Summary
Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gridpreparasjonsmetode som gjør det mulig å skille flerlags og konsentrerte biologiske prøver i enkeltlag for å redusere tykkelsen, øke prøvekonsentrasjonen og lette bildebehandlingen.
Abstract
Peel-blot cryo-EM gridpreparasjonsteknikken er en betydelig modifisert tilbakeinjeksjonsmetode med sikte på å oppnå en reduksjon i lag med flerlagsprøver. Denne fjerningen av lag før dypping kan bidra til å redusere prøvetykkelsen til et nivå som er egnet for innsamling av kryo-EM-data, forbedre prøveflatheten og lette bildebehandlingen. Peel-blot-teknikken tillater separasjon av multilamellære membraner i enkeltlag, av lagdelte 2D-krystaller i individuelle krystaller, og av stablede, arklignende strukturer av oppløselige proteiner som også skal separeres i enkeltlag. Den høye prøvetykkelsen på denne typen prøver utgjør ofte uoverstigelige problemer for cryo-EM-datainnsamling og cryo-EM-bildebehandling, spesielt når mikroskoptrinnet må vippes for datainnsamling. Videre kan gitter med høye konsentrasjoner av noen av disse prøvene fremstilles for effektiv datainnsamling, siden prøvekonsentrasjonen før klargjøring av rutenettet kan økes og peel-blot-teknikken justeres for å resultere i en tett fordeling av enkeltlagsprøver.
Introduction
Peel-blot-teknikken ble utviklet for å skille stablede todimensjonale krystaller av membranproteiner i enkeltlag for å oppnå passende tynne prøver for kryo-EM 2D- og 3D-datainnsamling og lette bildebehandling1. Protokollen er tilsvarende egnet for andre typer multilamellære prøver, samt for å oppnå høye prøvekonsentrasjoner av begge prøvetyper på rutenettet uten å øke tykkelsen i Z.
Reduksjon av prøvelag til ett lag oppnås ved å påføre en kombinasjon av kapillærtrykk og skjærkrefter i en protokoll som vesentlig strekker seg på og endrer tilbakeinjeksjonsmetoden2. Et første blotting-trinn resulterer i tett sandwiching og overholdelse av karbonfilmen og en gitterstang på hver side av flerlagsprøven under blotting på submikron i stedet for 20-25μm filterpapirporestørrelse i tilbakeinjeksjonsmetoden. Separasjonen, eller peeling, av et enkelt lag skjer ved å tvinge separasjonen av de sammenklemte lagene når rutenettet presses vertikalt på en trehalosefall, og tvinger karbonfilmen bort fra rutenettstangen (figur 1). Flytting av karbonfilmen bort fra det opprinnelige kontaktpunktet med rutenettet skjer i neste trinn, når rutenettet igjen er blottet på submikronfilterpapir. Antall gjentakelser av disse trinnene kan optimaliseres for bestemte prøver. Videre kan protokollen brukes til å øke prøvekonsentrasjonene samtidig som aggregering i Z. På grunn av avhengigheten av overholdelse av gitterstangen og karbonfilmen, samt kraftig separasjon, kan denne tilnærmingen ikke være egnet for svært skjøre molekyler som visse delikate og / eller ustabile proteiner og proteinkomplekser.
Peel-blot-teknikken krever verken spesialutstyr eller dyre forsyninger. Anvendelse på spesifikke prøver vil imidlertid kreve nøye vurderinger av biologiske parametere. Beslutningen er lettere for 2D-krystaller, da karbonfilm er nødvendig for å sikre flathet, men manipulering via peel-blot-teknikken kan påvirke den biologiske integriteten til prøven eller krystallinsk rekkefølge. Egnetheten til peel-blot-teknikken til enkeltpartikler er begrenset til og kan testes for de som krever karbonfilm og er stabile for manipulering. Prøver med kritiske biologiske interaksjoner mellom lag kan ikke være egnet for karakterisering ved hjelp av peel-blot-teknikken på grunn av forstyrrelsen av slike interaksjoner.
Peel-blot-teknikken ("peel-blot") optimaliseres raskest ved testing og screening med negativ flekk eller ufargede prøver av TEM ved romtemperatur. Når det optimale antallet peel-blot-iterasjoner er identifisert, kan tiden for å kontrollere tykkelsen før vitrifisering bestemmes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelsestrinn for peel-blot-teknikken
MERK: Forberedelse krever at følgende elementer plasseres ved siden av hverandre.
- Stable to stykker av 20-25 μm pore størrelse filter papir (se tabell over materialer).
- Plasser en ~8 cm x 10 cm lang parafinfilm ved siden av filterpapiret med papiret vendt opp.
- Legg et stykke submikronfilterpapir på toppen av to ekstra stykker # 4 filterpapir (figur 1-1).
- Plasser antikapillær tang med det bøyde benet vendt opp og det rette benet vendt ned. Velg deretter et rutenett med 600 netting med den glatte/blanke siden opp. Plasser tangen på en petriskål eller annen hevet overflate for å unngå kontakt med det rene rutenettet med andre gjenstander.
- Fjern papiret fra parafinfilmen og trekk sidene (~ 5 mm) for å lage en liten kant. Pipette to 150 μL dråper 4% trehaloseoppløsning ~ 1-2 cm fra den ene kortsiden av parafinfilmen og ~ 1 cm fra hverandre på parafinfilmen.
- På en separat benk eller på gulvet, hell flytende nitrogen i en liten polystyrenskumbeholder (se materialtabell).
FORSIKTIG: Få opplæring i riktig håndtering med hansker og ansiktsskjerm for å unngå frostskader. - Plasser en liten cryo-EM gitterbeholder i flytende nitrogen og dekk polystyrenskumbeholderen med lofrie kluter.
2. Plasser karbonfilmen på rutenettet
- Bruk Dumont # 5 tang (se Materialtabell) til å flyte av karbonfilmen fra glimmeren ved å berøre den ene siden av glimmeren i en liten vinkel nedover (~ 20 ° -40 °) på en av dråpene trehaloseløsning og sakte la vannspenningen løfte av karbonfilmen ved å flytte glimmeren nedover. Slipp glimmeren når karbonfilmen flyter på overflaten av dråpen.
- Inspiser karbonfilmen visuelt for å unngå å bruke karbon med skade i form av brudd.
- Sett inn rutenettet som holdes av antikapillærtangene i en vinkel (~ 20 ° -30 °) i et trehalosefall i en posisjon ved siden av, og deretter sentrert under karbonfilmen. Plukk opp karbonfilmen (Figur 1-2).
- Hold rutenettet i samme retning og senk det sakte ned på overflaten av den andre dråpen trehalose uten å bryte overflatespenningen til dråpen for å fjerne unødvendig karbonfilm som kan ha viklet seg rundt kanten av rutenettet til den grove siden.
3. Separasjon av flerlags 2D-krystaller i enkeltlag
- Roter antikapillærtangene (se materialtabellen) og legg dem på en petriskål med karbonsiden av rutenettet vendt ned (Figur 1-3).
- Pipetter 1,3 μL av prøven inn i den lette trehalose menisken på toppen av rutenettet. Pipette løsningen ~ 8-10 ganger for å blande og distribuere trehalose og prøve på begge sider av rutenettet.
- Under inkubering av løsningen i 1 min, pipetter du en eller flere 1,7 μL dråper trehaloseoppløsning på parafinfilmen.
- Roter rutenettet tilbake til sin opprinnelige posisjon med karbonfilmen vendt opp.
- Bruk antikapillær tang for å trykke rutenettet på submikronfilterpapiret (Figur 1-4). Når løsningen er absorbert av filterpapiret og karbonfilmen ligger flatt, vent i 3s før du løfter rutenettet og beveger det vertikalt på 1,7 μL dråpe trehaloseoppløsning (figur 1-5).
MERK: Gjenta dette trinnet flere ganger for svært stablede prøver, eller rutenettet er klargjort for vitrifisering i de neste trinnene. - Fjern rutenettet på de to stykkene filterpapir, og løft deretter rutenettet fra filterpapiret (Figur 1-6). Etter ca. 13 s, avhengig av fuktighet og prøvebuffer, dypp gitteret i det flytende nitrogenet i den lille isoporbeholderen og plasser gitteret i cryo-EM-nettbeholderen eller overfør det direkte for kryo-EM-screening eller datainnsamling.
MERK: For å raskt optimalisere protokollen, må du farge det skrellblåste rutenettet negativt på dette trinnet i stedet for å kaste det inn i flytende nitrogen. Fargelegg prøven negativt ved å påføre 3 μL 1% uranylacetat på rutenettet, inkuber rutenettet i 30 s, og fjern det med et revet stykke 20-25 μm porestørrelsesfilterpapir. Gitter av 2D-krystaller vitrifisert i trehalose, tannin eller glukose blir rutinemessig håndstupt for vitrifisering, da trehalose, tannin og glukose forhindrer dannelsen av krystallinsk is ved hastigheter som brukes til hånddykking2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et vellykket peel-blot-eksperiment vil resultere i enkeltlag med prøver i ofte høye konsentrasjoner. Det er å forvente at noen regioner i de fleste rutenettfirkanter fortsatt vil inneholde flere lag, spesielt ved færre antall iterasjoner av peel-blot-trinnene. De fleste rutenettkvadrater vil imidlertid inneholde store områder av enkeltlag som observert for 2D-krystaller av human leukotrien C 4-syntase (figur 2) og liposomer (lagt til i trinn 3.2, figur 3). Ytterligere peel-blot-trinn må kanskje testes for prøver som ikke viser ønsket reduksjon i lag.
Den viktigste indikasjonen på et vellykket peel-blot-eksperiment vil være datakvaliteten og den biologiske integriteten som observeres etter høyoppløselig innsamling og bildebehandling av kryo-EM. Datatolkning må inkludere nøye vurdering av potensiell skade eller forvrengning av kontaktregioner mellom lag.
Regioner i EM-rutenettet der peeling blotting har skjedd, viser vanligvis en høyere konsentrasjon av prøve enn regioner der det ikke har skjedd. Denne tilsynelatende konsentrerende effekten skyldes at den multilamellære prøven overholder både karbonfilmen og gitterstangoverflatene, etterfulgt av ytterligere overholdelse av begge overflater under peel-blot-preparatet da de gjentatte ganger separeres, flyttes litt og igjen tar kontakt. Resultatet er at de forskjellige lagene i den opprinnelige multilamellprøven er spredt fra hverandre over et større sideområde (figur 3 og figur 4). Disse regionene kan til og med inneholde større 2D-krystaller eller membraner. Begge fenomenene er lett å observere og sammenligne i områder der en "peel zone" ligger ved siden av et område som ikke er påvirket av peel-blot-trinnet (figur 3). Bildene i figur 2-4 ble samlet inn under lavdoseforhold ved en akselererende spenning på 120 kV med et transmisjonselektronmikroskop (se materialtabell).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av peel-blot-teknikken. De to første trinnene (1-2 og 1-3) og det siste trinnet (1-6) i peel-blot-teknikken er basert på tilbakeinjeksjonsmetoden 2, og de mellomliggende trinnene følger peel-blot-protokollen (modifisert fra Johnson et al.1). I trinn 1 stables (A) to stykker 20-25 μm filterpapir i porestørrelse, (B) ved siden av et stykke parafinfilm med to dråper trehaloseoppløsning og (C) et stykke submikronfilterpapir på to ekstra stykker filterpapir. I trinn 2 flytes (A) karbonfilmen av på den første trehalosedråpen og (B) plukkes opp med antikapillær tang, hvorpå den berøres til overflaten av den andre dråpen (ikke vist) uten å bryte overflatespenningen for å fjerne overflødig karbonfilm fra periferien. I trinn 3 roteres (A) tangen som holder gitteret med 180° (karbonfilmsiden av rutenettet vender nå ned) og (B) prøven pipetteres inn i menisken til trehalosen. I trinn 4 har rutenettet blitt rotert tilbake til den opprinnelige retningen med karbonfilmen vendt opp og prøven senkes sakte ned på submikronfilterpapiret. Gitteret løftes opp og i trinn 5 senkes vertikalt på en 1,7 μL dråpe trehaloseoppløsning. Trinn 4 og 5 kalles "peel-blotting" og kan itereres tre eller flere ganger, avhengig av mengden stabling. Antall iterasjoner må kanskje optimaliseres for forskjellige prøver. I trinn 6, (A) blir prøven blottet på to lag med 20-25 μm porestørrelse filterpapir, før (B) det blir håndkastet i flytende nitrogen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En 2D krystallprøve utsatt for peel-blot-metoden. Regionen til venstre for pilen ble i stor grad redusert til enkeltlags 2D-krystaller i et kontaktområde mellom karbonfilmen og rutenettstangen som ble skrellet og deretter forskjøvet, mens regionen til høyre for pilen ikke var i et område påvirket av peel-blot. De skrellblåste områdene kan enkelt velges for og observeres på det meste av rutenettet. 2D-krystallene som vises er stablede og enkeltlags 2D-krystaller av human leukotrienC4-syntase. Skalalinjen tilsvarer 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Liposomer utsatt for peeling-blot. Skrellflekken kan med hell påføres for å avbryte kantene på kollapsede liposomer og vesikler for å resultere i regioner med store, for det meste enkeltlags fosfolipid-dobbeltlag som observert i nedre halvdel av bildet. Den øvre halvdelen var ikke i en kontaktsone mellom gitterstangen og karbonfilmen og inneholder dermed komplette liposomer med to fosfolipid-dobbeltlag. Skalalinjen tilsvarer 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Skrellflekkavtrykket. Rutenettet i et rutenett med 400 nett viser fotavtrykket (merket "B") på rutenettstangen og de resulterende skrellflekkede områdene samt regionene (merket "C") som ikke var i kontakt med en rutenettstang, eller utsatt for færre gjentakelser av skrellflekker. Skalalinjen tilsvarer 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Blotting av et EM-rutenett fremstilt ved tilbakeinjeksjon på et submikronfilterpapir, ved bruk av karbonfilm som er for tynn. Bilder er enkeltbilder fra en video (se Video 1) tatt ved (A) første kontakt med membranen, (B) 1000 ms etter kontakt og (C) 2000 ms etter kontakt. Pilen indikerer rutenettfirkanter der kapillærtrykket har brutt karbonfilmen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: Rutenettet er plassert på submikronfilterpapiret for peel-blot-trinnet. Karbonfilmen suges sakte og tett på rutenettet i retning fra nedre venstre til øvre høyre, som tett smører prøven mellom rutenettstangen og karbonfilmen. Karbonfilmen og dermed individuelle prøvelag forskyves i hvert påfølgende peel-blot-trinn, noe som muliggjør optimalisering med ytterligere iterasjoner for mer lagdelte prøver. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Peel-blot er en kraftig metode for å overvinne stabling og tykkelse av flerlags 2D-krystaller og lignende prøver for kryo-EM-datainnsamling og bildebehandling. En beslutning om bruk av peel-blot vil være basert på biologiske parametere i prøven og vil også kreve vurdering når en 3D cryo-EM-modell er tilgjengelig. Den biologiske betydningen av kontakter og potensiell fleksibilitet i kontaktregioner vil være særlig viktig i denne vurderingen.
Antallet peel-blots vil i utgangspunktet bli etablert via observasjon etter standard negativ flekkgitterforberedelse, hvor for høye lag eller tykkelse vil kreve alternative strategier til standard cryo-EM gridpreparasjon. Tynne flerlagskrystaller som er stablet i register kan brukes direkte til microED3 eller FIB-frest ved tykkere krystaller4. Skrellflekken vil vanligvis ikke være nødvendig for dobbeltlags 2D-krystaller, da lag kan behandles enkeltvis eller sammen, når lagene er i register5. Det kan potensielt være gunstig for å utsette begge sider av membranprotein 2D-krystaller for ligander eller hemmere, en gang i oppløsning før peeling-blotting, og en gang etter det siste peeling-blotting-trinnet. I tillegg kan reduksjon av store, velordnede dobbeltlags 2D-krystaller tillate elektrondiffraksjon 6,7. Flerlag, enten indusert eller biologisk forekommende, av 2D-krystaller av membran og oppløselige proteiner vil være de mest sannsynlige målene for peeling-blot, selv om protokollen kan brukes på en rekke prøver og tjene til å konsentrere forskjellige prøver for cryo-EM (figur 4).
Innledende testing med negativ flekk vil dramatisk redusere tid og kostnader for å optimalisere prøvene som frysing, klargjøring av cryo-EM prøveholdere, overføring til en cryo-EM, og bruk av en cryo-EM er ikke nødvendig. Bare tørketiden før frysetrinnet må optimaliseres separat. Tørketiden vil være identisk eller svært lik tiden som brukes til tørking av et standard tilbakeinjeksjonsnett av samme prøve1.
Mens 600-mesh rutenett generelt resulterer i god bevaring av karbonfilmen, kan økt antall peel-blot iterasjoner og tynnere karbonfilmlag føre til økt karbonfilmbrudd (figur 5). Stablede 2D-krystaller, liposomer og lagdelte prøver av store arrays av oppløselige proteiner kan med hell separeres (figur 2-4).
Prøven evalueres nøye av cryo-EM for å sikre at negative effekter på prøvekvaliteten unngås. Dette kan oppnås ved bildebehandling for å sammenligne bilder av stablede og ikke-stablede krystaller. Både for vurderingsformål og for å oppnå målet om en 3D-modell, utføres bildebehandling via 2dx-programmene som er tilgjengelige i Focus8,9, som også implementerer enkeltpartikkeltilnærminger for å adressere gitterfeil og protein heterogenitet med muligheten til å dramatisk øke på den iboende kvaliteten på de originale 2D-krystallene10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
En del av dette arbeidet ble støttet av NIH-stipend HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
