Summary
本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。
Abstract
メカノバイオロジーにおける基本的な問題は、細胞生理学と病理学の文脈で、生細胞が細胞外の機械的刺激をどのように感知するかということです。細胞外力学的刺激の細胞メカノ感覚は、膜受容体、関連するタンパク質複合体、および細胞骨格を介して行われると考えられています。メカノバイオロジーの最近の進歩は、細胞質自体の細胞核が独立して機械的刺激を同時に感知できることを示しています。しかし、細胞核が機械的刺激をどのように感知し、形質導入し、応答するかについての機構的理解は、主に従来のツールによる核力学へのアクセスと定量化における技術的課題のために不足しています。この論文では、正確で非侵襲的な3D機械的刺激を適用して細胞核を直接変形させる新しい磁力アクチュエータの設計、製造、および実装について説明します。CRISPR/Cas9で改変された細胞を用いて、このツールと高解像度の共焦点蛍光イメージングを組み合わせることで、単一細胞におけるメカノ感受性Yes随伴タンパク質(YAP)のリアルタイムダイナミクスを核変形の関数として明らかにすることができることを実証する。この簡単な方法は、メカノバイオロジーコミュニティにおける現在の技術ギャップを埋め、核のメカノトランスダクションと細胞機能との関係に存在する知識ギャップに対する答えを提供する可能性を秘めています。
Introduction
本研究では、細胞核に直接機械的な力を加える磁気アクチュエータと、細胞内構造変化と機能変化を同時に撮像する共焦点蛍光顕微鏡を組み合わせることで、核メカノバイオロジーを解明する新しい技術を開発し、応用することを目的としています。細胞は、組織の硬さ1,2,3,4、間質液圧およびせん断応力5,6,7、表面トポロジー/形状8,9,10,11,12、および引張/圧縮応力13,14を含む細胞外生物物理学的シグナルを感知します。15,16。生物物理学的シグナルは生化学的シグナルに変換され、遺伝子発現と細胞挙動の潜在的な下流変化を引き起こします-メカノトランスダクションとして知られるプロセス17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.メカノトランスダクションプロセスを研究するために、原子間力顕微鏡28、細胞伸張装置29、バイオMEMS(微小電気機械システム)力センサ15、30、31、せん断レオロジー32、ステレオビジョンシステム33など、細胞に機械的力を加えるための無数の技術が開発されています。.最近のレビューでは、細胞外の機械的手がかりを適用し、メカノセンシングを妨害するアプローチを要約しています34。現在まで、これらの方法のほとんどは細胞原形質膜に力を加えており、細胞はインテグリン、カドヘリン、イオンチャネル、Gタンパク質共役型受容体などの膜受容体を介してこれらの細胞外生物物理学的シグナルを直接受信しています。続いて、それらは細胞内の細胞骨格および核にシグナルを伝達する。例えば、メカノセンシングの指標としてyes随伴タンパク質(YAP)転座を用いると、細胞は細胞膜からの基質の硬さおよび細胞外張力の機械的シグナルを感知し、それらを細胞骨格を介して核に伝達し、YAP細胞質から核への転座を誘導することが示されている28,35。
最近の証拠は、細胞核自体が独立したメカノセンサーであることを示唆しています8,36,37。これは、細胞から採取された単離された核で行われた実験によって証明され、そこでは、核がそれらに直接加えられた機械的な力に応答してそれらの剛性を適応的に変化させることが明らかになった36。多くの生理学的状態の間、腫瘍細胞および健康な細胞の両方における核は、細胞外生物物理学的シグナルを感知し、それらの機械的特性および集合体を変化させる38,39,40。例えば、血管外漏出時に、腫瘍細胞の核硬直は減少し、24時間38時間にわたって柔らかさを維持する。限られた間質空間を通る移動中に、腫瘍細胞の核はしばしばその構造的完全性を失い、回復する39。しかし、核が生物物理学的シグナルを感知する方法は不明ですが、ラミンA / Cや核骨格と細胞骨格のリンカー(LINC)複合体など、いくつかの核エンベロープタンパク質とタンパク質ファミリーが関与していることがわかっています38,41。したがって、核に直接力を加えることができる新しい非侵襲的方法は、細胞原形質膜と細胞骨格からの力伝達の影響を切り離し、これまでアクセスできなかった核メカノセンシングの分子メカニズムの解明に役立ちます。
光ピンセットを用いて細胞小器官42を操作し、細胞43に注入したマイクロビーズを用いた研究は、核に直接力を加える技術力を示した。しかしながら、光ピンセット技術にはいくつかの制限がある:(1)低スループット光ピンセットは、しばしば一度に1つの細胞またはマイクロビーズしか操作しない。(2)核の潜在的な光損傷および温度アーチファクト変形には数十のpN36が必要であり、対応する必要なレーザー出力はpN44,45あたり約10mWです。このようなレーザー強度は、実験46の間に細胞における光損傷を引き起こし、細胞機能を混乱させるのに十分である。
生細胞内のマイクロビーズを介して加えられる磁力は、核に直接力を加える可能性を示し、光ピンセットの限界を克服します。マイクロビーズが細胞質に送達されると、磁場は複数のマイクロビーズに同時にハイスループットな方法で磁力を及ぼすことができます。磁場は細胞機能47に影響を与えないが、pNからnNまでの力を生成し、これは核変形を誘発するのに十分である36,48,49。現在までに、磁気マイクロビーズの操作は、細胞原形質膜48、細胞質50の内部、F-アクチン51、核47の内部、および単離された核36に適用されてきた。しかし、マイクロビーズの磁気操作は、核内のメカノトランスダクションを研究するために核エンベロープに直接的な機械的力を加えるために使用されたことはありません。
本論文では、磁性マイクロビーズを細胞質に非侵襲的に送達し、このマイクロビーズを使用して核に機械的な力を加える簡単な技術を開発しました(図1)。ここでは、mNeonGreen21-10/11タグ付きYAPを内因的に発現するCRISPR/Cas9操作されたヒト正常B2B細胞株を使用して、この方法を検証します。YAPはメカノ感受性タンパク質であり、YAPの転座は核メカノセンシングによって制御されています14,28。CRISPR/Cas9制御ノックインアプローチは、内因性YAPに蛍光タンパク質(FP)mNeonGreen21-10/11をタグ付けするために選択されました。CRISPR編集は不完全な効率とオフターゲット効果を有することが知られているが、以前の出版物のプロトコルは、正しいオープンリーディングフレーム挿入のために選択するために蛍光ソーティングを統合した52、53、54。この追加の選択層により、以前に生成された20+細胞株においてオフターゲットタグ付け事象は観察されなかった52,53,54,55。これはスプリット蛍光タンパク質構築物ですが、原理的には、任意の発現可能な蛍光タグを使用できます。この標識アプローチは、導入遺伝子または抗体法よりも優れています。第一に、導入遺伝子発現とは異なり、タグ付きタンパク質は単コピー遺伝子投与量を維持し、天然遺伝子調節ネットワークの生理学的状況で発現し、タンパク質濃度、局在、および相互作用の偏差を制限する。この研究で使用されたタグ付け方法は、完全なFPタグ付けよりも桁違いに高いスループットと効率を達成します。また、固定アーチファクトや高品質で特異性の高い抗体の限られた入手による免疫蛍光に関連する課題を回避します。第二に、この論文で使用されているアプローチは、細胞生理学への摂動を最小限に抑え、すべての内因性YAPのリアルタイム啓示を可能にします。対照的に、他の一般的な導入遺伝子法は、しばしばYAPの過剰発現をもたらす。結果として生じる人工的な分布は、潜在的に細胞毒性を引き起こし、細胞のメカノセンシングに影響を与える可能性があります56、57、58。
この研究は、細胞質に送達された磁気マイクロビーズを介して核に直接力を加え、同時に生細胞蛍光イメージングを行うためのプロトコルを提示します。要約すると、ここで提示されたプロトコルは、(1)核の外側で磁気マイクロビーズを細胞内に送達する方法、(2)マイクロビーズを操作して核に磁力を加える方法、(3)操作中に細胞の共焦点蛍光イメージングを実行する方法、および(4)力を加えるプロセス全体を通してYAP核/細胞質(N / C)比を定量的に分析する方法を示しています。結果は、(1)エンドサイトーシスを介して、磁気マイクロビーズが7時間以内にB2B細胞の細胞質に非侵襲的に送達できることを示唆しています(図2および図3)。(2)核に直接加えられた定量化された磁力(図4、図5、および図6)だけで、CRISPR/Cas9操作B2B細胞におけるYAP N / C比の多様な変化を引き起こす可能性があります(図7および図8)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CRISPR/Cas9遺伝子改変B2B細胞のメンテナンス
- 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640を含むT25フラスコでB2B細胞を培養します。
- B2B細胞を加湿インキュベーター内で5%CO2を含む37°Cに維持する。
- コンフルエントが70%〜80%に達したときにB2B細胞を継代培養する。
- B2B細胞株を10%(v/v)DMSOを含むRPMI-1640培養培地の-80°C冷凍庫に保管します。
- 実験では継代数が10未満のB2B細胞を使用します。
2. 細胞培養
- 細胞をガラス底のペトリ皿に播種します。
- 内部にB2B細胞を含むフラスコをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動します。
- 真空ポンプを接続した吸引ピペットを使用してフラスコ内の培養液を除去します。
- フラスコを2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
- 吸引ピペットを使用してPBSを取り外します。
- 0.5 mLの0.05%トリプシン溶液を加えて、フラスコ基質の底から細胞を剥離します。
- フラスコをインキュベーターに5分間入れます。
- フラスコをバイオセーフティキャビネットに移動します。5 mLの新しい培養液をフラスコに加え、溶液を上下にピペットで固定します。
- 細胞を含む培地50 μL(300細胞/μL)をガラス底のペトリ皿に堆積させます。2 mLの培養液をペトリ皿に加えます。
- ペトリ皿をインキュベーターに入れます。セルが付着するまで12時間待ちます。
- 磁気マイクロビーズで細胞を培養します。
- 平均直径7μmのカルボニル鉄マイクロビーズ(以下、7μmマイクロビーズという、 材料表参照)を0.2g秤量する。
- ピペットを使用して、マイクロビーズを1 mLのRPMI-1640培地に懸濁します。
- B2B細胞の入ったペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに持っていきます。
- マイクロビーズを含む培地200 μLをペトリ皿に加えます。
注意: マイクロビーズの沈殿を避けるために、培地をすばやく追加します。 - マイクロビーズが細胞によって内在化されるまで、ペトリ皿をインキュベーターに戻します。6時間ごとにインターナリゼーションをチェックして、さまざまな細胞株のインターナリゼーションに最適な時間を決定します。
- インターナリゼーションを確認するには、共焦点蛍光イメージングを実行して、マイクロビーズ、核、および細胞境界を視覚化します。マイクロビーズが細胞によって内部化されている場合、それは細胞境界内にあります。
3. 核の可視化
- インキュベーター内の培養液1.5 mLを15分間温めます。
- バイオセーフティキャビネットのライトをオフにします。細胞、加温した培地、核染色、ベラパミルHClが入ったペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに入れます。
注:核染色成分は光に敏感です。操作中は光にさらさないでください。 - DMSOで1000倍の核染色を100倍に希釈します。
- 100 mM ベラパミル塩酸塩をDMSOで 10 mM に希釈します。
- 15 μLの100x核染色剤と15 μLの10 mMベラパミルHClを1.5 mLの培地に加えます。上下にピペッティングしてよく混ぜます。
- ペトリ皿から培地を取り出します。核染色を含む培養液をペトリ皿に加えます。
- 細胞をインキュベーターに2時間以上戻します。
4. 磁力印加金物の準備
- アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS)を使用してすべての部品を3Dプリントし、CAD設計に従って組み立てます(図1A)。CAD設計は 材料表に含まれています。
- 両面テープを使用して、磁石を磁石移動装置に取り付けます(図1A)。
- 磁石移動装置を顕微鏡ステージの横に設置します。3つのノブを使用して、磁石がペトリ皿の上を13mmから120mmの間で移動できるようになるまで、磁石の空間位置を調整します。
注意: 磁気マイクロビーズに不要な力が加わらないように、磁石とペトリ皿の間の距離の上限ができるだけ大きくなっていることを確認してください。この実験セットアップでは、120mmが最大値です。磁石が対物レンズや電動ステージなどの顕微鏡部品に干渉しないようにしてください。 - 磁石を最も高いz位置(120 mm)に設定します。
5. 強制適用と生細胞イメージング
- 長期イメージングのための環境チャンバーの設置
- 75%エタノール溶液を塗布して、環境チャンバーを完全に滅菌および洗浄します。
- 倒立顕微鏡の電動ステージに環境チャンバーを置きます。
- CO2タンクを開き、CO2流入速度を160mL /分に設定します。
- チャンバーの温度を44°C(上)、42°C(バス)、40°C(ステージ)に調整します。
- 20mLの精製水を環境チャンバーの浴に加え、湿度90%を維持します。
- 組織培養インキュベーターから標的細胞を含むガラス底のペトリ皿を取り出し、チャンバーに入れます。
- 環境チャンバーの金属クランプを適用して、ペトリ皿の位置を固定します。
注意: ペトリ皿は、クランプされていないと磁力が皿を動かす可能性があるため、チャンバー内でしっかりと固定する必要があります。 - チャンバーの蓋を閉めます。
- イメージングパラメータの最適化
- ピンホールサイズの最適化:ピンホールは焦点が合っていない光子をブロックします。ピンホールサイズを大きくすると、焦点が合っていない光子が多くなりますが、画像は明るくなります。ピンホールサイズを小さくすると、より焦点が合った暗い画像が得られます。ピンホールのサイズを最適化して、適切な信号対雑音比で焦点の合った共焦点画像を取得してください。
- レーザー強度の最適化:レーザー強度は励起の強度を決定し、したがって発光光を決定します。レーザー強度が低いため、信号対雑音比が低くなります。レーザー強度が高すぎると、光退色が発生します。それに応じてレーザー強度を調整します。
- ステップサイズとステップを最適化する:ステップとステップサイズによって、Zスタックで取得する画像の数が決まります。ステップサイズを小さくし、ステップを多くすると、Zスタックの解像度が向上しますが、光退色も増加します。この実験では、細胞高さ~15 μmの細胞に1 μmステップサイズを使用しました。
- 露光時間の最適化:露光時間は、細胞が励起レーザーにさらされる時間を決定します。露光時間が短いと、信号対雑音比が低下します。露光時間が長いと、光退色が発生します。この実験では、4秒あたり1フレームの露光時間を使用しました。
- イメージングパラメータの最適化:4つのパラメータの1つを繰り返し変更し、他のパラメータの一貫性を維持します。毎回、各画像のYAP N / C比を測定し、YAP N / C比の変化を比較して、光退色レベルを決定します。信号対雑音比、イメージング速度、および光退色のバランスが取れるまで、最適化プロセスを繰り返します。
- 最適化されたイメージングパラメータを使用してイメージング構成を定義し、実験中のイメージング設定を高速化します。
注意: この研究で使用される構成は、イメージングパラメータのセクション5.3で説明されています。セクション5.3の構成のイメージングパラメータを最適化するには、手順5.2.5と同じ方法を使用します。
- 小力印加と共焦点イメージング
注:この研究では、Nikon Ti2-E顕微鏡を使用してイメージングを行い、画像取得の詳細な手順を以下に示します。- 倒立顕微鏡を開きます。ソフトウェアアプリケーション Elementsを開きます。
- コンフィギュレーション magnetic_findを定義します。FITCチャネルのみをチェックします。光電子増倍管 HV = 70、オフセット = 0、レーザー強度 = 10 に設定します。1 /2 ボタンをクリックして、スキャン速度を1秒あたり2フレームに設定します。ピンホールのサイズを1.2AUに設定するには、 1.2A.U. ボタンをクリックします。この設定は、手順 5.3.5 で使用されます。
- 構成 magnetic_YAP_Nucleusを定義します。FITCチャネルを確認してください。光電子増倍管 HV = 70、オフセット = 0、レーザー強度 = 10 に設定します。1 /2 ボタンをクリックして、スキャン速度を4秒ごとに1フレームに設定します。ピンホールのサイズを1.2AUに設定するには、 1.2A.U. ボタンをクリックします。核境界と核染色強度を画像化するには、Cy5チャネルを確認してください。光電子増倍管 HV = 70、オフセット = 0、レーザー強度 = 10 に設定します。ピンホールサイズは、3D YAPイメージング用に最適化されています。Cy5チャネルを確認した後、 1.2 A.U. ボタンを再度クリックしないでください。この設定は、ステップ 5.3.7 で使用されます。
- 必要に応じて、エレメントを介してDIAをオンにします。SpinView を開き、明視野を使用してオブジェクトのフォーカスを調整し、セルのピントが合った鮮明な画像を取得します。10倍の対物レンズを使用して、内部に1つのマイクロビーズがある、内部に複数のマイクロビーズがある、内部にマイクロビーズがないという3つの条件で適切な複数の単一セルを見つけます。40倍の対物レンズに切り替えます。この位置に適切な位置番号を付けます。
- 要素を開きます。magnetic_findをクリックします。[インターロックの削除]ボタンをクリックします。
- [ スキャン ] をクリックし、焦点面の Z 位置を調整します。 [上 ] ボタンと [下 ] ボタンをクリックして、選択したセルの Z スタックの下限と上限を設定します。もう一度 [ スキャン ] をクリックしてスキャンを停止します。
- magnetic_YAP_Nucleus構成に切り替えます。ファイル名を before_small_force.nd2 に設定します。記録されたZスタックの[実行]ボタンをクリックします。
- 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。 スピンビュー を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から46mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。ビデオをチェックして、マイクロビーズが磁力によって誘発される変位を示していることを確認します。
- 手順5.3.5〜5.3.7を繰り返します。ファイル名を after_small_force.nd2 に設定します。
- 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。次に、 SpinView を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から最大120mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。
- 手順 5.3.5 から 5.3.7 を繰り返し、ファイル名を before_large_force.nd2 に設定します。
- 大きな力の適用と共焦点イメージング
- 環境チャンバーの蓋を外して、磁石がペトリ皿の底から13mm上になるようにします。
- 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。 スピンビュー を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から13mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。ビデオをチェックして、マイクロビーズが磁力によって誘発される変位を示していることを確認します。
- 手順 5.3.5 から 5.3.7 を繰り返し、ファイル名を after_large_force.nd2 に設定します。
- 正しい光路に切り替えて、 DIAをオンにします。次に、 SpinView を開き、[ 録音 ]ボタンをクリックします。その間、磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から最大120mm上に移動します。明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。
- 手順5.3.5〜5.3.7を繰り返します。ファイル名を retract_large_force.nd2 に設定します。
- 環境チャンバーの蓋を閉めます。
- 複数の視野に対して手順 5.2 と 5.3 を繰り返して、必要に応じてさらにデータを取得します。
6. 画像処理とデータ解析
- YAP N/C比の定量化
- フィジー画像を開きますJ.手順 5 で取得した .nd2 イメージを開きます。
- [ 分析 ]をクリックして> 測定値を設定します。 面積、 積分密度、 平均グレー値、 および形状記述子を確認します。
- Cy5チャネルを使用して核を特定します。 フリーハンド 選択をクリックして、自由選択ツールを使用して核の輪郭を描きます。また、ImageJの自動核マスクマクロを確認してください( 材料表を参照)。
- FITCチャネルで[分析>測定]をクリックします。なお、Meanの測定値は、平均核YAP強度DNである。
- Cy5チャネルを使用して核を特定します。FITC チャネルを使用してセルを識別します。 フリーハンド 選択をクリックして、自由選択ツールを使用して細胞質内の関心領域を選択し、磁気マイクロビーズを回避します。この関心領域には核が含まれていてはなりません。
- FITCチャネルで[分析>測定]をクリックします。なお、Meanの測定値は、平均細胞質YAP強度DCである。
- ヤップ N/C 比 = D N / DC を計算します。
- 核形状と正規化された核染色強度の定量化
- フィジー画像を開きますJ.手順 5 で取得した .nd2 イメージを開きます。
- [ 分析 ]をクリックして> 測定値を設定します。 面積、 積分密度、 平均グレー値、 および形状記述子を確認します。
- Cy5チャネルを使用して核を特定します。 フリーハンド 選択をクリックして、自由選択ツールを使用して核の輪郭を描きます。
- Cy5チャンネルで分析>測定をクリックします。平均の測定値は核染色強度です。サークの測定値。核の循環性です。
- 異なる力状態での核染色強度を比較するために、すべての核染色強度を「before_small_force.nd2」の核染色強度で割って、正規化された核染色強度を生成します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
磁石移動装置の設計と磁力の応用
磁気マイクロビーズを介して原子核に力を加えるために、磁石の空間位置を制御するために磁石移動装置が設計および構築されました。磁石移動装置には、中央フレーム、3つのノブ、およびレールが含まれており、取り付けられた磁石をサイクルあたり1.59mmの空間分解能でx、y、z方向に独立して移動させます(図1A)。磁石が細胞内に送達された7μmのマイクロビーズに近づくと(図1B)、磁石はマイクロビーズを磁気的に引き付け、核に力を加えます(図1C)。力の方向と大きさは、磁石とマイクロビーズの間の相対位置によって制御されます。
この論文では、2つの異なる大きさの力がマイクロビーズに加えられました:(1)磁石がセルの46 mm上に置かれたときの比較的小さな力。(2)磁石をセルの13mm上に置いたときの比較的大きな力。マイクロビーズFに加えられる磁力は、式59によって計算することができる:
ここで、Ndは減磁係数(球の場合は0.33)、μ真空中の透磁率(鉄の場合は6.3 × 10-3H / m)、Vpはマイクロビーズの体積(7μmマイクロビーズの場合は178 μm3)、 Hは単位A / mの磁界強度であり、Hは単位テスラの磁束密度Bに比例します。1つの7μmマイクロビーズに作用する磁力は極めて小さく、力変換器では検出が困難であることが予想されたため、マイクロビーズにかかる磁力の大きさを示すために、基準となる磁束密度Bを測定した。シャーレ底部位置にホールセンサーを導入して磁束密度を測定し、シャーレ底部から13mmまたは46mmの距離に磁石を配置した。7μmのマイクロビーズは磁場に影響を与えるため、磁束密度はマイクロビーズの有無にかかわらず測定されました。7μmのマイクロビーズの存在にかかわらず、同じ磁束密度が得られた:13mmの距離でB = 60.1mTおよび46mmの距離でB = 3.7mT。 この測定は、直径12.7 mm、高さ12.7 mmの円筒形磁石によって生成された磁場に対する7 μmマイクロビーズの影響(材料表を参照)が、この研究で使用したホールセンサーでは検出できなかったことを示しています。しかし、距離が13mmの場合の磁束密度は、距離が46mmの場合の約16倍でした。磁力の実験的較正については、次のセクションで説明します(図6)。
細胞質への磁気マイクロビーズの送達
ガラス底のペトリ皿に細胞を播種してから12時間後、7 μmのマイクロビーズを培養液に加えます。マイクロビーズは細胞によって自発的に内在化されます。マイクロビーズはFITCまたはCy5チャネルのレーザー励起下で蛍光を発しないため、内部化されたマイクロビーズの位置は、YAPと核の蛍光の共焦点イメージングによる暗空洞の位置によって特定できます。2D画像と3D画像はどちらも、マイクロビーズが細胞質内にあり、核の外側にあることを示しています(図2)。
細胞へのマイクロビーズのインターナリゼーションレベルは、細胞とマイクロビーズの共培養の期間に依存します。したがって、細胞は、内部化されたマイクロビーズの量に応じて、マイクロビーズなし、単一マイクロビーズ、およびマルチマイクロビーズの3つのタイプに分類されました(図3A)。7時間の共培養では、62%の細胞がマイクロビーズをインターナライズし、15%の細胞が単一のマイクロビーズをインターナリナリングし、23%の細胞がマルチマイクロビーズをインターナリゼーションした(細胞の総数=13)。共培養の12時間では、53%の細胞がマイクロビーズをインターナリネートし、26%の細胞が単一のマイクロビーズをインターナリナリングし、21%の細胞がマルチマイクロビーズをインターナリゼーションした(細胞の総数=62)。共培養の24時間では、20%の細胞がマイクロビーズをインターナライズし、28%の細胞が単一のマイクロビーズをインターナライズし、53%の細胞がマルチマイクロビーズをインターナライズした(細胞の総数=40)(図3B)。
細胞質内のマイクロビーズは核の形状やYAP活性に影響を与えない
マイクロビーズの内在化が核形状およびタンパク質活性に及ぼす影響を調べるために、まず核形状を円形度で定量し、YAP N/C比でYAP活性を定量した。円形度は、 円形度 = 4μ(面積/周囲長2)で計算されます。YAP N/C比を定量化する詳細なステップは、以前の公報60に記載されている。簡単に説明すると、YAP N / C比は、核内の平均YAP強度を細胞質の平均YAP強度で割ることによって計算されました。マイクロビーズと細胞の共培養が、マイクロビーズが内在化されていなくても核形状に影響を与える可能性を考慮すると、共培養のない細胞(黒い点、コントロール#1、円形度= 0.806 ± 0.037、n = 20)、マイクロビーズと共培養されたが内部化されていない細胞(灰色の点、コントロール#2、円形度= 0.806 ± 0.035、n = 22)、単一マイクロビーズを内在させる細胞(赤い点、単一のマイクロビーズ、 円形度=0.793 ± 0.048、n = 15)と、マルチマイクロビーズを内在化している細胞(青色点、マルチマイクロビーズ、n=7)(図3C)を比較した。結果は、テストされた4つのグループすべての間で、核の円形度に有意差がないことを示しています(図3C)。
次に、YAP N/C比がマイクロビーズの内在化に影響されるかどうかを調べるために、マイクロビーズと共培養したが内在化していない細胞(灰色の点、コントロール#2、YAP N/C比= 1.155 ± 0.074、n = 35)を、単一または複数のマイクロビーズの内在化のみの細胞(赤点、マイクロビーズを含む細胞、YAP N/C比= 1.140 ± 0.078、 n=36)を共培養の12時間目に した(図3D)。共培養なしの細胞は、マイクロビーズを含むディッシュはより低い細胞密度を示し、YAP N / C比12に影響を与える可能性があるため、比較しませんでした。結果は、2つのグループ間でYAP N/C比に有意差(p 値= 0.667)を示さず、マイクロビーズの内在化がYAP活性に影響を与えないことを示しています(図3D)。
磁力が原子核を変形させる
まず、核の変形が示されます。核の変形は、細胞骨格を含む細胞内のマイクロビーズ(図4Aおよび図4A1-3)によって加えられる圧縮力によって引き起こされます。このデータ(すなわち、マイクロビーズの圧縮によって核が変形している)は、マイクロビーズが実際に混雑した細胞質の核に力を加えていることを裏付けています。補足資料には、力の適用プロセスを示す明視野ビデオが含まれています(補足ビデオ1)。第二に、マイクロビーズが周囲の細胞骨格に力を加え、核を間接的に変形させる可能性があるため、アクチンフィラメントを破壊した細胞で圧縮実験を繰り返しました(Cyto Dの処理(2.5 μM、1時間);図4B)。この研究は、アクチンフィラメントが実際に解重合され(図4B)、核がマイクロビーズによって変形することを示しています(図4B1-3)。このデータは、マイクロビーズが周囲の細胞骨格が絡み合っていない状態で核に直接力を加えていることを裏付けています。まとめると、このデータは、プロトコルとツールが原子核に直接力を加えることができることを示しています。
細胞内磁気マイクロビーズの空間的・時間的制御
マイクロビーズの空間制御を実現するために、一対の磁石を使用してマイクロビーズを移動させ、核上のくぼみの位置を制御しました(図5A)。ビーズは最大2.2μmの変位でしか移動できませんが(図5A1-4)、対応する位置の核に柔軟にくぼみを加えることができます。周囲のアクチン細胞骨格は、マイクロビーズの動きを制限する可能性があります。したがって、アクチン細胞骨格はCyto D処理(2.5μM、1時間)によって破壊され、マイクロビーズの位置が操作されましたが、同様の結果を示しました。したがって、マイクロビーズは細胞質内の核や他の周囲の細胞小器官と物理的/化学的に結合し、その大きな空間運動(>2.2μm)を制限する可能性があるという仮説を提案することができます。
マイクロビーズの空間制御を実現するために、マイクロビーズを制御する一対の磁石を使用して、核の同じ位置に2回(異なる力の大きさで)力を加えたり解放したりしました(図5Bおよび図5B1-B4)。力の適用と解放の1サイクルの現在の時間は12秒です。時間制御の速度は、XYZムーバの動作速度によって決まります。
磁力の校正
原子核に加えられたビーズの力は、核の同様の変形を引き起こす較正された原子間力顕微鏡(AFM)によって加えられる力を実験的に測定することによって推定されました。具体的には、AFMが細胞の頂端表面に力を加え、アクチン皮質と細胞骨格を除去することでAFM先端と細胞核がより直接的に接触できるようになるため、アクチン細胞骨格は最初にCytoDによって溶解されました(2.5 μM;1時間、 図4B)。アクチン皮質と細胞骨格が溶解した細胞は、核の形状と核染色強度を健常細胞の細胞と比較すると生きています(補足図1)。次に、マイクロビーズと同様のサイズと形状を持つ機能化されていないAFMチップ(半球形、半径= 5 μm)を使用して、力制御された方法で細胞の頂端表面をインデントし、同時に細胞と核体の3D共焦点画像を取得しました(図6A)。0.8 nNから2.0 nNまでの圧縮力の大きさを選んだのは、文献24に基づいて、1.5nNの大きさの力が原子核を十分に変形させることが知られているからです。第三に、AFMのくぼみによって引き起こされた核の正常な変形を定量的イメージング分析によって測定しました。また、定量的なAFM力と変位の関係を提供する検量線(図6B)が得られた。第四に、大きさと形状が類似したマイクロビーズ(半径=7μm; 図6C)において、核膜の変形を画像解析 により 測定した。ビーズに加えられる力は、AFMの力と変位の関係に基づいて推定されます。
たとえば、 図6Cでは、「大きな力」での磁気マイクロビーズ(直径=~7μm)によって引き起こされる核の変形は約1.5μmです。 図6Dでは、5 μmの半球形のプローブを持つAFMチップを使用して、核上部の細胞をインデントし、1.5 μmの核変形を実現しました。AFMによって記録された対応する力は1.4nNです。したがって、マイクロビーズによって加えられる力は~1.4nNと推定されます。同じアプローチに従って、「小さな力」での磁力は0.8nNとして較正され、0.4μmの核のくぼみを引き起こしました。
この研究では、AFMで測定された力は、次の仮定に基づいてマイクロビーズに加えられた力を表すことができると考えています:(1)異なる細胞内の核の剛性は類似しています。(2)核の機械的性質は、くぼみが適用された核部位に依存しない。磁力は核の側面に水平に加えられ、AFM力は核の頂端側に垂直に加えられます。それらの間の機械的な違いはごくわずかであると想定されています。(3)AFM実験では、プローブは細胞膜と細胞骨格を介して核に直接力を加えています。アクチンフィラメントを破壊した後、前者の場合、膜はまだAFMプローブと核の間に位置しているにもかかわらず、核に加えられるAFMの力は、核に加えられたマイクロビーズの力と同様です。
磁力がYAP N/C比の変化を引き起こす
マイクロビーズに加えられた磁力が核を変形させ、YAP転座を誘発できることを証明するために、マイクロビーズがインターナリゼーションした細胞のYAP N / C比を、(1)力を加える前、(2)力を加えた後、(3)力を解放した後の3段階で定量化しました。一部の細胞は、力が加えられたり解放されたりしたときに核の形状とYAP N / C比の変化を示しました(図7A、C)。YAPの強度変化は、2つの可能なメカニズムに起因する可能性があります:(1)YAP-FPタンパク質は、力を加えた後に細胞質から核に移動します。この場合、核染色はシグナルの変化を示さないはずです。核染色強度は大きく変化してはならない。(2)YAP-FPタンパク質は力を加えても転位しない。観測されたYAP強度の変化は、力による核体積変化とそれに伴うYAP-FP濃度変化によるものです。この場合、核体積が変化するにつれて染色色素の濃度も変化するため、核染色強度はYAP核強度と同様の傾向で変化するはずです。そこで、赤チャンネルからの核染色強度変化(励起:650nm;発光:681nm)を測定した。緑チャネルではYAPの強度変化があるが、赤チャネルでは核染色の強度変化はない。したがって、最初のメカニズムが存在する可能性があります(図7B)。まとめると、結果は、磁力誘起核変形がYAP転座を引き起こすことを示しています。
次に、YAP N / C比の正味の変化を2つの細胞群内で定量化した:(1)マイクロビーズが内在していない細胞(灰色の点、対照、n = 9)。(2)YAP N / C比の変化を示す内部化されたマイクロビーズを持つ選択された細胞(小さな力の場合は緑色の点、大きな力の場合は赤い点、n = 11)。0.8 nNの力で、内部化されたマイクロビーズを有する細胞は、正味のYAP N / C比の変化= -0.030 ± 0.029、n = 11を示します。コントロールセルは、正味のYAP N / C比の変化= -0.003 ± 0.012、n = 9を示します。1.4 nNの力で、内部化されたマイクロビーズを有する細胞は、正味のYAP N / C比の変化= 0.011 ± 0.040、n = 11を示します。対照細胞は、正味のYAP N / C比の変化= 0.005±0.005、n = 9を示します(図8A)。0.8 nNの力で、内部化されたマイクロビーズを有する細胞は、絶対正味YAP N / C比の変化= 0.057 ± 0.017、n = 11を示します。対照細胞は、正味のYAP N / C比の変化= 0.021 ± 0.007、n = 9を示します。差は有意です(p 値= 0.0093、**)。1.4 nNの力で、内部化されたマイクロビーズを有する細胞は、絶対正味YAP N / C比の変化= 0.070 ± 0.020、n = 11を示します。コントロールセルは、正味のYAP N / C比の変化= 0.010 ± 0.003、n = 9を示します。差は有意です(p 値= 0.0007、***)(図8B)。まとめると、これらの結果は、細胞質内のマイクロビーズに加えられた磁力が実際にYAP転座を誘発し、YAP N / C比を変化させることができることを裏付けています。
図1:磁気マイクロビーズによる磁気移動装置の設計とセル内への模式的な力の付与 。 (A)磁石を保持し、x、y、z方向に移動させるために実装されたデバイスの3次元概略図。このデバイスは、幅241.3 mm、高さ104.1 mmのベース、2つのノブ、バー、および磁石で構成されています。ノブは正しい操作回転方向にスプラインされ、対応する方向への動きを提供します。磁石を皿に近づけたり上げたりして、磁気マイクロビーズに大きさと方向の異なる磁力を加えます。(b)7μm鉄マイクロビーズの走査型電子顕微鏡(SEM)画像の例。(C)細胞質内に送達された磁気マイクロビーズは、磁場を加えると核などの細胞小器官に力を加えることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:磁気マイクロビーズ(青い矢印で示された黒いくぼみ)が細胞(YAPで示される)および核の外側に内在化されていることを示す代表的な画像。 (A)YAP(緑)、核(赤)、明視野の細胞のX-Y断面。(B)細胞の3D再構成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:細胞に内在化したマイクロビーズは、核の形状やYAP N/C比に影響を与えない 。 (A)マイクロビーズなし、単一マイクロビーズ、およびマルチマイクロビーズのインターナリゼーションを有する細胞の代表的な明視野および蛍光画像。青い矢印は、細胞質内のマイクロビーズの位置を示しています。(b)共培養の7時間(n=13)、12時間(n=62)、および24時間(n=40)における、マイクロビーズ、単一マイクロビーズ、およびマルチマイクロビーズのインターナリゼーションを示さない細胞の割合。(C)核の円形度は、コントロール細胞とマイクロビーズのインターナリゼーションを有する細胞との間に有意差を示さない。コントロール#1(マイクロビーズ共培養なし):円形度= 0.806 ± 0.037、n = 20;コントロール#2(マイクロビーズ共培養あり、マイクロビーズ内在化なし):円形度= 0.806 ± 0.035、n = 22;単一マイクロビーズの内在化:円形度= 0.793 ± 0.048、n = 15;マルチマイクロビーズのインターナリゼーション:真円度= 0.780 ± 0.061、n = 7。(D)YAP N/C比は、対照細胞(マイクロビーズ共培養あり、マイクロビーズインターナリゼーションなし、YAP N/C比=1.155 ± 0.074、n=35)とマイクロビーズインターナリゼーション細胞(YAP N/C比=1.140 ± 0.078、n=36)との間に有意差を示さない(p 値=0.667)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アクチンフィラメントの有無にかかわらず核に直接力を加える 。 (A)細胞はアクチンフィラメント(黄色)を示す。(A1)力を加えない場合の核の画像。(A2)力を加えた後の原子核の画像。(A3)力を加える前後の核境界の重なり画像は、核のくぼみを示しています。(B)細胞は、Cyto D処理(2.5 μM、1時間)後に破壊されたアクチンフィラメント(黄色)を示します。(B1)力を加えない場合の核の画像。(B2)力を加えた後の原子核の画像。(B3)力を加える前後の核境界の重なり像は、破壊されたアクチン細胞骨格との核のくぼみを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:細胞内磁気マイクロビーズの空間的・時間的制御 。 (A)一対の磁石が磁気マイクロビーズを空間的に制御する。(A1)位置1の細胞境界(緑線)、核境界(赤線)、磁気マイクロビーズ(黄色線)の明視野画像。(A2)磁気マイクロビーズは、位置1で核をインデントします。(A3)磁気マイクロビーズを位置2(黄色の線)に移動します。位置 1 は参照として示されています (黄色の破線)。(A4)磁気マイクロビーズは、位置2で核をくぼませます。(B)一対の磁石が磁気マイクロビーズを時間的に制御します。(B1)時間点Iで力を加えていない細胞の明視野画像(B2)磁気マイクロビーズは、時間点IIで核に力を加えます。(B3)磁気マイクロビーズは、時点IIIで核から力を放出します。(B4)磁気マイクロビーズは、時点IVで核に大きな力を加えます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.AFMインデンテーションを用いたマイクロビーズによる核への力の較正 (A)キャリブレーションプロセスの概略図。磁気マイクロビーズは核に水平方向の圧縮を加え(左)、AFMプローブは核上で垂直にくぼみます。(B)AFM押し込み力対核変形。(C)磁気マイクロビーズによる力加わり前後の核変形(1.5μm)の代表像。(D)1.4nNの力でAFM圧痕化前後の類似核変形(1.5μm)の代表画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:磁力の印加と解放によって誘起されるYAP N/C比変化を示す代表的なデータ 。 (a)無力、強制オン、および強制オフでの細胞のYAP(緑)および核(赤)蛍光画像のX-Y断面。フォースオン状態では、黄色の矢印が指す位置で細胞質YAP強度が低下し、核YAP強度が増加します。YAP N/C比が増加します。(B)YAP N/C比は、力を入れると増加し(1.0791から1.2327へ)、力が降ると減少する(1.2327から1.1548へ)。正規化された核染色強度は、力の適用(1.00117)と解放(0.95578)によってわずかな変化を示します。(C)無力、無理力オン、無理退の細胞のYAP(緑)および核(赤)画像のX-Z断面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:磁力印加によるYAP N/C比変化 。 (A)0.8 nNの力で、マイクロビーズを内在させた細胞は、正味のYAP N / C比の変化= -0.030±0.029、n = 11を示します。コントロールセルは、正味のYAP N / C比の変化= -0.003 ± 0.012、n = 9を示します。1.4 nNの力で、内部化されたマイクロビーズを有する細胞は、正味のYAP N / C比の変化= 0.011 ± 0.040、n = 11を示します。コントロールセルは、正味のYAP N / C比の変化= 0.005 ± 0.005、n = 9を示します。(B)0.8 nNの力で、マイクロビーズを内在化した細胞は、絶対正味のYAP N / C比の変化= 0.057±0.017、n = 11を示します。対照細胞は、正味のYAP N / C比の変化= 0.021 ± 0.007、n = 9を示します。差は有意です(p 値= 0.0093、**)。1.4 nNの力で、内部化されたマイクロビーズを有する細胞は、絶対正味YAP N / C比の変化= 0.070 ± 0.020、n = 11を示します。コントロールセルは、正味のYAP N / C比の変化= 0.010 ± 0.003、n = 9を示します。差は有意です(p 値= 0.0007、***) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:核の形状と核染色強度。 (A)サイトD処理なし、(B)サイトD処理あり、(C)死細胞。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:力の適用プロセスを示す明視野ビデオ。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
細胞外マイクロビーズは核に直接力を加えることができないため、磁気マイクロビーズの内在化(セクション2.2)は重要です。力の適用とイメージング(セクション5.3)は、この実験の重要なステップであり、核を変形させて意味のある生物学的結果を誘発するために必要な力は、サンプルに依存する可能性があります。この実験の力の大きさ(0.8 nNと1.4 nN)をさらに大きくして、感度の低い細胞で核メカノセンシングをトリガーすることができます。
高スループットで定量的に磁力を加えるには、単一のマイクロビーズの内在化が理想的なアプローチです。この研究では、単一マイクロビーズのインターナリゼーションを持つ細胞の割合は12時間(26%)と24時間(28%)で類似していましたが、マイクロビーズのインターナリゼーションがない細胞は12時間(53%)で24時間(20%)よりも高かった(図3B)。12時間は、より多くの単一マイクロビーズを含めることができ、細胞を制御できるため、力を加える実験に最適な時間であると考えられています。異なる細胞株およびマイクロビーズサイズについて、共培養時間とマイクロビーズ濃度をテストして、対応する最適条件を決定する必要があります。
実験では、マイクロビーズは核に特異的に結合するようにコーティングされていなかった。したがって、マイクロビーズから核に直接伝達される力は、おそらく圧縮のみである。結果は、YAP N / C比が細胞集団を増減することを示しています(図8A)。考えられる理由の1つは、マイクロビーズ を介して 加えられる磁力が細胞骨格内で正または負の張力変化を引き起こし、YAP N / C比をそれぞれ増減するように制御する可能性があることです28。先行研究では、原子核にかかる圧縮力がYAP N/C比28の増加を誘発することが示されている。将来の実験では、核の直接的な力の感知を研究するために、細胞骨格を破壊して、細胞骨格から核への力の伝達を排除することができます。
現在の方法には2つの潜在的な欠点があります。まず、これらの実験では、3Dムーバー(図1A)を利用してビーズの動きを調整し、リアルタイムの共焦点イメージングによって監視され、核に圧縮力を加えることを目的としています。しかしながら、核膜の滑りやすい性質および細胞質内の複雑な環境のために、ビーズに加えられる力の方向は純粋に圧縮的ではない(すなわち、核膜表面に対して絶対的に垂直ではない)かもしれない。この不完全性により、核膜にせん断力が加えられる可能性があります。第二に、この研究で使用されている現在のマイクロビーズは、非接触磁気アクチュエータの利点を実証するためにビーズの空間移動度が現在の実験で重要であるため、核と結合する抗体と結合していません。したがって、現在の方法では核膜に張力を加えることはできません。
将来的には、(1)抗ネスプリン-1抗体を含むビーズが核と特異的に結合するように結合する予定です。これにより、マイクロビーズと標的タンパク質間の直接的かつ比力の伝達を保証できます。(2)力の方向は、蛍光ビーズが埋め込まれた柔らかいヒドロゲル中の単一の磁気マイクロビーズを操作することによって較正されます。蛍光ビーズの3D変位を使用して、ヒドロゲルの変形場を計算し、印加された磁場の関数として力の方向を決定することができます。マイクロビーズが原子核と化学的に結合した後、既知の方向で力を加えると、力の種類(張力、圧縮、またはせん断)が決まります。(3)核染色の3Dイメージングを使用して、核の3DシミュレーションFEMモデルを構築します。磁力印加前後の核変形を比較することで力の方向を確認することができます。
本研究で開発した独自の手法は、(1)AFMプローブによる垂直方向のくぼみと比較して、磁気マイクロビーズはあらゆる方向に力を加えることができるといういくつかの潜在的な利点を提供します。2D基板表面上で培養された細胞は、原形質膜および核膜の垂直および水平面に不均一なタンパク質分布および配向を有し得る。水平に力を加えると、これまで観察されていなかったメカノセンシング応答が誘発される可能性があります。(2)マイクロビーズが核に結合するように機能的にコーティングされると、押し力と引っ張り力の両方を核に直接適用して、力の方向が異なるため、差動核メカノセンシングをさらに研究することができます。(3)マイクロビーズの核外皮タンパク質への特異的結合を制御することで、これまで未解明だった核力センシングのメカニズムを解明することができます。新たな証拠は、核がメカノセンサー36である可能性が高く、核メカノセンシングがYAP転座28の最も直接的な調節因子であることを示しています。核制御YAP転座のメカニズムは活発に研究されており、核孔径28、核形状25,61、LINC複合体、核エンベロープ張力20など、核内のメカノセンサーまたはパラメータのいくつかの候補が提案されています。磁気マイクロビーズを操作することで、LINC複合体への直接的な力の適用と核エンベロープの張力と形状の制御によって、そのようなメカニズムの詳細な調査の可能性が開かれます。(4)マイクロビーズは、核に力を加えるだけでなく、原形質膜の内側に結合するように操作して、膜タンパク質の細胞内ドメインとその複合体が生物物理学的シグナルにどのように応答するかを明らかにするのにも適しています。
以上をまとめると、本論文は、(1)核形態やタンパク質機能に影響を与えることなく、マイクロサイズの鉄マイクロビーズを細胞質に送達する方法、(2)磁気マイクロビーズによって核に力を加える方法、(3)力を加える際に共焦点蛍光生細胞イメージングを行う方法を示した。これらの非侵襲的ツールは、単一細胞におけるオルガネラの直接的なエピジェネティック操作、核メカノトランスダクションの超解像イメージングベースの調査、および力制御された3D染色体構成の詳細な探索(Hi-Cと組み合わせて:高解像度染色体確認キャプチャ)および細胞生理学および病理生物学のコンテキストでの再プログラミングの可能性を開きます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、UFゲータレードアワードスタートアップパッケージ(X.T.)、UFHCCパイロットアワード(X.T.およびディートマールシーマン博士)、UFオポチュニティシードファンド(X.T.)、およびUFHCC大学奨学生プログラム(HY.ワン)によって資金提供されています。ジョナサン・リヒト博士(UFHCC)、ロルフ・レネ博士(UFHCC)、クリストファー・ヴァルプ博士(UFHCC)、ブランカ・シャルマ博士(BME)、マーク・シェプラク博士(MAE&ECE)、ダニエル・フェリス博士(BME)、マリサ・サルンティノラノン博士(MAE)、アショク・クマール博士(MAE)、ベンジャミン・ケセロウスキー博士(BME)、ブレント・ギラ博士(RSC)、フィリップ・フェン博士(ECE)、 グレゴリー・A・フダラ博士(BME)、スティーブン・ギヴィッツァーニ博士(OSSM)、エニセル・クルス・アルメイダ博士(CDBS)、ロジャー・フィリンギム博士(CD-BS)、ロバート・コードル博士(OMS)、ジョン・ノイバート博士(DN-OR)、ジャスティン・ヒリアード博士(脳神経外科)、天和博士(ハーバード大学)、ヨウフア・タン博士(香港理工大学)、ジェシー・L-S Au博士(定量システム薬理学研究所)、デビッド・ハーン博士(アリゾナ大学) ニコンの支援チーム(ホセ・セラーノ・ベレス博士、ラリー・コードン博士、ジョン・エクマン博士)。唐、山口、シャルマ、アウ、シーマン、グアンの研究所のすべてのメンバーとUF MAE部門のすべてのスタッフからの効果的なサポートに深く感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
| 7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
| A1R confocal system | Nikon | ||
| Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
| Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
| NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
| XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
- Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
- Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
- Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
- Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
- Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
- Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
- Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
- Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
- Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
- Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
- Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
- Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
- Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
- Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
- Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
- Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
- Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
- Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
- Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
- Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
- Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
- Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
- Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
- Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
- Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
- Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
- Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
- Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
- Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
- Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
- Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
- Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
- Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
- Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
- Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
- Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
- Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).
