Summary
이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
기계 생물학의 근본적인 질문은 살아있는 세포가 세포 생리학 및 병리학의 맥락에서 세포 외 기계적 자극을 감지하는 방법입니다. 세포 외 기계적 자극의 세포 기계 감각은 막 수용체, 관련 단백질 복합체 및 세포 골격을 통해 이루어지는 것으로 여겨집니다. 기계 생물학의 최근 발전은 세포질 자체의 세포핵이 독립적으로 기계적 자극을 동시에 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 그러나 세포핵이 기계적 자극을 감지, 형질도입 및 반응하는 방법에 대한 기계론적 이해는 주로 기존 도구로 핵 역학에 접근하고 정량화하는 기술적 어려움 때문에 부족합니다. 이 백서에서는 정밀하고 비침습적인 3D 기계적 자극을 적용하여 세포핵을 직접 변형시키는 새로운 자기력 액추에이터의 설계, 제조 및 구현에 대해 설명합니다. CRISPR/Cas9 엔지니어링 셀을 사용하여 이 연구는 고해상도 컨포칼 형광 이미징과 결합된 이 도구가 핵 변형의 함수로서 단일 세포에서 기계 민감성 예 관련 단백질(YAP)의 실시간 역학을 밝힐 수 있음을 보여줍니다. 이 간단한 방법은 기계 생물학 커뮤니티의 현재 기술 격차를 해소하고 핵 기계 변환과 세포 기능 사이의 관계에 존재하는 지식 격차에 대한 해답을 제공 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.
Introduction
이 연구는 세포핵에 직접 기계적 힘을 가하는 자기 액추에이터와 구조적 및 기능적 세포 내 변화를 동시에 이미지화하는 공초점 형광 현미경을 결합하여 핵 기계 생물학을 해명하는 새로운 기술을 개발하고 적용하는 것을 목표로 합니다. 세포는 조직 경직 1,2,3,4, 간질 유체 압력 및 전단 응력 5,6,7, 표면 토폴로지 / 기하학 8,9,10,11,12 및 인장 / 압축 응력13,14를 포함한 세포 외 생물 물리학 적 신호를 감지합니다. 15,16. 생물 물리학 적 신호는 생화학 적 신호로 변환되어 유전자 발현 및 세포 행동의 잠재적 인 다운 스트림 변화를 유발합니다 - 기계 전달 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27로 알려진 과정 . 기계변환 과정을 연구하기 위해, 원자력 현미경(28), 세포 연신 장치(29), 바이오-MEMS(마이크로-전자 기계 시스템) 힘 센서(15,30,31), 전단 유변학(32) 및 스테레오 비전 시스템(33)과 같은 세포에 기계적 힘을 가하기 위한 무수한 기술이 개발되었다. . 최근의 리뷰는 세포 외 기계적 신호를 적용하고 기계 감지34를 방해하는 접근법을 요약합니다. 현재까지 이러한 방법의 대부분은 세포 원형질막에 힘을 가하고 세포는 인테그린, 카데린, 이온 채널 및 G-단백질 결합 수용체와 같은 막 수용체를 통해 이러한 세포외 생물물리학적 신호를 직접 수신합니다. 그 후, 그들은 세포 내 세포 골격과 핵에 신호를 전달합니다. 예를 들어, 예 연관 단백질 (YAP) 전좌를 기계 감지의 지표로 사용하여 세포는 세포막에서 기질 경화 및 세포 외 장력의 기계적 신호를 감지하고 세포 골격을 통해 핵으로 전달하여 YAP 세포질-핵 전좌를 유도하는 것으로 나타났습니다28,35.
최근의 증거는 세포핵 자체가 독립적 인 기계 센서 8,36,37임을 시사한다. 이것은 세포로부터 수확 된 분리 된 핵에 대해 수행 된 실험에 의해 입증되며, 핵은 그들에게 직접 가해지는 기계적 힘에 반응하여 강성을 적응 적으로 변화시키는 것으로 밝혀졌다36. 많은 생리적 조건 동안, 종양 및 건강한 세포 모두의 핵은 세포 외 생물 물리학 적 신호를 감지하고 기계적 성질 및 어셈블리를 변화시킨다38,39,40. 예를 들어, 혈관 외 유출시, 종양 세포의 핵 경직은 감소하고 24 시간38 이상 동안 부드러움을 유지합니다. 제한된 간질 공간을 통해 이동하는 동안, 종양 세포의 핵은 종종 구조적 완전성을 잃고 회복한다39. 그러나 핵이 생물 물리학 적 신호를 감지하는 방식은 알려져 있지 않지만 Lamin A / C 및 핵 골격 및 세포 골격 (LINC) 복합체38,41의 링커와 같은 여러 핵 외피 단백질 및 단백질 계열이 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 핵에 직접 힘을 가할 수있는 새로운 비 침습적 방법은 세포-원형질막과 세포 골격에서 힘 전달 효과를 분리하고 이전에는 접근 할 수 없었던 핵 기계 감지의 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
세포 소기관(42)과 세포(43)에 주입된 마이크로비드를 조작하기 위해 광학 핀셋을 사용한 연구는 핵에 직접 힘을 가하는 기술적 능력을 보여주었다. 그러나, 광학 핀셋 기술은 몇 가지 한계를 갖는다: (1) 낮은 처리량 - 광학 핀셋은 종종 한 번에 하나의 셀 또는 마이크로비드만을 조작하고; (2) 핵의 잠재적 광손상 및 온도 인공물-변형은 수십pN36을 필요로 하고, 상응하는 필요한 레이저 출력은 pN(44,45)당 약 10mW이다. 이러한 레이저 강도는 실험(46) 동안 세포에서의 광손상 및 교란 세포 기능을 유발하기에 충분하다.
살아있는 세포 내의 마이크로 비드를 통해 가해지는 자기력은 핵에 직접 힘을 가할 수있는 잠재력을 보여주고 광학 핀셋의 한계를 극복합니다. 마이크로비드가 세포질로 전달되면 자기장은 고처리량 방식으로 여러 마이크로비드에 동시에 자기력을 가할 수 있습니다. 자기장은 셀 기능(47)에 영향을 미치지 않지만, pN에서 nN으로의 힘을 발생시키며, 이는 핵 변형(36,48,49)을 유도하기에 충분하다. 현재까지, 자성 마이크로비드의 조작은 세포 원형질막(4)8, 세포질(50) 내부, F-액틴(51), 핵(47) 내부, 및 단리된 핵(36)에 적용되었다. 그러나 마이크로 비드의 자기 조작은 핵의 기계 변환을 연구하기 위해 핵 외피에 직접적인 기계적 힘을 가하는 데 사용 된 적이 없습니다.
이 논문에서는 자성 마이크로비드를 세포질에 비침습적으로 전달하고 이러한 마이크로비드를 사용하여 핵에 기계적 힘을 가하는 간단한 기술을 개발했습니다(그림 1). 여기에서 mNeonGreen21-10/11 태그 YAP를 내인성으로 발현하는 CRISPR/Cas9 조작된 인간 정상 B2B 세포주를 사용하여 방법을 검증합니다. YAP는 기계-민감성 단백질이고, YAP의 전좌는 핵-기계-센싱14,28에 의해 조절된다. CRISPR/Cas9 조절 녹인 접근법은 내인성 YAP에 형광 단백질(FP) mNeonGreen21-10/11을 태그하기 위해 선택되었습니다. CRISPR 편집이 불완전한 효율성과 오프 타겟 효과를 갖는 것으로 알려져 있지만, 이전 간행물의 프로토콜은 형광 분류를 통합하여 올바른 개방 판독 프레임 삽입을 선택했습니다52,53,54. 이러한 추가 선택 계층으로, 이전에 생성된 52,53,54,55 20+ 세포주에서 오프-타겟 태깅 이벤트가 관찰되지 않았다. 이것은 분할 형광 단백질 작제물이지만, 원칙적으로 임의의 표현 가능한 형광 태그를 사용할 수 있다. 이 표지 접근법은 전이 유전자 또는 항체 방법보다 우수합니다. 첫째, 전이유전자 발현과 달리, 태그된 단백질은 단일 카피 유전자 투여량을 유지하고 천연 유전자 조절 네트워크의 생리학적 맥락에서 발현하여 단백질 농도, 국소화 및 상호작용의 편차를 제한한다. 이 연구에 사용된 태깅 방법은 전체 FP 태깅보다 훨씬 더 높은 처리량과 효율성을 달성합니다. 또한 고정 인공물 및 고품질, 고특이성 항체의 제한된 가용성으로 인한 면역형광과 관련된 문제를 방지합니다. 둘째, 이 논문에서 사용된 접근 방식은 세포 생리학에 대한 섭동을 최소화하고 모든 내인성 YAP를 실시간으로 실시간으로 밝힐 수 있습니다. 대조적으로, 다른 일반적인 전이 유전자 방법은 종종 YAP의 과발현을 유도합니다. 생성된 인공 분포는 잠재적으로 세포독성을 유발할 수 있고 세포(56,57,58)의 기계-감지에 영향을 미칠 수 있다.
이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 핵에 직접 힘을 가하고 동시 라이브 셀 형광 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 요약하면, 여기에 제시된 프로토콜은 (1) 핵 외부에 있는 동안 자기 마이크로비드를 세포 내로 전달하고, (2) 마이크로비드를 조작하여 핵에 자기력을 가하고, (3) 조작 중에 세포의 컨포칼 형광 이미징을 수행하고, (4) 힘 적용 프로세스 전반에 걸쳐 YAP 핵/세포질(N/C) 비율을 정량적으로 분석하는 방법을 보여줍니다. 결과는 (1) 엔도 사이토 시스를 통해 자성 마이크로 비드가 2 시간 이내에 B7B 세포의 세포질로 비 침습적으로 전달 될 수 있음을 시사합니다 (그림 2 및 그림 3). (2) 핵에 직접 가해지는 정량화된 자기력(그림 4, 그림 5 및 그림 6)만으로도 CRISPR/Cas9 엔지니어링 B2B 세포에서 YAP N/C 비율의 다양한 변화를 유발할 수 있습니다(그림 7 및 그림 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CRISPR / Cas9 엔지니어링 B2B 셀의 유지 보수
- B2B 세포를 RPMI-1640이 보충된 T25 플라스크에서 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 배양합니다.
- B2B 세포를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 유지한다.
- B2B 세포를 계대배양하면 컨플루언시가 70% 내지 80%에 도달한다.
- B2B 세포주를 -80°C 냉동고에서 10%(v/v) DMSO가 있는 RPMI-1640 배양 배지에 보관합니다.
- 실험에서 계대수가 10 미만인 B2B 세포를 사용한다.
2. 세포 배양
- 유리 바닥 페트리 접시에 세포를 씨를 뿌립니다.
- 내부에 B2B 세포가 들어있는 플라스크를 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
- 진공 펌프가 연결된 흡인 피펫을 사용하여 플라스크에서 배양 배지를 제거합니다.
- 2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 플라스크를 세척합니다.
- 흡인 피펫을 사용하여 PBS를 제거합니다.
- 0.05% 트립신 용액 0.5mL를 추가하여 플라스크 기판 바닥에서 세포를 분리합니다.
- 플라스크를 인큐베이터에 5 분 동안 두십시오.
- 플라스크를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 5mL의 새로운 배양 배지를 플라스크에 넣고 용액을 위아래로 피펫팅합니다.
- 셀(300 cells/μL)이 있는 배지 50μL를 유리 바닥 페트리 접시에 증착합니다. 배양 배지 2mL를 페트리 접시에 추가합니다.
- 페트리 접시를 인큐베이터에 넣으십시오. 셀이 부착 될 때까지 12 시간 동안 기다리십시오.
- 자성 마이크로 비드로 세포를 배양하십시오.
- 7 μm 평균 직경 카르보닐 철 마이크로비드(이하 7 μm 마이크로비드라고 함, 재료 표 참조)의 0.2 g의 무게를 잰다.
- 피펫을 사용하여 마이크로비드를 RPMI-1640 배양 배지 1mL에 현탁시킵니다.
- B2B 세포가 담긴 페트리 접시를 생물안전 캐비닛으로 가져갑니다.
- 마이크로비드가 포함된 배지 200μL를 페트리 접시에 추가합니다.
알림: 마이크로비드의 침전을 방지하기 위해 배지를 빠르게 추가하십시오. - 마이크로 비드가 세포에 의해 내부화 될 때까지 페트리 접시를 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 6시간마다 내재화를 확인하여 다른 세포주에 대한 내재화를 위한 최적의 시간을 결정합니다.
- 내재화를 확인하려면 컨포칼 형광 이미징을 수행하여 마이크로비드, 핵 및 세포 경계를 시각화합니다. 마이크로비드가 세포에 의해 내재화되면 세포 경계 내에 있게 됩니다.
3. 핵의 시각화
- 배양기에서 배양 배지 1.5mL를 15 분 동안 따뜻하게합니다.
- 생물 안전 캐비닛의 조명을 끕니다. 세포, 예열 된 배양 배지, 핵 얼룩 및 베라파밀 HCl이 들어있는 페트리 접시를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
알림: 핵 염색 성분은 빛에 민감합니다. 작동 중 빛에 노출되지 않도록하십시오. - DMSO에 의한 1000x 핵 얼룩을 100x로 희석합니다.
- DMSO에 의해 100 mM 베라파밀 HCl을 10 mM로 희석한다.
- 15μL의 100x 핵 염색과 15μL의 10mM 베라파밀 HCl을 1.5mL의 배양 배지에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞는다.
- 페트리 접시에서 배양 배지를 제거합니다. 핵 염색이 포함된 배양 배지를 페트리 접시에 첨가한다.
- 세포를 인큐베이터에 2 시간 이상 다시 넣으십시오.
4. 자기력 응용 하드웨어의 준비
- 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS)을 사용하여 모든 부품을 3D 프린팅하고 CAD 설계에 따라 조립합니다(그림 1A). CAD 설계는 재료 테이블에 포함되어 있습니다.
- 양면 테이프를 사용하여 자석 이동 장치에 자석을 부착합니다(그림 1A).
- 자석 이동 장치를 현미경 스테이지 옆에 놓습니다. 세 개의 손잡이를 사용하여 자석이 페트리 접시 위로 13mm에서 120mm 사이로 이동할 수 있을 때까지 자석의 공간 위치를 조정합니다.
알림: 자석과 페트리 접시 사이의 거리 상한이 마그네틱 마이크로비드에 원치 않는 힘이 가해지지 않도록 가능한 한 큰지 확인하십시오. 이 실험 설정에서 최대값은 120mm입니다. 자석이 대물렌즈 및 전동 스테이지를 포함한 현미경 부품을 방해하지 않는지 확인하십시오. - 자석을 가장 높은 z 위치(120mm)로 설정합니다.
5. 강제 적용 및 라이브 셀 이미징
- 장기 이미징을 위한 환경실 설치
- 75 % 에탄올 용액을 적용하여 환경 챔버를 철저히 살균하고 청소하십시오.
- 환경 챔버를 도립 현미경의 전동 스테이지에 놓습니다.
- CO2 탱크를 열고CO2 유입 속도를 160mL/분으로 설정합니다.
- 챔버의 온도를 44°C(상단), 42°C(수조) 및 40°C(스테이지)로 조정합니다.
- 20mL의 정제수를 환경 챔버의 욕조에 추가하여 90% 습도를 유지합니다.
- 조직 배양 인큐베이터에서 표적 세포가 들어있는 유리 바닥 페트리 접시를 꺼내 챔버에 넣습니다.
- 환경 챔버의 금속 클램프를 적용하여 페트리 접시 위치를 고정합니다.
알림: 페트리 접시는 고정되지 않으면 자기력이 접시를 움직일 수 있으므로 챔버에 단단히 고정해야 합니다. - 챔버의 뚜껑을 닫습니다.
- 이미징 파라미터의 최적화
- 핀홀 크기 최적화: 핀홀은 초점이 맞지 않는 광자를 차단합니다. 핀홀 크기가 클수록 초점이 맞지 않는 광자가 더 많이 생성되지만 이미지는 더 밝아집니다. 핀홀 크기가 작을수록 더 초점이 맞춰지고 어두운 이미지가 생성됩니다. 핀홀 크기를 최적화하여 적절한 신호 대 잡음비로 초점이 맞는 컨포칼 이미지를 얻으십시오.
- 레이저 강도 최적화: 레이저 강도는 여기의 강도를 결정하여 빛을 방출합니다. 낮은 레이저 강도는 낮은 신호 대 잡음비를 제공합니다. 레이저 강도가 너무 높으면 광퇴색이 발생합니다. 그에 따라 레이저 강도를 조정하십시오.
- 단계 크기 및 단계 최적화: 단계 및 단계 크기는 Z 스택에서 촬영할 이미지 수를 결정합니다. 스텝 크기가 작고 스텝이 많을수록 Z 스택 해상도가 증가하지만 광퇴색도 증가합니다. 이 실험에서는 ~15μm 세포 높이의 세포에 대해 1μm 스텝 크기를 사용했습니다.
- 노출 시간 최적화: 노출 시간은 세포가 여기 레이저에 노출되는 시간을 결정합니다. 노출 시간이 짧으면 신호 대 잡음비가 감소합니다. 노출 시간이 길면 광퇴색이 발생합니다. 이 실험에는 4 초 당 1 프레임의 노출 시간이 사용되었습니다.
- 이미징 파라미터 최적화: 4개의 파라미터 중 하나를 반복적으로 변경하고 다른 파라미터는 일관성을 유지합니다. 매번 각 영상의 YAP N/C 비율을 측정하고 YAP N/C 비율 변화를 비교하여 광퇴색 수준을 결정합니다. 신호 대 잡음비, 이미징 속도 및 광퇴색 간의 균형을 얻을 때까지 최적화 프로세스를 반복합니다.
- 실험 중 더 빠른 이미징 설정을 위해 최적화된 이미징 파라미터를 사용하여 이미징 구성을 정의합니다.
알림: 이 연구에 사용된 구성은 이미징 매개변수의 섹션 5.3에 설명되어 있습니다. 섹션 5.3에서 구성의 이미징 파라미터를 최적화하려면 5.2.5단계와 동일한 방법을 사용합니다.
- 작은 힘 적용 및 컨포칼 이미징
참고: 이 연구에서는 Nikon Ti2-E 현미경이 이미징에 사용되었으며 이미지 획득을 위한 자세한 단계는 아래에 나와 있습니다.- 도립 현미경을 엽니다. 소프트웨어 응용 프로그램 요소를 엽니다.
- 구성 magnetic_find 정의합니다. FITC 채널만 확인합니다. PMT HV = 70, 오프셋 = 0, 레이저 강도 = 10을 설정합니다. 1/2 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 2초당 1프레임으로 설정합니다. 1.2 AU 버튼을 클릭하여 핀홀 크기를 1.2AU로 설정합니다. 이 구성은 5.3.5단계에서 사용됩니다.
- 구성 magnetic_YAP_Nucleus 정의합니다. FITC 채널을 확인하십시오. PMT HV = 70, 오프셋 = 0, 레이저 강도 = 10을 설정합니다. 1/2 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 4초당 1프레임으로 설정합니다. 1.2 AU 버튼을 클릭하여 핀홀 크기를 1.2AU로 설정합니다. 핵 경계와 핵 염색 강도를 이미지화하려면 Cy5 채널을 확인하십시오. PMT HV = 70, 오프셋 = 0, 레이저 강도 = 10을 설정합니다. 핀홀 크기는 3D YAP 이미징에 최적화되어 있습니다. Cy5 채널을 확인한 후 1.2 AU 버튼을 다시 클릭하지 마십시오. 이 구성은 5.3.7단계에서 사용됩니다.
- 필요한 경우 엘리먼츠를 통해 DIA를 켭니다. SpinView를 열고 명시야를 사용하고 개체의 초점을 조정하여 초점이 맞는 선명한 셀 이미지를 얻습니다. 10x 대물렌즈를 사용하여 내부에 단일 마이크로비드가 있는 상태, 내부에 여러 개의 마이크로비드가 있는 경우, 내부에 마이크로비드가 없는 세 가지 조건에서 적절한 다중 단일 셀을 찾습니다. 40x 대물렌즈로 전환합니다. 이 위치의 이름을 적절한 위치 번호로 지정합니다.
- 요소를 엽니다. magnetic_find 클릭합니다. 인터록 제거 버튼을 클릭합니다.
- 스캔을 클릭하고 초점면의 Z 위치를 조정합니다. 위쪽 및 아래쪽 단추를 클릭하여 선택한 셀의 Z 스택에 대한 하한과 상한을 설정합니다. 스캔을 다시 클릭하여 스캔을 중지합니다.
- magnetic_YAP_Nucleus 구성으로 전환합니다. 파일 이름을 before_small_force.nd2로 설정합니다. 기록 된 Z 스택으로 실행 버튼을 클릭하십시오.
- 올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 스핀뷰를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 46mm 아래로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다. 비디오를 확인하여 마이크로비드가 자기력에 의해 유도된 변위를 나타내는지 확인하십시오.
- 5.3.5-5.3.7 단계를 반복하십시오. 파일 이름을 after_small_force.nd2로 설정합니다.
- 올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 그런 다음 SpinView 를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 최대 120mm 위로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다.
- 5.3.5-5.3.7단계를 반복하고 파일 이름을 before_large_force.nd2로 설정합니다.
- 큰 힘 적용 및 컨포칼 이미징
- 자석이 페트리 접시 바닥에서 13mm 위에 도달하도록 환경 챔버의 뚜껑을 제거합니다.
- 올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 스핀뷰를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 13mm 아래로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다. 비디오를 확인하여 마이크로비드가 자기력에 의해 유도된 변위를 나타내는지 확인하십시오.
- 5.3.5-5.3.7단계를 반복하고 파일 이름을 after_large_force.nd2로 설정합니다.
- 올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 그런 다음 SpinView 를 열고 녹음 버튼을 클릭합니다. 한편, 자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 자석을 페트리 접시 바닥에서 최대 120mm 위로 이동합니다. 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다.
- 5.3.5-5.3.7 단계를 반복하십시오. 파일 이름을 retract_large_force.nd2로 설정합니다.
- 환경 챔버의 뚜껑을 닫습니다.
- 필요한 경우 여러 보기 필드에 대해 5.2단계와 5.3단계를 반복하여 더 많은 데이터를 얻습니다.
6. 이미지 처리 및 데이터 분석
- YAP N/C 비율의 정량화
- 피지 이미지J를 엽니다. 5단계에서 촬영한 .nd2 이미지를 엽니다.
- 분석 > 측정값 설정을 클릭합니다. 면적, 통합 밀도, 평균 회색 값 및 모양 설명자를 확인합니다.
- Cy5 채널을 사용하여 핵을 식별합니다. 자유형 선택을 클릭하여 자유 선택 도구를 사용하여 핵의 윤곽을 그립니다. 또한 ImageJ에서 자동 핵 마스크 매크로를 확인하십시오 ( 재료 표 참조).
- FITC 채널에서 분석 > 측정을 클릭합니다. 평균의 측정값은 평균 핵 YAP 강도 DN이다.
- Cy5 채널을 사용하여 핵을 식별합니다. FITC 채널을 사용하여 셀을 식별합니다. 자유형 선택을 클릭하여 자유 선택 도구를 사용하여 세포질 내에서 관심 영역을 선택하고 자기 마이크로비드를 방지합니다. 이 관심 영역에는 핵이 포함되어서는 안됩니다.
- FITC 채널에서 분석 > 측정을 클릭합니다. 평균의 측정값은 평균 세포질 YAP 강도 DC이다.
- YAP N / C 비율 = D N / DC를 계산하십시오.
- 핵 형상 및 정규화된 핵 얼룩 강도의 정량화
- 피지 이미지J를 엽니다. 5단계에서 촬영한 .nd2 이미지를 엽니다.
- 분석 > 측정값 설정을 클릭합니다. 면적, 통합 밀도, 평균 회색 값 및 모양 설명자를 확인합니다.
- Cy5 채널을 사용하여 핵을 식별합니다. 자유형 선택을 클릭하여 자유 선택 도구를 사용하여 핵의 윤곽을 그립니다.
- Cy5 채널에서 분석 > 측정을 클릭합니다. 평균 의 측정값은 핵 얼룩 강도입니다. Circ의 측정값입니다. 핵 순환성입니다.
- 다른 힘 상태에서의 핵 얼룩 강도를 비교하기 위해 모든 핵 얼룩 강도를 "before_small_force.nd2"의 핵 얼룩 강도로 나누어 정규화된 핵 얼룩 강도를 생성합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
자석 이동 장치의 설계 및 자기력의 적용
자성 마이크로 비드를 통해 핵에 힘을 가하기 위해 자석의 공간적 위치를 제어하기 위해 자석 이동 장치가 설계 및 제작되었습니다. 자석 이동 장치에는 중앙 프레임, 3개의 손잡이 및 레일이 포함되어 있어 사이클당 1.59mm의 공간 분해능으로 부착된 자석을 x, y 및 z 방향으로 독립적으로 이동할 수 있습니다(그림 1A). 자석이 세포로 전달되는 7μm 마이크로비드에 가깝게 이동하면(그림 1B) 마이크로비드를 자기적으로 끌어당겨 핵에 힘을 가합니다(그림 1C). 힘의 방향과 크기는 자석과 마이크로비드 사이의 상대적 위치에 의해 제어됩니다.
이 논문에서, 마이크로 비드에 두 가지 다른 크기의 힘이 적용되었다 : (1) 자석이 셀 위 46mm에 놓였을 때 상대적으로 작은 힘; (2) 자석이 셀 위 13mm에 배치되었을 때 상대적으로 큰 힘. 마이크로비드 F에 가해지는 자기력은 식59에 의해 계산될 수 있다: 
여기서, Nd 는 소자 계수(구의 경우 0.33), μ는 진공에서의 투자율(철의 경우 6.3 × 10-3H/m), Vp는 마이크로비드의 부피(7μm 마이크로비드의 경우 178 μm3)이고, H는 단위 A/m의 자기장 강도입니다. H는 단위 Tesla의 자속 밀도 B에 비례합니다. 단일 7μm 마이크로비드에 작용하는 자기력은 매우 작고 힘 변환기로 감지하기 어려울 것으로 예상되었기 때문에 자속 밀도 B를 기준으로 측정하여 마이크로비드에 가해지는 자기력의 크기를 나타냈습니다. 자속 밀도를 측정하기 위해 페트리 접시 바닥의 위치에 홀 센서를 도입하고 자석을 페트리 접시 바닥에서 13mm 또는 46mm 떨어진 곳에 배치했습니다. 7μm 마이크로비드가 자기장에 영향을 미치기 때문에 자속 밀도는 마이크로비드의 유무에 관계없이 측정되었습니다. 7μm 마이크로비드의 존재에 관계없이, 동일한 자속 밀도가 얻어졌다: 13mm의 거리에서 B = 60.1mT 및 46mm의 거리에서 B = 3.7mT. 이 측정은 직경 12.7mm, 높이 12.7mm의 원통형 자석에 의해 생성된 자기장에 대한 7μm 마이크로비드의 영향(재료 표 참조)이 이 연구에 사용된 홀 센서로는 감지할 수 없음을 보여줍니다. 그러나, 13mm 거리를 갖는 경우의 자속 밀도는 46mm 거리의 경우보다 약 16 배 더 높았다. 자기력의 실험적 교정은 다음 섹션에 설명되어 있습니다(그림 6).
세포질로의 자성 마이크로비드 전달
유리 바닥 페트리 접시에 세포를 시딩한 후 12시간 후, 7μm 마이크로비드를 배양 배지에 첨가합니다. 마이크로비드는 세포에 의해 자발적으로 내재화됩니다. 마이크로비드는 FITC 또는 Cy5 채널에서 레이저 여기 하에서 형광을 방출하지 않기 때문에 내재화된 마이크로비드의 위치는 YAP 및 핵의 형광에 대한 컨포칼 이미징을 통해 어두운 중공의 위치로 식별할 수 있습니다. 2D 및 3D 이미지 모두 마이크로비드가 핵 외부에 있는 동안 세포질에 있음을 보여줍니다(그림 2).
마이크로비드의 세포 내로의 내재화 수준은 세포와 마이크로비드의 공동 배양 기간에 따라 달라집니다. 따라서, 세포는 내재화된 마이크로비드의 양에 따라 마이크로비드 없음, 단일 마이크로비드 및 다중 마이크로비드의 세 가지 유형으로 분류되었다(그림 3A). 공동 배양 7시간에, 세포의 62%는 마이크로비드를 내재화하지 않았고, 세포의 15%는 단일 마이크로비드를 내재화했으며, 세포의 23%는 다중 마이크로비드를 내재화하였다(총 세포 수 = 13). 공동 배양 12시간에, 세포의 53%는 마이크로비드를 내재화하지 않았고, 세포의 26%는 단일 마이크로비드를 내재화했으며, 세포의 21%는 다중 마이크로비드를 내재화했습니다(총 세포 수 = 62). 공동 배양 24시간에, 세포의 20%는 마이크로비드를 내재화하지 않았고, 세포의 28%는 단일 마이크로비드를 내재화했으며, 세포의 53%는 다중 마이크로비드를 내재화했습니다(총 세포 수 = 40)(그림 3B).
세포질의 마이크로비드는 핵 모양과 YAP 활성에 영향을 미치지 않습니다.
마이크로비드의 내재화가 핵 형상 및 단백질 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 먼저 원형도에 의해 핵 형상 및 YAP 활성을 YAP N/C 비율에 의해 각각 정량화하였다. 원형도는 원형도 = 4μ (면적 / 둘레2)로 계산됩니다. YAP N/C 비를 정량화하기 위한 상세한 단계는 이전 간행물60에 기재되어 있다. 간단히 말해서, YAP N/C 비율은 핵의 평균 YAP 강도를 세포질의 평균 YAP 강도로 나누어 계산하였다. 마이크로비드와 세포의 공배양이 마이크로비드가 내재화되지 않더라도 핵 모양에 영향을 미칠 수 있는 가능성을 고려할 때, 공동배양이 없는 세포(검은색 점, 대조군 #1, 원형도=0.806 ± 0.037, n=20), 마이크로비드와 공동배양되었지만 내재화가 없는 세포(회색 점, 대조군 #2, 원형도=0.806 ± 0.035, n=22), 단일 마이크로비드를 내재화하는 세포(빨간색 점, 단일 마이크로비드, 원형도 = 0.793 ± 0.048, n = 15)과 세포 내재화 멀티 마이크로 비드 (파란색 점, 멀티 마이크로 비드, n = 7) (도 3C)를 비교하였다. 결과는 테스트 된 4 개 그룹 모두에서 핵 순환성이 큰 차이가 없음을 보여줍니다 (그림 3C).
다음으로, YAP N/C 비율이 마이크로비드의 내재화에 의해 영향을 받는지 여부를 조사하기 위해, 마이크로비드와 공동 배양되었지만 내재화가 없는 세포(회색 점, 대조군 #2, YAP N/C 비율 = 1.155 ± 0.074, n=35)만을 단일 또는 다중 마이크로비드 내재화를 가진 세포(빨간색 점, 마이크로비드가 있는 세포, YAP N/C 비율 = 1.140 ± 0.078, n = 36) 공동 배양 12시간 (그림 3D). 마이크로비드가 있는 접시가 더 낮은 세포 밀도를 나타내기 때문에 공동 배양이 없는 세포는 비교되지 않았으며, 이는 YAP N/C 비율12에 영향을 미칠 수 있습니다. 결과는 두 그룹 간의 YAP N/C 비율에 유의미한 차이(p 값 = 0.667)가 없음을 보여주며, 이는 마이크로비드의 내재화가 YAP 활성에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다(그림 3D).
자기력은 핵을 변형시킵니다.
먼저, 핵의 변형이 도시된다. 핵의 변형은 세포 골격을 포함하는 세포에서 마이크로 비드 (그림 4A 및 그림 4A1-3)에 의해 적용된 압축력에 의해 발생합니다. 이 데이터(즉, 마이크로비드의 압축에 의해 변형되는 핵)는 마이크로비드가 실제로 군집된 세포질의 핵에 힘을 가하고 있음을 뒷받침합니다. 강제 적용 과정을 보여주는 명시야 비디오는 보충 자료에 포함되어 있습니다(보충 비디오 1). 둘째, 마이크로비드가 주변 세포골격에 힘을 가하는 동시에 핵을 간접적으로 변형시킬 수 있기 때문에, 파쇄된 액틴 필라멘트가 있는 세포에서 압축 실험을 반복하였다(Cyto D 처리(2.5μM, 1시간); 그림 4B). 이 연구는 액틴 필라멘트가 실제로 해중합되고(그림 4B) 핵이 마이크로비드에 의해 변형됨을 보여줍니다(그림 4B1-3). 이 데이터는 마이크로 비드가 얽힌 주변 세포 골격이없는 상태에서 핵에 직접 힘을 가하고 있음을 뒷받침합니다. 종합적으로, 이 데이터는 프로토콜과 도구가 핵에 직접 힘을 가할 수 있음을 보여줍니다.
세포 내 자기 마이크로비드의 공간적 및 시간적 제어
마이크로비드의 공간 제어를 달성하기 위해, 한 쌍의 자석을 사용하여 마이크로비드를 이동시키고 핵 상의 압입 위치를 제어하였다(도 5A). 비드는 최대 2.2μm의 변위로만 이동할 수 있지만(그림 5A1-4), 해당 위치의 핵에 압입 기능을 유연하게 적용할 수 있습니다. 주변 액틴 세포 골격은 마이크로 비드의 움직임을 제한 할 수 있습니다. 따라서 액틴 세포 골격은 Cyto D 처리 (2.5 μM, 1 h)에 의해 파괴되었고 마이크로 비드 위치는 조작되었지만 유사한 결과를 보였다. 따라서 미세 비드가 세포질의 핵 및 기타 주변 세포 기관과 물리적 / 화학적으로 결합하여 큰 공간 이동 (>2.2 μm)을 제한 할 수 있다는 가설을 제안 할 수 있습니다.
마이크로비드의 공간 제어를 달성하기 위해, 마이크로비드가 핵의 동일한 위치에서 힘을 두 번(다른 힘 크기로) 적용 및 해제하도록 제어하는 한 쌍의 자석이 사용되었습니다(그림 5B 및 그림 5B1-B4). 힘 적용 및 해제의 한 주기에 대한 현재 지속 시간은 12초입니다. 시간 제어 속도는 XYZ 무버의 작동 속도에 의해 결정됩니다.
자기력 교정
핵에 적용된 비드 힘은 핵의 유사한 변형을 일으키는 보정된 원자력 현미경(AFM)에 의해 적용된 힘을 실험적으로 측정하여 추정되었습니다. 특히, 액틴 세포 골격은 AFM이 세포의 정점 표면에 힘을 가하고 액틴 피질과 세포 골격의 제거가 AFM 팁과 세포핵 사이의보다 직접적인 접촉을 허용하기 때문에 CytoD (2.5 μM; 1 h, 그림 4B)에 의해 먼저 용해되었습니다. 액틴 피질과 세포 골격이 용해 된 세포는 핵 모양과 핵 염색 강도를 건강한 세포와 비교 한 결과 살아 있습니다 (보충 그림 1). 둘째, 마이크로 비드와 유사한 크기와 모양을 가진 기능화되지 않은 AFM 팁 (반 구형, 반경 = 5 μm)을 사용하여 힘 제어 방식으로 세포의 정점 표면을 들여 쓰고 동시에 세포와 핵체의 3D 공초점 이미지를 획득했습니다 (그림 6A). 0.8 nN에서 2.0 nN까지의 압축력의 크기는 문헌24에 기초하여 1.5 nN 크기의 힘이 핵을 충분히 변형시키는 것으로 알려져 있기 때문에 선택되었습니다. 셋째, AFM 압흔으로 인한 핵의 정상적인 변형을 정량적 영상 분석을 통해 측정하였다. 또한 정량적 AFM 힘-변위 관계를 제공하는 검량선(그림 6B)을 얻었습니다. 넷째, 유사한 크기와 모양을 갖는 마이크로 비드를 제어하여 핵의 측면에 압축력을 가했습니다(반경=7μm; 도 6C), 및 핵막의 변형을 영상분석을 통해 측정하였다. 비드 적용 힘은 AFM 힘-변위 관계를 기반으로 추정됩니다.
예를 들어, 그림 6C에서 '큰 힘'에서 자성 마이크로 비드 (직경 = ~ 7 μm)로 인한 핵의 변형은 약 1.5 μm입니다. 그림 6D에서 5μm 반구형 프로브가 있는 AFM 팁을 사용하여 핵 위에 세포를 들여쓰기하여 1.5μm 핵 변형을 달성했습니다. AFM에 의해 기록 된 해당 힘은 1.4 nN입니다. 따라서 마이크로비드에 의해 가해지는 힘은 ~1.4nN으로 추정됩니다. 동일한 접근 방식에 따라 '작은 힘'에서의 자기력은 0.8nN으로 보정되고 0.4μm 핵 압입을 일으켰습니다.
이 연구는 AFM으로 측정된 힘이 다음 가정에 기초하여 마이크로비드에 가해진 힘을 나타낼 수 있다고 생각한다: (1) 상이한 세포 내의 핵의 강성은 유사하다. (2) 핵의 기계적 성질은 압흔이 적용된 핵 부위에 의존하지 않는다. 자기력은 핵의 측면에 수평으로 적용되는 반면 AFM 힘은 핵의 정점 측면에 수직으로 적용됩니다. 그들 사이의 기계적 차이는 무시할 수있는 것으로 가정합니다. (3) AFM 실험에서 프로브는 세포막과 세포 골격을 통해 핵에 직접 힘을 가합니다. 액틴 필라멘트를 파괴 한 후, AFM이 핵에 가해지는 힘은 전자의 경우 AFM 프로브와 핵 사이에 여전히 막이 있음에도 불구하고 핵에 마이크로 비드가 가해지는 힘과 유사합니다.
자기력은 YAP N/C 비율의 변화를 유발합니다.
마이크로비드에 가해진 자기력이 핵을 변형시키고 YAP 전좌를 유도할 수 있음을 증명하기 위해, 마이크로비드 내재화와 세포의 YAP N/C 비율을 (1) 힘을 가하기 전, (2) 힘을 가한 후, (3) 힘을 방출한 후의 세 단계로 정량화하였다. 일부 세포는 힘이 가해지거나 방출되었을 때 핵 모양과 YAP N/C 비율의 변화를 보였다(그림 7A, C). YAP의 강도 변화는 두 가지 가능한 메커니즘에 기인 할 수 있습니다 : (1) YAP-FP 단백질은 강제 적용 후 세포질에서 핵으로 전위됩니다. 이 경우 핵 염색은 신호 변화가 없어야합니다. 핵 염색 강도는 크게 변하지 않아야합니다. (2) YAP-FP 단백질은 강제 적용 후 전위되지 않습니다. 관찰된 YAP 강도 변화는 힘에 의한 핵 부피 변화 및 결과적인 YAP-FP 농도 변화로 인한 것이다. 이 경우, 핵 부피가 변함에 따라 염색 염료의 농도도 변하기 때문에 핵 염색 강도는 YAP 핵 강도와 유사한 경향으로 변화해야 한다. 따라서 적색 채널로부터의 핵 염색 강도 변화(여기: 650 nm; 방출: 681 nm)를 측정하였다. 녹색 채널에서 YAP의 강도는 변하지만, 적색 채널에서 핵 염색에는 강도 변화가 없다. 따라서 첫 번째 메커니즘이 존재할 가능성이 높습니다(그림 7B). 종합적으로, 결과는 자기력에 의한 핵 변형이 YAP 전좌를 유발한다는 것을 보여줍니다.
다음으로, YAP N/C 비율의 순 변화를 두 그룹의 세포 내에서 정량화하였다: (1) 마이크로비드 내재화가 없는 세포 (회색 점, 대조군, n=9); 및 (2) YAP N/C 비율의 변화를 나타내는 내재화된 마이크로비드가 있는 선택된 셀(작은 힘의 경우 녹색 점, 큰 힘의 경우 빨간색 점, n = 11). 0.8nN 힘에서 내재화된 마이크로비드가 있는 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = -0.030 ± 0.029, n = 11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = -0.003 ± 0.012, n = 9를 보여줍니다. 1.4nN의 힘에서, 내재화된 마이크로비드(들)를 갖는 세포는 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.011 ± 0.040, n=11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.005 ± 0.005, n = 9를 보여줍니다(그림 8A). 0.8nN의 힘에서, 내재화된 마이크로비드를 갖는 세포는 절대 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.057 ± 0.017, n=11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.021 ± 0.007, n = 9를 보여줍니다. 차이가 유의합니다(p 값 = 0.0093, **). 1.4nN 힘에서 내재화된 마이크로비드가 있는 셀은 절대 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.070 ± 0.020, n = 11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.010 ± 0.003, n = 9를 보여줍니다. 그 차이는 유의하다(p 값 = 0.0007, ***)(도 8B). 함께, 이러한 결과는 세포질 내의 마이크로비드에 적용된 자기력이 실제로 YAP 전좌를 유도하고 YAP N/C 비율을 변화시킬 수 있음을 확증합니다.
그림 1: 자기 이동 장치의 설계 및 자기 마이크로비드에 의한 셀에서의 힘 적용 개략도. (A) 자석을 잡고 x, y, z 방향으로 이동하도록 구현된 장치의 3차원 개략도. 이 장치는 너비 241.3mm, 높이 104.1mm의 베이스, 두 개의 손잡이, 막대 및 자석으로 구성됩니다. 손잡이는 올바른 작동 회전 방향으로 스플라인되어 해당 방향으로 움직입니다. 자석은 자기 마이크로 비드에 다른 크기와 방향으로 자기력을 적용하기 위해 접시에 더 가깝게 낮추거나 더 들어 올립니다. (b) 7 μm 철 마이크로비드의 실시예 주사전자현미경(SEM) 이미지. (C) 세포질 내부에 전달된 자성 마이크로비드는 자기장이 인가될 때 핵과 같은 세포 소기관에 힘을 가할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 자성 마이크로비드(파란색 화살표로 표시된 검은색 중공)가 세포(YAP로 표시됨)와 핵 외부에 내재화되어 있음을 보여주는 대표적인 이미지 . (A) YAP(녹색), 핵(빨간색) 및 명시야 세포의 XY 단면. (B) 세포의 3D 재구성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 세포에 의해 내재화된 마이크로비드는 핵 모양과 YAP N/C 비율에 영향을 미치지 않습니다 . (A) 마이크로비드, 단일 마이크로비드 및 다중 마이크로비드 내재화가 없는 세포의 대표적인 명시야 및 형광 이미지. 파란색 화살표는 세포질 내부의 마이크로 비드의 위치를 나타냅니다. (b) 공동 배양의 7 시간 (n = 13), 12 시간 (n = 62) 및 24 시간 (n = 40)에서, 마이크로 비드, 단일 마이크로 비드 및 다중 마이크로 비드 내재화를 나타내지 않는 세포의 백분율. (C) 핵 원형도는 대조군 세포와 마이크로비드 내재화를 갖는 세포 사이에 유의한 차이를 나타내지 않는다. 대조군 #1 (마이크로비드 공동배양 없음): 원형도 = 0.806 ± 0.037, n = 20; 대조군 #2 (마이크로비드 공동배양 포함, 마이크로비드 내재화 없음): 원형도 = 0.806 ± 0.035, n=22; 단일 마이크로비드 내재화: 원형도 = 0.793 ± 0.048, n=15; 다중 마이크로비드 내재화: 원형도 = 0.780 ± 0.061, n = 7. (D) YAP N/C 비율은 대조군 세포(마이크로비드 공동 배양 포함, 마이크로비드 내재화 없음, YAP N/C 비율 = 1.155 ± 0.074, n = 35)와 마이크로비드 내재화가 있는 세포(YAP N/C 비율 = 1.140 ± 0.078, n = 36) 간에 유의미한 차이(p 값 = 0.667)를 나타내지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 액틴 필라멘트가 있거나 없는 핵에 직접 힘 적용. (A) 세포는 액틴 필라멘트 (노란색)를 보여줍니다. (대답 1) 힘이 가해지지 않을 때의 핵 이미지. (대답 2) 힘이 가해진 후의 핵 이미지. (대답 3) 힘 적용 전후의 핵 경계의 중첩 이미지는 핵 들여쓰기를 보여줍니다. (B) 세포는 Cyto D 처리 (2.5 μM, 1 시간) 후에 파괴 된 액틴 필라멘트 (노란색)를 보여줍니다. (나1) 힘이 가해지지 않을 때의 핵 이미지. (나2) 힘이 가해진 후의 핵 이미지. (나3) 힘 적용 전후의 핵 경계의 중첩 이미지는 파괴된 액틴 세포골격과의 핵 압흔을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포내 마그네틱 마이크로비드의 공간적 및 시간적 제어. (A) 한 쌍의 자석이 자성 마이크로비드를 공간적으로 제어합니다. (대답 1) 위치 1에서 세포 경계(녹색 선), 핵 경계(빨간색 선) 및 자성 마이크로비드(노란색 선)의 명시야 이미지. (대답 2) 마그네틱 마이크로비드는 위치 1에서 핵을 들여씁니다. (대답 3) 자성 마이크로비드는 위치 2(노란색 선)로 이동한다. 위치 1은 참조(노란색 점선)로 표시됩니다. (대답 4) 마그네틱 마이크로비드는 위치 2에서 핵을 들여씁니다. (B) 한 쌍의 자석이 자기 마이크로 비드를 일시적으로 제어합니다. (나1) 시점 I.에서 힘이 가해지지 않은 세포의 명시야 이미지(B2) 마그네틱 마이크로비드는 시점 II에서 핵에 힘을 가합니다. (나3) 자성 마이크로비드는 시점 III에서 핵으로부터 힘을 방출한다. (지하 4층) 자성 마이크로비드는 시점 IV에서 핵에 더 큰 힘을 가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. AFM 압흔을 사용하여 핵에 마이크로비드가 가해진 힘을 교정합니다. (A) 교정 프로세스의 개략도. 마그네틱 마이크로비드는 핵(왼쪽)에 수평 압축을 적용하고 AFM 프로브는 핵에 수직으로 들여쓰기합니다. (B) AFM 압입력 대 핵 변형. (C) 자성 마이크로 비드에 의한 강제 적용 전후의 핵 변형 (1.5 μm)의 대표 이미지. (D) 1.4nN 힘으로 AFM 압입 전후의 유사한 핵 변형 (1.5μm)의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: YAP N/C 비율 변화가 자기력 적용 및 방출에 의해 유도됨을 보여주는 대표적인 데이터. (A) YAP(녹색)의 XY 단면과 핵(적색)의 형광 이미지, 힘 없음, 강제 켜기 및 강제 끄기. 강제 사용 상태에서 세포질 YAP 강도는 노란색 화살표로 가리키는 위치에서 감소하는 반면 핵 YAP 강도는 증가합니다. YAP N/C 비율이 증가합니다. (B) YAP N/C 비율은 힘이 켜질 때(1.0791에서 1.2327로) 증가하고 힘이 꺼지면 감소합니다(1.2327에서 1.1548로). 정규화된 핵 얼룩 강도는 힘 적용(1.00117) 및 방출(0.95578)에 따라 약간의 변화를 보입니다. (C) YAP (녹색) 및 핵 (적색)의 X-Z 단면 이미지의 힘, 강제 켜기 및 강제 끄기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 자기력 적용에 의해 유도된 YAP N/C 비율 변화. (A) 0.8nN의 힘에서 내재화된 마이크로비드가 있는 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = -0.030 ± 0.029, n=11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = -0.003 ± 0.012, n = 9를 보여줍니다. 1.4nN의 힘에서, 내재화된 마이크로비드(들)를 갖는 세포는 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.011 ± 0.040, n=11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.005 ± 0.005, n = 9를 보여줍니다. (B) 0.8nN 힘에서 내재화된 마이크로비드가 있는 셀은 절대 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.057 ± 0.017, n = 11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.021 ± 0.007, n = 9를 보여줍니다. 차이가 유의합니다(p 값 = 0.0093, **). 1.4nN 힘에서 내재화된 마이크로비드가 있는 셀은 절대 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.070 ± 0.020, n = 11; 대조군 셀은 순 YAP N/C 비율 변화 = 0.010 ± 0.003, n = 9를 보여줍니다. 차이가 유의합니다 (p 값 = 0.0007, ***) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 핵 모양과 핵 염색 강도. (A) Cyto D 처리없이, (B) Cyto D 처리시 및 (C) 죽은 세포. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: 힘 적용 과정을 보여주는 명시야 비디오입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
자성 마이크로비드의 내재화(섹션 2.2)는 세포외 마이크로비드가 핵에 직접 힘을 가할 수 없기 때문에 중요합니다. 힘 적용 및 이미징 (섹션 5.3)은이 실험에서 중요한 단계이며 핵을 변형시키고 의미있는 생물학적 결과를 유도하는 데 필요한 힘은 샘플에 따라 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 힘 크기 (0.8 nN 및 1.4 nN)는 덜 민감한 세포에서 핵 기계 감지를 유발하기 위해 더 증가 될 수 있습니다.
높은 처리량으로 정량적 방식으로 자기력을 적용하려면 단일 마이크로비드의 내재화가 이상적인 접근 방식입니다. 이 연구에서 단일 마이크로비드 내재화가 있는 세포의 비율은 12시간(26%)과 24시간(28%)에서 유사했지만 마이크로비드 내재화가 없는 세포는 24시간(20%)보다 12시간(53%)에서 더 높았습니다(그림 3B). 12 시간은 더 많은 단일 마이크로 비드가 포함될 수 있고 세포를 제어 할 수 있기 때문에 강제 적용 실험을위한 최적의 시간으로 간주됩니다. 다양한 세포주 및 마이크로비드 크기의 경우 공동 배양 시간과 마이크로비드 농도를 테스트하여 해당 최적 조건을 결정해야 합니다.
실험에서, 마이크로비드는 핵에 특이적으로 결합하도록 코팅되지 않았다. 따라서 마이크로 비드에서 핵으로 직접 전달되는 힘은 압축 일 가능성이 높습니다. 결과는 YAP N/C 비율이 세포 집단을 증가시키고 감소시킨다는 것을 보여줍니다(그림 8A). 한 가지 가능한 이유는 마이크로비드를 통해 가해지는 자기력이 세포골격 내에서 양의 또는 음의 장력 변화를 일으키고 YAP N/C 비율을 조절하여 각각 증가 또는 감소할 수 있기 때문입니다(28). 이전 연구에 따르면 핵에 대한 압축력은 YAP N/C 비율의 증가를 유도합니다28. 향후 실험에서 핵의 직접적인 힘 감지를 연구하기 위해 세포 골격을 파괴하여 세포 골격에서 핵으로의 힘 전달을 제거 할 수 있습니다.
현재 방법에는 두 가지 잠재적인 단점이 있습니다. 첫째, 이러한 실험에서 3D 무버(그림 1A)를 사용하여 비드의 움직임을 조정했으며, 이는 실시간 컨포칼 이미징으로 모니터링되고 핵에 압축력을 적용하는 것을 목표로 합니다. 그러나, 핵막의 미끄러운 성질 및 세포질에서의 복잡한 환경으로 인해, 비드-가해지는 힘의 방향은 순전히 압축적이지 않을 수 있다(즉, 핵막 표면에 절대적으로 수직이 아닐 수 있다). 이 불완전 성은 전단력이 핵막에 적용될 수 있습니다. 둘째, 본 연구에 사용된 현재 마이크로비드는 핵과 결합하는 항체와 접합되지 않는데, 이는 비드의 공간적 이동성이 비접촉 마그네틱 액추에이터의 장점을 입증하는 현재 실험에서 중요하기 때문이다. 따라서 현재의 방법은 핵막에 장력을 가할 수 없습니다.
앞으로는 (1) 항-네스프린-1 항체를 갖는 비드가 핵과 특이적으로 결합하도록 접합될 것이다. 이는 마이크로비드와 표적 단백질 사이의 직접적이고 특정한 힘 전달을 보장할 수 있습니다. (2) 힘의 방향은 형광 비드가 내장된 소프트 하이드로겔에서 단일 자성 마이크로비드를 조작하여 보정됩니다. 형광 비드의 3D 변위는 하이드로겔의 변형장을 계산하고 적용된 자기장의 함수로 힘 방향을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 마이크로비드가 핵과 화학적으로 결합된 후 알려진 방향으로 힘을 가하면 힘 유형(인장, 압축 또는 전단)이 결정됩니다. (3) 핵 염색의 3D 이미징은 핵의 3D 시뮬레이션 FEM 모델을 구축하는 데 사용됩니다. 힘 방향은 자기력 적용 전후의 핵 변형을 비교하여 확인할 수 있습니다.
이 연구에서 개발 된 고유 한 기술은 몇 가지 잠재적 인 이점을 제공합니다 : (1) AFM 프로브에 의한 수직 압입과 비교하여 자기 마이크로 비드는 모든 방향으로 힘을 가할 수 있습니다. 2D 기질 표면 상에서 배양된 세포는 원형질막 및 핵 외피의 그의 수직 및 수평 표면 상에 이질적인 단백질 분포 및 배향을 가질 수 있다. 수평으로 힘을 가하면 이전에 관찰되지 않은 기계 감지 응답을 유도 할 수 있습니다. (2) 마이크로 비드가 기능적으로 코팅되어 핵에 결합하면 밀고 당기는 힘을 모두 핵에 직접 적용하여 뚜렷한 힘 방향으로 인한 차동 핵 기계 감지를 추가로 연구 할 수 있습니다. (3) 특정 핵 외피 단백질에 대한 마이크로 비드의 특이 적 결합을 제어함으로써, 이전에 충분히 조사되지 않은 핵력 감지 메커니즘을 해명 할 수있다. 새로운 증거는 핵이 기계-센서(36)일 가능성이 있고, 핵-기계-감지가 YAP 전좌(28)의 가장 직접적인 조절자임을 보여준다. 핵 조절 YAP 전좌의 메커니즘이 활발히 연구되고 핵 기공 크기28, 핵 모양 25,61, LINC 복합체 및 핵 포락선 장력20을 포함하여 핵의 기계 센서 또는 매개 변수의 여러 후보가 제안됩니다. 자성 마이크로비드를 조작하면 LINC 복합체에 직접 힘을 가하고 핵 외피 장력 및 모양의 제어된 규제를 통해 이러한 메커니즘을 자세히 탐색할 수 있습니다. (4) 핵에 힘을 가하는 것 외에도 마이크로 비드는 원형질막의 내부에 결합하여 막 단백질의 세포 내 도메인과 그 복합체가 생물 물리학 적 신호에 어떻게 반응하는지 밝히도록 설계하는 데 적합합니다.
요약하면, 이 논문은 (1) 핵 형태 및 단백질 기능에 영향을 미치지 않고 마이크로 크기의 철 마이크로비드를 세포질에 전달하고, (2) 자기 마이크로비드에 의해 핵에 힘을 가하고, (3) 힘 적용 중에 공초점 형광 라이브 셀 이미징을 수행하는 방법을 시연했습니다. 이러한 비침습적 도구는 단일 세포 내 세포 소기관의 직접적인 후성유전학적 조작, 핵 기계 변환에 대한 초고해상도 이미징 기반 심문, 강제 조절 3D 염색체 조직에 대한 상세한 탐색(Hi-C와 결합: 고해상도 염색체 확인 캡처) 및 세포 생리학 및 병리생물학의 맥락에서 재프로그래밍할 수 있는 가능성을 열어줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 UF Gatorade Award Start-up Package (XT), UFHCC Pilot Award (XT 및 Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (XT) 및 UFHCC University Scholars Program (H.Y. Wang)의 지원을 받습니다. 우리는 Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris(BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (신경 외과), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Jessie L-S Au 박사 (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), 그리고 Nikon의 지원 팀 (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon 및 Jon Ekman). 우리는 Tang, Yamaguchi, Sharma 's, Au, Siemann 및 Guan의 연구소의 모든 구성원과 UF MAE 부서의 모든 직원의 효과적인 지원에 깊이 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
| 7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
| A1R confocal system | Nikon | ||
| Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
| Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
| NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
| XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
- Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
- Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
- Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
- Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
- Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
- Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
- Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
- Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
- Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
- Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
- Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
- Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
- Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
- Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
- Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
- Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
- Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
- Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
- Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
- Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
- Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
- Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
- Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
- Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
- Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
- Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
- Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
- Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
- Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
- Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
- Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
- Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
- Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
- Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
- Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
- Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
- Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
- Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
- Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).
