעלי מעטפת גרעינית ומשפחות של חלבונים, כגון Lamin A/C ומקשר של קומפלקס נוקלאוסקלטון וציטוסקלטון (LINC)38,41. לפיכך, שיטות לא פולשניות חדשות שיכולות להפעיל כוח ישירות על הגרעין ינתקו את ההשפעה של העברת כוח מממברנת התא-פלזמה ושלד הציטוסקלטון, ויסייעו להבהיר את המנגנונים המולקולריים שלא היו נגישים בעבר של חישת מכנו-חישה גרעינית.

מחקר שהשתמש בפינצטה אופטית כדי לתמרן אברונים42 ומיקרובים שהוזרקו לתאים43 הראה את היכולת הטכנולוגית של הפעלת כוח ישירות על הגרעין. עם זאת, לטכניקת הפינצטה האופטית יש מספר מגבלות: (1) פינצטות אופטיות בעלות תפוקה נמוכה לעיתים קרובות מתמרנות רק תא אחד או מיקרובאד אחד בכל פעם; ו-(2) פוטו-דפורמציה פוטנציאלית ועיוות טמפרטורה של הגרעין דורשת עשרות pN36, ועוצמת הלייזר הנדרשת המתאימה היא כ-10 mW ל-pN44,45. עוצמת לייזר כזו מספיקה כדי לגרום לפוטו-נזק בתאים ולהפריע לתפקודי התאים במהלך הניסוי46.

כוח מגנטי המופעל באמצעות מיקרובים בתוך תאים חיים מראה את הפוטנציאל להפעיל כוח ישירות על הגרעין ומתגבר על המגבלות של פינצטה אופטית. ברגע שמיקרובים מועברים לתוך הציטופלסמה, שדה מגנטי יכול להפעיל כוח מגנטי על מספר מיקרובים בו זמנית באופן בעל תפוקה גבוהה. השדה המגנטי אינו משפיע על תפקודי התא47, אלא מייצר כוח מ-pN ל-nN, וזה מספיק כדי לגרום לעיוות גרעיני 36,48,49. עד כה, מניפולציה של חיידקים מגנטיים יושמה על קרום פלזמה תאית48, בתוך הציטופלסמה50, על F-actin51, בתוך הגרעין47, ועל הגרעין המבודד36. עם זאת, מניפולציה מגנטית של מיקרובים מעולם לא שימשה להפעלת כוח מכני ישיר על מעטפת הגרעין כדי לחקור מכנוטרנסדוקציה בגרעין.

במאמר זה פותחה טכניקה פשוטה להעברה לא פולשנית של מיקרובים מגנטיים לתוך הציטופלסמה, ושימוש במיקרובים האלה כדי להפעיל כוח מכני על הגרעין (איור 1). כאן, קווי תאי B2B אנושיים רגילים מהונדסים על ידי CRISPR/Cas9 המבטאים באופן אנדוגני mNeonGreen21-10/11-מתויג YAP משמשים לאימות השיטה. YAP הוא חלבון רגיש למכנו, והטרנסלוקציה של YAP מווסתת על ידי חישת מכאנו גרעינית14,28. גישת ה-knock-in המווסתת קריספר/Cas9 נבחרה כדי לתייג YAP אנדוגני עם חלבון פלואורסצנטי (FP) mNeonGreen21-10/11. למרות שידוע שלעריכת קריספר יש יעילות חלקית ואפקט מחוץ למטרה, הפרוטוקולים בפרסומים קודמים שילבו מיון פלואורסצנטי כדי לבחור להכנסת מסגרת קריאה פתוחה נכונה52,53,54. עם שכבת בחירה נוספת זו, לא נצפה אירוע תיוג מחוץ למטרה ב-20+ שורות תאים שנוצרו בעברב-52,53,54,55. זהו מבנה חלבון פלואורסצנטי מפוצל, אך באופן עקרוני, כל תג פלואורסצנטי הניתן לביטוי יכול להיות שמיש. גישת תיוג זו עדיפה על שיטות טרנסגניות או נוגדנים. ראשית, בניגוד לביטוי הטרנסגני, החלבון המתויג שומר על מינון גן של עותק יחיד ומתבטא בהקשר הפיזיולוגי של רשת הוויסות של הגנים המקומיים, תוך הגבלת סטיות בריכוז החלבון, לוקליזציה ואינטראקציה. שיטת התיוג ששימשה במחקר זה משיגה תפוקה ויעילות גבוהות יותר בסדר גודל מאשר תיוג FP מלא. הוא גם נמנע מאתגרים הקשורים לאימונופלואורסצנציה בשל ממצאי קיבוע והזמינות המוגבלת של נוגדנים איכותיים וספציפיים במיוחד. שנית, הגישה שבה נעשה שימוש במאמר זה עושה מינימום הפרעה לפיזיולוגיה של התא ומאפשרת גילוי בזמן אמת של כל ה-YAPs האנדוגניים באופן אותנטי. לעומת זאת, שיטות טרנסגניות נפוצות אחרות מובילות לעתים קרובות לביטוי יתר של YAP. ההפצה המלאכותית הנובעת מכך עלולה לגרום לציטוטוקסיות ולהשפיע על חישת מכאנו של תאים56,57,58.

מחקר זה מציג פרוטוקול להפעלת כוח ישירות על הגרעין באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים. לסיכום, הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים כיצד (1) להעביר מיקרובים מגנטיים לתוך התא כשהם מחוץ לגרעין, (2) לתמרן את המיקרובים כדי להפעיל כוח מגנטי על הגרעין, (3) לבצע הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של התאים במהלך מניפולציה, ו-(4) לנתח באופן כמותי את יחס הגרעין/ציטופלסמה (N/C) של YAP לאורך כל תהליך יישום הכוח. התוצאות מצביעות על כך ש-(1) באמצעות אנדוציטוזה, מיקרובים מגנטיים יכולים להיות מועברים באופן לא פולשני לציטופלסמה של תאי B2B תוך 7 שעות (איור 2 ואיור 3); ו-(2) כוח מגנטי מכמת המופעל ישירות על הגרעין (איור 4, איור 5 ואיור 6) לבדו יכול לגרום לשינויים מגוונים ביחס YAP N/C בתאי B2B מהונדסים של CRISPR/Cas9 (איור 7 ואיור 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תחזוקה של תאי B2B מהונדסים בקריספר/Cas9

  1. תרבית תאי B2B בבקבוק T25 עם RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. שמור על תאי B2B באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  3. תת-תרבית של תאי B2B כאשר המפגש מגיע ל-70% עד 80%.
  4. אחסן את קו התאים B2B בתרבית RPMI-1640 בינונית עם 10% (v/v) DMSO במקפיא של -80 °C.
  5. השתמש בתאי B2B עם מספר מעבר קטן מ-10 בניסויים.

2. תרבית תאים

  1. זרעו את התאים על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית.
    1. הזיזו את הבקבוקון המכיל תאי B2B פנימה מהאינקובטור לארון ה-biosafety.
    2. הסר את מדיום התרבית בבקבוקון באמצעות פיפטה שאפתנית עם משאבת ואקום מחוברת.
    3. לשטוף את הבקבוקון עם 2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
    4. הסר PBS באמצעות פיפטה שואפת.
    5. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.05% כדי לנתק תאים מתחתית מצע הבקבוקון.
    6. שים את הבקבוקון בחממה במשך 5 דקות.
    7. העבירו את הבקבוקון לארון הבטיחות הביולוגית. הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבות חדש לתוך הבקבוקון פיפטה את הפתרון למעלה ולמטה.
    8. הפקידו 50 μL של המדיום עם תאים (300 תאים / μL) על צלחת פטרי תחתית זכוכית. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות לתוך צלחת פטרי.
    9. מכניסים את צלחת הפטרי לחממה. המתן 12 שעות עד שהתאים יתחברו.
  2. תרבית את התאים עם מיקרובים מגנטיים.
    1. שוקלים 0.2 גרם של מיקרובי ברזל קרבוניל בקוטר ממוצע של 7 מיקרומטר (להלן 5 מיקרובים של 7 מיקרומטר, ראו טבלת החומרים).
    2. השתמש פיפטה כדי להשעות את microads ב 1 מ"ל של מדיום תרבית RPMI-1640.
    3. קח את צלחת פטרי עם תאי B2B לארון הבטיחות הביולוגית.
    4. הוסיפו 200 מיקרוליטר של המדיום המכיל מיקרובים לצלחת פטרי.
      הערה: הוסיפו את המדיום במהירות כדי למנוע משקעים של החיידקים.
    5. החזירו את צלחת הפטרי לאינקובטור עד שהחיידקים יופנמו על ידי התאים. בדוק את ההפנמה כל 6 שעות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי להפנמה עבור קווי תאים שונים.
    6. כדי לבדוק את ההפנמה, בצע הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית כדי לדמיין את גבול המיקרוב, הגרעין והתא. אם המיקרוב מופנם על ידי התא, הוא יהיה בתוך גבולות התא.

3. הדמיה של גרעין

  1. מחממים 1.5 מ"ל של מדיום התרבות באינקובטור במשך 15 דקות.
  2. כבו את האור של ארון הבטיחות הביולוגית. קחו את צלחת הפטרי המכילה את התא, מדיום התרבית המחוממת, הכתם הגרעיני ו-Verapamil HCl לארון הביו-בטיחות.
    הערה: רכיבי צביעה גרעינית רגישים לאור. יש להימנע מחשיפה לאור במהלך הפעולה.
  3. דילול 1000x כתם גרעיני על ידי DMSO עד 100x.
  4. יש לדלל 100 mM Verapamil HCl על ידי DMSO ל-10 mM.
  5. הוסף 15 μL של 100x כתם גרעיני ו 15 μL של 10 mM Verapamil HCl ל 1.5 מ"ל של מדיום תרבית. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
  6. הסר את מדיום התרבות מצלחת פטרי. הוסף את מדיום התרבות המכיל כתמים גרעיניים לתוך צלחת פטרי.
  7. החזירו את התאים לאינקובטור למשך יותר משעתיים.

4. הכנת חומרת יישום הכוח המגנטי

  1. הדפס בתלת-ממד את כל החלקים באמצעות אקרילוניטריל בוטאדיאן סטירן (ABS) והרכיב אותם בהתאם לתכנון ה-CAD (איור 1A). עיצוב ה-CAD כלול בטבלת החומרים.
  2. השתמשו בקלטת דו-צדדית כדי לחבר את המגנט למכשיר שנע על ידי המגנט (איור 1A).
  3. הניחו את המכשיר הנע במגנט ליד במת המיקרוסקופ. השתמשו בשלושת הידיות כדי לכוונן את המיקום המרחבי של המגנט עד שהוא יוכל לנוע מעל צלחת פטרי בין 13 מ"מ ל-120 מ"מ.
    הערה: ודא שהגבול העליון של המרחק בין המגנט לצלחת פטרי גדול ככל האפשר כדי למנוע הפעלת כוח לא רצויה על החיידקים המגנטיים. 120 מ"מ הוא הערך המרבי במערך ניסיוני זה. ודא שהמגנט אינו מפריע לחלקי המיקרוסקופ, כולל מטרות ושלבים ממונעים.
  4. הגדר את המגנט למיקום z הגבוה ביותר (ב- 120 מ"מ).

5. יישום כוח והדמיית תאים חיים

  1. הגדרת תא הסביבה להדמיה ארוכת טווח
    1. החל תמיסת אתנול 75% כדי לעקר ביסודיות ולנקות את תא הסביבה.
    2. מקם את תא הסביבה על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ ההפוך.
    3. פתח את מיכל CO 2 והגדר את קצב זרימת ה- CO2 ל- 160 מ"ל לדקה.
    4. כוונן את טמפרטורת התא ל-44 °C (למעלה), 42 °C (אמבטיה) ו-40 °C (במה).
    5. הוסיפו 20 מ"ל של מים מטוהרים לאמבטיה של תא הסביבה כדי לשמור על 90% לחות.
    6. מוציאים את צלחת הפטרי בעלת תחתית הזכוכית המכילה תאי מטרה מהאינקובטור של תרבית הרקמה ומכניסים אותה לתא.
    7. החל את מהדק המתכת של תא הסביבה כדי לתקן את מיקום צלחת פטרי.
      הערה: צלחת פטרי חייבת להיות מהודקת היטב בתא מכיוון שהכוח המגנטי עשוי להזיז את המנה אם היא לא מהודקת.
    8. סגור את מכסה החדר.
  2. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה
    1. מטב את גודל חור הסיכה: חור הסיכה חוסם את הפוטונים שאינם ממוקדים. גודל חור סיכה גדול יותר מניב יותר פוטונים שאינם ממוקדים, אך תמונה בהירה יותר. גודל חור סיכה קטן יותר מניב תמונה ממוקדת ועמומה יותר. הקפד למטב את גודל חור הסיכה כדי לקבל תמונות קונפוקליות במיקוד עם יחס אות לרעש המתאים.
    2. מטב את עוצמת הלייזר: עוצמת הלייזר קובעת את עוצמת העירור ובכך את עוצמת הפליטה של האור. עוצמת הלייזר הנמוכה מעניקה יחס אות לרעש נמוך. עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום להלבנת תמונות. כוונן את עוצמת הלייזר בהתאם.
    3. מטב את גודל הצעד והצעדים: צעדים וגודל צעדים קובעים כמה תמונות יצלמו בערימת Z. גדלי צעדים קטנים יותר וצעדים רבים יותר יגדילו את רזולוציית Z-stack אך גם יגדילו את הלבנת התמונות. בניסוי זה נעשה שימוש בגודל צעד של 1 מיקרומטר עבור התאים עם ~ 15 מיקרומטר גובה התא.
    4. מטב את זמן החשיפה: זמן החשיפה קובע כמה זמן ייחשף התא ללייזר העירור. זמן חשיפה נמוך יקטין את יחס האות לרעש. זמן חשיפה גבוה יגרום להלבנת תמונות. בניסוי זה נעשה שימוש בזמן חשיפה של פריים אחד לכל 4 שניות.
    5. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה: שנה אחד מארבעת הפרמטרים באופן איטרטיבי ושמור על עקביות הפרמטרים האחרים. בכל פעם, מדוד את יחס YAP N/C של כל תמונה והשווה את השינוי ביחס YAP N/C כדי לקבוע את רמת הלבנת התמונות. חזור על תהליך האופטימיזציה עד להשגת איזון בין יחס אות לרעש, מהירות הדמיה והלבנת תמונות.
    6. הגדר את תצורות ההדמיה באמצעות פרמטרי ההדמיה הממוטבים להגדרות הדמיה מהירות יותר במהלך הניסויים.
      הערה: התצורות ששימשו במחקר זה מתוארות בסעיף 5.3 של פרמטרי ההדמיה. כדי למטב את פרמטרי ההדמיה של תצורות בסעיף 5.3, השתמש באותה שיטה כמו בשלב 5.2.5.
  3. יישום כוח קטן והדמיה קונפוקלית
    הערה: מיקרוסקופ Nikon Ti2-E שימש להדמיה במחקר זה, ושלבים מפורטים לרכישת תמונה מובאים להלן.
    1. פתח את המיקרוסקופ ההפוך. פתח את יישום התוכנה Elements.
    2. הגדר תצורה magnetic_find. בדוק רק ערוץ FITC. הגדר PMT HV = 70, היסט = 0, עוצמת לייזר = 10. הגדר את מהירות הסריקה לפריים אחד לכל 2 שניות על ידי לחיצה על לחצן 1/2 . הגדר את גודל חור הסיכה ל- 1.2 AU על-ידי לחיצה על לחצן 1.2 A.U. . תצורה זו תשמש בשלב 5.3.5.
    3. הגדר תצורה magnetic_YAP_Nucleus. בדוק את ערוץ FITC. הגדר PMT HV = 70, היסט = 0, עוצמת לייזר = 10. הגדר את מהירות הסריקה לפריים אחד לכל 4 שניות על ידי לחיצה על לחצן 1/2 . הגדר את גודל חור הסיכה ל- 1.2 AU על-ידי לחיצה על לחצן 1.2 A.U. . כדי לדמות את גבול הגרעין ואת עוצמת הכתם הגרעיני, בדוק את ערוץ Cy5. הגדר PMT HV = 70, היסט = 0, עוצמת לייזר = 10. גודל חור הסיכה מותאם להדמיית YAP תלת-ממדית. אל תלחץ שוב על לחצן 1.2 A.U . לאחר בדיקת ערוץ Cy5. תצורה זו תשמש בשלב 5.3.7.
    4. הפעל DIA דרך רכיבים במידת הצורך. פתח את SpinView, השתמש בשדה בהיר והתאם את המיקוד של האובייקט כדי לקבל תמונה ברורה של תאים במיקוד. השתמש במטרה של פי 10 כדי למצוא תאים בודדים מרובים מתאימים בשלושה תנאים: עם מיקרוב יחיד בפנים, עם מיקרובים מרובים בפנים, וללא מיקרובים בפנים. עבור למטרה 40x. תן שם לעמדה זו עם מספר המיקום המתאים.
    5. פתח רכיבים. לחץ על magnetic_find. לחץ על הלחצן הסר אינטרלוק.
    6. לחץ על סרוק והתאם את מיקום Z של מישור המוקד. לחץ על הלחצנים העליון והתחתון כדי להגדיר את הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z של התאים שנבחרו. הפסק לסרוק על-ידי לחיצה נוספת על סרוק.
    7. עבור לתצורת magnetic_YAP_Nucleus . הגדר את שם הקובץ כ - before_small_force.nd2. לחץ על הפעלה כפתור עם מחסנית Z מוקלטת.
    8. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט מטה ל-46 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר. בדוק את הסרטון כדי לוודא שמיקרובים מראים תזוזה המושרה על ידי כוח מגנטי.
    9. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7; הגדר את שם הקובץ ל- after_small_force.nd2.
    10. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. לאחר מכן, פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט עד 120 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר.
    11. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7 והגדר את שם הקובץ ל- before_large_force.nd2.
  4. יישום כוח גדול והדמיה קונפוקלית
    1. הסר את המכסה של תא הסביבה כדי לאפשר למגנט להגיע ל-13 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי.
    2. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט עד 13 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר. בדוק את הסרטון כדי לוודא שמיקרובים מראים תזוזה המושרה על ידי כוח מגנטי.
    3. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7 והגדר את שם הקובץ ל- after_large_force.nd2.
    4. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. לאחר מכן, פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט עד 120 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר.
    5. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7; הגדר את שם הקובץ ל- retract_large_force.nd2.
    6. סגור את המכסה של תא הסביבה.
  5. חזור על שלבים 5.2 ו- 5.3 עבור שדות תצוגה מרובים כדי לקבל נתונים נוספים במידת הצורך.

6. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

  1. כימות יחס YAP N/C
    1. פתח את פיג'י אימג'יי. פתח את תמונות ה- .nd2 שצולמו בשלב 5.
    2. לחץ על נתח > הגדר מדידות. אזור בדיקה, צפיפות משולבת, ערך אפור ממוצע ומתארי צורות.
    3. השתמש בערוץ Cy5 כדי לזהות את הגרעין. לחצו על ' בחירות חופשיות' כדי להשתמש בכלי הבחירה החופשית כדי ליצור קווי מתאר של הגרעין. כמו כן, בדוק את המאקרו של המסכה הגרעינית האוטומטית ב- ImageJ (ראה טבלת חומרים).
    4. לחץ על נתח > מדידה בערוץ FITC. הערך הנמדד של הממוצע הוא עוצמת YAP גרעינית ממוצעת DN.
    5. השתמש בערוץ Cy5 כדי לזהות את הגרעין. השתמש בערוץ FITC כדי לזהות את התא. לחצו על 'בחירות חופשיות' כדי להשתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לבחור אזור מעניין בתוך הציטופלסמה ולהימנע מהמיקרוב המגנטי. אסור שאזור עניין זה יכלול את הגרעין.
    6. לחצו על 'נתח > מדידה ' בערוץ FITC. הערך הנמדד של הממוצע הוא עוצמת YAP הציטופלסמית הממוצעת DC.
    7. חישוב יחס YAP N/C = D N / DC.
  2. כימות הצורה הגרעינית ועוצמת הכתמים הגרעיניים המנורמלים
    1. פתח את פיג'י אימג'יי. פתח את תמונות ה- .nd2 שצולמו בשלב 5.
    2. לחץ על נתח > הגדר מדידות. אזור בדיקה, צפיפות משולבת, ערך אפור ממוצע ומתארי צורות.
    3. השתמש בערוץ Cy5 כדי לזהות את הגרעין. לחצו על ' בחירות חופשיות' כדי להשתמש בכלי הבחירה החופשית כדי ליצור קווי מתאר של הגרעין.
    4. לחץ על נתח > מדידה בערוץ Cy5. הערך הנמדד של הממוצע הוא עוצמת הכתם הגרעיני. הערך הנמדד של Circ. היא מעגליות גרעינית.
    5. כדי להשוות את עוצמת הכתם הגרעיני במצב כוח שונה, כל עוצמת הכתם הגרעיני מחולקת בעוצמת הכתם הגרעיני ב-"before_small_force.nd2" כדי ליצור את עוצמת הכתם הגרעיני המנורמלת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תכנון מכשיר הנעת מגנט ויישום כוח מגנטי
כדי להפעיל כוח על הגרעין דרך המיקרובים המגנטיים, תוכנן ונבנה מכשיר הנע מגנט כדי לשלוט במיקום המרחבי של המגנט. המכשיר הנע באמצעות מגנט מכיל מסגרת מרכזית, שלוש ידיות ומסילות להזזת המגנט המחובר בכיוונים x, y ו-z באופן עצמאי ברזולוציה המרחבית של 1.59 מ"מ למחזור (איור 1A). ברגע שהמגנט מועבר קרוב למיקרובים של 7 מיקרומטר המועברים לתאים (איור 1B), הוא מושך באופן מגנטי את המיקרובים ומפעיל כוח על הגרעין (איור 1C). כיוון הכוח והגודל נשלטים על ידי המיקום היחסי בין המגנט למיקרובים.

במאמר זה הופעלו שני סדרי גודל שונים של כוח על המיקרובים: (1) כוח קטן יחסית כאשר המגנט הוצב 46 מ"מ מעל התא; ו-(2) כוח גדול יחסית כאשר המגנט הוצב 13 מ"מ מעל התא. הכוח המגנטי המופעל על המיקרוב F ניתן לחישוב על ידי משוואה59: Equation 1, כאשר Nd הוא גורם הדמגנטיזציה (0.33 עבור כדור), μ היא החדירות בריק (6.3 × 10-3 H/m עבור ברזל), Vp הוא נפח המיקרוב (178 μ m 3 עבור מיקרובאד 7 מיקרומטר), ו-H היא עוצמת השדה המגנטי עם היחידה A/m. H פרופורציונלית לצפיפות השטף המגנטי B עם יחידת טסלה. מאחר שהכוח המגנטי הפועל על מיקרוב יחיד של 7 מיקרומטר היה צפוי להיות קטן ביותר וקשה לזיהוי על ידי מתמר כוח, צפיפות השטף המגנטי B כייחוס נמדדה כדי להצביע על גודל הכוח המגנטי המופעל על המיקרובים. חיישן הול הוצג במיקום של תחתית צלחת פטרי כדי למדוד את צפיפות השטף המגנטי, והמגנט הוצב במרחק של 13 מ"מ או 46 מ"מ מתחתית צלחת פטרי. מאחר שהמיקרובים של 7 מיקרומטר משפיעים על השדה המגנטי, צפיפות השטף המגנטי נמדדה עם ובלי מיקרובים. ללא קשר לנוכחותם של חיידקי 7 מיקרומטר, התקבלה אותה צפיפות שטף מגנטי: B = 60.1 mT במרחק של 13 מ"מ ו- B = 3.7 mT במרחק של 46 מ"מ. מדידה זו מראה כי ההשפעה של 7 מיקרובים מיקרוביים על השדה המגנטי שנוצר על ידי המגנט הגלילי בקוטר 12.7 מ"מ וגובה 12.7 מ"מ (ראו טבלת החומרים) לא הייתה ניתנת לזיהוי על ידי חיישן Hall ששימש במחקר זה. עם זאת, צפיפות השטף המגנטי במקרה עם מרחק של 13 מ"מ הייתה גבוהה בערך פי 16 מזו עם מרחק של 46 מ"מ. כיול ניסיוני של הכוח המגנטי מתואר בסעיף הבא (איור 6).

העברת מיקרובים מגנטיים לתוך הציטופלסמה
12 שעות לאחר זריעת תאים על צלחת פטרי בעלת תחתית הזכוכית, 7 מיקרובים מתווספים למדיום התרבית. מיקרובים מופנמים באופן ספונטני על ידי התאים. מאחר שהמיקרובים אינם פולטים פלואורסצנציה תחת עירור לייזר בערוץ FITC או Cy5, ניתן לזהות את מיקומם של המיקרובים המופנמים על ידי מיקום החלול הכהה באמצעות הדמיה קונפוקלית של פלואורסצנציה של YAP וגרעין. גם תמונות דו-ממדיות וגם תמונות תלת-ממדיות מראות שהמיקרובאד נמצא בציטופלסמה בעודו מחוץ לגרעין (איור 2).

רמות ההפנמה של מיקרובים לתוך התאים תלויות במשך התרבית המשותפת של תאים ומיקרובים. לפיכך, התאים סווגו לשלושה סוגים לפי כמות המיקרובים המופנמים – ללא מיקרובים, מיקרובים בודדים ורב-מיקרובים (איור 3A). ב-7 שעות של תרבית משותפת, 62% מהתאים לא הפנימו שום מיקרוב, 15% מהתאים הפנימו מיקרוביאד אחד, ו-23% מהתאים הפנימו מולטי-מיקרובים (מספר התאים הכולל = 13). ב-12 שעות של תרבית קו-תרבית, 53% מהתאים לא הפנימו שום מיקרוב, 26% מהתאים הפנימו מיקרוביאד יחיד, ו-21% מהתאים הפנימו מולטי-מיקרובים (מספר כולל של תאים = 62). ב-24 שעות של תרבית משותפת, 20% מהתאים לא הפנימו שום מיקרובאד, 28% מהתאים הפנימו מיקרובאד יחיד, ו-53% מהתאים הפנימו מיקרובים מרובים (מספר התאים הכולל = 40) (איור 3B).

מיקרובים בציטופלסמה אינם משפיעים על הצורה הגרעינית ועל פעילות YAP
כדי לבחון את השפעת ההפנמה של מיקרובים על הצורה הגרעינית ועל פעילות החלבונים, הצורה הגרעינית כומתה תחילה על ידי מעגליות ופעילות YAP על ידי יחס YAP N/C, בהתאמה. מעגליות מחושבת על ידי מעגליות = 4μ (שטח / היקף2). הצעדים המפורטים לכימות יחס YAP N/C תוארו בפרסום קודם60. בקצרה, יחס YAP N/C חושב על ידי חלוקת עוצמת YAP הממוצעת בגרעין בעוצמת YAP הממוצעת בציטופלסמה. בהתחשב באפשרות שתרבית משותפת של מיקרובים ותאים יכולה להשפיע על הצורה הגרעינית גם אם לא מופנם מיקרוב, התאים ללא תרבית משותפת (נקודות שחורות, בקרה #1, מעגליות = 0.806 ± 0.037, n = 20), תאים בתרבית משותפת עם מיקרובים אך ללא הפנמה (נקודות אפורות, בקרה #2, מעגליות = 0.806 ± 0.035, n = 22), תאים המפנימים מיקרובאד יחיד (נקודות אדומות, מיקרוב יחיד, מעגליות = 0.793 ± 0.048, n = 15), ותאים שהפנימו מיקרובים מרובים (נקודות כחולות, מיקרובים מרובים, n = 7) (איור 3C). התוצאה מראה שמבין כל ארבע הקבוצות שנבדקו, למעגליות הגרעינית לא היה הבדל משמעותי (איור 3C).

לאחר מכן, כדי לבחון אם יחס YAP N/C מושפע מהפנמה של מיקרובים, התאים שגודלו בתרבית משותפת עם מיקרובים אך ללא הפנמה (נקודות אפורות, בקרה #2, יחס YAP N/C = 1.155 ± 0.074, n = 35) הושוו רק עם התאים עם הפנמה של מיקרובים בודדים או מרובי מיקרובים (נקודות אדומות, תא עם מיקרובים, יחס YAP N/C = 1.140 ± 0.078, n = 36) בשעהה-12 של התרבות המשותפת (איור 3D). התאים ללא תרבית משותפת לא הושוו מכיוון שהמנה עם המיקרובים מראה צפיפות תאים נמוכה יותר, מה שעשוי להשפיע על יחס YAP N/C12. התוצאה אינה מראה הבדל משמעותי (ערך p = 0.667) ביחס YAP N/C בין שתי הקבוצות, מה שמצביע על כך שהפנמת המיקרובים אינה משפיעה על פעילות YAP (איור 3D).

כוח מגנטי מעוות את הגרעין
ראשית, העיוות של הגרעין מוצג. העיוות של הגרעין נגרם על-ידי כוח הדחיסה שמפעילים המיקרובים (איור 4A ואיור 4A1-3) בתאים שמכילים שלד ציטוסקולרי. נתונים אלה (כלומר, הגרעין המעוות על ידי דחיסת המיקרוב) תומכים בכך שהמיקרוב אכן מפעיל כוח על הגרעין בציטופלסמה הצפופה. סרטון שדה בהיר המציג את תהליך יישום הכוח כלול בחומר התוסף (סרטון משלים 1). שנית, מכיוון שייתכן שהמיקרובאד מפעיל בו זמנית כוח על השלד הסובב ומעוות את הגרעין בעקיפין, ניסויי הדחיסה חזרו על עצמם בתאים שיש להם את חוטי האקטין המשובשים (טיפול ב- Cyto D (2.5 μM, 1 h); איור 4B). המחקר הזה מראה שחוטי האקטין אכן עוברים דה-פולימריזציה (איור 4B), והגרעין מעוות על-ידי המיקרובים (איור 4B1-3). נתונים אלה תומכים בכך שהמיקרובים מפעילים כוח ישירות על הגרעין בהיעדר שלד ציטוסקולרי שזורים זה בזה. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי הפרוטוקולים והכלים יכולים להפעיל כוח ישירות על הגרעין.

בקרה מרחבית וזמנית של מיקרובים מגנטיים תוך-תאיים
כדי להשיג שליטה מרחבית על המיקרובים, נעשה שימוש בזוג מגנטים כדי להזיז את המיקרוב ולשלוט במיקום הכניסה שלו אל הגרעין (איור 5A). ניתן להזיז את החרוז רק עם תזוזה של עד 2.2 מיקרומטר (איור 5A1-4), אך הוא יכול להחיל באופן גמיש כניסה על הגרעין במקומות מתאימים. שלד האקטין שמסביב עשוי להגביל את תנועתם של מיקרובים. לכן, שלד האקטין הופרע על ידי טיפול Cyto D (2.5 μM, 1 h), ומיקום המיקרובים עבר מניפולציה אך הראה תוצאות דומות. לכן, ניתן להעלות השערה: המיקרוב עשוי להיקשר פיזית/כימית לגרעין ולאברונים אחרים הסובבים אותו בציטופלסמה, מה שמגביל את התנועה המרחבית הגדולה שלו (>2.2 מיקרומטר).

כדי להשיג שליטה מרחבית על המיקרובים, נעשה שימוש בזוג מגנטים ששולטים במיקרובים כדי להפעיל ולשחרר את הכוח פעמיים (עם גודל כוח שונה) באותו מיקום של הגרעין (איור 5B ואיור 5B1-B4). משך הזמן הנוכחי עבור מחזור אחד של יישום כוח ושחרור הוא 12 שניות. מהירות השליטה הזמנית נקבעת על ידי מהירות הפעולה של מעביר XYZ.

כיול הכוח המגנטי
הכוח המופעל על ידי חרוזים הוערך על ידי מדידה ניסיונית של הכוח המופעל על ידי מיקרוסקופיית כוח אטומי מכוילת (AFM) הגורמת לעיוות דומה של הגרעין. באופן ספציפי, שלד האקטין מומס לראשונה על-ידי CytoD (2.5 μM; שעה אחת, איור 4B) מאחר שה-AFM מפעיל כוח על פני השטח האפיקליים של התא, והסרת קליפת האקטין ושלד הציטוסקלטון מאפשרת מגע ישיר יותר בין קצה ה-AFM לגרעין התא. התאים שקליפת האקטין והשלד הציטוסקולרי שלהם מומסים חיים על סמך ההשוואה של הצורה הגרעינית ועוצמת הכתמים הגרעיניים עם התאים הבריאים (איור משלים 1). שנית, קצה ה-AFM הלא-פונקציונלי (כדורי למחצה, רדיוס = 5 מיקרומטר) בעל גודל וצורה דומים לאלה של המיקרובים, שימש להסטת המשטח האפיקלי של התא באופן מבוקר כוח ולרכוש בו-זמנית תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות של התא וגופי הגרעין (איור 6A). גודלו של כוח הדחיסה מ-0.8 nN ל-2.0 nN נבחר משום שעל פי הספרות24, כוח בסדר גודל של 1.5 nN היה ידוע כמעוות מספיק את הגרעין. שלישית, העיוות הרגיל של הגרעין שנגרם על ידי כניסת AFM נמדד באמצעות ניתוח הדמיה כמותי. כמו כן, התקבלה עקומת הכיול המספקת את הקשר הכמותי בין תזוזת כוח AFM (איור 6B). רביעית, כוח דחיסה הופעל על פני השטח הצדדיים של הגרעין על ידי שליטה במיקרו-חרוזים בעלי גודל וצורה דומים (רדיוס = 7 מיקרומטר; איור 6C), והעיוות של קרום הגרעין נמדד באמצעות ניתוח הדמיה. הכוח המופעל באמצעות חרוזים מוערך על סמך יחסי תזוזת הכוח של AFM.

לדוגמה, באיור 6C, העיוות של הגרעין שנגרם על-ידי מיקרובים מגנטיים (קוטר = ~7 מיקרומטר) ב'כוח גדול' הוא בסביבות 1.5 מיקרומטר. באיור 6D, קצה AFM שיש לו גשושית חצי-כדורית של 5 מיקרומטר שימש כדי להסיט את התא מעל הגרעין כדי להשיג עיוות גרעיני של 1.5 מיקרומטר. הכוח המקביל שנרשם על ידי AFM הוא 1.4 nN. לפיכך, הכוח המופעל על ידי המיקרובים מוערך ב~1.4 nN. בעקבות אותה גישה, הכוח המגנטי ב'כוח קטן' מכויל כ-0.8 nN, והוא גרם לכניסה גרעינית של 0.4 מיקרומטר.

מחקר זה סבור כי הכוח שנמדד על-ידי AFM יכול לייצג את הכוח המופעל על-ידי מיקרובים בהתבסס על ההנחות הבאות: (1) הנוקשות של הגרעין בתוך תאים שונים דומה. (2) התכונות המכניות של הגרעין אינן תלויות באתרים הגרעיניים שעליהם הופעלה הכניסה. הכוח המגנטי מופעל אופקית על הצדדים הצדדיים של הגרעין, בעוד שכוח ה- AFM מופעל אנכית על הצדדים האפיקליים של הגרעין. ההבדל המכני ביניהם מניח זניח. (3) בניסויי AFM, הגשושית מפעילה כוח ישירות דרך קרום התא ושלד הציטוסקלטון על הגרעין. לאחר שיבוש חוטי האקטין, הכוח המופעל על ידי AFM על הגרעין דומה לכוח המופעל על ידי מיקרובים על הגרעין, למרות שהממברנה עדיין ממוקמת בין גשושית ה-AFM לגרעין במקרה הקודם.

כוח מגנטי גורם לשינוי ביחס YAP N/C
כדי להוכיח שהכוח המגנטי המופעל על המיקרובים יכול לעוות את הגרעין ולגרום לטרנסלוקציה של YAP, יחס YAP N/C של התאים עם הפנמת המיקרובים כומת בשלושה שלבים: (1) לפני הפעלת הכוח, (2) לאחר הפעלת הכוח, ו-(3) לאחר שחרור הכוח. חלק מהתאים הראו שינוי בצורה הגרעינית וביחס YAP N/C כאשר הכוח הופעל או שוחרר (איור 7A,C). את שינויי העוצמה ב-YAP ניתן לייחס על ידי שני מנגנונים אפשריים: (1) חלבוני YAP-FP מבצעים טרנסלוקציה מהציטופלסמה לגרעין לאחר הפעלת כוח. במקרה זה, צביעה גרעינית לא אמורה להראות שינויים באות. עוצמת הכתמים הגרעיניים לא צריכה להשתנות במידה רבה; (2) חלבוני YAP-FP אינם מבצעים טרנסלוקציה לאחר הפעלת כוח. השינויים הנצפים בעוצמת YAP נובעים מהשינוי בנפח הגרעיני המושרה בכוח ומהשינוי בריכוז YAP-FP כתוצאה מכך. במקרה זה, עוצמת הצביעה הגרעינית אמורה להשתנות במגמה דומה לעוצמת הגרעין של YAP מכיוון שגם ריכוז צבע ההכתמה משתנה כאשר נפח הגרעין משתנה. לכן נמדדה עוצמת הכתם הגרעיני מהתעלה האדומה (עירור: 650 ננומטר; פליטה: 681 ננומטר). העוצמה משתנה ב-YAP בתעלה הירוקה, אך אין שינויים בעוצמה בכתם הגרעין בתעלה האדומה. לפיכך, סביר להניח שהמנגנון הראשון קיים (איור 7B). באופן קולקטיבי, התוצאות מראות כי העיוות הגרעיני המושרה על ידי הכוח המגנטי מפעיל טרנסלוקציה של YAP.

לאחר מכן, השינוי נטו ביחס YAP N/C כומת בשתי קבוצות תאים: (1) תאים ללא מיקרוביד מופנם (נקודות אפורות, בקרה, n = 9); ו-(2) תאים נבחרים עם מיקרובואידים מופנמים שמראים שינוי ביחס YAP N/C (נקודות ירוקות לכוח קטן, נקודות אדומות לכוח גדול, n = 11). בעוצמה של 0.8 nN, תאים עם מיקרובים מופנמים מראים שינוי ביחס YAP N/C נטו = -0.030 ± 0.029, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי יחס YAP N/C נטו = -0.003 ± 0.012, n = 9. בכוח של 1.4 nN, תאים עם מיקרובואידים מופנמים מראים שינוי ביחס YAP N/C נטו = 0.011 ± 0.040, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי ביחס YAP N/C נטו = 0.005 ± 0.005, n = 9 (איור 8A). בכוח של 0.8 nN, תאים עם מיקרובואידים מופנמים מראים שינוי מוחלט ביחס YAP N/C נטו = 0.057 ± 0.017, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי יחס YAP N/C נטו = 0.021 ± 0.007, n = 9. ההפרש משמעותי (ערך p = 0.0093, **). בעוצמה של 1.4 nN, תאים עם מיקרובים מופנמים מראים שינוי מוחלט ביחס YAP N/C נטו = 0.070 ± 0.020, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי יחס YAP N/C נטו = 0.010 ± 0.003, n = 9. ההפרש הוא משמעותי (ערך p = 0.0007, ***) (איור 8B). יחד, תוצאות אלה מאששות כי הכוח המגנטי המופעל על המיקרובים בתוך הציטופלסמה אכן יכול לגרום לטרנסלוקציה של YAP ולשנות את יחס YAP N/C.

Figure 1
איור 1: תכנון המכשיר הנע המגנטי והפעלת הכוח הסכמטי בתא על-ידי מיקרובים מגנטיים . (A) סכמת תלת-ממדית של המכשיר המיושמת כדי להחזיק את המגנט ולהזיז אותו בכיוונים x, y ו-z. המכשיר מורכב מבסיס ברוחב 241.3 מ"מ וגובה 104.1 מ"מ, שתי ידיות, מוט ומגנט. הידיות יהיו מפוזרות בכיוון סיבוב הפעולה הנכון, אשר יספק תנועה בכיוון המתאים. המגנט יוריד קרוב יותר/יוגבה עוד יותר לצלחת כדי להפעיל כוח מגנטי עם גודל וכיוון שונים על מיקרובים מגנטיים. (B) דוגמה לתמונה ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של מיקרובאד ברזל בגודל 7 מיקרומטר. (C) מיקרובים מגנטיים המועברים בתוך הציטופלסמה יכולים להפעיל כוח על האברונים כגון הגרעין כאשר מופעל שדה מגנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות המראות מיקרובאד מגנטי (חלול שחור מחודד על ידי חץ כחול) מופנם לתוך התא (מסומן על-ידי YAP) ומחוץ לגרעין . (A) חתך X-Y של תא של YAP (ירוק), גרעין (אדום) ושדה בהיר. (B) שחזור תלת-ממדי של התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מיקרובים המופנמים על-ידי התאים אינם משפיעים על הצורה הגרעינית ועל יחס YAP N/C. (A) תמונות מייצגות של שדות בהירים ופלואורסצנטיות של תאים ללא מיקרובאד, מיקרובאד יחיד והפנמה מרובת מיקרובים. חיצים כחולים מציינים את מיקומם של מיקרובים בתוך הציטופלסמה. (B) ב-7 שעות (n = 13), 12 שעות (n = 62) ו-24 שעות (n = 40) של תרבית משותפת, אחוז התאים אינו מראה מיקרובאד, מיקרובאד יחיד והפנמה מרובת מיקרובים. (C) מעגליות גרעינית אינה מראה הבדל משמעותי בין תאי בקרה לבין תאים עם הפנמת מיקרובים. בקרה #1 (ללא תרבית משותפת של מיקרובים): מעגליות = 0.806 ± 0.037, n = 20; בקרה #2 (עם תרבית משותפת של מיקרובים, ללא הפנמת מיקרובים): מעגליות = 0.806 ± 0.035, n = 22; הפנמה של מיקרובאד יחיד: מעגליות = 0.793 ± 0.048, n = 15; הפנמה מרובת מיקרובים: מעגליות = 0.780 ± 0.061, n = 7. (D) יחס YAP N/C אינו מראה הבדל משמעותי (ערך p = 0.667) בין תאי בקרה (עם תרבית משותפת של מיקרובים, ללא הפנמת מיקרובים, יחס YAP N/C = 1.155 ± 0.074, n = 35) לבין תאים עם הפנמת מיקרובים (יחס YAP N/C = 1.140 ± 0.078, n = 36). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הפעלת כוח ישיר על גרעין עם ובלי חוטי אקטין. (A) תאים מראים חוטי אקטין (צהובים). (א1) תמונה של הגרעין כאשר לא מופעל כוח. (א2) תמונה של הגרעין לאחר הפעלת הכוח. (א3) תמונת חפיפה של הגבול הגרעיני לפני ואחרי הפעלת הכוח מראה כניסה גרעינית. (B) תאים מראים חוטי אקטין משובשים (צהובים) לאחר טיפול Cyto D (2.5 μM, שעה אחת). (ב1) תמונה של הגרעין כאשר לא מופעל כוח. (ב2) תמונה של הגרעין לאחר הפעלת הכוח. (ב3) תמונת חפיפה של הגבול הגרעיני לפני ואחרי הפעלת הכוח מראה כניסה גרעינית עם שלד האקטין המופרע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: בקרה מרחבית וזמנית של מיקרובים מגנטיים תוך-תאיים . (A) זוג מגנטים שולט מרחבית במיקרוב המגנטי. (א1) תמונת שדה בהיר של גבול התא (קו ירוק), גבול גרעיני (קו אדום) ומיקרוב מגנטי (קו צהוב) במיקום 1. (א2) מיקרובאד מגנטי מכניס גרעין בעמדה 1. (א3) מיקרוב מגנטי מועבר למצב 2 (קו צהוב). מיקום 1 מוצג כהפניה (קו מקווקו צהוב). (א4) מיקרוביד מגנטי מכניס גרעין בעמדה 2. (B) זוג מגנטים שולט באופן זמני במיקרוב מגנטי. (ב1) תמונת שדה בהיר של תא ללא כוח המופעל בנקודת זמן I. (B2) מיקרובאד מגנטי מפעיל כוח על הגרעין בנקודת זמן II. (ב3) מיקרובאד מגנטי משחרר את הכוח מהגרעין בנקודת זמן III. (ב4) מיקרוב מגנטי מפעיל כוח גדול יותר על הגרעין בנקודת הזמן הרביעית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
תרשים 6. כיול הכוח המופעל על ידי מיקרובים על הגרעין באמצעות כניסת AFM. (A) איור סכמטי של תהליך הכיול. מיקרובאד מגנטי מפעיל דחיסה אופקית על הגרעין (משמאל), ובדיקת AFM נכנסת אנכית על הגרעין. (B) כוח כניסה AFM לעומת דפורמציה גרעינית. (C) תמונה מייצגת של דפורמציית גרעין (1.5 מיקרומטר) לפני ואחרי הפעלת כוח על ידי מיקרובאד מגנטי. (D) תמונה מייצגת של עיוות גרעין דומה (1.5 מיקרומטר) לפני ואחרי כניסת AFM עם כוח 1.4 nN. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: נתונים מייצגים המראים שינוי ביחס YAP N/C מושרה על-ידי יישום כוח מגנטי ושחרורו . (A) חתך X-Y של YAP (ירוק) וגרעין (אדום) תמונה פלואורסצנטית של התא ללא כוח, כוח מופעל וכבריח. במצב כוח על, עוצמת YAP ציטופלסמית יורדת במיקום המכוון על ידי חץ צהוב בעוד שעוצמת YAP גרעינית עולה. יחס YAP N/C עולה. (B) יחס YAP N/C עולה כאשר הכוח מופעל (מ-1.0791 ל-1.2327) ויורד כאשר הכוח כבוי (מ-1.2327 ל-1.1548). עוצמת הכתם הגרעיני המנורמל מראה שינוי קל עם הפעלת הכוח (1.00117) ושחרור (0.95578). (C) חתך X-Z של YAP (ירוק) ותמונת גרעין (אדום) של התא ללא כוח, כוח מופעל וכוח כבוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: שינוי ביחס YAP N/C המושרה על-ידי הפעלת כוח מגנטי. (A) בכוח של 0.8 nN, תאים עם מיקרובואידים מופנמים מראים שינוי ביחס YAP N/C נטו = -0.030 ± 0.029, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי יחס YAP N/C נטו = -0.003 ± 0.012, n = 9. בכוח של 1.4 nN, תאים עם מיקרובואידים מופנמים מראים שינוי ביחס YAP N/C נטו = 0.011 ± 0.040, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי יחס YAP N/C נטו = 0.005 ± 0.005, n = 9. (B) בעוצמה של 0.8 nN, תאים עם מיקרובידים מופנמים מראים שינוי מוחלט ביחס YAP N/C נטו = 0.057 ± 0.017, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי יחס YAP N/C נטו = 0.021 ± 0.007, n = 9. ההפרש משמעותי (ערך p = 0.0093, **). בעוצמה של 1.4 nN, תאים עם מיקרובים מופנמים מראים שינוי מוחלט ביחס YAP N/C נטו = 0.070 ± 0.020, n = 11; תאי בקרה מראים שינוי יחס YAP N/C נטו = 0.010 ± 0.003, n = 9. ההבדל הוא משמעותי (ערך p = 0.0007, ***) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: צורה גרעינית ועוצמת צביעה גרעינית. (A) ללא טיפול Cyto D, (B) עם טיפול Cyto D ו-(C) תא מת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרטון משלים 1: סרטון שדה בהיר המציג את תהליך יישום הכוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפנמה של מיקרובים מגנטיים (סעיף 2.2) היא קריטית מאחר שמיקרובים חוץ-תאיים אינם יכולים להפעיל כוח ישירות על הגרעין. הפעלת כוח והדמיה (סעיף 5.3) הם שלבים קריטיים בניסוי זה, והכוח הדרוש כדי לעוות את הגרעין ולגרום לתוצאות ביולוגיות משמעותיות עשוי להיות תלוי בדגימה. ניתן להגדיל עוד יותר את עוצמת הכוח בניסוי זה (0.8 nN ו-1.4 nN) כדי להפעיל חישת מכנו-גרעינית בתאים פחות רגישים.

כדי להפעיל כוח מגנטי באופן כמותי עם תפוקה גבוהה, הפנמה של מיקרוב יחיד היא גישה אידיאלית. במחקר זה, אחוז התאים עם הפנמה של מיקרובאד יחיד היה דומה ב-12 שעות (26%) ו-24 שעות (28%), בעוד שהתאים ללא הפנמת מיקרובים היו גבוהים יותר ב-12 שעות (53%) מאשר ב-24 שעות (20%) (איור 3B). זה נחשב כי 12 שעות הוא הזמן האופטימלי עבור ניסוי יישום כוח כי יותר מיקרובים בודדים ניתן לכלול, ותאים ניתן לשלוט. עבור קווי תאים שונים וגדלי מיקרובים שונים, יש לבדוק את זמן התרבית המשותפת ואת ריכוז המיקרובים כדי לקבוע את התנאים האופטימליים המתאימים.

בניסויים, המיקרובים לא היו מצופים כדי להיקשר באופן ספציפי לגרעין. לכן, הכוח המועבר ישירות מהמיקרובים לגרעין הוא ככל הנראה רק דחיסה. התוצאות מראות שיחס YAP N/C עולה ומקטין את אוכלוסיית התאים (איור 8A). סיבה אפשרית אחת היא שהכוח המגנטי המופעל באמצעות המיקרובים עשוי לגרום לשינוי מתח חיובי או שלילי בתוך השלד המווסת את יחס YAP N/C כדי להגדיל או להקטין,בהתאמה 28. מחקרים קודמים מראים כי כוח דחיסה על הגרעין גורם לעלייה ביחס YAP N/C28. בניסויים עתידיים, על מנת לחקור את חישת הכוח הישירה של הגרעין, ניתן לשבש את השלד הציטוסקולרי כדי לחסל את העברת הכוח מהשלד אל הגרעין.

ישנם שני חסרונות פוטנציאליים בשיטות הנוכחיות. ראשית, בניסויים האלה, הנע התלת-ממדי (איור 1A) נוצל כדי להתאים את תנועת החרוזים, אשר מנוטרת על-ידי הדמיה קונפוקלית בזמן אמת ומטרתה להפעיל כוח דחיסה על הגרעין. עם זאת, בשל האופי החלקלק של קרום הגרעין והסביבה המורכבת בציטופלסמה, כיוון הכוח המופעל על ידי החרוזים עשוי שלא להיות דחיסה גרידא (כלומר, לא בניצב מוחלט לפני השטח של קרום הגרעין). פגם זה יכול לגרום להפעלת כוח גזירה על קרום הגרעין. שנית, המיקרובים הנוכחיים ששימשו במחקר זה אינם מצומדים לנוגדן כדי להיקשר לגרעין, מכיוון שהניידות המרחבית של החרוזים היא קריטית בניסוי הנוכחי כדי להדגים את היתרון של מפעיל מגנטי ללא מגע. לפיכך, השיטה הנוכחית אינה יכולה להחיל מתח על קרום הגרעין.

בעתיד, (1) חרוזים עם נוגדן אנטי-נספרין-1 יהיו מצומדים להיקשר באופן ספציפי עם הגרעין. זה יכול להבטיח את העברת הכוח הישירה והספציפית בין מיקרובים לחלבוני המטרה. (2) כיוון הכוח יכויל על ידי מניפולציה של המיקרוב המגנטי היחיד בהידרוג'ל רך המשובץ בחרוזים פלואורסצנטיים. ניתן להשתמש בתזוזה התלת-ממדית של חרוזים פלואורסצנטיים כדי לחשב את שדה העיוות של ההידרוג'ל ולקבוע את כיוון הכוח כפונקציה של השדה המגנטי המופעל. לאחר שהמיקרובאד נקשר כימית עם הגרעין, הפעלת כוח עם כיוון ידוע תקבע את סוג הכוח (מתח, דחיסה או גזירה). (3) ההדמיה התלת-ממדית של צביעה גרעינית תשמש לבניית מודל FEM של סימולציה תלת-ממדית של הגרעין. ניתן לאמת את כיוון הכוח על ידי השוואת העיוות הגרעיני לפני ואחרי הפעלת הכוח המגנטי.

הטכניקה הייחודית שפותחה במחקר זה מספקת מספר יתרונות פוטנציאליים: (1) בהשוואה לכניסה אנכית על ידי בדיקות AFM, מיקרובים מגנטיים יכולים להפעיל כוח בכל כיוון. תאים שגודלו בתרבית על משטחי מצע דו-ממדיים עשויים להיות בעלי התפלגות חלבונים הטרוגנית והתמצאות על המשטחים האנכיים והאופקיים שלהם של קרום הפלזמה ומעטפת הגרעין. הפעלת כוח אופקית עלולה לגרום לתגובות של חישת מכאנו, שלא נצפו קודם לכן. (2) ברגע שהמיקרובים מצופים באופן פונקציונלי כדי להיקשר לגרעינים, ניתן להפעיל כוחות דחיפה ומשיכה ישירות על הגרעין כדי להמשיך ולחקור את חישת המכנו הגרעינית הדיפרנציאלית בשל כיווני הכוח השונים. (3) על ידי שליטה בקשירה הספציפית של מיקרובים לחלבונים מסוימים במעטפת הגרעין, ניתן להבהיר מנגנונים שלא נחקרו בעבר של חישת כוח גרעיני. עדויות חדשות מראות כי הגרעין הוא ככל הנראה חיישן מכנו36, וחישת מכנו גרעינית היא הרגולטור הישיר ביותר של טרנסלוקציה YAP28. המנגנון של טרנסלוקציה YAP מוסדרת גרעינית נחקר באופן פעיל ומוצעים מספר מועמדים של חיישן מכנו או פרמטרים בגרעין, כולל גודל נקבוביות גרעיניות28, צורה גרעינית 25,61, קומפלקס LINC ומתח מעטפת גרעינית20. מניפולציה של המיקרובים המגנטיים פותחת את האפשרות לחקירה מפורטת של מנגנונים כאלה על ידי הפעלת כוח ישיר על התקנות המורכבות והמבוקרות של LINC של המתח והצורה של מעטפת הגרעין. (4) בנוסף להפעלת כוחות על הגרעין, מיקרובים מתאימים גם להיות מהונדסים להיקשר לצד הפנימי של קרום הפלזמה כדי לחשוף כיצד התחומים התוך-תאיים של חלבוני הממברנה והקומפלקס שלהם מגיבים לאותות ביופיזיקליים.

לסיכום, מאמר זה הדגים שיטה לפיה (1) מעבירה מיקרובי ברזל בגודל זעיר לציטופלסמה מבלי להשפיע על המורפולוגיה הגרעינית ועל תפקודי החלבון, (2) מפעילה כוח על הגרעין על ידי מיקרובים מגנטיים, ו-(3) מבצעת הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים במהלך הפעלת הכוח. כלים לא פולשניים אלה פותחים את האפשרויות למניפולציה אפיגנטית ישירה של אברונים בתאים בודדים, חקירה מבוססת הדמיה-סופר-רזולוציה של גרעין מכנוטרנסדוקציה, וחקירה מפורטת של ארגון כרומוזומים תלת-ממדיים מווסתים בכוח (בשילוב עם Hi-C: לכידת אישור כרומוזומים ברזולוציה גבוהה) ותכנות מחדש בהקשרים של פיזיולוגיה של התא ופתוביולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

פרויקט זה ממומן על ידי חבילת הסטארט-אפ של פרס UF Gatorade (X. T.), פרס הפיילוט של UFHCC (X. T. וד"ר דיטמר סימן), קרן הזרעים של UF Opportunity (X. T.), ותוכנית החוקרים של אוניברסיטת UFHCC (H. Y. Wang). אנו מעריכים מאוד את הדיונים האינטלקטואליים עם ד"ר ג'ונתן ליכט (UFHCC), ד"ר רולף רן (UFHCC), ד"ר כריסטופר וולפה (UFHCC), ד"ר בלנקה שארמה (BME), ד"ר מארק שפלאק (MAE ו- ECE), ד"ר דניאל פריס (BME), ד"ר מליסה סרנטינורנונט (MAE), ד"ר אשוק קומאר (MAE), ד"ר בנג'מין קסלובסקי (BME), ד"ר ברנט גילה (RSC), ד"ר פיליפ פנג (ECE), ד"ר גרגורי א. הודלה (BME), ד"ר סטיבן גיביזאני (OSSM), ד"ר יניסל קרוז-אלמיידה (CDBS), ד"ר רוג'ר פילינגים (CD-BS), ד"ר רוברט קאודל (OMS), ד"ר ג'ון נויברט (DN-OR), ד"ר ג'סטין היליארד (נוירוכירורגיה), ד"ר טיאן הא (אוניברסיטת הרווארד), ד"ר יוהואה טאן (האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג), ד"ר ג'סי L-S Au (המכון לפרמקולוגיה של מערכות כמותיות), ד"ר דיוויד האן (אוניברסיטת אריזונה), וצוות התמיכה של ניקון (ד"ר חוזה סראנו-ולז, לארי קורדון וג'ון אקמן). אנו אסירי תודה על התמיכה האפקטיבית של כל חברי מעבדות המחקר של טאנג, יאמאגוצ'י, שארמה, או, סימן וגואן וכל חברי הצוות של מחלקת UF MAE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 185 גרעין מכניוביולוגיה כוח מגנטי קריספר/Cas9 מכנוטרנסדוקציה חומר פעיל רך חלבון הקשור כן (YAP) הדמיה תפקודית פלואורסצנטית עיבוד הדמיה דיגיטלית אופטוגנטיקה אפיגנטיקה
שילוב של מפעיל כוח מגנטי תלת-ממדי והדמיה פלואורסצנטית רב-תפקודית לחקר גרעין המכנוביולוגיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter