Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinera 3D-magnetiskt kraftställdon och multifunktionell fluorescensavbildning för att studera kärnmekanobiologi

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

Denna studie presenterar ett nytt protokoll för att direkt applicera mekanisk kraft på cellkärnan genom magnetiska mikrober som levereras in i cytoplasman och för att genomföra samtidig fluorescerande avbildning av levande celler.

Abstract

En grundläggande fråga inom mekanobiologin är hur levande celler känner av extracellulära mekaniska stimuli i samband med cellfysiologi och patologi. Den cellulära mekano-känslan av extracellulära mekaniska stimuli tros vara genom membranreceptorerna, det associerade proteinkomplexet och cytoskeletten. Nya framsteg inom mekanobiologi visar att cellkärnan i cytoplasma själv självständigt kan känna av mekaniska stimuli samtidigt. En mekanistisk förståelse av hur cellkärnan känner av, omvandlar och svarar på mekaniska stimuli saknas dock, främst på grund av de tekniska utmaningarna med att komma åt och kvantifiera kärnmekaniken med konventionella verktyg. Detta dokument beskriver design, tillverkning och implementering av ett nytt magnetiskt kraftställdon som tillämpar exakta och icke-invasiva 3D-mekaniska stimuli för att direkt deformera cellkärnan. Med hjälp av CRISPR/Cas9-konstruerade celler visar denna studie att detta verktyg, i kombination med högupplöst konfokal fluorescerande avbildning, möjliggör avslöjandet av realtidsdynamiken hos ett mekanokänsligt ja-associerat protein (YAP) i enskilda celler som en funktion av kärndeformation. Denna enkla metod har potential att överbrygga det nuvarande teknikgapet i mekanobiologisamhället och ge svar på den kunskapslucka som finns i förhållandet mellan kärnmekanotransduktion och cellfunktion.

Introduction

Denna studie syftar till att utveckla och tillämpa en ny teknik för att belysa kärnmekanobiologi genom att kombinera de magnetiska ställdonen som applicerar mekanisk kraft direkt på cellkärnan och den konfokala fluorescensmikroskopin som samtidigt avbildar de strukturella och funktionella subcellulära förändringarna. Celler känner av extracellulära biofysiska signaler inklusive vävnadsstyvhet 1,2,3,4, interstitiellt vätsketryck och skjuvspänning 5,6,7, yttopologi/geometri 8,9,10,11,12 och spännings-/kompressionsspänning13,14, 15,16. Biofysiska signaler omvandlas till biokemiska signaler och utlöser potentiella nedströmsförändringar av genuttryck och cellbeteenden - en process som kallas mekanotransduktion 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . För att studera mekanotransduktionsprocesser har en myriad av tekniker utvecklats för att tillämpa mekanisk kraft på cellerna, såsom atomkraftmikroskopi28, cellsträckningsanordning29, bio-MEMS (mikroelektromekaniska system) kraftsensor 15,30,31, skjuvreologi 32 och Stereo Vision System 33 . En ny granskning sammanfattar metoderna för att tillämpa extracellulära mekaniska ledtrådar och störa mekanosensering34. Hittills tillämpar de flesta av dessa metoder kraft på cellplasmamembranet, och celler tar direkt emot dessa extracellulära biofysiska signaler via membranreceptorer såsom integrin, kadherin, jonkanaler och G-proteinkopplade receptorer. Därefter sänder de signalen till den intracellulära cytoskeletten och kärnan. Till exempel, med hjälp av ja-associerad protein (YAP) translokation som en indikator på mekano-avkänning, visas celler att känna av de mekaniska signalerna om substratstyvhet och extracellulär spänning från cellmembranet och överföra dem genom cytoskeletten till kärnan för att inducera YAP-cytoplasma-till-kärntranslokation28,35.

Nya bevis tyder på att själva cellkärnan är en oberoende mekanosensor 8,36,37. Detta bevisas av experiment som utförs på den isolerade kärnan som skördats från celler, där det avslöjades att kärnor adaptivt ändrar sin styvhet som svar på den mekaniska kraften som direkt appliceras på dem36. Under många fysiologiska förhållanden känner kärnor i både tumör- och friska celler av extracellulära biofysiska signaler och ändrar deras mekaniska egenskaper och sammansättningar38,39,40. Till exempel, vid extravasation, minskar tumörcellernas kärnstyvhet och upprätthåller mjukhet i över 24 timmar38. Under migration genom begränsat interstitiellt utrymme förlorar kärnorna i tumörceller ofta och återställer sin strukturella integritet39. Hur kärnan känner av den biofysiska signalen är dock okänt, även om flera kärnhöljeproteiner och familjer av proteiner har visat sig vara inblandade, såsom Lamin A / C och linker av nukleoskelett och cytoskelett (LINC) komplex38,41. Därför kommer nya icke-invasiva metoder som direkt kan applicera kraft på kärnan att frikoppla effekten av kraftöverföring från cellplasmamembranet och cytoskelettet och kommer att hjälpa till att belysa de tidigare otillgängliga molekylära mekanismerna för kärnmekanoavkänning.

Forskning som använde optisk pincett för att manipulera organeller42 och mikrober injicerade i celler43 visade den tekniska förmågan att direkt applicera kraft på kärnan. Den optiska pincetttekniken har emellertid flera begränsningar: (1) optisk pincett med låg genomströmning manipulerar ofta bara en cell eller mikrob åt gången; och (2) potentiell fotoskada och temperatur artefakt-deformation av kärnkraft kräver tiotals pN36, och motsvarande nödvändiga lasereffekt är cirka 10 mW per pN44,45. Sådan laserintensitet är tillräcklig för att utlösa fotoskador i cellerna och störa cellfunktionerna under experimentet46.

Magnetisk kraft applicerad genom mikrober i levande celler visar potentialen att direkt applicera kraft på kärnan och övervinner begränsningarna hos optisk pincett. När mikrober levereras in i cytoplasman kan ett magnetfält utöva en magnetisk kraft på flera mikrober samtidigt på ett sätt med hög genomströmning. Magnetfältet påverkar inte cellfunktioner47, men genererar kraft från pN till nN, vilket är tillräckligt för att inducera kärndeformation 36,48,49. Hittills har manipulation av magnetiska mikrober applicerats på cellplasmamembran48, inuti cytoplasman50, på F-aktin51, inuti kärnan47 och på den isolerade kärnan36. Magnetisk manipulation av mikrober har emellertid aldrig använts för att applicera direkt mekanisk kraft på kärnhöljet för att studera mekanotransduktion i kärnan.

I detta dokument utvecklas en enkel teknik för att icke-invasivt leverera magnetiska mikrober till cytoplasman och använda dessa mikrober för att applicera mekanisk kraft på kärnan (figur 1). Här används CRISPR / Cas9-konstruerade mänskliga normala B2B-cellinjer som endogent uttrycker mNeonGreen21-10/11-taggad YAP för att validera metoden. YAP är ett mekanokänsligt protein, och translokationen av YAP regleras av kärnmekanoavkännande 14,28. Den CRISPR/Cas9-reglerade knock-in-metoden valdes för att märka endogen YAP med ett fluorescerande protein (FP) mNeonGreen21-10/11. Även om CRISPR-redigering är känd för att ha ofullständig effektivitet och off-target-effekt, integrerade protokollen i tidigare publikationer fluorescenssortering för att välja för korrekt öppen läsraminsättning52,53,54. Med detta ytterligare urvalslager observerades ingen taggningshändelse utanför målet i 20+ cellinjer som tidigare genererat52,53,54,55. Detta är en delad fluorescerande proteinkonstruktion, men i princip kan vilken uttryckbar fluorescerande tagg som helst vara användbar. Denna märkningsmetod är överlägsen transgen- eller antikroppsmetoder. För det första, till skillnad från transgenuttrycket, upprätthåller det taggade proteinet enkopiegendosering och uttrycker sig i det fysiologiska sammanhanget för det inhemska genreglerande nätverket, vilket begränsar avvikelser i proteinkoncentration, lokalisering och interaktion. Taggningsmetoden som används i denna studie uppnår över en storleksordning högre genomströmning och effektivitet än full FP-taggning. Det undviker också utmaningar i samband med immunofluorescens på grund av fixeringsartefakter och den begränsade tillgången på högkvalitativa antikroppar med hög specificitet. För det andra gör tillvägagångssättet som används i detta dokument minimal störning av cellfysiologin och möjliggör realtidsuppenbarelse av alla endogena YAP: er autentiskt. Däremot leder andra vanliga transgenmetoder ofta till överuttryck av YAP. Den resulterande artificiella fördelningen kan potentiellt orsaka cytotoxicitet och påverka mekanoavkänning av celler56,57,58.

Denna studie presenterar ett protokoll för att direkt applicera kraft på kärnan genom magnetiska mikrober som levereras in i cytoplasman och för att genomföra samtidig fluorescerande avbildning av levande celler. Sammanfattningsvis visar protokollen som presenteras här hur man (1) levererar magnetiska mikrober in i cellen utanför kärnan, (2) manipulerar mikroberna för att applicera magnetisk kraft på kärnan, (3) utför konfokal fluorescerande avbildning av cellerna under manipulation och (4) kvantitativt analyserar YAP-kärn- / cytoplasmaförhållandet (N / C) under hela kraftapplikationsprocessen. Resultaten tyder på att (1) genom endocytos kan magnetiska mikrober icke-invasivt levereras till cytoplasman hos B2B-celler inom 7 timmar (figur 2 och figur 3); och (2) kvantifierad magnetisk kraft som appliceras direkt på kärnan (figur 4, figur 5 och figur 6) ensam kan utlösa olika förändringar av YAP N / C-förhållandet i CRISPR / Cas9-konstruerade B2B-celler (figur 7 och figur 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Underhåll av CRISPR/Cas9-konstruerade B2B-celler

  1. Odla B2B-celler i en T25-kolv med RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin.
  2. Håll B2B-cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5%CO2.
  3. Subkultur B2B-cellerna när sammanflödet når 70% till 80%.
  4. Förvara B2B-cellinjen i RPMI-1640 odlingsmedium med 10% (v / v) DMSO i en -80 ° C frys.
  5. Använd B2B-cellerna med ett passagenummer mindre än 10 i experimenten.

2. Cellodling

  1. Frö cellerna på en petriskål med glasbotten.
    1. Flytta kolven som innehåller B2B-celler inuti från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet.
    2. Ta bort odlingsmediet i kolven med en aspirerande pipett med en vakuumpump ansluten.
    3. Tvätta kolven med 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    4. Ta bort PBS med aspireringspipetten.
    5. Tillsätt 0,5 ml 0,05% trypsinlösning för att lossa celler från botten av kolvsubstratet.
    6. Sätt kolven i inkubatorn i 5 min.
    7. Flytta kolven till biosäkerhetsskåpet. Tillsätt 5 ml nytt odlingsmedium i kolven och pipettera lösningen upp och ner.
    8. Avsätt 50 μl av mediet med celler (300 celler/μl) på petriskålen med glasbotten. Tillsätt 2 ml odlingsmedium i petriskålen.
    9. Placera petriskålen i inkubatorn. Vänta i 12 timmar tills cellerna fäster.
  2. Odla cellerna med magnetiska mikrober.
    1. Väg 0,2 g av 7 μm karbonyljärnmikrober med medeldiameter (nedan kallade 7 μm mikrober, se materialtabellen).
    2. Använd en pipett för att suspendera mikroberna i 1 ml RPMI-1640 odlingsmedium.
    3. Ta petriskålen med B2B-celler till biosäkerhetsskåpet.
    4. Tillsätt 200 μl av mediet som innehåller mikropärlor i petriskålen.
      OBS: Tillsätt mediet snabbt för att undvika utfällning av mikropärlorna.
    5. Sätt tillbaka petriskålen i inkubatorn tills mikrober internaliseras av cellerna. Kontrollera internaliseringen var 6: e timme för att bestämma den optimala tiden för internalisering för olika cellinjer.
    6. För att kontrollera internaliseringen, utför konfokal fluorescensavbildning för att visualisera mikropärlan, kärnkraften och cellgränsen. Om mikrobon internaliseras av cellen kommer den att ligga inom cellgränsen.

3. Visualisering av kärnan

  1. Värm 1,5 ml av odlingsmediet i inkubatorn i 15 min.
  2. Stäng av ljuset på biosäkerhetsskåpet. Ta petriskålen som innehåller cellen, uppvärmt odlingsmedium, kärnfläck och Verapamil HCl i biosäkerhetsskåpet.
    OBS: Kärnfärgningskomponenter är känsliga för ljus. Undvik exponering för ljus under drift.
  3. Späd 1000x kärnfläck med DMSO till 100x.
  4. Späd 100 mM Verapamil HCl med DMSO till 10 mM.
  5. Tillsätt 15 μl 100x kärnfläck och 15 μl 10 mM Verapamil HCl till 1,5 ml odlingsmedium. Blanda väl genom att pipettera upp och ner.
  6. Ta bort odlingsmediet från petriskålen. Tillsätt odlingsmediet som innehåller kärnfärgning i petriskålen.
  7. Sätt tillbaka cellerna i inkubatorn i över 2 timmar.

4. Förberedelse av hårdvaran för magnetisk kraftapplikation

  1. 3D-utskrift av alla delar med akrylnitrilbutadienstyren (ABS) och montera dem enligt CAD-designen (figur 1A). CAD-designen ingår i materialtabellen.
  2. Använd dubbelhäftande tejp för att fästa magneten på den magnetförflyttningsbara enheten (bild 1A).
  3. Ställ in den magnetförflyttningsanordningen bredvid mikroskopsteget. Använd de tre vreden för att justera magnetens rumsliga placering tills den kan röra sig över petriskålen mellan 13 mm och 120 mm.
    OBS: Se till att den övre gränsen för avståndet mellan magneten och petriskålen är så stor som möjligt för att undvika oönskad kraftapplikation på de magnetiska mikropärlorna. 120 mm är det maximala värdet i denna experimentella installation. Se till att magneten inte stör mikroskopdelar, inklusive mål och motoriserade steg.
  4. Ställ magneten på högsta z-position (vid 120 mm).

5. Forcering och avbildning av levande celler

  1. Installation av miljökammaren för långtidsavbildning
    1. Applicera 75% etanollösning för att noggrant sterilisera och rengöra miljökammaren.
    2. Placera miljökammaren på det motoriserade steget i det inverterade mikroskopet.
    3. Öppna CO 2-tanken och ställ in CO2-inflödeshastigheten till 160 ml / min.
    4. Justera kammarens temperatur till 44 °C (överst), 42 °C (bad) och 40 °C (steg).
    5. Tillsätt 20 ml renat vatten i badet i miljökammaren för att bibehålla 90% fuktighet.
    6. Ta ut petriskålen med glasbotten som innehåller målceller från vävnadsodlingsinkubatorn och placera den i kammaren.
    7. Applicera metallklämman i miljökammaren för att fixera petriskålens läge.
      OBS: Petriskålen måste klämmas fast ordentligt i kammaren eftersom den magnetiska kraften kan flytta skålen om den inte är fastspänd.
    8. Stäng locket på kammaren.
  2. Optimering av bildparametrar
    1. Optimera pinhålsstorleken: Nålhålet blockerar fotonerna som inte är i fokus. En större hålstorlek ger fler fotoner som inte är i fokus men en ljusare bild. En mindre hålstorlek ger en mer fokuserad och mörkare bild. Se till att optimera pinhålsstorleken för att få konfokala bilder i fokus med rätt signal-brusförhållande.
    2. Optimera laserintensiteten: Laserintensiteten bestämmer intensiteten av excitation och därmed emissionsljus. Den låga laserintensiteten ger ett lågt signal-brusförhållande. För hög laserintensitet kommer att orsaka fotoblekning. Justera laserintensiteten därefter.
    3. Optimera stegstorleken och stegen: Steg och stegstorlek avgör hur många bilder som ska tas i en Z-stack. Mindre stegstorlekar och fler steg ökar Z-stack-upplösningen men kommer också att öka fotoblekningen. I detta experiment användes 1 μm stegstorlek för cellerna med ~ 15 μm cellhöjd.
    4. Optimera exponeringstiden: Exponeringstiden avgör hur länge cellen kommer att exponeras för excitationslasern. En låg exponeringstid minskar signal-brusförhållandet. En hög exponeringstid kommer att orsaka fotoblekning. En exponeringstid på 1 bildruta per 4 s användes i detta experiment.
    5. Optimering av avbildningsparametrar: Ändra en av de fyra parametrarna iterativt och håll de andra parametrarna konsekventa. Mät varje gång YAP N/C-förhållandet för varje bild och jämför förändringen av YAP N/C-förhållandet för att bestämma fotoblekningsnivån. Upprepa optimeringsprocessen tills du uppnår en balans mellan signal-brusförhållandet, bildhastigheten och fotoblekningen.
    6. Definiera avbildningskonfigurationerna med hjälp av de optimerade avbildningsparametrarna för snabbare avbildningsinställningar under experimenten.
      OBS: Konfigurationer som används i denna studie beskrivs i avsnitt 5.3 i bildparametrarna. För att optimera avbildningsparametrar för konfigurationer i avsnitt 5.3, använd samma metod som i steg 5.2.5.
  3. Liten kraftapplikation och konfokal avbildning
    OBS: Nikon Ti2-E-mikroskop användes för avbildning i denna studie, och detaljerade steg för bildförvärv ges nedan.
    1. Öppna det inverterade mikroskopet. Öppna programvaran Elements.
    2. Definiera konfiguration magnetic_find. Kontrollera endast FITC-kanalen. Ställ in PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensitet = 10. Ställ in skanningshastigheten till 1 bildruta per 2 s genom att klicka på 1/2-knappen . Ställ in pinhålstorleken på 1.2 AU genom att klicka på 1.2 A.U.-knappen. Den här konfigurationen kommer att användas i steg 5.3.5.
    3. Definiera konfiguration magnetic_YAP_Nucleus. Kontrollera FITC-kanalen. Ställ in PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensitet = 10. Ställ in skanningshastigheten till 1 bildruta per 4 s genom att klicka på 1/2-knappen . Ställ in pinhålstorleken på 1.2 AU genom att klicka på 1.2 A.U.-knappen. För att avbilda kärngränsen och kärnfläckintensiteten, kontrollera Cy5-kanalen. Ställ in PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensitet = 10. Pinhålsstorleken är optimerad för 3D YAP-avbildning. Klicka inte på 1.2 A.U.- knappen igen efter att ha kontrollerat Cy5-kanalen. Den här konfigurationen kommer att användas i steg 5.3.7.
    4. Slå på DIA via Elements om det behövs. Öppna SpinView, använd ett ljust fält och justera objektets fokus för att få en tydlig bild i fokus av celler. Använd ett 10x-mål för att hitta lämpliga flera enskilda celler under tre förhållanden: med en enda mikrob inuti, med flera mikrober inuti och utan någon mikrobeta inuti. Byt till 40x mål. Namnge denna position med lämpligt positionsnummer.
    5. Öppna element. Klicka på magnetic_find. Klicka på knappen Ta bort förregling .
    6. Klicka på Skanna och justera fokalplanets Z-position. Klicka på knapparna Överkant och Nederkant för att ställa in den nedre och övre gränsen för Z-stacken för de markerade cellerna. Sluta skanna genom att klicka på Skanna igen.
    7. Byt till magnetic_YAP_Nucleus konfiguration. Ange filnamnet som before_small_force.nd2. Klicka på run knappen med den inspelade Z-stacken.
    8. Byt till rätt ljusväg och slå på DIA. Öppna SpinView och klicka på inspelningsknappen . Under tiden snurrar du vredet på magnetrörelseanordningen för att flytta magneten ner till 46 mm över petriskålens botten. Spara ljusfältbildsekvens eller video. Kontrollera videon för att bekräfta att mikrober visar förskjutning inducerad av magnetisk kraft.
    9. Upprepa steg 5.3.5–5.3.7. Ange filnamnet till after_small_force.nd2.
    10. Byt till rätt ljusväg och slå på DIA. Öppna sedan SpinView och klicka på inspelningsknappen . Snurra under tiden vredet på magnetrörelseanordningen för att flytta magneten upp till 120 mm över petriskålens botten. Spara ljusfältbildsekvens eller video.
    11. Upprepa steg 5.3.5-5.3.7 och ställ in filnamnet på before_large_force.nd2.
  4. Stor kraftapplikation och konfokal avbildning
    1. Ta bort locket på miljökammaren så att magneten når 13 mm över petriskålens botten.
    2. Byt till rätt ljusväg och slå på DIA. Öppna SpinView och klicka på inspelningsknappen . Snurra under tiden vredet på magnetrörelseanordningen för att flytta magneten ner till 13 mm över petriskålens botten. Spara ljusfältbildsekvens eller video. Kontrollera videon för att bekräfta att mikrober visar förskjutning inducerad av magnetisk kraft.
    3. Upprepa steg 5.3.5-5.3.7 och ställ in filnamnet på after_large_force.nd2.
    4. Byt till rätt ljusväg och slå på DIA. Öppna sedan SpinView och klicka på inspelningsknappen . Snurra under tiden vredet på magnetrörelseanordningen för att flytta magneten upp till 120 mm över petriskålens botten. Spara ljusfältbildsekvens eller video.
    5. Upprepa steg 5.3.5–5.3.7. Ange filnamnet till retract_large_force.nd2.
    6. Stäng locket på miljökammaren.
  5. Upprepa steg 5.2 och 5.3 för flera synfält för att få mer data om det behövs.

6. Bildbehandling och dataanalys

  1. Kvantifiering av YAP N/C-förhållande
    1. Öppna Fiji ImageJ. Öppna .nd2-bilderna som togs i steg 5.
    2. Klicka på Analysera > ställa in mätningar. Kontrollera område, integrerad densitet, medelgrått värde och formbeskrivningar.
    3. Använd Cy5-kanalen för att identifiera kärnan. Klicka på Freehand Selections för att använda verktyget för fritt val för att beskriva kärnan. Kontrollera också det automatiska kärnmaskmakrot i ImageJ (se materialförteckningen).
    4. Klicka på Analysera > mått i FITC-kanalen. Det uppmätta värdet för medelvärdet är den genomsnittliga nukleära YAP-intensiteten DN.
    5. Använd Cy5-kanalen för att identifiera kärnan. Använd FITC-kanalen för att identifiera cellen. Klicka på Freehand Selections för att använda verktyget för fritt val för att välja ett område av intresse inom cytoplasman och undvika den magnetiska mikrobasen. Denna region av intresse får inte omfatta kärnan.
    6. Klicka på Analysera > mått i FITC-kanalen. Det uppmätta värdet för medelvärdet är den genomsnittliga cytoplasmatiska YAP-intensiteten DC.
    7. Beräkna YAP N / C-förhållandet = D N / DC.
  2. Kvantifiering av kärnform och normaliserad kärnfläckintensitet
    1. Öppna Fiji ImageJ. Öppna .nd2-bilderna som togs i steg 5.
    2. Klicka på Analysera > ställa in mätningar. Kontrollera område, integrerad densitet, medelgrått värde och formbeskrivningar.
    3. Använd Cy5-kanalen för att identifiera kärnan. Klicka på Freehand Selections för att använda verktyget för fritt val för att beskriva kärnan.
    4. Klicka på Analysera > mäta i Cy5-kanalen. Det uppmätta värdet på medelvärdet är kärnfläckintensiteten. Det uppmätta värdet på Circ. är nukleär cirkularitet.
    5. För att jämföra kärnfläckintensiteten vid olika krafttillstånd divideras all kärnfläckintensitet med kärnfläckintensiteten i "before_small_force.nd2" för att generera den normaliserade kärnfläckintensiteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Design av en magnetrörlig anordning och applicering av magnetisk kraft
För att applicera kraft på kärnan genom de magnetiska mikropärlorna designades och byggdes en magnetrörlig anordning för att styra magnetens rumsliga position. Den magnetförflyttningsanordningen innehåller en central ram, tre vred och skenor för att flytta den bifogade magneten i x-, y- och z-riktningar oberoende av varandra med en rumslig upplösning på 1,59 mm per cykel (figur 1A). När magneten har flyttats nära de 7 μm mikropärlor som levereras in i cellerna (figur 1B), lockar den magnetiskt mikroberna och applicerar kraft på kärnan (figur 1C). Kraftriktningen och storleken styrs av den relativa positionen mellan magneten och mikropärlorna.

I detta papper applicerades två olika kraftstorlekar på mikropärlorna: (1) en relativt liten kraft när magneten placerades 46 mm ovanför cellen; och (2) en relativt stor kraft när magneten placerades 13 mm ovanför cellen. Den magnetiska kraften som appliceras på mikrobon F kan beräknas med ekvationen59: Equation 1, där Nd är avmagnetiseringsfaktorn (0,33 för en sfär), μ är permeabiliteten i vakuum (6,3 × 10-3H / m för järn), Vp är mikrobens volym (178 μm3 för en 7 μm mikrobok), och H är magnetfältintensiteten med enheten A/m. H är proportionell mot magnetisk flödestäthet B med enhet Tesla. Eftersom den magnetiska kraften som verkar på en enda 7 μm mikroböld förväntades vara extremt liten och svår att detektera av en kraftgivare, mättes den magnetiska flödestätheten B som referens för att indikera storleken på den magnetiska kraften som applicerades på mikropärlorna. En Hall-sensor introducerades på platsen för petriskålens botten för att mäta den magnetiska flödestätheten, och magneten placerades på ett avstånd av 13 mm eller 46 mm från botten av petriskålen. Eftersom mikropärlorna på 7 μm påverkar magnetfältet mättes den magnetiska flödestätheten med och utan mikropärlor. Oavsett närvaron av 7 μm mikrobeads erhölls samma magnetiska flödestäthet: B = 60,1 mT på ett avstånd av 13 mm och B = 3,7 mT på ett avstånd av 46 mm. Denna mätning visar att effekten av 7 μm mikrober på magnetfältet som genereras av den cylindriska magneten med 12,7 mm diameter och 12,7 mm höjd (se materialtabellen) inte kunde detekteras av Hall-sensorn som användes i denna studie. Den magnetiska flödestätheten i fallet med ett avstånd på 13 mm var emellertid cirka 16 gånger högre än det med ett avstånd på 46 mm. Experimentell kalibrering av den magnetiska kraften beskrivs i följande avsnitt (figur 6).

Leverans av magnetiska mikrober i cytoplasman
12 h efter sådd av celler på petriskålen med glasbotten tillsätts 7 μm mikropärlor i odlingsmediet. Mikrober internaliseras spontant av cellerna. Eftersom mikropärlorna inte avger fluorescens under laserexcitation i FITC- eller Cy5-kanalen kan placeringen av de internaliserade mikropärlorna identifieras med placeringen av den mörka ihåliga med konfokal avbildning av fluorescens av YAP och kärna. Både 2D- och 3D-bilder visar att mikrobon finns i cytoplasman utanför kärnan (figur 2).

Internaliseringsnivåerna av mikrober i cellerna beror på varaktigheten av samodlingen av celler och mikrober. Således kategoriserades cellerna i tre typer beroende på mängden internaliserade mikropärlor - ingen mikrobok, enstaka mikrober och multimikrober (figur 3A). Vid 7 h samodling internaliserade 62% av cellerna ingen mikrobead, 15% av cellerna internaliserade en enda mikrob och 23% av cellerna internaliserade multimikrober (totalt antal celler = 13). Vid 12 timmars samodling internaliserade 53% av cellerna ingen mikropärla, 26% av cellerna internaliserade en enda mikrob och 21% av cellerna internaliserade multimikrober (totalt antal celler = 62). Vid 24 timmars samodling internaliserade 20% av cellerna ingen mikrobead, 28% av cellerna internaliserade en enda mikrob och 53% av cellerna internaliserade multimikrober (totalt antal celler = 40) (Figur 3B).

Mikrober i cytoplasma påverkar inte kärnform och YAP-aktivitet
För att undersöka effekten av internaliseringen av mikrober på kärnform och proteinaktivitet kvantifierades kärnformen först av cirkularitet respektive YAP-aktiviteten med YAP N / C-förhållande. Cirkularitet beräknas med cirkularitet = 4μ (område / omkrets2). De detaljerade stegen för att kvantifiera YAP N/C-förhållandet beskrevs i en tidigare publikation60. Kortfattat beräknades YAP N / C-förhållandet genom att dividera den genomsnittliga YAP-intensiteten i kärnan med den genomsnittliga YAP-intensiteten i cytoplasman. Med tanke på möjligheten att samodling av mikrober och celler kan påverka kärnformen även om ingen mikrob internaliseras, cellerna utan samkultur (svarta prickar, kontroll #1, cirkularitet = 0,806 ± 0,037, n = 20), celler som samodlas med mikrober men utan internalisering (grå prickar, kontroll #2, cirkularitet = 0,806 ± 0,035, n = 22), celler som internaliserar enstaka mikrober (röda prickar, enstaka mikrober, Cirkularitet = 0,793 ± 0,048, n = 15) och celler som internaliserar multimikrober (blå prickar, multimikrober, n = 7) (Figur 3C) jämfördes. Resultatet visar att bland alla fyra testade grupperna hade nukleär cirkularitet ingen signifikant skillnad (figur 3C).

Därefter, för att undersöka om YAP N / C-förhållandet påverkas av internaliseringen av mikrober, jämfördes cellerna samodlade med mikrober men utan internalisering (grå prickar, kontroll #2, YAP N / C-förhållande = 1,155 ± 0,074, n = 35) endast med cellerna med enkel- eller multimikrobisk internalisering (röda prickar, cell med mikrober, YAP N / C-förhållande = 1,140 ± 0,078, n = 36) vid den 12:e timmen av samkultur (figur 3D). Cellerna utan samodling jämfördes inte eftersom skålen med mikrober visar lägre celltäthet, vilket kan påverka YAP N / C-förhållandet12. Resultatet visar ingen signifikant skillnad (p-värde = 0,667) i YAP N/C-förhållandet mellan de två grupperna, vilket indikerar att internaliseringen av mikrober inte påverkar YAP-aktiviteten (figur 3D).

Magnetisk kraft deformerar kärnan
Först visas deformationen av kärnan. Deformationen av kärnan orsakas av kompressionskraften som appliceras av mikropärlorna (figur 4A och figur 4A1-3) i celler som innehåller cytoskelett. Dessa data (dvs. kärnan deformeras av mikrobasens kompression) stöder att mikrobon verkligen applicerar en kraft på kärnan i den trånga cytoplasman. En ljusfältsvideo som visar kraftappliceringsprocessen ingår i tilläggsmaterialet (Supplementary Video 1). För det andra, eftersom det är möjligt att mikrobon samtidigt applicerar kraft på den omgivande cytoskeletten och deformerar kärnan indirekt, upprepades kompressionsexperimenten i celler som har de störda aktinfilamenten (behandling av Cyto D (2,5 μM, 1 h); Figur 4B). Denna studie visar att aktinfilamenten verkligen depolymeriseras (figur 4B) och kärnan deformeras av mikropärlorna (figur 4B1-3). Dessa data stöder att mikropärlorna applicerar en kraft direkt på kärnan i frånvaro av sammanflätade omgivande cytoskelett. Sammantaget visar dessa data att protokollen och verktygen kan applicera en kraft direkt på kärnan.

Rumslig och tidsmässig kontroll av intracellulära magnetiska mikrober
För att uppnå rumslig kontroll av mikropärlorna användes ett par magneter för att flytta mikrobon och kontrollera dess placering av indragningen på kärnan (figur 5A). Pärlan kan endast flyttas med upp till 2,2 μm förskjutning (figur 5A1-4), men kan flexibelt applicera indragning på kärnan på motsvarande platser. Den omgivande aktincytoskeletten kan begränsa rörelsen av mikrober. Därför stördes aktincytoskelettet av Cyto D-behandling (2,5 μM, 1 h), och mikrobernas placering manipulerades men visade liknande resultat. Därför kan en hypotes föreslås: mikrobon kan fysiskt/kemiskt binda till kärnan och andra omgivande organeller i cytoplasman, vilket begränsar dess stora rumsliga rörelse (>2,2 μm).

För att uppnå rumslig kontroll av mikroberna användes ett par magneter som styr mikroberna för att applicera och släppa kraften två gånger (med olika kraftstorlek) på samma plats för kärnan (figur 5B och figur 5B1-B4). Den aktuella tidslängden för en cykel av kraftapplikation och frisättning är 12 s. Hastigheten för tidskontroll bestäms av XYZ-flyttarens driftshastighet.

Kalibrering av den magnetiska kraften
Den pärlapplicerade kraften på kärnan uppskattades genom att experimentellt mäta kraften som appliceras med en kalibrerad atomkraftsmikroskopi (AFM) som orsakar en liknande deformation av kärnan. Specifikt löstes aktincytoskelettet först av CytoD (2,5 μM; 1 h, figur 4B) eftersom AFM applicerar kraft på cellens apikala yta, och avlägsnandet av aktincortex och cytoskelett möjliggör mer direktkontakt mellan AFM-spets och cellkärna. Cellerna som har sin aktincortex och cytoskelett upplösta lever baserat på jämförelsen av kärnform och kärnfärgningsintensitet med dem i friska celler (kompletterande figur 1). För det andra användes den icke-funktionaliserade AFM-spetsen (halvsfärisk, radie = 5 μm) som har en liknande storlek och form som mikropärlornas för att dra in cellens apikala yta på ett kraftkontrollerat sätt och samtidigt förvärva 3D-konfokala bilder av cellen och kärnkropparna (Figur 6A). Storleken på tryckkraften från 0,8 nN till 2,0 nN valdes eftersom, baserat på litteraturen24, kraft vid en storlek av 1,5 nN var känd för att tillräckligt deformera kärnan. För det tredje mättes den normala deformationen av kärnan som orsakades av AFM-indragningen genom kvantitativ bildanalys. Dessutom erhölls kalibreringskurvan som ger det kvantitativa AFM-kraftförskjutningsförhållandet (figur 6B). För det fjärde applicerades en tryckkraft på kärnans laterala yta genom att kontrollera mikropärlor som har liknande storlek och form (radie = 7 μm; Figur 6C), och deformationen av kärnmembranet mättes via bildanalys. Den pärlor-applicerade kraften uppskattas baserat på AFM-kraftförskjutningsförhållandet.

Till exempel, i figur 6C, är deformationen av kärnan orsakad av magnetiska mikrober (diameter = ~ 7 μm) vid "stor kraft" cirka 1,5 μm. I figur 6D användes en AFM-spets som har en 5 μm semisfärisk sond för att dra in cellen ovanpå kärnan för att uppnå 1,5 μm kärndeformation. Motsvarande kraft som registrerats av AFM är 1,4 nN. Därför uppskattas kraften som appliceras av mikroberna till ~ 1,4 nN. Efter samma tillvägagångssätt kalibreras den magnetiska kraften vid "liten kraft" som 0,8 nN, och det orsakade 0,4 μm kärnindragning.

Denna studie anser att den AFM-uppmätta kraften kan representera den mikrobead-applicerade kraften baserat på följande antaganden: (1) Kärnans styvhet i olika celler är liknande. (2) Kärnans mekaniska egenskaper är inte beroende av de kärntekniska platser på vilka indragningen applicerades. Den magnetiska kraften appliceras horisontellt på kärnans laterala sidor, medan AFM-kraften appliceras vertikalt på kärnans apikala sidor. Den mekaniska skillnaden mellan dem antas vara försumbar. (3) I AFM-experiment applicerar sonden direkt kraft genom cellmembranet och cytoskeletten på kärnan. Efter att ha stört aktinfilamenten liknar den AFM-applicerade kraften på kärnan den mikrobeadsapplicerade kraften på kärnan, trots att membranet fortfarande ligger mellan AFM-sonden och kärnan i det tidigare fallet.

Magnetisk kraft utlöser förändring av YAP N / C-förhållandet
För att bevisa att den magnetiska kraften som appliceras på mikroberna kan deformera kärnan och inducera YAP-translokation, kvantifierades YAP N / C-förhållandet mellan cellerna med internalisering av mikropärlor i tre steg: (1) innan kraften applicerades, (2) efter applicering av kraften och (3) efter att kraften släppts. Vissa celler visade en förändring av kärnform och YAP N/C-förhållande när kraften applicerades eller frigjordes (figur 7A,C). Intensitetsförändringarna i YAP kan tillskrivas av två möjliga mekanismer: (1) YAP-FP-proteiner translokerar från cytoplasman till kärnan efter kraftapplikation. I detta fall bör kärnfärgning inte visa några signalförändringar. Kärnfärgningsintensiteten bör inte förändras i stor utsträckning; (2) YAP-FP-proteiner translokeras inte efter kraftapplicering. De observerade YAP-intensitetsförändringarna beror på den kraftinducerade kärnvolymförändringen och den resulterande YAP-FP-koncentrationsförändringen. I detta fall bör kärnfärgningsintensiteten förändras i en liknande trend som YAP-kärnintensiteten eftersom koncentrationen av färgningsfärg också förändras när kärnvolymen förändras. Därför mättes den nukleära färgningsintensitetsförändringen från den röda kanalen (excitation: 650 nm; utsläpp: 681 nm). Intensiteten förändras i YAP i den gröna kanalen, men det finns inga intensitetsförändringar i kärnfärgning i den röda kanalen. Således finns sannolikt den första mekanismen (figur 7B). Sammantaget visar resultaten att den magnetiska kraftinducerade kärndeformationen utlöser YAP-translokation.

Därefter kvantifierades nettoförändringen av YAP N / C-förhållandet inom två grupper av celler: (1) celler utan mikrobead internaliserade (grå prickar, kontroll, n = 9); och (2) utvalda celler med internaliserade mikropärlor som visar förändring av YAP N / C-förhållandet (gröna prickar för liten kraft, röda prickar för stor kraft, n = 11). Vid 0,8 nN-kraft visar celler med internaliserade mikropärlor netto YAP N / C-förhållandeförändring = -0,030 ± 0,029, n = 11; kontrollceller visar netto YAP N / C-förhållande förändring = -0,003 ± 0,012, n = 9. Vid 1,4 nN-kraft visar celler med internaliserade mikropärlor netto YAP N / C-förhållande förändring = 0,011 ± 0,040, n = 11; kontrollceller visar nettoförändring av YAP N / C-förhållande = 0,005 ± 0,005, n = 9 (figur 8A). Vid 0,8 nN-kraft visar celler med internaliserade mikropärlor absolut netto YAP N / C-förhållande förändring = 0,057 ± 0,017, n = 11; kontrollceller visar nettoförändring av YAP N / C-förhållande = 0,021 ± 0,007, n = 9. Skillnaden är signifikant (p-värde = 0,0093, **). Vid 1,4 nN-kraft visar celler med internaliserade mikropärlor absolut netto YAP N / C-förhållande förändring = 0,070 ± 0,020, n = 11; kontrollceller visar nettoförändring av YAP N / C-förhållande = 0,010 ± 0,003, n = 9. Skillnaden är signifikant (p-värde = 0,0007, ***) (figur 8B). Tillsammans bekräftar dessa resultat att den magnetiska kraften som appliceras på mikroberna i cytoplasman verkligen kan inducera YAP-translokation och ändra YAP N / C-förhållandet.

Figure 1
Figur 1: Design av den magnetiska rörliga enheten och schematisk kraftapplikation i cellen med magnetiska mikrober. (A) Tredimensionellt schema över enheten implementerad för att hålla magneten och flytta den i x-, y- och z-riktningar. Enheten består av en bas 241,3 mm i bredd och 104,1 mm i höjd, två vred, en stång och en magnet. Vreden kommer att splines i rätt driftsrotationsriktning, vilket ger rörelse i motsvarande riktning. Magneten kommer att sänkas närmare / höjas längre till skålen för att applicera magnetisk kraft med olika storlek och riktning på magnetiska mikrober. (B) Exempel på svepelektronmikroskop (SEM) bild av 7 μm järnmikroböl. (C) Magnetiska mikrober som levereras inuti cytoplasman kan applicera kraft på organellerna, såsom kärnan när ett magnetfält appliceras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder som visar magnetisk mikrob (svart ihålig spetsig med blå pil) internaliseras i cellen (indikeras av YAP) och utanför kärnan. (A) X-Y-tvärsnitt av en cell av YAP (grön), kärna (röd) och ljusfält. B) 3D-rekonstruktion av cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Mikrober som internaliseras av cellerna påverkar inte kärnformen och YAP N / C-förhållandet . (A) Representativa ljusfälts- och fluorescensbilder av celler utan mikrober, enstaka mikrober och internalisering med flera mikrober. Blå pilar indikerar positionen för mikrober inuti cytoplasman. (B) Vid 7 h (n = 13), 12 h (n = 62) och 24 h (n = 40) samodling, procentandelen av cellerna som inte visar någon mikrobok, enstaka mikrober och internalisering av flera mikrober. (C) Nukleär cirkularitet visar ingen signifikant skillnad mellan kontrollceller och celler med internalisering av mikrober. Kontroll #1 (utan mikrobisk samodling): Cirkularitet = 0,806 ± 0,037, n = 20; Kontroll #2 (med mikrobisk samkultur, utan mikrobisk internalisering): Cirkularitet = 0,806 ± 0,035, n = 22; Internalisering av enstaka mikrober: Cirkularitet = 0,793 ± 0,048, n = 15; internalisering av flera mikrober: Cirkularitet = 0,780 ± 0,061, n = 7. (D) YAP N / C-förhållandet visar ingen signifikant skillnad (p-värde = 0,667) mellan kontrollceller (med mikrobisk samodling, utan mikrobannonsinternalisering, YAP N / C-förhållande = 1,155 ± 0,074, n = 35) och celler med mikrobannonsinternalisering (YAP N / C-förhållande = 1,140 ± 0,078, n = 36). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Direkt kraftapplicering på kärnan med och utan aktinfilament. (A) Celler visar aktinfilament (gul). (A1) Bild av kärnan när ingen kraft appliceras. (A2) Bild av kärnan efter att kraften applicerats. (A3) Överlappande bild av kärnkraftsgränsen före och efter kraftapplikationen visar nukleär indragning. (B) Celler visar störda aktinfilament (gula) efter Cyto D-behandling (2,5 μM, 1 h). (B1) Bild av kärnan när ingen kraft appliceras. (B2) Bild av kärnan efter att kraften applicerats. (B3) Överlappningsbild av kärngränsen före och efter kraftapplikationen visar nukleär indragning med den störda aktincytoskeletten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Rumslig och tidsmässig kontroll av intracellulär magnetisk mikropärla . (A) Ett par magneter styr rumsligt den magnetiska mikrobasen. (A1) Ljusfältsbild av cellgräns (grön linje), kärngräns (röd linje) och magnetisk mikropärla (gul linje) vid position 1. (A2) Magnetiska mikrobölder drar in kärnan vid position 1. (A3) Magnetisk mikrob flyttas till position 2 (gul linje). Position 1 visas som referens (gul streckad linje). (A4) Magnetisk mikropärla indrag kärna vid position 2. (B) Ett par magneter styr tidsmässigt magnetisk mikroböld. (B1) Ljusfältsbild av en cell utan kraft applicerad vid tidpunkt I. (B2) Magnetisk mikrob applicerar en kraft på kärnan vid tidpunkt II. (B3) Magnetisk mikrob frigör kraften från kärnan vid tidpunkt III. (B4) Magnetisk mikrob applicerar en större kraft på kärnan vid tidpunkt IV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Kalibrering av mikropärlapplicerad kraft på kärnan med AFM-indragning. (A) Schematisk illustration av kalibreringsprocessen. Magnetisk mikrob applicerar horisontell kompression på kärnan (vänster) och AFM-sonden drar in vertikalt på kärnan. (B) AFM-indragningskraft kontra nukleär deformation. (C) Representativ bild av kärndeformation (1,5 μm) före och efter kraftapplicering med magnetisk mikroböl. (D) Representativ bild av liknande kärndeformation (1,5 μm) före och efter AFM-indragning med 1,4 nN-kraft. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Representativa data som visar förändring av YAP N/C-förhållandet induceras av magnetisk kraftapplicering och frisättning . (A) X-Y-tvärsnitt av YAP (grön) och kärna (röd) fluorescerande bild av cellen utan kraft, kraft på och kraft av. I force-on-tillståndet minskar cytoplasmatisk YAP-intensitet på den plats som pekas av en gul pil medan nukleär YAP-intensitet ökar. YAP N / C-förhållandet ökar. (B) YAP N/C-förhållandet ökar när kraften slås på (från 1,0791 till 1,2327) och minskar när den tvingas av (från 1,2327 till 1,1548). Normaliserad kärnfläckintensitet visar mindre förändring med kraftapplikation (1,00117) och frisättning (0,95578). (C) X-Z-tvärsnitt av YAP (grön) och kärna (röd) bild av cellen utan kraft, kraft på och kraft av. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: YAP N / C-förhållandeförändring inducerad av magnetisk kraftapplikation. (A) Vid 0,8 nN-kraft visar celler med internaliserade mikropärlor nettoförändring av YAP N / C-förhållande = -0,030 ± 0,029, n = 11; kontrollceller visar netto YAP N / C-förhållande förändring = -0,003 ± 0,012, n = 9. Vid 1,4 nN-kraft visar celler med internaliserade mikropärlor netto YAP N / C-förhållande förändring = 0,011 ± 0,040, n = 11; kontrollceller visar nettoförändring av YAP N / C-förhållande = 0,005 ± 0,005, n = 9. (B) Vid 0,8 nN-kraft visar celler med internaliserade mikrober (er) absolut netto YAP N / C-förhållande förändring = 0,057 ± 0,017, n = 11; kontrollceller visar nettoförändring av YAP N / C-förhållande = 0,021 ± 0,007, n = 9. Skillnaden är signifikant (p-värde = 0,0093, **). Vid 1,4 nN-kraft visar celler med internaliserade mikropärlor absolut netto YAP N / C-förhållande förändring = 0,070 ± 0,020, n = 11; kontrollceller visar nettoförändring av YAP N / C-förhållande = 0,010 ± 0,003, n = 9. Skillnaden är signifikant (p-värde = 0,0007, ***) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Kärnform och kärnfärgningsintensitet. (A) Utan Cyto D-behandling, (B) med Cyto D-behandling och (C) Döda celler. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 1: En ljusfältsvideo som visar kraftapplikationsprocessen. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Internalisering av magnetiska mikrober (avsnitt 2.2) är avgörande eftersom extracellulära mikrober inte kan applicera kraft direkt på kärnan. Krafttillämpning och avbildning (avsnitt 5.3) är kritiska steg i detta experiment, och den kraft som behövs för att deformera kärnan och inducera meningsfulla biologiska konsekvenser kan vara provberoende. Kraftstorleken i detta experiment (0,8 nN och 1,4 nN) kan ökas ytterligare för att utlösa kärnmekanoavkänning i mindre känsliga celler.

För att applicera magnetisk kraft på ett kvantitativt sätt med hög genomströmning är internaliseringen av en enda mikrob ett idealiskt tillvägagångssätt. I denna studie var andelen celler med internalisering med en mikrob liknande vid 12 h (26%) och 24 h (28%), medan cellerna utan mikrobisk internalisering var högre vid 12 h (53%) än vid 24 h (20%) (Figur 3B). Det anses att 12 h är den optimala tiden för kraftapplikationsexperiment eftersom fler enskilda mikrober kan inkluderas och celler kan kontrolleras. För olika cellinjer och mikrobstorlekar bör samodlingstid och mikrobkoncentration testas för att bestämma motsvarande optimala förhållanden.

I experimenten var mikroberna inte belagda för att specifikt binda till kärnan. Därför är kraften som överförs direkt från mikroberna till kärnan sannolikt endast komprimerande. Resultaten visar att YAP N/C-förhållandet ökar och minskar cellpopulationen (figur 8A). En möjlig orsak är att den magnetiska kraften som appliceras via mikroberna kan orsaka positiv eller negativ spänningsförändring i cytoskeletten och reglera YAP N / C-förhållandet för att öka respektiveminska 28. Tidigare forskning visar att tryckkraften på kärnan inducerar en ökning av YAP N/C-förhållandet28. I framtida experiment, för att studera kärnans direkta kraftavkänning, kan cytoskeletten störas för att eliminera kraftöverföringen från cytoskeletten till kärnan.

Det finns två potentiella nackdelar med de nuvarande metoderna. Först i dessa experiment användes 3D-flyttaren (figur 1A) för att justera pärlornas rörelse, som övervakas av konfokal avbildning i realtid och syftar till att applicera en tryckkraft på kärnan. På grund av kärnmembranets hala natur och den komplexa miljön i cytoplasman kan emellertid riktningen för den pärlor-applicerade kraften inte vara rent komprimerande (dvs inte absolut vinkelrätt mot kärnmembranytan). Denna ofullkomlighet kan orsaka att en skjuvkraft appliceras på kärnmembranet. För det andra är de nuvarande mikroberna som används i denna studie inte konjugerade med antikroppen för att binda med kärnan, eftersom pärlornas rumsliga rörlighet är avgörande i det aktuella experimentet för att visa fördelen med beröringsfritt magnetiskt ställdon. Därför kan den nuvarande metoden inte applicera spänning på kärnmembranet.

I framtiden kommer (1) pärlor med anti-nesprin-1-antikropp att konjugeras för att specifikt binda med kärnan. Detta kan garantera direkt och specifik kraftöverföring mellan mikrober och målproteinerna. (2) Kraftriktningen kommer att kalibreras genom att manipulera den enda magnetiska mikrobon i mjuk hydrogel inbäddad med fluorescerande pärlor. 3D-förskjutningen av fluorescerande pärlor kan användas för att beräkna hydrogelens deformationsfält och bestämma kraftriktningen som en funktion av det applicerade magnetfältet. Efter att mikrobölden är kemiskt bunden med kärnan bestämmer en kraft med en känd riktning krafttypen (spänning, kompression eller skjuvning). (3) 3D-avbildning av kärnfärgning kommer att användas för att bygga en 3D-simulering FEM-modell av kärnan. Kraftriktningen kan verifieras genom att jämföra kärndeformationen före och efter den magnetiska kraftapplikationen.

Den unika tekniken som utvecklats i denna studie ger flera potentiella fördelar: (1) Jämfört med vertikal indragning av AFM-sonder kan magnetiska mikrober applicera kraft i vilken riktning som helst. Celler som odlas på 2D-substratytor kan ha heterogen proteinfördelning och orientering på sina vertikala och horisontella ytor av plasmamembranet och kärnhöljet. Att applicera kraft horisontellt kan inducera tidigare oobserverade mekanavkänningssvar. (2) När mikroberna är funktionellt belagda för att binda till kärnorna kan både tryck- och dragkrafter appliceras direkt på kärnan för att ytterligare studera differentialkärnmekanoavkänningen på grund av de distinkta kraftriktningarna. (3) Genom att kontrollera den specifika bindningen av mikrober till vissa kärnhöljeproteiner kan tidigare underundersökta mekanismer för nukleär kraftavkänning belysas. Nya bevis visar att kärnan sannolikt är en mekanosensor36, och kärnmekanoavkänning är den mest direkta regulatorn för YAP-translokation28. Mekanismen för kärnreglerad YAP-translokation studeras aktivt och flera kandidater för mekanosensor eller parametrar i kärnan föreslås, inklusive kärnporstorlek28, kärnform 25,61, LINC-komplex och kärnhöljespänning20. Att manipulera de magnetiska mikroberna öppnar möjligheten för detaljerad utforskning av sådana mekanismer genom direkt kraftapplikation på LINC-komplexet och kontrollerade regler för kärnhöljets spänning och form. (4) Förutom att applicera krafter på kärnan är mikrober också lämpliga att konstrueras för att binda till insidan av plasmamembranet för att avslöja hur membranproteinernas intracellulära domäner och deras komplex svarar på biofysiska signaler.

Sammanfattningsvis visade detta papper en metod som (1) levererar järnmikropärlor i mikrostorlek till cytoplasma utan att påverka kärnmorfologi och proteinfunktioner, (2) applicerar kraft på kärnan genom magnetiska mikrober och (3) utför konfokal fluorescens levande cellavbildning under kraftapplikationen. Dessa icke-invasiva verktyg öppnar möjligheterna för direkt epigenetisk manipulation av organeller i enskilda celler, superupplösningsavbildningsbaserad förhör av kärnmekanotransduktion och detaljerad utforskning av kraftreglerad 3D-kromosomorganisation (i kombination med Hi-C: högupplöst kromosombekräftelsefångst) och omprogrammering i samband med cellfysiologi och patobiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Detta projekt finansieras av UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. och Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) och UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Vi uppskattar uppriktigt de intellektuella diskussionerna med och den tekniska supporten från Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurokirurgi), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), och supportteam av Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kodon och Jon Ekman). Vi är djupt tacksamma för det effektiva stödet från alla medlemmar i Tangs, Yamaguchis, Sharmas, Au: s, Siemanns och Guans forskningslaboratorier och alla anställda på UF MAE-avdelningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

Biologi utgåva 185 Kärnmekanobiologi magnetisk kraft CRISPR/Cas9 mekanotransduktion mjuk aktiv materia ja-associerat protein (YAP) fluorescerande funktionell avbildning digital bildbehandling optogenetik epigenetik
Kombinera 3D-magnetiskt kraftställdon och multifunktionell fluorescensavbildning för att studera kärnmekanobiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter