Summary
A técnica peel-blot é um método de preparação de grade crio-EM que permite a separação de amostras biológicas multicamadas e concentradas em camadas únicas para reduzir a espessura, aumentar a concentração da amostra e facilitar o processamento da imagem.
Abstract
A técnica de preparação de grade crio-EM peel-blot é um método de retroinjeção significativamente modificado com o objetivo de alcançar uma redução nas camadas de amostras de várias camadas. Essa remoção de camadas antes do congelamento por imersão pode ajudar a reduzir a espessura da amostra para um nível adequado para a coleta de dados crio-EM, melhorando a planicidade da amostra e facilitando o processamento da imagem. A técnica peel-blot permite a separação de membranas multilamelares em camadas únicas, de cristais 2D em camadas em cristais individuais e de estruturas empilhadas em forma de folha de proteínas solúveis para também serem separadas em camadas únicas. A alta espessura da amostra desses tipos de amostras frequentemente apresenta problemas insuperáveis para a coleta de dados crio-EM e processamento de imagem crio-EM, especialmente quando o estágio do microscópio deve ser inclinado para a coleta de dados. Além disso, grades de altas concentrações de qualquer uma dessas amostras podem ser preparadas para uma coleta de dados eficiente, uma vez que a concentração da amostra antes da preparação da grade pode ser aumentada e a técnica peel-blot ajustada para resultar em uma distribuição densa de amostra de camada única.
Introduction
A técnica peel-blot foi desenvolvida com o objetivo de separar cristais bidimensionais empilhados de proteínas de membrana em camadas únicas para obter amostras adequadamente finas para coleta de dados crio-EM 2D e 3D e facilitar o processamento de imagens1. O protocolo é igualmente adequado para outros tipos de amostras multilamelares, bem como para alcançar altas concentrações de amostra de qualquer tipo de amostra na grade sem aumentar a espessura em Z.
A redução das camadas de amostra para uma camada é alcançada pela aplicação de uma combinação de pressão capilar e forças de cisalhamento em um protocolo que se estende substancialmente e modifica o método de retroinjeção2. Uma primeira etapa de blotting resulta em sanduíche apertado e aderência ao filme de carbono e uma barra de grade em ambos os lados da amostra de várias camadas durante a mancha em submícron, em vez do tamanho do poro de papel de filtro de 20-25μm no método de retroinjeção. A separação, ou descamação, de uma camada individual ocorre ao forçar a separação das camadas ensanduichadas uma vez que a grade é pressionada verticalmente em uma gota de trealose, forçando o filme de carbono para longe da barra de grade (Figura 1). O reposicionamento do filme de carbono para longe do ponto de contato original com a barra de grade ocorre na próxima etapa, quando a grade é novamente manchada em papel de filtro submícron. O número de iterações dessas etapas pode ser otimizado para amostras específicas. Além disso, o protocolo pode ser usado para aumentar as concentrações da amostra, evitando a agregação em Z. Devido à dependência da aderência à barra de grade e ao filme de carbono, bem como à separação forçada, essa abordagem pode não ser adequada para moléculas altamente frágeis, como certas proteínas delicadas e / ou instáveis e complexos proteicos.
A técnica peel-blot não requer equipamentos especializados nem suprimentos caros. A aplicabilidade a amostras específicas exigirá, no entanto, considerações cuidadosas sobre os parâmetros biológicos. A decisão é mais fácil para os cristais 2D, pois o filme de carbono é necessário para garantir a planicidade, mas a manipulação através da técnica peel-blot pode afetar a integridade biológica da amostra ou a ordem cristalina. A adequação da técnica peel-blot a partículas individuais é restrita e pode ser testada para aquelas que requerem filme de carbono e são estáveis à manipulação. Espécimes com interações biológicas críticas entre camadas podem não ser adequados para caracterização com a ajuda da técnica peel-blot devido à interrupção de tais interações.
A técnica peel-blot ("peel-blot") é mais rapidamente otimizada por testes e triagem com coloração negativa ou amostras não coradas por MET à temperatura ambiente. Uma vez que o número ideal de iterações de peel-blot tenha sido identificado, o tempo para controlar a espessura antes da vitrificação pode ser determinado.
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Protocol
1. Etapas de preparação para a técnica peel-blot
NOTA: A preparação requer que os seguintes itens sejam colocados adjacentes uns aos outros.
- Empilhe dois pedaços de papel de filtro de 20-25 μm de tamanho de poro (consulte Tabela de Materiais).
- Coloque uma película de parafina de ~8 cm x 10 cm de comprimento adjacente ao papel de filtro com o papel voltado para cima.
- Coloque um pedaço de papel de filtro submícron em cima de dois pedaços adicionais de papel de filtro #4 (Figura 1-1).
- Posicione a pinça anticapilar com a perna dobrada virada para cima e a perna reta voltada para baixo. Em seguida, selecione uma grade de 600 malhas com o lado liso/brilhante para cima. Coloque a pinça em uma placa de Petri ou outra superfície elevada para evitar o contato da grade limpa com outros itens.
- Retire o papel da película de parafina e puxe os lados (~ 5 mm) para criar uma pequena borda. Pipete duas gotas de 150 μL de solução de trealose a 4% ~1-2 cm de um lado curto do filme de parafina e ~1 cm de distância no filme de parafina.
- Em um banco separado ou no chão, despeje nitrogênio líquido em um pequeno recipiente de espuma de poliestireno (consulte Tabela de materiais).
CUIDADO: Receba treinamento para o manuseio adequado usando luvas e um escudo facial, a fim de evitar a picada de gelo. - Coloque um pequeno recipiente de grade crio-EM no nitrogênio líquido e cubra o recipiente de espuma de poliestireno com lenços sem fiapos.
2. Colocando o filme de carbono na grade
- Use a pinça Dumont #5 (ver Tabela de Materiais) para flutuar do filme de carbono da mica tocando um lado da mica em um leve ângulo para baixo (~20°-40°) em uma das gotas de solução de trealose e lentamente deixe a tensão da água levantar o filme de carbono movendo a mica para baixo. Solte a mica uma vez que o filme de carbono flutua na superfície da gota.
- Inspecione visualmente o filme de carbono para evitar o uso de carbono com danos na forma de fraturas.
- Insira a grade mantida pela pinça anticapilar em um ângulo (~20°-30°) em uma gota de trealose em uma posição adjacente e, em seguida, centralizada sob o filme de carbono. Pegue o filme de carbono (Figura 1-2).
- Mantenha a grade na mesma orientação e abaixe lentamente na superfície da segunda gota de trealose sem quebrar a tensão superficial da gota para remover o filme de carbono desnecessário que pode ter envolvido a borda da grade para o lado áspero.
3. Separação de cristais 2D de várias camadas em camadas únicas
- Gire a pinça anticapilar (ver Tabela de Materiais) e coloque-a em uma placa de Petri com o lado de carbono da grade voltado para baixo (Figura 1-3).
- Pipetar 1,3 μL da amostra para o menisco ligeiro de trealose no topo da grelha. Pipete a solução ~8-10 vezes para misturar e distribuir a trealose e a amostra em ambos os lados da grade.
- Durante a incubação da solução por 1 min, pipete uma ou mais gotas de 1,7 μL de solução de trealose no filme de parafina.
- Gire a grade de volta à sua posição original com o filme de carbono voltado para cima.
- Use a pinça anticapilar para pressionar a grade no papel de filtro submícron (Figura 1-4). Uma vez que a solução tenha sido absorvida pelo papel de filtro e o filme de carbono esteja deitado, aguarde 3s antes de levantar a grade e movê-la verticalmente para a gota de 1,7 μL de solução de trealose (Figura 1-5).
Observação : repita esta etapa várias vezes para amostras altamente empilhadas ou a grade é preparada para vitrificação nas próximas etapas. - Limpe a grade nos dois pedaços de papel de filtro e, em seguida, levante a grade do papel de filtro (Figura 1-6). Após aproximadamente 13 s, dependendo da umidade e do tampão de amostra, mergulhe a grade no nitrogênio líquido no pequeno recipiente de isopor e coloque a grade no recipiente de grade cryo-EM ou transfira-a diretamente para triagem crio-EM ou coleta de dados.
NOTA: Para otimizar rapidamente o protocolo, manche negativamente a grade manchada por casca nesta etapa, em vez de mergulhá-la em nitrogênio líquido. Contamine negativamente a amostra aplicando 3 μL de acetato de uranila a 1% na grade, incube a grade por 30 s e a limpe com um pedaço rasgado de papel de filtro de tamanho de poro de 20-25 μm. Grades de cristais 2D vitrificados em trealose, tanino ou glicose são rotineiramente mergulhadas à mão para vitrificação, pois trealose, tanino e glicose impedem a formação de gelo cristalino a taxas usadas para mergulho manual2.
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Representative Results
Um experimento bem-sucedido de peel-blot resultará em camadas únicas de amostras em concentrações muitas vezes altas. É de se esperar que algumas regiões na maioria dos quadrados de grade ainda contenham várias camadas, especialmente em menor número de iterações dos passos de peel-blot. A maioria dos quadrados de grade, no entanto, conterá extensas regiões de camadas únicas, como observado para cristais 2D de leucotrieno humano C4 sintase (Figura 2) e lipossomas (adicionados na etapa 3.2, Figura 3). Etapas adicionais de peel-blot podem precisar ser testadas para amostras que não mostram a redução desejada nas camadas.
A indicação mais importante de um experimento bem-sucedido de peel-blot será a qualidade dos dados e a integridade biológica observadas após a coleta de dados crio-EM de alta resolução e o processamento de imagens. A interpretação dos dados precisará incluir uma consideração cuidadosa de possíveis danos ou distorções nas regiões de contato entre camadas.
As regiões da grade EM em que ocorreu o peeling blotting normalmente exibem uma concentração maior de amostra do que as regiões em que não ocorreu. Esse efeito de concentração aparente é causado pela aderência da amostra multilamelar às superfícies do filme de carbono e da barra de grade, seguida pela aderência adicional a ambas as superfícies durante a preparação do peel-blot, à medida que elas se separam repetidamente, reposicionam ligeiramente e novamente fazem contato. O resultado é que as diferentes camadas da amostra multilamelar original estão espalhadas por uma área lateral maior (Figura 3 e Figura 4). Essas regiões podem até conter cristais ou membranas 2D maiores. Ambos os fenômenos são facilmente observados e comparados em áreas onde uma "zona de descascamento" é adjacente a uma área não afetada pela etapa peel-blot (Figura 3). As imagens das Figuras 2-4 foram coletadas em condições de baixa dose a uma tensão de aceleração de 120 kV com microscópio eletrônico de transmissão (ver Tabela de Materiais).
Figura 1: Representação esquemática da técnica peel-blot. As duas primeiras etapas (1-2 e 1-3) e a última etapa (1-6) da técnica peel-blot são baseadas no método de back-injection 2 e as etapas intermediárias seguem o protocolo peel-blot (modificado de Johnson et al.1). Na etapa 1, (A) dois pedaços de papel de filtro de tamanho de poro de 20-25 μm são empilhados, (B) adjacentes a um pedaço de filme de parafina com duas gotas de solução de trealose e (C) um pedaço de papel de filtro submícron em dois pedaços adicionais de papel de filtro. Na etapa 2, (A) o filme de carbono é flutuado na primeira gota de trealose e (B) retirado com pinça anticapilar, após o que é tocado na superfície da segunda gota (não mostrado) sem quebrar a tensão superficial para remover o excesso de filme de carbono da periferia. Na etapa 3, (A) a pinça que segura a grade é girada em 180° (o lado do filme de carbono da grade está agora voltado para baixo) e (B) a amostra é pipetada para o menisco da trealose. Na etapa 4, a grade foi girada de volta à orientação original com o filme de carbono voltado para cima e a amostra é lentamente abaixada no papel de filtro submícron. A grade é levantada e, na etapa 5, abaixada verticalmente em uma gota de 1,7 μL de solução de trealose. As etapas 4 e 5 são chamadas de "peel-blotting" e podem ser iteradas três ou mais vezes, dependendo da quantidade de empilhamento. O número de iterações pode precisar ser otimizado para amostras diferentes. Na etapa 6, (A) a amostra é manchada em duas camadas de papel de filtro de 20-25 μm de tamanho de poro, antes de (B) ser mergulhada manualmente em nitrogênio líquido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma amostra de cristal 2 D submetida ao método peel-blot. A região à esquerda da seta foi amplamente reduzida a cristais 2D de camada única em uma região de contato entre o filme de carbono e a barra de grade que foi manchada e depois deslocada, enquanto a região à direita da seta não estava em uma região afetada pela mancha de casca. As regiões manchadas de casca podem ser facilmente selecionadas e são observadas na maior parte da grade. Os cristais 2D mostrados são cristais 2D empilhados e de camada única do leucotrieno humano C4 sintase. A barra de escala corresponde a 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Lipossomas submetidos à peel-blot. O peel-blot pode ser aplicado com sucesso para interromper as bordas de lipossomas e vesículas colapsadas para resultar em regiões com grandes bicamadas de fosfolipídios de camada única, como observado na metade inferior da imagem. A metade superior não estava em uma zona de contato entre a barra de grade e o filme de carbono e, portanto, contém lipossomas completos com duas bicamadas fosfolipídicas. A barra de escala corresponde a 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A pegada da mancha de casca. O quadrado da grade de uma grade de 400 malhas mostra a pegada (rotulada como "B") da barra de grade e as regiões descascadas resultantes, bem como as regiões (rotuladas como "C") que não estavam em contato com uma barra de grade ou submetidas a menos iterações de mancha de casca. A barra de escala corresponde a 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Esvaziamento de uma grade EM preparada por retroinjeção em um papel de filtro submícron, usando filme de carbono muito fino. As imagens são quadros únicos de um vídeo (ver Vídeo 1) tirado em (A) contato inicial com a membrana, (B) 1000 ms após o contato e (C) 2000 ms após o contato. A seta indica quadrados de grade em que a pressão capilar rompeu o filme de carbono. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: A grade é colocada no papel de filtro submícron para a etapa de peel-blot. O filme de carbono é lenta e firmemente aspirado à grade na direção do canto inferior esquerdo para o superior direito, que sanduíche firmemente a amostra entre a barra de grade e o filme de carbono. O filme de carbono e, portanto, as camadas de amostra individuais são deslocados em cada etapa subsequente do peel-blot, permitindo a otimização com iterações adicionais para amostras mais altamente estratificadas. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O peel-blot é um método poderoso para superar o empilhamento e a espessura de cristais 2D de várias camadas e amostras semelhantes para coleta de dados crio-EM e processamento de imagens. Uma decisão sobre o uso do peel-blot será baseada em parâmetros biológicos da amostra e também exigirá avaliação assim que um modelo crio-EM 3D estiver disponível. A importância biológica dos contactos e a potencial flexibilidade das regiões de contacto serão particularmente importantes nesta avaliação.
O número de manchas de casca será inicialmente estabelecido através da observação após a preparação padrão da grade de coloração negativa, onde camadas ou espessuras excessivas exigirão estratégias alternativas à preparação padrão da grade crio-EM. Cristais finos de várias camadas empilhados em registro podem ser usados diretamente para microED3 ou moídos por FIB no caso de cristais mais espessos4. A mancha de casca geralmente não será necessária para cristais 2D de camada dupla, pois as camadas podem ser processadas individualmente ou em conjunto, quando as camadas estão no registro5. Pode ser potencialmente benéfico para expor ambos os lados dos cristais de proteína de membrana 2D a ligantes ou inibidores, uma vez em solução antes de peel-blotting, e uma vez após a etapa final de peel-blotting. Além disso, a redução de cristais 2D de camada dupla grandes e bem ordenados pode permitir a difração de elétrons 6,7. Multicamadas, induzidas ou biologicamente, de cristais 2D de membrana e proteínas solúveis serão os alvos mais prováveis para o peel-blot, embora o protocolo possa ser aplicado a uma variedade de espécimes e sirva para concentrar várias amostras para crio-EM (Figura 4).
O teste inicial com mancha negativa reduzirá drasticamente o tempo e o custo para otimizar as amostras, pois o congelamento, a preparação de suportes de amostras crio-EM, a transferência para um crio-EM e o uso de um crio-EM não são necessários. Somente o tempo de secagem antes da etapa de congelamento precisará ser otimizado separadamente. O tempo de secagem será idêntico ou muito semelhante ao tempo utilizado para secar uma grelha de retro-injecção padrão da mesma amostra1.
Embora as grades de 600 malhas geralmente resultem em uma boa preservação do filme de carbono, o aumento do número de iterações peel-blot e camadas mais finas de filme de carbono pode levar ao aumento da quebra do filme de carbono (Figura 5). Cristais 2D empilhados, lipossomas e amostras em camadas de grandes matrizes de proteínas solúveis podem ser separados com sucesso (Figuras 2-4).
A amostra é cuidadosamente avaliada por crio-EM para garantir que os efeitos adversos na qualidade da amostra sejam evitados. Isso pode ser conseguido pelo processamento de imagens para comparar imagens de cristais empilhados e não empilhados. Tanto para fins de avaliação quanto para atingir o objetivo de um modelo 3D, o processamento de imagens é conduzido por meio dos programas 2dx disponíveis no Focus8,9, que também implementa abordagens de partículas únicas para abordar imperfeições de rede e heterogeneidade de proteínas, com a possibilidade de aumentar drasticamente a qualidade inerente dos cristais 2D originais10.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Parte deste trabalho foi apoiado pela subvenção do NIH HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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