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Biology

न्यूक्लियस मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए 3 डी चुंबकीय बल एक्ट्यूएटर और मल्टी-फंक्शनल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का संयोजन

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

यह अध्ययन साइटोप्लाज्म में वितरित चुंबकीय माइक्रोबीड्स के माध्यम से सेल नाभिक पर यांत्रिक बल को सीधे लागू करने और एक साथ लाइव-सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग का संचालन करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

Abstract

मेकेनोबायोलॉजी में एक मौलिक सवाल यह है कि जीवित कोशिकाएं सेल फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी के संदर्भ में बाह्य यांत्रिक उत्तेजनाओं को कैसे समझती हैं। माना जाता है कि बाह्य यांत्रिक उत्तेजनाओं की सेलुलर मेकेनो-संवेदना झिल्ली रिसेप्टर्स, संबंधित प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और साइटोस्केलेटन के माध्यम से होती है। मेकेनोबायोलॉजी में हालिया प्रगति से पता चलता है कि साइटोप्लाज्म में कोशिका नाभिक स्वतंत्र रूप से एक साथ यांत्रिक उत्तेजनाओं को समझ सकता है। हालांकि, सेल न्यूक्लियस यांत्रिक उत्तेजनाओं को कैसे समझता है, ट्रांसड्यूस करता है और प्रतिक्रिया करता है, इसकी एक यांत्रिक समझ की कमी है, मुख्य रूप से पारंपरिक उपकरणों द्वारा नाभिक यांत्रिकी तक पहुंचने और मात्रा निर्धारित करने में तकनीकी चुनौतियों के कारण। यह पेपर एक नए चुंबकीय बल एक्ट्यूएटर के डिजाइन, निर्माण और कार्यान्वयन का वर्णन करता है जो सेल नाभिक को सीधे विकृत करने के लिए सटीक और गैर-इनवेसिव 3 डी यांत्रिक उत्तेजनाओं को लागू करता है। CRISPR / Cas9-इंजीनियर कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, यह अध्ययन दर्शाता है कि यह उपकरण, उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ मिलकर, नाभिक विरूपण के कार्य के रूप में एकल कोशिकाओं में एक मेकेनो-संवेदनशील हां-संबद्ध प्रोटीन (वाईएपी) की वास्तविक समय की गतिशीलता के रहस्योद्घाटन को सक्षम बनाता है। इस सरल विधि में मेकेनोबायोलॉजी समुदाय में वर्तमान प्रौद्योगिकी अंतर को पाटने और न्यूक्लियस मेकेनोट्रांसडक्शन और सेल फ़ंक्शन के बीच संबंध में मौजूद ज्ञान अंतर के उत्तर प्रदान करने की क्षमता है।

Introduction

इस अध्ययन का उद्देश्य चुंबकीय एक्ट्यूएटर के संयोजन से न्यूक्लियस मेकेनोबायोलॉजी को स्पष्ट करने के लिए एक नई तकनीक विकसित और लागू करना है जो सीधे सेल न्यूक्लियस पर यांत्रिक बल लागू करते हैं और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी जो एक साथ संरचनात्मक और कार्यात्मक उपकोशिकीय परिवर्तनों को चित्रित करते हैं। कोशिकाएं ऊतक कठोरता 1,2,3,4, अंतरालीय द्रव दबाव और कतरनी तनाव 5,6,7, सतह टोपोलॉजी / ज्यामिति 8,9,10,11,12, और तनाव / संपीड़न तनाव 13,14 सहित बाह्य बायोफिज़िकल संकेतों को महसूस करती हैं। 15,16. बायोफिज़िकल संकेतों को जैव रासायनिक संकेतों में परिवर्तित किया जाता है और जीन अभिव्यक्ति और कोशिका व्यवहार के संभावित डाउनस्ट्रीम परिवर्तनों को ट्रिगर किया जाता है- एक प्रक्रिया जिसे मेकेनोट्रांसडक्शन 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 के रूप में जाना जाता है . मेकैनोट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं पर यांत्रिक बल को लागू करने के लिए असंख्य तकनीकों को विकसित किया गया है, जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी28, सेल स्ट्रेचिंग डिवाइस29, बायो-एमईएमएस (माइक्रो-इलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम) बल सेंसर 15,30,31, कतरनी रिओलॉजी 32, और स्टीरियो विजन सिस्टम33 . एक हालिया समीक्षा बाह्य यांत्रिक संकेतों को लागू करने और मेकेनोसेंसिंग34 के साथ हस्तक्षेप करने के दृष्टिकोण को सारांशित करती है। आज तक, इनमें से अधिकांश विधियां कोशिका प्लाज्मा झिल्ली पर बल लागू करती हैं, और कोशिकाएं सीधे इंटीग्रिन, कैडरिन, आयन चैनल और जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स जैसे झिल्ली रिसेप्टर्स के माध्यम से इन बाह्य बायोफिज़िकल संकेतों को प्राप्त करती हैं। इसके बाद, वे इंट्रासेल्युलर साइटोस्केलेटन और नाभिक को संकेत प्रेषित करते हैं। उदाहरण के लिए, मेकानो-सेंसिंग के संकेतक के रूप में हां से जुड़े प्रोटीन (वाईएपी) स्थानांतरण का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को कोशिका झिल्ली से सब्सट्रेट कठोरता और बाह्य तनाव के यांत्रिक संकेतों को समझने के लिए दिखाया जाता है और उन्हें वाईएपी साइटोप्लाज्म-टू-न्यूक्लियस ट्रांसलोकेशन 28,35 को प्रेरित करने के लिए साइटोस्केलेटन के माध्यम से नाभिक में संचारित किया जाता है।

हाल के सबूत बताते हैं कि सेल न्यूक्लियस स्वयं एक स्वतंत्र मेचानो-सेंसर 8,36,37 है। यह कोशिकाओं से काटे गए पृथक नाभिक पर किए गए प्रयोगों से साबित होता है, जहां यह पता चला था कि नाभिक सीधे उन पर लागू यांत्रिक बल के जवाब में अपनी कठोरता को अनुकूली रूप से बदलतेहैं। कई शारीरिक स्थितियों के दौरान, ट्यूमर और स्वस्थ कोशिकाओं दोनों में नाभिक बाह्य बायोफिज़िकल संकेतों को महसूस करते हैं और अपने यांत्रिक गुणों और असेंबलीको 38,39,40 बदलते हैं। उदाहरण के लिए, अतिरिक्तता पर, ट्यूमर कोशिकाओं की परमाणु कठोरता कम हो जाती है और 24 घंटे38 से अधिक समय तक कोमलता बनाए रखती है। सीमित अंतरालीय स्थान के माध्यम से प्रवास के दौरान, ट्यूमर कोशिकाओं के नाभिक अक्सर अपनी संरचनात्मक अखंडता को खो देते हैं और पुनर्प्राप्त करतेहैं। हालांकि, जिस तरह से नाभिक बायोफिज़िकल सिग्नल को महसूस करता है वह अज्ञात है, हालांकि कई परमाणु-लिफाफा प्रोटीन और प्रोटीन के परिवार शामिल पाए गए हैं, जैसे कि लैमिन ए / सी और न्यूक्लियोस्केलेटन और साइटोस्केलेटन (एलआईएनसी) कॉम्प्लेक्स38,41 के लिंकर। इसलिए, नए गैर-इनवेसिव तरीके जो सीधे नाभिक पर बल लागू कर सकते हैं, कोशिका-प्लाज्मा झिल्ली और साइटोस्केलेटन से बल संचरण के प्रभाव को कम करेंगे, और परमाणु मेकानो-सेंसिंग के पहले दुर्गम आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करेंगे।

ऑर्गेनेल42 और माइक्रोबीड्स को कोशिकाओं43 में इंजेक्ट करने के लिए ऑप्टिकल ट्वीज़र्स को नियोजित करने वाले शोध ने नाभिक पर सीधे बल लागू करने की तकनीकी क्षमता दिखाई। हालांकि, ऑप्टिकल-ट्वीजर तकनीक की कई सीमाएं हैं: (1) कम थ्रूपुट-ऑप्टिकल ट्वीज़र अक्सर एक समय में केवल एक सेल या माइक्रोबीड में हेरफेर करते हैं; और (2) परमाणु के संभावित फोटोडैमेज और तापमान विरूपण-विरूपण के लिए दसियों पीएन36 की आवश्यकता होती है, और संबंधित आवश्यक लेजर शक्ति लगभग 10 एमडब्ल्यू प्रति पीएन 44,45 है। इस तरह की लेजर तीव्रता कोशिकाओं में फोटोडैमेज को ट्रिगर करने और प्रयोग के दौरान सेल कार्यों को परेशान करने के लिए पर्याप्तहै।

जीवित कोशिकाओं के भीतर माइक्रोबीड्स के माध्यम से लागू चुंबकीय बल नाभिक पर सीधे बल लागू करने की क्षमता दिखाता है और ऑप्टिकल चिमटी की सीमाओं को दूर करता है। एक बार माइक्रोबीड्स साइटोप्लाज्म में वितरित किए जाने के बाद, एक चुंबकीय क्षेत्र एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से एक साथ कई माइक्रोबीड्स पर चुंबकीय बल डाल सकता है। चुंबकीय क्षेत्र सेल फ़ंक्शन47 को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन पीएन से एनएन तक बल उत्पन्न करता है, जो परमाणु विरूपण 36,48,49 को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। आज तक, चुंबकीय माइक्रोबीड्स का हेरफेर सेल प्लाज्मा झिल्ली48 पर, साइटोप्लाज्म50 के अंदर, एफ-एक्टिन51 पर, नाभिक47 के अंदर और पृथक नाभिक36 पर लागू किया गया है। हालांकि, नाभिक में मेकेनोट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए परमाणु लिफाफे पर प्रत्यक्ष यांत्रिक बल लागू करने के लिए माइक्रोबीड्स के चुंबकीय हेरफेर का उपयोग कभी नहीं किया गया है।

इस पेपर में, साइटोप्लाज्म में चुंबकीय माइक्रोबीड्स को गैर-आक्रामक रूप से वितरित करने और नाभिक पर यांत्रिक बल लागू करने के लिए इन माइक्रोबीड्स का उपयोग करने के लिए एक सरल तकनीक विकसित की गई है (चित्रा 1)। यहां, CRISPR / Cas9-इंजीनियर मानव सामान्य B2B सेल लाइनें जो अंतर्जात रूप से mNeonGreen21-10/11-टैग किए गए YAP को व्यक्त करती हैं, विधि को मान्य करने के लिए उपयोग की जाती हैं। वाईएपी एक मेचानो-संवेदनशील प्रोटीन है, और वाईएपी के स्थानांतरण को परमाणु मेकानो-सेंसिंग14,28 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। CRISPR / Cas9-विनियमित नॉक-इन दृष्टिकोण को फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) mNeonGreen21-10/11 के साथ अंतर्जात वाईएपी को टैग करने के लिए चुना गया था। यद्यपि सीआरआईएसपीआर संपादन को अपूर्ण दक्षता और ऑफ-टारगेट प्रभाव के लिए जाना जाता है, पिछले प्रकाशनों में प्रोटोकॉल ने सही ओपन रीडिंग फ्रेम सम्मिलन52,53,54 के लिए चयन करने के लिए फ्लोरेसेंस सॉर्टिंग को एकीकृत किया। चयन की इस अतिरिक्त परत के साथ, पहले उत्पन्न 52,53,54,55 से पहले उत्पन्न20+ सेल लाइनों में कोई ऑफ-टारगेट टैगिंग घटना नहीं देखी गई थी। यह एक विभाजित फ्लोरोसेंट प्रोटीन निर्माण है, लेकिन सिद्धांत रूप में, कोई भी व्यक्त फ्लोरोसेंट टैग उपयोग करने योग्य हो सकता है। यह लेबलिंग दृष्टिकोण ट्रांसजीन या एंटीबॉडी विधियों से बेहतर है। सबसे पहले, ट्रांसजेन अभिव्यक्ति के विपरीत, टैग किया गया प्रोटीन एकल-प्रतिलिपि जीन खुराक बनाए रखता है और देशी जीन नियामक नेटवर्क के शारीरिक संदर्भ में व्यक्त करता है, प्रोटीन एकाग्रता, स्थानीयकरण और बातचीत में विचलन को सीमित करता है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली टैगिंग विधि पूर्ण एफपी टैगिंग की तुलना में उच्च थ्रूपुट और दक्षता प्राप्त करती है। यह निर्धारण कलाकृतियों और उच्च गुणवत्ता वाले, उच्च विशिष्टता एंटीबॉडी की सीमित उपलब्धता के कारण इम्यूनोफ्लोरेसेंस से जुड़ी चुनौतियों से भी बचता है। दूसरा, इस पेपर में उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण सेल फिजियोलॉजी के लिए न्यूनतम गड़बड़ी करता है और प्रामाणिक रूप से सभी अंतर्जात वाईएपी के वास्तविक समय के रहस्योद्घाटन को सक्षम बनाता है। इसके विपरीत, अन्य सामान्य ट्रांसजीन विधियां अक्सर वाईएपी के अतिवृद्धि का कारण बनती हैं। परिणामस्वरूप कृत्रिम वितरण संभावित रूप से साइटोटॉक्सिसिटी का कारण बन सकता है और कोशिकाओं56,57,58 के मेकानो-सेंसिंग को प्रभावित कर सकता है।

यह अध्ययन साइटोप्लाज्म में वितरित चुंबकीय माइक्रोबीड्स के माध्यम से नाभिक पर सीधे बल लागू करने और एक साथ लाइव-सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग का संचालन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। सारांश में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं कि (1) नाभिक के बाहर सेल में चुंबकीय माइक्रोबीड्स कैसे वितरित किया जाए, (2) नाभिक पर चुंबकीय बल लागू करने के लिए माइक्रोबीड्स में हेरफेर करें, (3) हेरफेर के दौरान कोशिकाओं की कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग करें, और (4) बल अनुप्रयोग प्रक्रिया के दौरान वाईएपी परमाणु / साइटोप्लाज्म (एन / सी) अनुपात का मात्रात्मक विश्लेषण करें। परिणाम बताते हैं कि (1) एंडोसाइटोसिस के माध्यम से, चुंबकीय माइक्रोबीड्स को 7 घंटे के भीतर बी 2 बी कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में गैर-आक्रामक रूप से वितरित किया जा सकता है (चित्रा 2 और चित्रा 3); और (2) नाभिक (चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6) पर सीधे लागू मात्रात्मक चुंबकीय बल अकेले सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-इंजीनियर बी 2 बी कोशिकाओं (चित्रा 7 और चित्रा 8) में वाईएपी एन / सी अनुपात के विविध परिवर्तनों को ट्रिगर कर सकता है।

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Protocol

1. CRISPR/Cas9-इंजीनियर B2B कोशिकाओं का रखरखाव

  1. आरपीएमआई -1640 के साथ टी 25 फ्लास्क में कल्चर बी 2 बी कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया जाता है।
  2. बी 2 बी कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में बनाए रखें।
  3. बी 2 बी कोशिकाओं की उपसंस्कृति जब कंफ्लुएंसी 70% से 80% तक पहुंच जाती है।
  4. बी 2 बी सेल लाइन को आरपीएमआई -1640 संस्कृति माध्यम में 10% (वी / वी) डीएमएसओ के साथ -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  5. प्रयोगों में 10 से कम मार्ग संख्या वाले बी 2 बी कोशिकाओं का उपयोग करें।

2. सेल संस्कृति

  1. कोशिकाओं को ग्लास-बॉटम पेट्री डिश पर बीज दें।
    1. फ्लास्क जिसमें बी 2 बी कोशिकाएं होती हैं, को इनक्यूबेटर से जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं।
    2. वैक्यूम पंप से जुड़े एक एस्पिरेटिंग पिपेट का उपयोग करके फ्लास्क में कल्चर माध्यम को हटा दें।
    3. फ्लास्क को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 2 एमएल के साथ धोएं।
    4. एस्पिरेटिंग पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को हटा दें।
    5. फ्लास्क सब्सट्रेट के तल से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन समाधान का 0.5 एमएल जोड़ें।
    6. फ्लास्क को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
    7. फ्लास्क को जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं। फ्लास्क में 5 एमएल नया कल्चर माध्यम जोड़ें और घोल को ऊपर और नीचे करें।
    8. ग्लास-बॉटम पेट्री डिश पर कोशिकाओं (300 कोशिकाओं / μL) के साथ माध्यम के 50 μL जमा करें। पेट्री डिश में 2 एमएल कल्चर माध्यम जोड़ें।
    9. पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए 12 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
  2. चुंबकीय माइक्रोबीड्स के साथ कोशिकाओं को कल्चर करें।
    1. 0.2 ग्राम का वजन 7 μm औसत व्यास कार्बोनिल आयरन माइक्रोबीड्स (इसके बाद 7 μm माइक्रोबीड्स कहा जाता है, सामग्री की तालिका देखें)।
    2. RPMI-1640 संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में माइक्रोबीड्स को निलंबित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    3. बी 2 बी कोशिकाओं के साथ पेट्री डिश को जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं।
    4. पेट्री डिश में माइक्रोबीड्स युक्त माध्यम का 200 μL जोड़ें।
      नोट: माइक्रोबीड्स की वर्षा से बचने के लिए माध्यम को जल्दी से जोड़ें।
    5. पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में वापस रखें जब तक कि माइक्रोबीड्स कोशिकाओं द्वारा आंतरिक रूप से नष्ट न हो जाएं। विभिन्न सेल लाइनों के लिए आंतरिककरण के लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए हर 6 घंटे में आंतरिककरण की जांच करें।
    6. आंतरिककरण की जांच करने के लिए, माइक्रोबीड, परमाणु और सेल सीमा की कल्पना करने के लिए कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस इमेजिंग करें। यदि माइक्रोबीड को सेल द्वारा आंतरिक रूप दिया जाता है, तो यह सेल सीमा के भीतर होगा।

3. नाभिक का विज़ुअलाइज़ेशन

  1. 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कल्चर माध्यम के 1.5 एमएल को गर्म करें।
  2. जैव सुरक्षा कैबिनेट की रोशनी बंद करें। पेट्री डिश लें जिसमें जैव सुरक्षा कैबिनेट में सेल, गर्म संस्कृति माध्यम, परमाणु दाग और वेरापामिल एचसीएल शामिल हैं।
    नोट: परमाणु धुंधला घटक प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं। ऑपरेशन के दौरान प्रकाश के संपर्क में आने से बचें।
  3. डीएमएसओ द्वारा 1000x परमाणु दाग को 100x तक पतला करें।
  4. डीएमएसओ द्वारा 100 एमएम वेरापामिल एचसीएल को 10 एमएम तक पतला करें।
  5. 1.5 एमएल कल्चर माध्यम में 100 x परमाणु दाग का 15 μL और 10 mM Verapamil HCl का 15 μL जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
  6. पेट्री डिश से संस्कृति माध्यम को हटा दें। पेट्री डिश में परमाणु धुंधलापन युक्त संस्कृति माध्यम जोड़ें।
  7. कोशिकाओं को 2 घंटे से अधिक समय के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।

4. चुंबकीय बल अनुप्रयोग हार्डवेयर की तैयारी

  1. 3 डी एक्रिलोनिट्राइल ब्यूटाडीन स्टाइलिन (एबीएस) का उपयोग करके सभी भागों को प्रिंट करें और उन्हें सीएडी डिजाइन (चित्रा 1 ए) के बाद इकट्ठा करें। सीएडी डिजाइन सामग्री की तालिका में शामिल है।
  2. चुंबक को चुंबक-चलती डिवाइस (चित्रा 1 ए) से जोड़ने के लिए डबल-साइडेड टेप का उपयोग करें।
  3. माइक्रोस्कोप चरण के बगल में चुंबक-चलती डिवाइस सेट करें। चुंबक के स्थानिक स्थान को समायोजित करने के लिए तीन नॉब्स का उपयोग करें जब तक कि यह 13 मिमी और 120 मिमी के बीच पेट्री डिश से ऊपर नहीं जा सकता।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चुंबकीय माइक्रोबीड्स पर अवांछित बल अनुप्रयोग से बचने के लिए चुंबक और पेट्री डिश के बीच की दूरी की ऊपरी सीमा जितना संभव हो उतनी बड़ी है। इस प्रयोगात्मक सेटअप में 120 मिमी अधिकतम मान है। सुनिश्चित करें कि चुंबक माइक्रोस्कोप भागों में हस्तक्षेप नहीं करता है, जिसमें उद्देश्य और मोटर चालित चरण शामिल हैं।
  4. चुंबक को उच्चतम z-स्थिति (120 मिमी पर) पर सेट करें।

5. बल अनुप्रयोग और लाइव-सेल इमेजिंग

  1. दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए पर्यावरण कक्ष की स्थापना
    1. पर्यावरण कक्ष को अच्छी तरह से निष्फल और साफ करने के लिए 75% इथेनॉल समाधान लागू करें।
    2. पर्यावरण कक्ष को उल्टे माइक्रोस्कोप के मोटर चालित चरण पर रखें।
    3. सीओ2 टैंक खोलें और सीओ2 प्रवाह दर को 160 एमएल / मिनट पर सेट करें।
    4. कक्ष के तापमान को 44 डिग्री सेल्सियस (शीर्ष), 42 डिग्री सेल्सियस (स्नान), और 40 डिग्री सेल्सियस (चरण) में समायोजित करें।
    5. 90% आर्द्रता बनाए रखने के लिए पर्यावरण कक्ष के स्नान में 20 मिलीलीटर शुद्ध पानी जोड़ें।
    6. ग्लास-बॉटम पेट्री डिश को बाहर निकालें जिसमें टिशू कल्चर इनक्यूबेटर से लक्ष्य कोशिकाएं होती हैं और इसे कक्ष में रखें।
    7. पेट्री डिश की स्थिति को ठीक करने के लिए पर्यावरण कक्ष के धातु क्लैंप लागू करें।
      नोट: पेट्री डिश को कक्ष में कसकर दबाया जाना चाहिए क्योंकि चुंबकीय बल डिश को स्थानांतरित कर सकता है यदि इसे क्लैंप नहीं किया जाता है।
    8. कक्ष का ढक्कन बंद करें।
  2. इमेजिंग पैरामीटर का अनुकूलन
    1. पिनहोल आकार को अनुकूलित करें: पिनहोल आउट-ऑफ-फोकस फोटॉन को अवरुद्ध करता है। एक बड़ा पिनहोल आकार अधिक आउट-ऑफ-फोकस फोटॉन पैदा करता है लेकिन एक उज्ज्वल छवि। एक छोटा पिनहोल आकार एक अधिक केंद्रित और मंद छवि उत्पन्न करता है। उपयुक्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ इन-फोकस कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए पिनहोल आकार को अनुकूलित करना सुनिश्चित करें।
    2. लेजर तीव्रता को अनुकूलित करें: लेजर तीव्रता उत्तेजना की तीव्रता और इस प्रकार उत्सर्जन प्रकाश निर्धारित करती है। कम लेजर तीव्रता कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात देती है। बहुत अधिक लेजर तीव्रता फोटोब्लीचिंग का कारण बनेगी। तदनुसार लेजर तीव्रता समायोजित करें।
    3. चरण आकार और चरणों को अनुकूलित करें: चरण और चरण आकार निर्धारित करते हैं कि जेड-स्टैक में कितनी छवियां लेंगी। छोटे चरण आकार और अधिक कदम जेड-स्टैक रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाएंगे लेकिन फोटोब्लीचिंग को भी बढ़ाएंगे। इस प्रयोग में, ~ 15 μm सेल ऊंचाई के साथ कोशिकाओं के लिए 1 μm चरण आकार का उपयोग किया गया था।
    4. एक्सपोज़र समय को अनुकूलित करें: एक्सपोज़र समय यह निर्धारित करता है कि सेल को उत्तेजना लेजर के संपर्क में कितनी देर तक रखा जाएगा। कम एक्सपोजर समय सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम कर देगा। एक उच्च एक्सपोजर समय फोटोब्लीचिंग का कारण बनेगा। इस प्रयोग में 1 फ्रेम प्रति 4 सेकंड के एक्सपोजर समय का उपयोग किया गया था।
    5. इमेजिंग मापदंडों का अनुकूलन: चार मापदंडों में से एक को पुनरावृत्ति रूप से बदलें और अन्य मापदंडों को सुसंगत रखें। हर बार, प्रत्येक छवि के वाईएपी एन / सी अनुपात को मापें और फोटोब्लीचिंग स्तर निर्धारित करने के लिए वाईएपी एन / सी अनुपात परिवर्तन की तुलना करें। सिग्नल-टू-शोर अनुपात, इमेजिंग गति और फोटोब्लीचिंग के बीच संतुलन प्राप्त करने तक अनुकूलन प्रक्रिया को दोहराएं।
    6. प्रयोगों के दौरान तेज़ इमेजिंग सेटिंग्स के लिए अनुकूलित इमेजिंग पैरामीटर का उपयोग करके इमेजिंग कॉन्फ़िगरेशन को परिभाषित करें।
      नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए गए कॉन्फ़िगरेशन इमेजिंग मापदंडों के अनुभाग 5.3 में वर्णित हैं। अनुभाग 5.3 में कॉन्फ़िगरेशन के इमेजिंग पैरामीटर को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, चरण 5.2.5 के समान विधि का उपयोग करें।
  3. छोटे बल अनुप्रयोग और कॉन्फोकल इमेजिंग
    नोट: इस अध्ययन में इमेजिंग के लिए निकॉन टीआई 2-ई माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था, और छवि अधिग्रहण के लिए विस्तृत कदम नीचे दिए गए हैं।
    1. उल्टे माइक्रोस्कोप खोलें। सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोग तत्व खोलें।
    2. कॉन्फ़िगरेशन magnetic_find निर्धारित करें. केवल FITC चैनल की जाँच करें। सेट पीएमटी एचवी = 70, ऑफसेट = 0, लेजर तीव्रता = 10। 1/2 बटन पर क्लिक करके स्कैनिंग गति को 1 फ्रेम प्रति 2 सेकंड पर सेट करें। 1.2 A.U. बटन पर क्लिक करके पिनहोल आकार को 1.2 AU पर सेट करें। यह कॉन्फ़िगरेशन चरण 5.3.5 में उपयोग किया जाएगा।
    3. कॉन्फ़िगरेशन magnetic_YAP_Nucleus निर्धारित करें. FITC चैनल की जाँच करें। सेट पीएमटी एचवी = 70, ऑफसेट = 0, लेजर तीव्रता = 10। 1 /2 बटन पर क्लिक करके स्कैनिंग गति को 1 फ्रेम प्रति 4 सेकंड पर सेट करें। 1.2 A.U. बटन पर क्लिक करके पिनहोल आकार को 1.2 AU पर सेट करें। नाभिक सीमा और परमाणु दाग तीव्रता को चित्रित करने के लिए, Cy5 चैनल की जांच करें। सेट पीएमटी एचवी = 70, ऑफसेट = 0, लेजर तीव्रता = 10। पिनहोल आकार 3 डी वाईएपी इमेजिंग के लिए अनुकूलित है। Cy5 चैनल की जाँच करने के बाद फिर से 1.2 A.U. बटन पर क्लिक न करें। यह कॉन्फ़िगरेशन चरण 5.3.7 में उपयोग किया जाएगा।
    4. यदि आवश्यक हो तो तत्वों के माध्यम से डीआईए चालू करें। स्पिनव्यू खोलें, एक उज्ज्वल-फ़ील्ड का उपयोग करें, और कोशिकाओं की स्पष्ट इन-फ़ोकस छवि प्राप्त करने के लिए ऑब्जेक्ट के फ़ोकस को समायोजित करें। तीन स्थितियों में उपयुक्त कई एकल कोशिकाओं को खोजने के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग करें: अंदर एक एकल माइक्रोबीड के साथ, अंदर कई माइक्रोबीड्स के साथ, और अंदर किसी भी माइक्रोबीड के बिना। 40x उद्देश्य पर स्विच करें। इस स्थिति को उपयुक्त स्थिति संख्या के साथ नाम दें।
    5. खुले तत्व. magnetic_find पर क्लिक करें। इंटरलॉक निकालें बटन क्लिक करें.
    6. स्कैन करें पर क्लिक करें और फोकल प्लेन की जेड-स्थिति समायोजित करें। चयनित कक्षों के Z-स्टैक के लिए निचली और ऊपरी सीमा सेट करने के लिए शीर्ष और नीचे बटन क्लिक करें. स्कैन को फिर से क्लिक करके स्कैन करना बंद करें।
    7. magnetic_YAP_Nucleus कॉन्फ़िगरेशन पर स्विच करें। फ़ाइल नाम before_small_force.nd2 के रूप में सेट करें. रिकॉर्ड किए गए जेड-स्टैक के साथ रन बटन पर क्लिक करें।
    8. सही प्रकाश पथ पर स्विच करें और डीआईए चालू करें। स्पिनव्यू खोलें और रिकॉर्डिंग बटन पर क्लिक करें। इस बीच, चुंबक को पेट्री डिश बॉटम से 46 मिमी ऊपर ले जाने के लिए चुंबक-चलती डिवाइस के नॉब को घुमाएं। उज्ज्वल-फ़ील्ड छवि अनुक्रम या वीडियो सहेजें। यह पुष्टि करने के लिए वीडियो की जांच करें कि माइक्रोबीड्स चुंबकीय बल द्वारा प्रेरित विस्थापन दिखाते हैं।
    9. चरण 5.3.5-5.3.7 दोहराएँ; फ़ाइल नाम को after_small_force.nd2 पर सेट करें।
    10. सही प्रकाश पथ पर स्विच करें और डीआईए चालू करें। इसके बाद, स्पिनव्यू खोलें और रिकॉर्डिंग बटन पर क्लिक करें। इस बीच, चुंबक को पेट्री डिश बॉटम से 120 मिमी ऊपर ले जाने के लिए चुंबक-चलती डिवाइस के नॉब को घुमाएं। उज्ज्वल-फ़ील्ड छवि अनुक्रम या वीडियो सहेजें।
    11. चरण 5.3.5-5.3.7 दोहराएँ और फ़ाइल नाम before_large_force.nd2 पर सेट करें।
  4. बड़े बल अनुप्रयोग और कॉन्फोकल इमेजिंग
    1. चुंबक को पेट्री डिश बॉटम से 13 मिमी ऊपर पहुंचने की अनुमति देने के लिए पर्यावरण कक्ष के ढक्कन को हटा दें।
    2. सही प्रकाश पथ पर स्विच करें और डीआईए चालू करें। स्पिनव्यू खोलें और रिकॉर्डिंग बटन पर क्लिक करें। इस बीच, चुंबक को पेट्री डिश बॉटम से 13 मिमी ऊपर ले जाने के लिए चुंबक-चलती डिवाइस के नॉब को घुमाएं। उज्ज्वल-फ़ील्ड छवि अनुक्रम या वीडियो सहेजें। यह पुष्टि करने के लिए वीडियो की जांच करें कि माइक्रोबीड्स चुंबकीय बल द्वारा प्रेरित विस्थापन दिखाते हैं।
    3. चरण 5.3.5-5.3.7 दोहराएँ और फ़ाइल नाम after_large_force.nd2 पर सेट करें।
    4. सही प्रकाश पथ पर स्विच करें और डीआईए चालू करें। इसके बाद, स्पिनव्यू खोलें और रिकॉर्डिंग बटन पर क्लिक करें। इस बीच, चुंबक को पेट्री डिश बॉटम से 120 मिमी ऊपर ले जाने के लिए चुंबक-चलती डिवाइस के नॉब को घुमाएं। उज्ज्वल-फ़ील्ड छवि अनुक्रम या वीडियो सहेजें।
    5. चरण 5.3.5-5.3.7 दोहराएँ; फ़ाइल नाम retract_large_force.nd2 पर सेट करें.
    6. पर्यावरण कक्ष के ढक्कन को बंद करें।
  5. यदि आवश्यक हो तो अधिक डेटा प्राप्त करने के लिए कई क्षेत्रों के लिए चरण 5.2 और 5.3 दोहराएँ।

6. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. वाईएपी एन/सी अनुपात का परिमाणीकरण
    1. Fiji ImageJ खोलें। चरण 5 में लिए गए .nd2 चित्रों को खोलें।
    2. विश्लेषण > सेट माप पर क्लिक करें। चेक एरिया, इंटीग्रेटेड डेंसिटी, मीन ग्रे वैल्यू और शेप डिस्क्रिप्टर्स।
    3. नाभिक की पहचान करने के लिए Cy5 चैनल का उपयोग करें। नाभिक को रेखांकित करने के लिए फ्री-चयन उपकरण का उपयोग करने के लिए फ्रीहैंड चयन पर क्लिक करें। इसके अलावा, इमेजजे में स्वचालित परमाणु मास्क मैक्रो की जांच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. FITC चैनल में माप > विश्लेषण करें क्लिक करें. माध्य का मापा मूल्य औसत परमाणु वाईएपी तीव्रता डीएन है।
    5. नाभिक की पहचान करने के लिए Cy5 चैनल का उपयोग करें। सेल की पहचान करने के लिए FITC चैनल का उपयोग करें। साइटोप्लाज्म के भीतर रुचि के क्षेत्र का चयन करने और चुंबकीय माइक्रोबीड से बचने के लिए फ्री-चयन उपकरण का उपयोग करने के लिए फ्रीहैंड चयन पर क्लिक करें। रुचि के इस क्षेत्र में नाभिक शामिल नहीं होना चाहिए।
    6. FITC चैनल में > माप का विश्लेषण करें क्लिक करें. माध्य का मापा मूल्य औसत साइटोप्लाज्मिक वाईएपी तीव्रता डीसी है।
    7. वाईएपी एन/सी अनुपात = डीएन / डीसी की गणना करें।
  2. परमाणु आकार और सामान्यीकृत परमाणु दाग तीव्रता का परिमाणीकरण
    1. Fiji ImageJ खोलें। चरण 5 में लिए गए .nd2 चित्रों को खोलें।
    2. विश्लेषण > सेट माप पर क्लिक करें। चेक एरिया, इंटीग्रेटेड डेंसिटी, मीन ग्रे वैल्यू और शेप डिस्क्रिप्टर्स।
    3. नाभिक की पहचान करने के लिए Cy5 चैनल का उपयोग करें। नाभिक को रेखांकित करने के लिए फ्री-चयन उपकरण का उपयोग करने के लिए फ्रीहैंड चयन पर क्लिक करें।
    4. Cy5 चैनल में विश्लेषण > माप पर क्लिक करें। माध्य का मापा मूल्य परमाणु दाग तीव्रता है। सिरिक का मापा मूल्य। परमाणु परिपत्रता है।
    5. विभिन्न बल अवस्था में परमाणु दाग तीव्रता की तुलना करने के लिए, सभी परमाणु दाग तीव्रता को सामान्यीकृत परमाणु दाग तीव्रता उत्पन्न करने के लिए "before_small_force.nd2" में परमाणु दाग तीव्रता से विभाजित किया जाता है।

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Representative Results

एक चुंबक-चलती डिवाइस का डिजाइन और चुंबकीय बल का अनुप्रयोग
चुंबकीय माइक्रोबीड्स के माध्यम से नाभिक पर बल लागू करने के लिए, चुंबक की स्थानिक स्थिति को नियंत्रित करने के लिए एक चुंबक-चलती डिवाइस को डिजाइन और बनाया गया था। चुंबक-गतिमान उपकरण में एक केंद्रीय फ्रेम, तीन घुंडी और रेल होते हैं जो संलग्न चुंबक को x, y और z दिशाओं में स्वतंत्र रूप से 1.59 मिमी प्रति चक्र के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर स्थानांतरित करते हैं (चित्रा 1 ए)। एक बार चुंबक को कोशिकाओं में वितरित 7 μm माइक्रोबीड्स के करीब ले जाया जाता है (चित्रा 1 बी), यह चुंबकीय रूप से माइक्रोबीड्स को आकर्षित करता है और नाभिक पर बल लागू करता है (चित्रा 1 सी)। बल की दिशा और परिमाण चुंबक और माइक्रोबीड्स के बीच सापेक्ष स्थिति द्वारा नियंत्रित होते हैं।

इस पेपर में, माइक्रोबीड्स पर बल के दो अलग-अलग परिमाण लागू किए गए थे: (1) एक अपेक्षाकृत छोटा बल जब चुंबक को सेल से 46 मिमी ऊपर रखा गया था; और (2) एक अपेक्षाकृत बड़ा बल जब चुंबक को सेल से 13 मिमी ऊपर रखा गया था। माइक्रोबीड एफ पर लागू चुंबकीय बल की गणना समीकरण59 द्वारा की जा सकती है: Equation 1जहां एनडी डिमैग्नेटाइजिंग कारक (एक गोले के लिए 0.33) है, μ वैक्यूम में पारगम्यता है (लोहे के लिए 6.3 × 10-3 एच / मीटर), वीपी माइक्रोबीड का आयतन है (7 μm माइक्रोबीड के लिए 178 μमीटर3), और H इकाई A/m के साथ चुंबकीय क्षेत्र की तीव्रता है। H इकाई टेस्ला के साथ चुंबकीय प्रवाह घनत्व B के समानुपाती है। चूंकि एकल 7 μm माइक्रोबीड पर कार्य करने वाले चुंबकीय बल को एक बल ट्रांसड्यूसर द्वारा पता लगाने के लिए बेहद छोटा और मुश्किल होने की उम्मीद थी, इसलिए संदर्भ के रूप में चुंबकीय प्रवाह घनत्व बी को माइक्रोबीड्स पर लागू चुंबकीय बल के परिमाण को इंगित करने के लिए मापा गया था। चुंबकीय प्रवाह घनत्व को मापने के लिए पेट्री डिश तल के स्थान पर एक हॉल सेंसर पेश किया गया था, और चुंबक को पेट्री डिश के तल से 13 मिमी या 46 मिमी की दूरी पर रखा गया था। क्योंकि 7 μm माइक्रोबीड्स चुंबकीय क्षेत्र को प्रभावित करते हैं, चुंबकीय प्रवाह घनत्व को माइक्रोबीड्स के साथ और बिना मापा गया था। 7 μm माइक्रोबीड्स की उपस्थिति के बावजूद, एक ही चुंबकीय प्रवाह घनत्व प्राप्त किया गया था: B = 60.1 mT 13 मिमी की दूरी पर और B = 3.7 mT 46 मिमी की दूरी पर। इस माप से पता चलता है कि 12.7 मिमी व्यास और 12.7 मिमी ऊंचाई के साथ बेलनाकार चुंबक द्वारा उत्पन्न चुंबकीय क्षेत्र पर 7 μm माइक्रोबीड्स का प्रभाव (सामग्री की तालिका देखें) इस अध्ययन में उपयोग किए गए हॉल सेंसर द्वारा पता लगाने योग्य नहीं था। हालांकि, 13 मिमी की दूरी के मामले में चुंबकीय प्रवाह घनत्व 46 मिमी दूरी की तुलना में लगभग 16 गुना अधिक था। चुंबकीय बल के प्रयोगात्मक अंशांकन को निम्नलिखित खंड (चित्रा 6) में वर्णित किया गया है।

साइटोप्लाज्म में चुंबकीय माइक्रोबीड्स का वितरण
ग्लास-बॉटम पेट्री डिश पर कोशिकाओं को सीड करने के 12 घंटे बाद, कल्चर माध्यम में 7 μm माइक्रोबीड्स जोड़े जाते हैं। माइक्रोबीड्स को कोशिकाओं द्वारा अनायास आंतरिक रूप से आंतरिक किया जाता है। चूंकि माइक्रोबीड्स एफआईटीसी या साइ 5 चैनल में लेजर उत्तेजना के तहत प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन नहीं करते हैं, इसलिए आंतरिक माइक्रोबीड्स के स्थान को वाईएपी और नाभिक के प्रतिदीप्ति के कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ अंधेरे खोखले के स्थान से पहचाना जा सकता है। 2 डी और 3 डी दोनों छवियों से पता चलता है कि माइक्रोबीड नाभिक के बाहर साइटोप्लाज्म में है (चित्रा 2)।

कोशिकाओं में माइक्रोबीड्स का आंतरिक स्तर कोशिकाओं और माइक्रोबीड्स की सह-संस्कृति की अवधि पर निर्भर करता है। इस प्रकार, कोशिकाओं को आंतरिक माइक्रोबीड्स की मात्रा के अनुसार तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया गया था- कोई माइक्रोबीड, एकल माइक्रोबीड और मल्टी-माइक्रोबीड्स (चित्रा 3 ए)। सह-संस्कृति के 7 घंटे में, 62% कोशिकाओं ने कोई माइक्रोबीड आंतरिक नहीं किया, 15% कोशिकाओं ने एक एकल माइक्रोबीड को आंतरिक रूप दिया, और 23% कोशिकाओं ने बहु-माइक्रोबीड्स (कोशिकाओं की कुल संख्या = 13) को आंतरिक रूप दिया। सह-संस्कृति के 12 घंटे में, 53% कोशिकाओं ने कोई माइक्रोबीड आंतरिक नहीं किया, 26% कोशिकाओं ने एक एकल माइक्रोबीड को आंतरिक रूप दिया, और 21% कोशिकाओं ने बहु-माइक्रोबीड्स (कोशिकाओं की कुल संख्या = 62) को आंतरिक रूप दिया। सह-संस्कृति के 24 घंटे में, 20% कोशिकाओं ने कोई माइक्रोबीड आंतरिक नहीं किया, 28% कोशिकाओं ने एक एकल माइक्रोबीड को आंतरिक रूप दिया, और 53% कोशिकाओं ने बहु-माइक्रोबीड्स (कोशिकाओं की कुल संख्या = 40) को आंतरिक रूप दिया (चित्रा 3 बी)।

साइटोप्लाज्म में माइक्रोबीड्स परमाणु आकार और वाईएपी गतिविधि को प्रभावित नहीं करते हैं
परमाणु आकार और प्रोटीन गतिविधि पर माइक्रोबीड्स के आंतरिककरण के प्रभाव की जांच करने के लिए, परमाणु आकार को पहले क्रमशः वाईएपी एन / सी अनुपात द्वारा परिपत्रता और वाईएपी गतिविधि द्वारा निर्धारित किया गया था। परिपत्रता की गणना परिपत्रता = 4μ (क्षेत्र / परिधि2) द्वारा की जाती है। वाईएपी एन /सी अनुपात को निर्धारित करने के लिए विस्तृत कदम पिछले प्रकाशन60 में वर्णित किए गए थे। संक्षेप में, वाईएपी एन / सी अनुपात की गणना साइटोप्लाज्म में औसत वाईएपी तीव्रता से नाभिक में औसत वाईएपी तीव्रता को विभाजित करके की गई थी। इस संभावना को ध्यान में रखते हुए कि माइक्रोबीड्स और कोशिकाओं की सह-संस्कृति परमाणु आकार को प्रभावित कर सकती है, भले ही कोई माइक्रोबीड आंतरिक न हो, सह-संस्कृति के बिना कोशिकाएं (काले बिंदु, नियंत्रण # 1, परिपत्रता = 0.806 ± 0.037, एन = 20), कोशिकाएं माइक्रोबीड्स के साथ सह-संवर्धित होती हैं लेकिन आंतरिककरण के बिना (ग्रे डॉट्स, नियंत्रण # 2, परिपत्रता = 0.806 ± 0.035, एन = 22), एकल माइक्रोबीड को आंतरिक करने वाली कोशिकाएं ।। परिपत्रता = 0.793 ± 0.048, एन = 15), और बहु-माइक्रोबीड्स (नीले बिंदु, बहु-माइक्रोबीड्स, एन = 7) को आंतरिक करने वाली कोशिकाओं की तुलना की गई (चित्रा 3 सी)। परिणाम से पता चलता है कि परीक्षण किए गए सभी चार समूहों में, परमाणु परिपत्रता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (चित्रा 3 सी)।

इसके बाद, यह जांचने के लिए कि क्या वाईएपी एन /सी अनुपात माइक्रोबीड्स के आंतरिककरण से प्रभावित होता है, कोशिकाओं को माइक्रोबीड्स के साथ सह-संवर्धित किया जाता है, लेकिन आंतरिककरण के बिना (ग्रे डॉट्स, नियंत्रण # 2, वाईएपी एन / सी अनुपात = 1.155 ± 0.074, एन = 35) की तुलना केवल एकल या बहु-माइक्रोबीड आंतरिककरण वाली कोशिकाओं (लाल बिंदु, माइक्रोबीड्स के साथ सेल, वाईएपी एन / सी अनुपात = 1.140 ± 0.078) के साथ की गई थी। एन = 36) सह-संस्कृति के 12वें घंटे में (चित्रा 3 डी)। सह-संस्कृति के बिना कोशिकाओं की तुलना नहीं की गई क्योंकि माइक्रोबीड्स के साथ पकवान कम सेल घनत्व दिखाता है, जो वाईएपी एन / सी अनुपात12 को प्रभावित कर सकता है। परिणाम दो समूहों के बीच वाईएपी एन / सी अनुपात में कोई महत्वपूर्ण अंतर (पी मान = 0.667) नहीं दिखाता है, यह दर्शाता है कि माइक्रोबीड्स का आंतरिककरण वाईएपी गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है (चित्रा 3 डी)।

चुंबकीय बल नाभिक को विकृत करता है
सबसे पहले, नाभिक का विरूपण दिखाया गया है। नाभिक का विरूपण कोशिकाओं में माइक्रोबीड्स (चित्रा 4 ए और चित्रा 4 ए 1-3) द्वारा लागू संपीड़न बल के कारण होता है जिसमें साइटोस्केलेटन होता है। यह डेटा (यानी, माइक्रोबीड के संपीड़न द्वारा विकृत होने वाला नाभिक) इस बात का समर्थन करता है कि माइक्रोबीड वास्तव में भीड़ वाले साइटोप्लाज्म में नाभिक पर एक बल लागू कर रहा है। बल आवेदन प्रक्रिया दिखाने वाला एक उज्ज्वल-क्षेत्र वीडियो पूरक सामग्री (पूरक वीडियो 1) में शामिल है। दूसरा, क्योंकि यह संभव है कि माइक्रोबीड एक साथ आसपास के साइटोस्केलेटन पर बल लागू करता है और अप्रत्यक्ष रूप से नाभिक को विकृत करता है, संपीड़न प्रयोगों को उन कोशिकाओं में दोहराया गया था जिनमें बाधित एक्टिन फिलामेंट्स (साइटो डी का उपचार (2.5 μM, 1 घंटे); चित्र 4 बी)। इस अध्ययन से पता चलता है कि एक्टिन फिलामेंट्स वास्तव में डीपोलीमराइज्ड हैं (चित्रा 4 बी), और नाभिक माइक्रोबीड्स (चित्रा 4 बी 1-3) द्वारा विकृत हो जाता है। यह डेटा इस बात का समर्थन करता है कि माइक्रोबीड्स साइटोस्केलेटन के आसपास के गुंथे हुए की अनुपस्थिति में सीधे नाभिक पर एक बल लागू कर रहे हैं। सामूहिक रूप से, इस डेटा से पता चलता है कि प्रोटोकॉल और उपकरण सीधे नाभिक पर एक बल लागू कर सकते हैं।

इंट्रासेल्युलर चुंबकीय माइक्रोबीड्स का स्थानिक और लौकिक नियंत्रण
माइक्रोबीड्स के स्थानिक नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए, मैग्नेट की एक जोड़ी का उपयोग माइक्रोबीड को स्थानांतरित करने और नाभिक पर इंडेंटेशन के अपने स्थान को नियंत्रित करने के लिए किया गया था (चित्रा 5 ए)। मोती को केवल विस्थापन के 2.2 μm (चित्रा 5A1-4) के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन संबंधित स्थानों पर नाभिक पर लचीले ढंग से इंडेंटेशन लागू कर सकता है। आसपास के एक्टिन साइटोस्केलेटन माइक्रोबीड्स के आंदोलन को प्रतिबंधित कर सकते हैं। इसलिए, साइटो डी उपचार (2.5 μM, 1 घंटे) द्वारा एक्टिन साइटोस्केलेटन को बाधित किया गया था, और माइक्रोबीड स्थान में हेरफेर किया गया था लेकिन समान परिणाम दिखाए गए थे। इसलिए, एक परिकल्पना प्रस्तावित की जा सकती है: माइक्रोबीड साइटोप्लाज्म में नाभिक और आसपास के अन्य अंगों के साथ शारीरिक / रासायनिक रूप से बंध सकता है, जो इसके बड़े स्थानिक आंदोलन को प्रतिबंधित करता है (>2.2 μm)।

माइक्रोबीड्स के स्थानिक नियंत्रण को प्राप्त करने के लिए, मैग्नेट की एक जोड़ी का उपयोग किया गया था जो नाभिक के एक ही स्थान पर दो बार (अलग-अलग बल परिमाण के साथ) बल को लागू करने और छोड़ने के लिए माइक्रोबीड्स को नियंत्रित करता है (चित्रा 5 बी और चित्रा 5 बी 1-बी 4)। बल आवेदन और रिलीज के एक चक्र के लिए वर्तमान समय अवधि 12 सेकंड है। अस्थायी नियंत्रण की गति XYZ मूवर की ऑपरेशन गति से निर्धारित होती है।

चुंबकीय बल का अंशांकन
नाभिक पर मोती-लागू बल का अनुमान प्रयोगात्मक रूप से एक कैलिब्रेटेड परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) द्वारा लागू बल को मापकर लगाया गया था जो नाभिक के समान विरूपण का कारण बनता है। विशेष रूप से, एक्टिन साइटोस्केलेटन को पहली बार साइटोडी (2.5 μM; 1 h, चित्रा 4B) द्वारा भंग किया गया था क्योंकि एएफएम सेल की एपिकल सतह पर बल लागू करता है, और एक्टिन कॉर्टेक्स और साइटोस्केलेटन को हटाने से एएफएम टिप और सेल न्यूक्लियस के बीच अधिक सीधा संपर्क होता है। जिन कोशिकाओं में उनके एक्टिन कॉर्टेक्स और साइटोस्केलेटन घुल जाते हैं, वे स्वस्थ कोशिकाओं के साथ परमाणु आकार और परमाणु धुंधला तीव्रता की तुलना के आधार पर जीवित होते हैं (पूरक चित्र 1)। दूसरा, अक्रियाशील एएफएम टिप (अर्ध-गोलाकार, त्रिज्या = 5 μm) जिसका आकार और आकार माइक्रोबीड्स के समान होता है, का उपयोग सेल की एपिकल सतह को बल-नियंत्रित तरीके से इंडेंट करने के लिए किया जाता था और साथ ही साथ सेल और न्यूक्लियस बॉडीज की 3 डी कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त किया जाता था (चित्रा 6 ए)। 0.8 nN से 2.0 nN तक संपीड़ित बल का परिमाण चुना गया था, क्योंकि साहित्य24 के आधार पर, 1.5 nN के परिमाण पर बल नाभिक को पर्याप्त रूप से विकृत करने के लिए जाना जाता था। तीसरा, नाभिक का सामान्य विरूपण जो एएफएम इंडेंटेशन के कारण हुआ था, मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से मापा गया था। इसके अलावा, अंशांकन वक्र जो मात्रात्मक एएफएम बल-विस्थापन संबंध (चित्रा 6 बी) प्रदान करता है, प्राप्त किया गया था। चौथा, समान आकार और आकार वाले सूक्ष्म मोतियों को नियंत्रित करके नाभिक की पार्श्व सतह पर एक संपीड़ित बल लागू किया गया था (त्रिज्या = 7 μm; चित्रा 6 सी), और परमाणु झिल्ली के विरूपण को इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से मापा गया था। एएफएम बल-विस्थापन संबंध के आधार पर मोतियों-लागू बल का अनुमान लगाया जाता है।

उदाहरण के लिए, चित्रा 6 सी में, 'बड़े बल' पर चुंबकीय माइक्रोबीड्स (व्यास = ~ 7 μm) के कारण नाभिक का विरूपण लगभग 1.5 μm है। चित्रा 6 डी में, एक एएफएम टिप जिसमें 5 μm अर्धगोलाकार जांच होती है, का उपयोग 1.5 μm परमाणु विरूपण प्राप्त करने के लिए नाभिक के शीर्ष पर कोशिका को इंडेंट करने के लिए किया गया था। एएफएम द्वारा दर्ज किया गया संबंधित बल 1.4 एनएन है। इसलिए, माइक्रोबीड्स द्वारा लागू बल ~ 1.4 nN होने का अनुमान है। उसी दृष्टिकोण का पालन करते हुए, 'छोटे बल' पर चुंबकीय बल को 0.8 nN के रूप में कैलिब्रेट किया जाता है, और यह 0.4 μm परमाणु इंडेंटेशन का कारण बनता है।

यह अध्ययन मानता है कि एएफएम-मापा बल निम्नलिखित मान्यताओं के आधार पर माइक्रोबीड-लागू बल का प्रतिनिधित्व कर सकता है: (1) विभिन्न कोशिकाओं के भीतर नाभिक की कठोरता समान है। (2) नाभिक के यांत्रिक गुण परमाणु साइटों पर निर्भर नहीं हैं जिन पर इंडेंटेशन लागू किया गया था। चुंबकीय बल नाभिक के पार्श्व पक्षों पर क्षैतिज रूप से लागू होता है, जबकि एएफएम बल नाभिक के एपिकल पक्षों पर लंबवत रूप से लागू होता है। उनके बीच यांत्रिक अंतर नगण्य माना जाता है। (3) एएफएम प्रयोगों में, जांच सीधे नाभिक पर कोशिका झिल्ली और साइटोस्केलेटन के माध्यम से बल लागू कर रही है। एक्टिन फिलामेंट्स को बाधित करने के बाद, नाभिक पर एएफएम-लागू बल नाभिक पर माइक्रोबीड्स-लागू बल के समान होता है, इसके बावजूद झिल्ली अभी भी पूर्व मामले में एएफएम जांच और नाभिक के बीच स्थित है।

चुंबकीय बल वाईएपी एन /सी अनुपात के परिवर्तन को ट्रिगर करता है
यह साबित करने के लिए कि माइक्रोबीड्स पर लागू चुंबकीय बल नाभिक को विकृत कर सकता है और वाईएपी स्थानांतरण को प्रेरित कर सकता है, माइक्रोबीड्स आंतरिककरण के साथ कोशिकाओं के वाईएपी एन / सी अनुपात को तीन चरणों में निर्धारित किया गया था: (1) बल लागू करने से पहले, (2) बल लागू करने के बाद, और (3) बल जारी करने के बाद। बल लागू या जारी किए जाने पर कुछ कोशिकाओं ने परमाणु आकार और वाईएपी एन / सी अनुपात में परिवर्तन दिखाया (चित्रा 7 ए, सी)। वाईएपी में तीव्रता परिवर्तन को दो संभावित तंत्रों द्वारा जिम्मेदार ठहराया जा सकता है: (1) वाईएपी-एफपी प्रोटीन बल आवेदन के बाद साइटोप्लाज्म से नाभिक में स्थानांतरित होते हैं। इस मामले में, परमाणु धुंधला कोई संकेत परिवर्तन नहीं दिखाना चाहिए। परमाणु धुंधला तीव्रता काफी हद तक नहीं बदलनी चाहिए; (2) वाईएपी-एफपी प्रोटीन बल आवेदन के बाद स्थानांतरित नहीं होते हैं। देखे गए वाईएपी तीव्रता परिवर्तन बल-प्रेरित परमाणु मात्रा परिवर्तन और परिणामस्वरूप वाईएपी-एफपी एकाग्रता परिवर्तन के कारण होते हैं। इस मामले में, परमाणु धुंधला तीव्रता वाईएपी परमाणु तीव्रता के समान प्रवृत्ति में बदलना चाहिए क्योंकि नाभिक की मात्रा बदलने के साथ धुंधला डाई की एकाग्रता भी बदल जाती है। इसलिए, लाल चैनल (उत्तेजना: 650 एनएम; उत्सर्जन: 681 एनएम) से परमाणु धुंधला तीव्रता परिवर्तन मापा गया था। हरे चैनल में वाईएपी में तीव्रता में परिवर्तन होता है, लेकिन लाल चैनल में नाभिक धुंधला होने में कोई तीव्रता परिवर्तन नहीं होता है। इस प्रकार, पहला तंत्र संभवतः मौजूद है (चित्रा 7 बी)। सामूहिक रूप से, परिणाम बताते हैं कि चुंबकीय बल-प्रेरित परमाणु विरूपण वाईएपी स्थानांतरण को ट्रिगर करता है।

इसके बाद, वाईएपी एन / सी अनुपात के शुद्ध परिवर्तन को कोशिकाओं के दो समूहों के भीतर निर्धारित किया गया था: (1) माइक्रोबीड के बिना कोशिकाएं आंतरिक (ग्रे डॉट्स, नियंत्रण, एन = 9); और (2) आंतरिक माइक्रोबीड (ओं) के साथ चयनित कोशिकाएं जो वाईएपी एन / सी अनुपात (छोटे बल के लिए हरे बिंदु, बड़े बल के लिए लाल बिंदु, एन = 11) के परिवर्तन को दर्शाती हैं। 0.8 nN बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (s) वाली कोशिकाएं शुद्ध YAP N/C अनुपात परिवर्तन = -0.030 ± 0.029, n = 11 दिखाती हैं; नियंत्रण कक्ष नेट वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = -0.003 ± 0.012, एन = 9 दिखाते हैं। 1.4 nN बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (s) वाली कोशिकाएं शुद्ध YAP N/C अनुपात परिवर्तन = 0.011 ± 0.040, n = 11 दिखाती हैं; नियंत्रण कक्ष नेट वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = 0.005 ± 0.005, एन = 9 (चित्रा 8 ए) दिखाते हैं। 0.8 nN बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (s) वाली कोशिकाएं पूर्ण शुद्ध YAP N/C अनुपात परिवर्तन = 0.057 ± 0.017, n = 11 दिखाती हैं; नियंत्रण कक्ष नेट वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = 0.021 ± 0.007, एन = 9 दिखाते हैं। अंतर महत्वपूर्ण है (पी मान = 0.0093, **)। 1.4 nN बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (ओं) वाली कोशिकाएं पूर्ण शुद्ध YAP N/C अनुपात परिवर्तन = 0.070 ± 0.020, n = 11 दिखाती हैं; नियंत्रण कक्ष शुद्ध वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = 0.010 ± 0.003, एन = 9 दिखाते हैं। अंतर महत्वपूर्ण है (पी मान = 0.0007, ***) (चित्रा 8 बी)। साथ में, ये परिणाम पुष्टि करते हैं कि साइटोप्लाज्म के भीतर माइक्रोबीड्स पर लागू चुंबकीय बल वास्तव में वाईएपी स्थानांतरण को प्रेरित कर सकता है और वाईएपी एन / सी अनुपात को बदल सकता है।

Figure 1
चित्र 1: चुंबकीय गतिशील उपकरण का डिजाइन और चुंबकीय माइक्रोबीड्स द्वारा सेल में योजनाबद्ध बल अनुप्रयोग। (A) चुंबक को पकड़ने और इसे x, y और z दिशाओं में स्थानांतरित करने के लिए लागू डिवाइस का त्रि-आयामी योजनाबद्ध। डिवाइस में चौड़ाई में 241.3 मिमी और ऊंचाई में 104.1 मिमी, दो नॉब्स, एक बार और एक चुंबक शामिल हैं। नॉब्स को सही ऑपरेशन रोटेशन दिशा में विभाजित किया जाएगा, जो संबंधित दिशा में आंदोलन प्रदान करेगा। चुंबकीय माइक्रोबीड्स पर विभिन्न परिमाण और दिशा के साथ चुंबकीय बल लागू करने के लिए चुंबक को डिश के करीब उतारा जाएगा/ उठाया जाएगा। (बी) उदाहरण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) छवि 7 μm आयरन माइक्रोबीड। (सी) साइटोप्लाज्म के अंदर वितरित चुंबकीय माइक्रोबीड्स नाभिक जैसे ऑर्गेनेल पर बल लागू कर सकते हैं जब चुंबकीय क्षेत्र लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: चुंबकीय माइक्रोबीड (नीले तीर द्वारा इंगित काला खोखला) दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां कोशिका में (वाईएपी द्वारा इंगित) और नाभिक के बाहर आंतरिक होती हैं। (A) वाईएपी (हरा), नाभिक (लाल), और उज्ज्वल-क्षेत्र के सेल का एक्स-वाई क्रॉस-सेक्शन। (बी) सेल का 3 डी पुनर्निर्माण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: कोशिकाओं द्वारा आंतरिक माइक्रोबीड्स परमाणु आकार और वाईएपी एन / सी अनुपात को प्रभावित नहीं करते हैं। (ए) कोशिकाओं की प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति छवियां जिनमें कोई माइक्रोबीड, एकल माइक्रोबीड और मल्टी-माइक्रोबीड आंतरिककरण नहीं है। नीले तीर साइटोप्लाज्म के अंदर माइक्रोबीड्स की स्थिति का संकेत देते हैं। (बी) सह-संस्कृति के 7 घंटे (एन = 13), 12 एच (एन = 62), और 24 एच (एन = 40) पर, कोशिकाओं का प्रतिशत कोई माइक्रोबीड, एकल माइक्रोबीड और मल्टी-माइक्रोबीड आंतरिककरण नहीं दिखाता है। (सी) परमाणु परिपत्रता नियंत्रण कोशिकाओं और माइक्रोबीड आंतरिककरण वाली कोशिकाओं के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाती है। नियंत्रण # 1 (माइक्रोबीड सह-संस्कृति के बिना): परिपत्रता = 0.806 ± 0.037, एन = 20; नियंत्रण # 2 (माइक्रोबीड सह-संस्कृति के साथ, माइक्रोबीड आंतरिककरण के बिना): परिपत्रता = 0.806 ± 0.035, एन = 22; एकल माइक्रोबीड आंतरिककरण: परिपत्रता = 0.793 ± 0.048, एन = 15; बहु-माइक्रोबीड आंतरिककरण: परिपत्रता = 0.780 ± 0.061, एन = 7। (घ) वाईएपी एन/सी अनुपात नियंत्रण कोशिकाओं ( माइक्रोबीड सह-संस्कृति के साथ, माइक्रोबीड आंतरिककरण के बिना, वाईएपी एन/सी अनुपात = 1.155 ± 0.074, एन = 35) और माइक्रोबीड आंतरिककरण वाली कोशिकाओं (वाईएपी एन/सी अनुपात = 1.140 ± 0.078, एन = 36) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एक्टिन फिलामेंट्स के साथ और बिना नाभिक पर प्रत्यक्ष बल अनुप्रयोग। (ए) कोशिकाएं एक्टिन फिलामेंट्स (पीला) दिखाती हैं। (A1) नाभिक की छवि जब कोई बल लागू नहीं किया जाता है। (A2) बल लागू होने के बाद नाभिक की छवि। (A3) बल आवेदन से पहले और बाद में परमाणु सीमा की ओवरलैप छवि परमाणु इंडेंटेशन दिखाती है। (बी) कोशिकाएं साइटो डी उपचार (2.5 μM, 1 घंटे) के बाद बाधित एक्टिन फिलामेंट्स (पीला) दिखाती हैं। (B1) नाभिक की छवि जब कोई बल लागू नहीं किया जाता है। (B2) बल लागू होने के बाद नाभिक की छवि। (B3) बल आवेदन से पहले और बाद में परमाणु सीमा की ओवरलैप छवि बाधित एक्टिन साइटोस्केलेटन के साथ परमाणु इंडेंटेशन दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: इंट्रासेल्युलर चुंबकीय माइक्रोबीड का स्थानिक और लौकिक नियंत्रण। (A) मैग्नेट की एक जोड़ी स्थानिक रूप से चुंबकीय माइक्रोबीड को नियंत्रित करती है। (A1) स्थिति 1 पर सेल सीमा (हरी रेखा), परमाणु सीमा (लाल रेखा), और चुंबकीय माइक्रोबीड (पीली रेखा) की उज्ज्वल-क्षेत्र छवि। (A2) चुंबकीय माइक्रोबीड ने नाभिक को स्थिति 1 पर रखा। (A3) चुंबकीय माइक्रोबीड को स्थिति 2 (पीली रेखा) में ले जाया जाता है। स्थिति 1 को संदर्भ (पीली डैश्ड लाइन) के रूप में दिखाया गया है। (A4) चुंबकीय माइक्रोबीड स्थिति 2 पर नाभिक को स्थापित करता है। (बी) मैग्नेट की एक जोड़ी अस्थायी रूप से चुंबकीय माइक्रोबीड को नियंत्रित करती है। (B1) एक कोशिका की उज्ज्वल-क्षेत्र छवि जिसमें समय बिंदु I पर कोई बल लागू नहीं होता है। (B2) चुंबकीय माइक्रोबीड समय बिंदु II पर नाभिक पर एक बल लागू करता है। (B3) चुंबकीय माइक्रोबीड समय बिंदु III पर नाभिक से बल जारी करता है। (B4) चुंबकीय माइक्रोबीड समय बिंदु IV पर नाभिक पर एक बड़ा बल लागू करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6. एएफएम इंडेंटेशन का उपयोग करके नाभिक पर माइक्रोबीड-लागू बल का अंशांकन। (ए) अंशांकन प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। चुंबकीय माइक्रोबीड नाभिक (बाएं) पर क्षैतिज संपीड़न लागू करता है, और एएफएम जांच नाभिक पर लंबवत रूप से इंडेंट करता है। (बी) एएफएम इंडेंटेशन फोर्स बनाम परमाणु विरूपण। (सी) चुंबकीय माइक्रोबीड द्वारा बल अनुप्रयोग से पहले और बाद में नाभिक विरूपण (1.5 μm) की प्रतिनिधि छवि। (डी) 1.4 एनएन बल के साथ एएफएम इंडेंटेशन से पहले और बाद में समान नाभिक विरूपण (1.5 μm) की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: वाईएपी एन/सी अनुपात परिवर्तन को दर्शाने वाला प्रतिनिधि डेटा चुंबकीय बल अनुप्रयोग और रिलीज द्वारा प्रेरित होता है। (A) वाईएपी (हरा) का एक्स-वाई क्रॉस-सेक्शन और सेल का न्यूक्लियस (लाल) फ्लोरोसेंट इमेज बिना किसी बल, बल और बल के। बल-ऑन स्थिति में, साइटोप्लाज्मिक वाईएपी तीव्रता एक पीले तीर द्वारा इंगित स्थान पर कम हो जाती है जबकि परमाणु वाईएपी तीव्रता बढ़ जाती है। वाईएपी एन /सी अनुपात बढ़ता है। (बी) वाईएपी एन/सी अनुपात बल (1.0791 से 1.2327 तक) बढ़ जाता है और बल बंद होने पर घट जाता है (1.2327 से 1.1548 तक)। सामान्यीकृत परमाणु दाग तीव्रता बल अनुप्रयोग (1.00117) और रिलीजिंग (0.95578) के साथ मामूली परिवर्तन दिखाती है। (C) कोशिका की वाईएपी (हरा) और न्यूक्लियस (लाल) छवि का X-Z क्रॉस-सेक्शन बिना किसी बल, बल और बल के बंद नहीं होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: चुंबकीय बल अनुप्रयोग द्वारा प्रेरित वाईएपी एन/सी अनुपात परिवर्तन। (A) 0.8 nN बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (s) वाली कोशिकाएं शुद्ध YAP N/C अनुपात परिवर्तन दिखाती हैं = -0.030 ± 0.029, n = 11; नियंत्रण कक्ष नेट वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = -0.003 ± 0.012, एन = 9 दिखाते हैं। 1.4 nN बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (s) वाली कोशिकाएं शुद्ध YAP N/C अनुपात परिवर्तन = 0.011 ± 0.040, n = 11 दिखाती हैं; नियंत्रण कक्ष नेट वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = 0.005 ± 0.005, एन = 9 दिखाते हैं। (बी) 0.8 एनएन बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (एस) वाली कोशिकाएं पूर्ण शुद्ध वाईएपी एन / सी अनुपात परिवर्तन दिखाती हैं = 0.057 ± 0.017, एन = 11; नियंत्रण कक्ष नेट वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = 0.021 ± 0.007, एन = 9 दिखाते हैं। अंतर महत्वपूर्ण है (पी मान = 0.0093, **)। 1.4 nN बल पर, आंतरिक माइक्रोबीड (ओं) वाली कोशिकाएं पूर्ण शुद्ध YAP N/C अनुपात परिवर्तन = 0.070 ± 0.020, n = 11 दिखाती हैं; नियंत्रण कक्ष शुद्ध वाईएपी एन /सी अनुपात परिवर्तन = 0.010 ± 0.003, एन = 9 दिखाते हैं। अंतर महत्वपूर्ण है (पी मान = 0.0007, ***) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: परमाणु आकार और परमाणु धुंधला तीव्रता। (ए) साइटो डी उपचार के बिना, (बी) साइटो डी उपचार और (सी) मृत कोशिका के साथ। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: बल आवेदन प्रक्रिया दिखाने वाला एक उज्ज्वल-क्षेत्र वीडियो। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चुंबकीय माइक्रोबीड्स (खंड 2.2) का आंतरिककरण महत्वपूर्ण है क्योंकि बाह्य माइक्रोबीड्स सीधे नाभिक पर बल लागू नहीं कर सकते हैं। बल अनुप्रयोग और इमेजिंग (धारा 5.3) इस प्रयोग में महत्वपूर्ण कदम हैं, और नाभिक को विकृत करने और सार्थक जैविक परिणामों को प्रेरित करने के लिए आवश्यक बल नमूना-निर्भर हो सकता है। इस प्रयोग में बल परिमाण (0.8 nN और 1.4 nN) को कम संवेदनशील कोशिकाओं में परमाणु मेकेनो-सेंसिंग को ट्रिगर करने के लिए और बढ़ाया जा सकता है।

उच्च थ्रूपुट के साथ मात्रात्मक तरीके से चुंबकीय बल को लागू करने के लिए, एकल माइक्रोबीड का आंतरिककरण एक आदर्श दृष्टिकोण है। इस अध्ययन में, एकल-माइक्रोबीड आंतरिककरण वाली कोशिकाओं का प्रतिशत 12 घंटे (26%) और 24 घंटे (28%) पर समान था, जबकि माइक्रोबीड आंतरिककरण के बिना कोशिकाएं 24 घंटे (20%) की तुलना में 12 घंटे (53%) पर अधिक थीं (चित्रा 3 बी)। यह माना जाता है कि बल-अनुप्रयोग प्रयोग के लिए 12 घंटे इष्टतम समय है क्योंकि अधिक एकल माइक्रोबीड्स को शामिल किया जा सकता है, और कोशिकाओं को नियंत्रित किया जा सकता है। विभिन्न सेल लाइनों और माइक्रोबीड आकारों के लिए, सह-संस्कृति समय और माइक्रोबीड एकाग्रता का परीक्षण संबंधित इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए।

प्रयोगों में, माइक्रोबीड्स को विशेष रूप से नाभिक से बांधने के लिए लेपित नहीं किया गया था। इसलिए, माइक्रोबीड्स से नाभिक में सीधे प्रेषित बल केवल संपीड़ित होने की संभावना है। परिणाम बताते हैं कि वाईएपी एन / सी अनुपात सेल आबादी को बढ़ाता है और कम करता है (चित्रा 8 ए)। एक संभावित कारण यह है कि माइक्रोबीड्स के माध्यम से लागू चुंबकीय बल साइटोस्केलेटन के भीतर सकारात्मक या नकारात्मक तनाव परिवर्तन का कारण बन सकता है और वाईएपी एन / सी अनुपात को क्रमशः बढ़ाने या घटाने के लिएविनियमित कर सकता है। पिछले शोध से पता चलता है कि नाभिक पर संपीड़ित बल वाईएपी एन / सी अनुपात28 में वृद्धि को प्रेरित करता है। भविष्य के प्रयोगों में, नाभिक के प्रत्यक्ष बल संवेदन का अध्ययन करने के लिए, साइटोस्केलेटन को नाभिक में साइटोस्केलेटन से बल संचरण को खत्म करने के लिए बाधित किया जा सकता है।

वर्तमान तरीकों में दो संभावित कमियां हैं। सबसे पहले, इन प्रयोगों में, 3 डी मूवर (चित्रा 1 ए) का उपयोग मोतियों की गति को समायोजित करने के लिए किया गया था, जिसे वास्तविक समय कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा निगरानी की जाती है और इसका उद्देश्य नाभिक पर एक संपीड़ित बल लागू करना है। हालांकि, परमाणु झिल्ली की फिसलन प्रकृति और साइटोप्लाज्म में जटिल वातावरण के कारण, मोतियों-लागू बल की दिशा विशुद्ध रूप से संपीड़ित नहीं हो सकती है (यानी, परमाणु झिल्ली की सतह के बिल्कुल लंबवत नहीं)। यह अपूर्णता परमाणु झिल्ली पर एक कतरनी बल लागू करने का कारण बन सकती है। दूसरा, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले वर्तमान माइक्रोबीड्स नाभिक के साथ बांधने के लिए एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित नहीं हैं, क्योंकि गैर-संपर्क चुंबकीय एक्ट्यूएटर के लाभ को प्रदर्शित करने के लिए वर्तमान प्रयोग में मोतियों की स्थानिक गतिशीलता महत्वपूर्ण है। इसलिए, वर्तमान विधि परमाणु झिल्ली पर तनाव लागू नहीं कर सकती है।

भविष्य में, (1) एंटी-नेस्प्रिन -1 एंटीबॉडी वाले मोतियों को विशेष रूप से नाभिक के साथ बांधने के लिए संयुग्मित किया जाएगा। यह माइक्रोबीड्स और लक्ष्य प्रोटीन के बीच प्रत्यक्ष और विशिष्ट बल संचरण की गारंटी दे सकता है। (2) फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ एम्बेडेड नरम हाइड्रोगेल में एकल चुंबकीय माइक्रोबीड में हेरफेर करके बल की दिशा को कैलिब्रेट किया जाएगा। फ्लोरोसेंट मोतियों के 3 डी विस्थापन का उपयोग हाइड्रोगेल के विरूपण क्षेत्र की गणना करने और लागू चुंबकीय क्षेत्र के कार्य के रूप में बल दिशा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। माइक्रोबीड को नाभिक के साथ रासायनिक रूप से बांधने के बाद, एक ज्ञात दिशा के साथ बल लगाने से बल प्रकार (तनाव, संपीड़न या कतरनी) निर्धारित होगा। (3) नाभिक के 3 डी सिमुलेशन फेम मॉडल के निर्माण के लिए परमाणु धुंधला की 3 डी इमेजिंग का उपयोग किया जाएगा। चुंबकीय बल अनुप्रयोग से पहले और बाद में परमाणु विरूपण की तुलना करके बल दिशा को सत्यापित किया जा सकता है।

इस अध्ययन में विकसित अनूठी तकनीक कई संभावित फायदे प्रदान करती है: (1) एएफएम जांच द्वारा ऊर्ध्वाधर इंडेंटेशन की तुलना में, चुंबकीय माइक्रोबीड्स किसी भी दिशा में बल लागू कर सकते हैं। 2 डी सब्सट्रेट सतहों पर संवर्धित कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली और परमाणु लिफाफे की ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज सतहों पर विषम प्रोटीन वितरण और अभिविन्यास हो सकता है। क्षैतिज रूप से बल लागू करने से पहले से अनदेखे मेकानो-सेंसिंग प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया जा सकता है। (2) एक बार जब माइक्रोबीड्स नाभिक से जुड़ने के लिए कार्यात्मक रूप से लेपित हो जाते हैं, तो अलग-अलग बल दिशाओं के कारण अंतर परमाणु मेकानो-सेंसिंग का आगे अध्ययन करने के लिए धक्का और खींचने वाले बलों दोनों को सीधे नाभिक पर लागू किया जा सकता है। (3) कुछ परमाणु लिफाफा प्रोटीनों के लिए माइक्रोबीड्स के विशिष्ट बंधन को नियंत्रित करके, परमाणु बल संवेदन के पहले से जांच किए गए तंत्र को स्पष्ट किया जा सकता है। उभरते सबूत ों से पता चलता है कि नाभिक संभवतः एक मेकानो-सेंसर36 है, और परमाणु मेकानो-सेंसिंग वाईएपी ट्रांसलोकेशन28 का सबसे प्रत्यक्ष नियामक है। परमाणु विनियमित वाईएपी स्थानांतरण के तंत्र का सक्रिय रूप से अध्ययन किया जाता है और नाभिक में मेचानो-सेंसर या मापदंडों के कई उम्मीदवारों का प्रस्ताव किया जाता है, जिसमें परमाणु छिद्र आकार28, परमाणु आकार25,61, एलआईएनसी कॉम्प्लेक्स और परमाणु लिफाफा तनाव20 शामिल हैं। चुंबकीय माइक्रोबीड्स में हेरफेर करने से एलआईएनसी कॉम्प्लेक्स पर प्रत्यक्ष बल अनुप्रयोग और परमाणु-लिफाफा तनाव और आकार के नियंत्रित नियमों द्वारा ऐसे तंत्रों की विस्तृत खोज की संभावना खुलती है। (4) नाभिक पर बलों को लागू करने के अलावा, माइक्रोबीड्स प्लाज्मा झिल्ली के आंतरिक पक्ष को बांधने के लिए भी उपयुक्त हैं ताकि यह पता चल सके कि झिल्ली प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर डोमेन और उनके जटिल बायोफिज़िकल संकेतों का जवाब कैसे देते हैं।

सारांश में, इस पेपर ने एक विधि का प्रदर्शन किया जो (1) परमाणु आकृति विज्ञान और प्रोटीन कार्यों को प्रभावित किए बिना साइटोप्लाज्म में सूक्ष्म आकार के लोहे के माइक्रोबीड्स वितरित करता है, (2) चुंबकीय माइक्रोबीड्स द्वारा नाभिक पर बल लागू करता है, और (3) बल अनुप्रयोग के दौरान कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस लाइव-सेल इमेजिंग करता है। ये गैर-इनवेसिव उपकरण एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनेल के प्रत्यक्ष एपिजेनेटिक हेरफेर, न्यूक्लियस मेकेनोट्रांसडक्शन की सुपर-रिज़ॉल्यूशन-इमेजिंग-आधारित पूछताछ, और बल-विनियमित 3 डी क्रोमोसोम संगठन (हाई-सी के साथ संयोजन में: उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमोसोम पुष्टिकरण कैप्चर) और सेल फिजियोलॉजी और पैथोबायोलॉजी के संदर्भों में रीप्रोग्रामिंग की विस्तृत खोज की संभावनाओं को खोलते हैं।

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Disclosures

घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूएफ गेटोरेड अवार्ड स्टार्ट-अप पैकेज (एक्सटी), यूएफएचसीसी पायलट अवार्ड (एक्सटी और डॉ डाइटमार सीमैन), यूएफ अपॉर्चुनिटी सीड फंड (एक्सटी), और यूएफएचसीसी यूनिवर्सिटी स्कॉलर्स प्रोग्राम (एचवाई वांग) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। हम ईमानदारी से डॉ जोनाथन लिच (यूएफएचसीसी), डॉ रॉल्फ रेने (यूएफएचसीसी), डॉ क्रिस्टोफर वल्पे (यूएफएचसीसी), डॉ ब्लैंका शर्मा (बीएमई), डॉ मार्क शेप्लाक (एमएई एंड ईसीई), डॉ डैनियल फेरिस (बीएमई), डॉ मालिसा सारंटिनोरानोंट (एमएई), डॉ अशोक कुमार (एमएई), डॉ बेंजामिन केसेलोव्स्की (बीएमई), डॉ ब्रेंट गिला (बीएमई), डॉ ब्रेंट गिला (बीएससीई), डॉ ब्रेंट गिला (बीएससीई) के साथ बौद्धिक चर्चाओं और तकनीकी सहायता की सराहना करते हैं। डॉ ग्रेगरी ए हुदल्ला (बीएमई), डॉ स्टीवन घिज्जानी (ओएसएसएम), डॉ येनिसेल क्रूज-अल्मीडा (सीडीबीएस), डॉ रोजर फिलिंगिम (सीडी-बीएस), डॉ रॉबर्ट कॉडल (ओएमएस), डॉ जॉन न्यूबर्ट (डीएन-ओआर), डॉ जस्टिन हिलियार्ड (न्यूरोसर्जरी), डॉ तियान हे (हार्वर्ड विश्वविद्यालय), डॉ यूहुआ टैन (हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय), डॉ जेसी एल-एस एयू (इंस्टीट्यूट ऑफ क्वांटिटेटिव सिस्टम्स फार्माकोलॉजी), डॉ डेविड हैन (यूनिवर्सिटी ऑफ एरिजोना), डॉ जेसी एल-एस एयू (इंस्टीट्यूट ऑफ क्वांटिटेटिव सिस्टम्स फार्माकोलॉजी), डॉ डेविड हैन (एमडी-बीएस), डॉ रॉबर्ट कॉडल (ओएमएस), डॉ जॉन न्यूबर्ट (डीएन-ओआर), डॉ जस्टिन हिलियार्ड (न्यूरोसर्जरी), डॉ तियान हे (हार्वर्ड विश्वविद्यालय), डॉ यूहुआ टैन (हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय), डॉ जेसी एल-एस एयू (मात्रात्मक प्रणाली फार्माकोलॉजी संस्थान), डॉ डेविड हैन (डीओआई)। और निकॉन की समर्थन टीम (डॉ जोस सेरानो-वेलेज़, लैरी कोर्डन और जॉन एकमैन)। हम तांग, यामागुची, शर्मा, एयू, सीमैन और गुआन की अनुसंधान प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों और यूएफ एमएई विभाग के सभी कर्मचारियों के प्रभावी समर्थन के लिए गहराई से आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

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References

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जीव विज्ञान अंक 185 न्यूक्लियस मेकेनोबायोलॉजी चुंबकीय बल CRISPR / Cas9 मेकेनोट्रांसडक्शन नरम सक्रिय पदार्थ हां से जुड़े प्रोटीन (वाईएपी) फ्लोरोसेंट कार्यात्मक इमेजिंग डिजिटल इमेजिंग प्रसंस्करण ऑप्टोजेनेटिक्स एपिजेनेटिक्स
न्यूक्लियस मेकेनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए 3 डी चुंबकीय बल एक्ट्यूएटर और मल्टी-फंक्शनल फ्लोरेसेंस इमेजिंग का संयोजन
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Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

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