Summary
De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.
Abstract
De peel-blot cryo-EM grid preparation techniek is een significant gewijzigde back-injection methode met als doel het bereiken van een vermindering van lagen van meerlagige monsters. Deze verwijdering van lagen voorafgaand aan het bevriezen van de duik kan helpen bij het verminderen van de dikte van het monster tot een niveau dat geschikt is voor cryo-EM-gegevensverzameling, het verbeteren van de vlakheid van het monster en het vergemakkelijken van beeldverwerking. De peel-blot-techniek maakt het mogelijk om multilamellaire membranen in enkele lagen te scheiden, van gelaagde 2D-kristallen in individuele kristallen en van gestapelde, plaatachtige structuren van oplosbare eiwitten die eveneens in enkele lagen moeten worden gescheiden. De hoge monsterdikte van dit soort monsters levert vaak onoverkomelijke problemen op voor cryo-EM-gegevensverzameling en cryo-EM-beeldverwerking, vooral wanneer de microscoopfase moet worden gekanteld voor gegevensverzameling. Bovendien kunnen rasters van hoge concentraties van elk van deze monsters worden voorbereid voor efficiënte gegevensverzameling, omdat de monsterconcentratie voorafgaand aan de rastervoorbereiding kan worden verhoogd en de peel-blot-techniek kan worden aangepast om te resulteren in een dichte verdeling van eenlaags monster.
Introduction
De peel-blot-techniek is ontwikkeld om gestapelde tweedimensionale kristallen van membraaneiwitten in enkele lagen te scheiden om voldoende dunne monsters te verkrijgen voor cryo-EM 2D- en 3D-gegevensverzameling en beeldverwerkingte vergemakkelijken 1. Het protocol is ook geschikt voor andere soorten multilamellaire monsters en voor het bereiken van hoge monsterconcentraties van beide monstertypen op het rooster zonder de dikte in Z te vergroten.
Reductie van monsterlagen tot één laag wordt bereikt door een combinatie van capillaire druk en schuifkrachten toe te passen in een protocol dat de teruginjectiemethode aanzienlijk verlengt en wijzigt2. Een eerste blotting-stap resulteert in strakke sandwiching en hechting aan de koolstoffilm en een rasterbalk aan weerszijden van het meerlagige monster tijdens het blotting op submicron in plaats van de 20-25μm filterpapierporiëngrootte in de back-injectiemethode. De scheiding, of peeling, van een individuele laag vindt plaats bij het forceren van de scheiding van de ingeklemde lagen zodra het raster verticaal op een trehalosedruppel wordt gedrukt, waardoor de koolstoffilm weg wordt gedwongen van de rasterbalk (figuur 1). Het verplaatsen van de koolstoffilm weg van het oorspronkelijke contactpunt met de rasterbalk vindt plaats in de volgende stap, wanneer het raster opnieuw wordt uitgeveegd op submicronfilterpapier. Het aantal iteraties van deze stappen kan worden geoptimaliseerd voor specifieke voorbeelden. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om de monsterconcentraties te verhogen en tegelijkertijd aggregatie in Z te vermijden. Vanwege de afhankelijkheid van de naleving van de rasterbalk en koolstoffilm en krachtige scheiding, is deze aanpak mogelijk niet geschikt voor zeer fragiele moleculen zoals bepaalde delicate en / of onstabiele eiwitten en eiwitcomplexen.
De peel-blot techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur of dure benodigdheden. Toepasbaarheid op specifieke monsters vereist echter zorgvuldige overwegingen van biologische parameters. De beslissing is gemakkelijker voor 2D-kristallen omdat koolstoffilm nodig is om vlakheid te garanderen, maar manipulatie via de peel-blot-techniek kan de biologische integriteit van het monster of de kristallijne volgorde beïnvloeden. De geschiktheid van de peel-blot-techniek voor afzonderlijke deeltjes is beperkt tot en kan worden getest voor deeltjes die koolstoffilm nodig hebben en stabiel zijn voor manipulatie. Specimens met kritische biologische interacties tussen lagen zijn mogelijk niet geschikt voor karakterisering met behulp van de peel-blot-techniek vanwege de verstoring van dergelijke interacties.
De peel-blot techniek ("peel-blot") wordt het snelst geoptimaliseerd door testen en screenen met negatieve vlekken of niet-gekleurde monsters door TEM bij kamertemperatuur. Zodra het optimale aantal peel-blot iteraties is geïdentificeerd, kan de tijd om de dikte vóór de vitrificatie te regelen worden bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereidingsstappen voor de peel-blot techniek
OPMERKING: Voorbereiding vereist dat de volgende items naast elkaar worden geplaatst.
- Stapel twee stukken filterpapier van 20-25 μm porieformaat (zie Materiaaltabel).
- Plaats een paraffinefilm van ~8 cm x 10 cm lang naast het filtreerpapier met het papier naar boven gericht.
- Leg een stuk submicronfilterpapier op twee extra stukken #4-filterpapier (figuur 1-1).
- Plaats de anti-capillaire tang met het gebogen been naar boven en het rechte been naar beneden. Selecteer vervolgens een raster met 600 mazen met de gladde / glanzende kant naar boven. Plaats de tang op een petrischaaltje of een ander verhoogd oppervlak om contact van het schone rooster met andere items te voorkomen.
- Verwijder het papier van de paraffinefilm en trek aan de zijkanten (~5 mm) om een kleine rand te creëren. Pipetteer twee druppels van 150 μL van 4% trehalose-oplossing ~ 1-2 cm van een korte kant van de paraffinefilm en ~ 1 cm uit elkaar op de paraffinefilm.
- Giet op een aparte bank of op de vloer vloeibare stikstof in een kleine polystyreenschuimcontainer (zie materiaaltabel).
LET OP: Ontvang training voor de juiste behandeling met handschoenen en een gezichtsscherm om vorstbeet te voorkomen. - Plaats een kleine cryo-EM roostercontainer in de vloeibare stikstof en bedek de polystyreenschuimcontainer met pluisvrije doekjes.
2. De koolstoffilm op het rooster plaatsen
- Gebruik de Dumont #5-tang (zie Materiaaltabel) om de koolstoffilm van het mica te laten zweven door één kant van het mica in een lichte hoek naar beneden (~20°-40°) op een van de druppels trehalose-oplossing aan te raken en laat de waterspanning langzaam van de koolstoffilm afstijgen door het mica naar beneden te bewegen. Laat de mica los zodra de koolstoffilm op het oppervlak van de druppel drijft.
- Inspecteer de koolstoffilm visueel om te voorkomen dat koolstof wordt gebruikt met schade in de vorm van breuken.
- Plaats het rooster dat door de anti-capillaire tang onder een hoek (~ 20 ° -30 °) wordt vastgehouden in een trehalosedruppel op een positie naast en vervolgens gecentreerd onder de koolstoffilm. Pak de koolstoffilm op (figuur 1-2).
- Houd het rooster in dezelfde richting en laat het langzaam op het oppervlak van de tweede druppel trehalose zakken zonder de oppervlaktespanning van de druppel te breken om onnodige koolstoffilm te verwijderen die zich mogelijk rond de rand van het rooster naar de ruwe kant heeft gewikkeld.
3. Scheiding van meerlaagse 2D-kristallen in enkele lagen
- Draai de anti-capillaire tang (zie Materiaaltabel) en plaats ze op een petrischaaltje met de koolstofzijde van het rooster naar beneden gericht (figuur 1-3).
- Pipetteer 1,3 μL van het monster in de lichte trehalose meniscus bovenop het rooster. Pipetteer de oplossing ~ 8-10 keer om de trehalose en het monster aan beide zijden van het rooster te mengen en te verdelen.
- Pipetteer tijdens het incuberen van de oplossing gedurende 1 min een of meer druppels trehalose-oplossing van 1,7 μL op de paraffinefilm.
- Draai het raster terug in zijn oorspronkelijke positie met de koolstoffilm naar boven gericht.
- Gebruik de anti-capillaire tang om het raster op het submicronfilterpapier te drukken (figuur 1-4). Zodra de oplossing door het filterpapier is geabsorbeerd en de koolstoffilm plat ligt, wacht u 3 seconden voordat u het rooster optilt en verticaal op de druppel trehaloseoplossing van 1,7 μL beweegt (figuur 1-5).
OPMERKING: Herhaal deze stap meerdere keren voor sterk gestapelde monsters, of het raster wordt voorbereid voor vitrificatie in de volgende stappen. - Dep het raster op de twee stukken filterpapier en til het raster vervolgens van het filterpapier (figuur 1-6). Na ongeveer 13 s, afhankelijk van vochtigheid en monsterbuffer, dompelt u het rooster in de vloeibare stikstof in de kleine piepschuimcontainer en plaatst u het rooster in de cryo-EM-rastercontainer of draagt u het rechtstreeks over voor cryo-EM-screening of gegevensverzameling.
OPMERKING: Om het protocol snel te optimaliseren, moet u het geschilde rooster bij deze stap negatief kleuren in plaats van het in vloeibare stikstof te storten. Kleur het monster negatief door 3 μL 1% uranylacetaat op het rooster aan te brengen, incubeer het rooster gedurende 30 s en dep het met een gescheurd stuk filterpapier van 20-25 μm porieformaat. Rasters van 2D-kristallen verglaasd in trehalose, tannine of glucose worden routinematig met de hand gedompeld voor verglazing, omdat trehalose, tannine en glucose de vorming van kristallijn ijs voorkomen met snelheden die worden gebruikt voor het met de hand storten2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvol peel-blot experiment zal resulteren in enkele lagen monsters in vaak hoge concentraties. Het is te verwachten dat sommige regio's in de meeste rastervierkanten nog steeds meerdere lagen zullen bevatten, vooral bij minder iteraties van de peel-blot-stappen. De meerderheid van de rastervierkanten zal echter uitgebreide gebieden van enkele lagen bevatten, zoals waargenomen voor 2D-kristallen van humaan leukotrieen C4-synthase (figuur 2) en liposomen (toegevoegd in stap 3.2, figuur 3). Aanvullende peel-blot-stappen moeten mogelijk worden getest op monsters die niet de gewenste vermindering van lagen vertonen.
De belangrijkste indicatie van een succesvol peel-blot-experiment is de gegevenskwaliteit en biologische integriteit die wordt waargenomen na cryo-EM-gegevensverzameling en beeldverwerking met hoge resolutie. De interpretatie van gegevens moet een zorgvuldige afweging omvatten van mogelijke schade of vervorming van contactgebieden tussen lagen.
Gebieden van het EM-raster waarin peel blotting heeft plaatsgevonden, vertonen doorgaans een hogere concentratie monster dan regio's waarin het niet is voorgekomen. Dit schijnbare concentrerende effect wordt veroorzaakt door de hechting van het multilamellaire monster aan zowel de koolstoffilm als de rasterbalkoppervlakken, gevolgd door extra hechting aan beide oppervlakken tijdens de peel-blot-bereiding omdat ze herhaaldelijk scheiden, enigszins herpositioneren en opnieuw contact maken. Het resultaat is dat de verschillende lagen van het oorspronkelijke multi-lamellaire monster uit elkaar zijn verspreid over een groter lateraal gebied (figuur 3 en figuur 4). Deze gebieden kunnen zelfs grotere 2D-kristallen of membranen bevatten. Beide verschijnselen worden gemakkelijk waargenomen en vergeleken in gebieden waar een "schilzone" grenst aan een gebied dat niet wordt beïnvloed door de peel-blot-stap (figuur 3). De beelden in figuren 2-4 werden verzameld onder omstandigheden met een lage dosis bij een versnellende spanning van 120 kV met een transmissie-elektronenmicroscoop (zie Materiaaltabel).
Figuur 1: Schematische weergave van de peel-blot techniek. De eerste twee stappen (1-2 en 1-3) en de laatste stap (1-6) van de peel-blot techniek zijn gebaseerd op de back-injectie methode2 en de tussenstappen volgen het peel-blot protocol (aangepast van Johnson et al.1). In stap 1 worden (A) twee stukken filterpapier van 20-25 μm porieformaat gestapeld, (B) naast een stuk paraffinefilm met twee druppels trehalose-oplossing en (C) een stuk submicronfilterpapier op twee extra stukken filterpapier. In stap 2 wordt (A) de koolstoffilm afgedreefd op de eerste trehalosedruppel en (B) opgepikt met een anti-capillaire tang, waarna deze wordt aangeraakt op het oppervlak van de tweede druppel (niet weergegeven) zonder de oppervlaktespanning te breken om overtollige koolstoffilm uit de periferie te verwijderen. In stap 3,(A) worden de tangen die het rooster vasthouden 180° gedraaid (de koolstoffilmzijde van het rooster is nu naar beneden gericht) en (B) wordt het monster in de meniscus van de trehalose gepipetteerd. In stap 4 is het raster teruggedraaid naar de oorspronkelijke oriëntatie met de koolstoffilm naar boven gericht en wordt het monster langzaam op het submicronfilterpapier neergelaten. Het rooster wordt opgetild en in stap 5 verticaal neergelaten op een druppel trehaloseoplossing van 1,7 μL. Stap 4 en 5 worden "peel-blotting" genoemd en kunnen drie of meer keer worden herhaald, afhankelijk van de hoeveelheid stapelen. Het aantal iteraties moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende monsters. In stap 6, (A) wordt het monster uitgeveegd op twee lagen filterpapier van 20-25 μm porieformaat, voordat (B) het met de hand in vloeibare stikstof wordt gedompeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een kristalmonster van 2D dat wordt onderworpen aan de peel-blot-methode. Het gebied links van de pijl werd grotendeels gereduceerd tot enkellaagse 2D-kristallen in een contactgebied tussen de koolstoffilm en de rasterbalk die werd afgepeld en vervolgens verschoven, terwijl het gebied rechts van de pijl zich niet in een gebied bevond dat werd beïnvloed door de schil-vlek. De peel-blotted regio's kunnen eenvoudig worden geselecteerd voor en worden waargenomen op het grootste deel van het rooster. De getoonde 2D-kristallen zijn gestapelde en enkellaagse 2D-kristallen van menselijk leukotrieen C4-synthase. De schaalbalk komt overeen met 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Liposomen onderworpen aan de peel-blot. De peel-blot kan met succes worden toegepast om de randen van ingeklapte liposomen en blaasjes te onderbreken om te resulteren in regio's met grote, meestal enkellaagse fosfolipide bilayers zoals waargenomen in de onderste helft van het beeld. De bovenste helft bevond zich niet in een contactzone tussen de rasterbalk en de koolstoffilm en bevat dus complete liposomen met twee fosfolipide bilayers. De schaalbalk komt overeen met 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De peel-blot footprint. Het rastervierkant van een raster met 400 mazen toont de voetafdruk (gelabeld "B") van de rasterbalk en de resulterende peel-blotted-gebieden, evenals de regio's (gelabeld "C") die niet in contact waren met een rasterbalk, of onderworpen aan minder peel-blot iteraties. De schaalbalk komt overeen met 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Een EM-raster dat is voorbereid door teruginjectie op een submicronfilterpapier, met behulp van koolstoffilm die te dun is. Afbeeldingen zijn afzonderlijke frames van een video (zie video 1) genomen bij (A) initieel contact met het membraan, (B) 1000 ms na contact en (C) 2000 ms na contact. De pijl geeft rastervierkanten aan waarin de capillaire druk de koolstoffilm heeft gescheurd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Het raster wordt op het submicron filterpapier geplaatst voor de peel-blot stap. De koolstoffilm wordt langzaam en strak op het raster gezogen in de richting van linksonder naar rechtsboven, waardoor het monster strak tussen de rasterbalk en koolstoffilm wordt gesmeerd. De koolstoffilm en dus individuele monsterlagen worden verplaatst in elke volgende peel-blot-stap, waardoor optimalisatie mogelijk is met extra iteraties voor meer hoog gelaagde monsters. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De peel-blot is een krachtige methode om stapeling en dikte van meerlaagse 2D-kristallen en soortgelijke monsters voor cryo-EM-gegevensverzameling en beeldverwerking te overwinnen. Een beslissing over het gebruik van de peel-blot zal gebaseerd zijn op biologische parameters van het monster en zal ook moeten worden beoordeeld zodra een 3D cryo-EM-model beschikbaar is. Het biologische belang van contacten en de potentiële flexibiliteit van contactregio's zullen bij deze beoordeling bijzonder belangrijk zijn.
Het aantal peel-blots zal in eerste instantie worden vastgesteld via observatie na standaard negatieve vlekrastervoorbereiding, waarbij overmatige lagen of dikte alternatieve strategieën vereisen voor standaard cryo-EM-rastervoorbereiding. Dunne meerlaagse kristallen die in register zijn gestapeld, kunnen direct worden gebruikt voor microED3 of FIB-gefreesd in het geval van dikkere kristallen4. De peel-blot zal meestal niet nodig zijn voor dubbellaagse 2D-kristallen, omdat lagen afzonderlijk of samen kunnen worden verwerkt, wanneer de lagen in register5 staan. Het kan echter mogelijk gunstig zijn voor het blootstellen van beide zijden van membraaneiwit 2D-kristallen aan liganden of remmers, eenmaal in oplossing vóór peel-blotting en eenmaal na de laatste peel-blotting-stap. Bovendien kan het verminderen van grote, goed geordende dubbellaagse 2D-kristallen elektronendiffractie mogelijk maken 6,7. Meerlagen, geïnduceerd of biologisch voorkomend, van 2D-kristallen van membraan- en oplosbare eiwitten zullen de meest waarschijnlijke doelen zijn voor de peel-blot, hoewel het protocol kan worden toegepast op een reeks monsters en dient om verschillende monsters voor cryo-EM te concentreren (figuur 4).
Initiële tests met negatieve vlekken zullen de tijd en kosten om de monsters te optimaliseren drastisch verminderen, omdat bevriezing, voorbereiding van cryo-EM-monsterhouders, overdracht naar een cryo-EM en gebruik van een cryo-EM niet vereist zijn. Alleen de droogtijd voor de vriesstap moet afzonderlijk worden geoptimaliseerd. De droogtijd zal identiek zijn aan of sterk vergelijkbaar zijn met de tijd die wordt gebruikt voor het drogen van een standaard teruginjectierooster van hetzelfde monster1.
Hoewel rasters met 600 mazen over het algemeen resulteren in een goede conservering van de koolstoffilm, kunnen verhoogde aantallen peel-blot-iteraties en dunnere koolstoffilmlagen leiden tot een verhoogde koolstoffilmbreuk (figuur 5). Gestapelde 2D-kristallen, liposomen en gelaagde monsters van grote reeksen oplosbare eiwitten kunnen met succes worden gescheiden (figuren 2-4).
Het monster wordt zorgvuldig geëvalueerd door cryo-EM om ervoor te zorgen dat nadelige effecten op de kwaliteit van het monster worden vermeden. Dit kan worden bereikt door beeldverwerking om afbeeldingen van gestapelde en ongestapelde kristallen te vergelijken. Zowel voor beoordelingsdoeleinden als om het doel van een 3D-model te bereiken, wordt beeldverwerking uitgevoerd via de 2dx-programma's die beschikbaar zijn in Focus 8,9, die ook benaderingen met één deeltje implementeert om roosteronvolkomenheden en eiwitheterogeniteit aan te pakken met de mogelijkheid om de inherente kwaliteit van de originele 2D-kristallen dramatisch te verhogen10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Een deel van dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
