Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver

Published: June 29, 2022 doi: 10.3791/64099
* These authors contributed equally

Summary

Peel-blot-teknikken er en cryo-EM-gitterforberedelsesmetode, der gør det muligt at adskille flerlags og koncentrerede biologiske prøver i enkeltlag for at reducere tykkelsen, øge prøvekoncentrationen og lette billedbehandlingen.

Abstract

Peel-blot cryo-EM-gitterforberedelsesteknikken er en signifikant modificeret tilbageinjektionsmetode med det formål at opnå en reduktion i lag af flerlagsprøver. Denne fjernelse af lag inden nedfrysning kan hjælpe med at reducere prøvetykkelsen til et niveau, der er egnet til cryo-EM-dataindsamling, forbedre prøvefladheden og lette billedbehandling. Peel-blot-teknikken gør det muligt at adskille multilamellarmembraner i enkeltlag, af lagdelte 2D-krystaller i individuelle krystaller og af stablede, arklignende strukturer af opløselige proteiner, der ligeledes kan adskilles i enkeltlag. Den høje prøvetykkelse af disse typer prøver udgør ofte uoverstigelige problemer for cryo-EM-dataindsamling og cryo-EM-billedbehandling, især når mikroskoptrinnet skal vippes for dataindsamling. Desuden kan gitre med høje koncentrationer af nogen af disse prøver forberedes til effektiv dataindsamling, da prøvekoncentrationen inden gitterforberedelse kan øges, og peel-blot-teknikken justeres for at resultere i en tæt fordeling af enkeltlagsprøve.

Introduction

Peel-blot-teknikken blev udviklet for at adskille stablede todimensionelle krystaller af membranproteiner i enkeltlag for at opnå passende tynde prøver til cryo-EM 2D- og 3D-dataindsamling og lette billedbehandling1. Protokollen er ligeledes velegnet til andre typer multilamellare prøver samt til at opnå høje prøvekoncentrationer af begge prøvetyper på gitteret uden at øge tykkelsen i Z.

Reduktion af prøvelag til et lag opnås ved at anvende en kombination af kapillærtryk og forskydningskræfter i en protokol, der væsentligt udvider og ændrer ryginjektionsmetoden2. Et første blottingtrin resulterer i tæt sandwiching og vedhæftning af carbonfilmen og en gitterstang på hver side af flerlagsprøven under blotting på submikron i stedet for 20-25 μm filterpapirporestørrelse i tilbageinjektionsmetoden. Adskillelsen eller afskalningen af et individuelt lag sker ved at tvinge adskillelsen af de klemte lag, når gitteret presses lodret på et trehalosefald, hvilket tvinger carbonfilmen væk fra gitterbjælken (figur 1). Omplacering af carbonfilmen væk fra det oprindelige kontaktpunkt med gitterbjælken sker i næste trin, når gitteret igen blottes på submikronfilterpapir. Antallet af gentagelser af disse trin kan optimeres til specifikke prøver. Desuden kan protokollen bruges til at øge prøvekoncentrationerne og samtidig undgå aggregering i Z. På grund af afhængigheden af overholdelse af gitterbjælken og carbonfilmen samt kraftig adskillelse er denne tilgang muligvis ikke egnet til meget skrøbelige molekyler såsom visse sarte og / eller ustabile proteiner og proteinkomplekser.

Peel-blot-teknikken kræver hverken specialudstyr eller dyre forsyninger. Anvendelighed på specifikke prøver vil dog kræve nøje overvejelser om biologiske parametre. Beslutningen er lettere for 2D-krystaller, da kulstoffilm er nødvendig for at sikre fladhed, men manipulation via peel-blot-teknikken kan påvirke prøvens biologiske integritet eller krystallinske rækkefølge. Peel-blot-teknikkens egnethed til enkeltpartikler er begrænset til og kan testes for dem, der kræver kulstoffilm og er stabile over for manipulation. Prøver med kritiske biologiske interaktioner mellem lag er muligvis ikke egnede til karakterisering ved hjælp af skrælblot-teknikken på grund af forstyrrelsen af sådanne interaktioner.

Peel-blot-teknikken ("peel-blot") optimeres hurtigst ved at teste og screene med negativ plet eller ufarvede prøver ved TEM ved stuetemperatur. Når det optimale antal peel-blot-iterationer er blevet identificeret, kan tiden til at kontrollere tykkelsen før forglasning bestemmes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelsestrin til skrælblot-teknikken

BEMÆRK: Forberedelse kræver, at følgende genstande placeres ved siden af hinanden.

  1. Stak to stykker filterpapir i porestørrelse på 20-25 μm (se Materialetabel).
  2. Placer en ~8 cm x 10 cm lang paraffinfilm ved siden af filterpapiret med papiret opad.
  3. Placer et stykke submikronfilterpapir oven på yderligere to stykker #4 filterpapir (figur 1-1).
  4. Placer antikapillærtangen med det bøjede ben opad og det lige ben nedad. Vælg derefter et gitter med 600 mesh med den glatte/skinnende side opad. Placer tangen på en petriskål eller anden hævet overflade for at undgå kontakt med det rene gitter med andre genstande.
  5. Fjern papiret fra paraffinfilmen, og træk i siderne (~5 mm) for at skabe en lille kant. Pipetter to 150 μL dråber 4% trehaloseopløsning ~ 1-2 cm fra den ene korte side af paraffinfilmen og ~ 1 cm fra hinanden på paraffinfilmen.
  6. På en separat bænk eller på gulvet hældes flydende nitrogen i en lille polystyrenskumbeholder (se Materialetabel).
    FORSIGTIG: Modtag træning i korrekt håndtering ved hjælp af handsker og ansigtsskærm for at undgå frostbid.
  7. Anbring en lille cryo-EM gitterbeholder i det flydende nitrogen og dæk polystyrenskumbeholderen med fnugfri klude.

2. Placering af kulstoffilmen på nettet

  1. Brug Dumont #5 tang (se Materialetabel) til at flyde af kulstoffilmen fra glimmeret ved at røre ved den ene side af glimmeret i en lille vinkel nedad (~ 20 ° -40 °) på en af dråberne af trehaloseopløsning og lad langsomt vandspændingen løfte sig af kulstoffilmen ved at flytte glimmeret nedad. Slip glimmeret, når kulstoffilmen flyder på overfladen af dråben.
  2. Visuelt inspicere carbonfilmen for at undgå at bruge kulstof med skader i form af brud.
  3. Indsæt gitteret, der holdes af antikapillærtangen i en vinkel (~ 20 ° -30 °) i et trehalosefald i en position ved siden af og derefter centreret under carbonfilmen. Tag kulstoffilmen op (figur 1-2).
  4. Hold gitteret i samme retning, og sænk det langsomt ned på overfladen af den anden dråbe trehalose uden at bryde faldets overfladespænding for at fjerne unødvendig kulstoffilm, der kan have viklet sig rundt om gitterets kant til den ru side.

3. Adskillelse af flerlags 2D-krystaller i enkeltlag

  1. Drej antikapillærtangen (se Materialetabel), og læg dem på en petriskål med kulstofsiden af gitteret nedad (figur 1-3).
  2. Pipetter 1,3 μL af prøven i den lette trehalose menisk oven på gitteret. Opløsningen pipetteres ~8-10 gange for at blande og fordele trehalosen og prøven på begge sider af gitteret.
  3. Mens opløsningen inkuberes i 1 min., pipetteres en eller flere 1,7 μL dråber trehaloseopløsning på paraffinfilmen.
  4. Drej gitteret tilbage til sin oprindelige position med carbonfilmen opad.
  5. Brug antikapillærtangen til at trykke gitteret på submikronfilterpapiret (figur 1-4). Når opløsningen er absorberet af filterpapiret, og kulfilmen ligger fladt, skal du vente i 3 sekunder, før du løfter gitteret og flytter det lodret på 1,7 μL dråbe trehaloseopløsning (figur 1-5).
    BEMÆRK: Gentag dette trin flere gange for stærkt stablede prøver, eller gitteret er forberedt til forglasning i de næste trin.
  6. Blotlæg gitteret på de to stykker filterpapir, og løft derefter gitteret fra filterpapiret (figur 1-6). Efter ca. 13 s, afhængigt af fugtighed og prøvebuffer, skal du stikke gitteret ned i det flydende nitrogen i den lille isoporbeholder og placere gitteret i cryo-EM-gitterbeholderen eller overføre det direkte til cryo-EM-screening eller dataindsamling.
    BEMÆRK: For hurtigt at optimere protokollen skal du plette det skræl-blottede gitter negativt på dette trin i stedet for at kaste det i flydende nitrogen. Prøven pletter negativt ved at påføre 3 μL 1% uranylacetat på gitteret, inkubere gitteret i 30 s og blotte det med et revet stykke filterpapir i porestørrelse på 20-25 μm. Gitter af 2D-krystaller forglasset i trehalose, tannin eller glucose kastes rutinemæssigt i hånden til forglasning, da trehalose, tannin og glukose forhindrer dannelsen af krystallinsk is med hastigheder, der anvendes til hånddykning2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et vellykket peel-blot-eksperiment vil resultere i enkeltlag af prøver i ofte høje koncentrationer. Det kan forventes, at nogle regioner i de fleste gitterkvadrater stadig vil indeholde flere lag, især ved færre antal iterationer af skrælblot-trinnene. Størstedelen af gitterkvadrater vil imidlertid indeholde omfattende regioner af enkeltlag som observeret for 2D-krystaller af human leukotrien C 4-syntase (figur 2) og liposomer (tilføjet i trin 3.2, figur 3). Yderligere skræl-blot trin skal muligvis testes for prøver, der ikke viser den ønskede reduktion i lag.

Den vigtigste indikation på et vellykket peel-blot-eksperiment vil være datakvaliteten og den biologiske integritet, der observeres efter højopløsnings cryo-EM-dataindsamling og billedbehandling. Datafortolkning skal omfatte omhyggelig overvejelse af potentiel skade eller forvrængning af kontaktområder mellem lag.

Regioner i EM-gitteret, hvor skrælblotting har fundet sted, viser typisk en højere koncentration af prøver end regioner, hvor det ikke har fundet sted. Denne tilsyneladende koncentrerende effekt er forårsaget af vedhæftningen af den multilamellare prøve til både carbonfilmen og gitterbjælkens overflader efterfulgt af yderligere vedhæftning til begge overflader under peel-blot-præparatet, da de gentagne gange adskilles, omplaceres lidt og igen får kontakt. Resultatet er, at de forskellige lag af den oprindelige multilamellare prøve er spredt fra hinanden over et større lateralt område (figur 3 og figur 4). Disse regioner kan endda indeholde større 2D-krystaller eller membraner. Begge fænomener observeres let og sammenlignes i områder, hvor en "skrælzone" støder op til et område, der ikke er påvirket af skrælblot-trinnet (figur 3). Billederne i figur 2-4 blev indsamlet under lavdosisforhold ved en accelererende spænding på 120 kV med et transmissionselektronmikroskop (se Materialetabel).

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af peel-blot-teknikken. De første to trin (1-2 og 1-3) og det sidste trin (1-6) i peel-blot-teknikken er baseret på ryginjektionsmetode 2, og de mellemliggende trin følger peel-blot-protokollen (modificeret fra Johnson et al.1). I trin 1 stables (A) to stykker filterpapir i porestørrelse på 20-25 μm, (B) ved siden af et stykke paraffinfilm med to dråber trehaloseopløsning og (C) et stykke submikronfilterpapir på to ekstra stykker filterpapir. I trin 2, (A) flydes kulstoffilmen af på den første trehalosedråbe og (B) afhentes med antikapillærtang, hvorefter den berøres til overfladen af den anden dråbe (ikke vist) uden at bryde overfladespændingen for at fjerne overskydende kulstoffilm fra periferien. I trin 3, (A) drejes tangen, der holder gitteret, med 180 ° (kulstoffilmsiden af gitteret vender nu nedad) og (B) prøven pipetiseres ind i trehalosens menisk. I trin 4 er gitteret blevet drejet tilbage til den oprindelige retning med carbonfilmen opad, og prøven sænkes langsomt ned på submikronfilterpapiret. Gitteret løftes op og sænkes i trin 5 lodret ned på en 1,7 μL dråbe trehaloseopløsning. Trin 4 og 5 kaldes "peel-blotting" og kan gentages tre eller flere gange, afhængigt af mængden af stabling. Antallet af gentagelser skal muligvis optimeres til forskellige prøver. I trin 6, (A) blottes prøven på to lag filterpapir i porestørrelse på 20-25 μm, før (B) den kastes i flydende nitrogen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: En 2D-krystalprøve underkastet peel-blot-metoden. Området til venstre for pilen blev stort set reduceret til enkeltlags 2D-krystaller i et kontaktområde mellem carbonfilmen og gitterbjælken, der blev skrællet og derefter skiftet, mens regionen til højre for pilen ikke var i et område, der var påvirket af skrælpletten. De skrællede områder kan let vælges til og observeres på det meste af nettet. De viste 2D-krystaller er stablede og enkeltlags 2D-krystaller af human leukotrien C 4-syntase. Skalabjælken svarer til 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Liposomer udsat for skrælpletten. Skrælpletten kan med succes påføres for at afbryde kanterne af kollapsede liposomer og vesikler for at resultere i regioner med store, for det meste enkeltlags phospholipid dobbeltlag som observeret i den nederste halvdel af billedet. Den øverste halvdel var ikke i en kontaktzone mellem gitterstangen og carbonfilmen og indeholder således komplette liposomer med to phospholipid dobbeltlag. Skalabjælken svarer til 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Skræl-blot-fodaftrykket. Gitterkvadratet på et gitter med 400 mesh viser fodaftrykket (mærket "B") af gitterbjælken og de resulterende skræl-blottede regioner samt de regioner (mærket "C"), der ikke var i kontakt med en gitterstang eller udsat for færre skræl-blot-iterationer. Skalabjælken svarer til 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Blotte et EM-gitter fremstillet ved tilbageinjektion på et submikronfilterpapir ved hjælp af kulfilm, der er for tynd. Billeder er enkeltbilleder fra en video (se video 1) taget ved (A) indledende kontakt med membranen, (B) 1000 ms efter kontakt og (C) 2000 ms efter kontakt. Pilen angiver gitterfirkanter, hvor kapillærtrykket har sprængt kulstoffilmen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Gitteret placeres på submikronfilterpapiret til skrælblot-trinnet. Kulstoffilmen suges langsomt og tæt på gitteret i retning fra nederst til venstre til øverst til højre, som tæt smører prøven mellem gitterstangen og kulstoffilmen. Kulstoffilmen og dermed de enkelte prøvelag forskydes i hvert efterfølgende peel-blot-trin, hvilket giver mulighed for optimering med yderligere iterationer for mere lagdelte prøver. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Peel-blot er en kraftfuld metode til at overvinde stabling og tykkelse af flerlags 2D-krystaller og lignende prøver til cryo-EM-dataindsamling og billedbehandling. En beslutning om brugen af peel-blot vil være baseret på biologiske parametre i prøven og vil også kræve vurdering, når en 3D cryo-EM-model er tilgængelig. Den biologiske betydning af kontakter og kontaktregionernes potentielle fleksibilitet vil være særlig vigtig i denne vurdering.

Antallet af skrælpletter vil i første omgang blive etableret via observation efter standard negativ pletgitterforberedelse, hvor for store lag eller tykkelse vil kræve alternative strategier til standard cryo-EM gitterforberedelse. Tynde flerlagskrystaller, der er stablet i register, kan anvendes direkte til mikroED3 eller FIB-fræset i tilfælde af tykkere krystaller4. Skrælpletten vil normalt ikke være nødvendig for dobbeltlags 2D-krystaller, da lag kan behandles individuelt eller sammen, når lagene er i register5. Det kan potentielt være gavnligt for at udsætte begge sider af membranprotein 2D-krystaller for ligander eller hæmmere, men en gang i opløsning før skræl-blotting og en gang efter det sidste peel-blotting trin. Derudover kan reduktion af store, velordnede dobbeltlags 2D-krystaller muliggøre elektrondiffraktion 6,7. Flere lag, enten inducerede eller biologisk forekommende, af 2D-krystaller af membran og opløselige proteiner vil være de mest sandsynlige mål for skrælblotten, selvom protokollen kan anvendes på en række prøver og tjener til at koncentrere forskellige prøver til cryo-EM (figur 4).

Indledende test med negativ plet vil dramatisk reducere tid og omkostninger til at optimere prøverne, da frysning, forberedelse af cryo-EM-prøveholdere, overførsel til en cryo-EM og brug af en cryo-EM ikke er påkrævet. Kun tørretiden før frysetrinnet skal optimeres separat. Tørretiden vil være identisk med eller meget lig den tid, der bruges til tørring af et standard tilbageinjektionsgitter af samme prøve1.

Mens 600-mesh gitter generelt resulterer i god bevarelse af carbonfilmen, kan et øget antal peel-blot-iterationer og tyndere kulstoffilmlag føre til øget kulstoffilmbrud (figur 5). Stablede 2D-krystaller, liposomer og lagdelte prøver af store arrays af opløselige proteiner kan med succes adskilles (figur 2-4).

Prøven evalueres omhyggeligt af cryo-EM for at sikre, at negative virkninger på prøvekvaliteten undgås. Dette kan opnås ved billedbehandling for at sammenligne billeder af stablede og ikke-stablede krystaller. Både til vurderingsformål og for at nå målet med en 3D-model udføres billedbehandling via de 2dx-programmer, der er tilgængelige i Focus8,9, som også implementerer enkeltpartikeltilgange til at adressere gitterfejl og protein heterogenitet med mulighed for dramatisk at øge den iboende kvalitet af de originale 2D-krystaller10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

En del af dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud HL090630 (ISK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
600-mesh grids SPI 2060-C-XA
Anti-capillary forceps Ted Pella 510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps Ted Pella 5622
Grid box for cryo-EM storage Ted Pella 160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica Ted Pella 56 The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper MilliporeSigma DAWP04700
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper MilliporeSigma WHA1004150 This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
  2. Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
  3. Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
  4. Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
  5. Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
  6. Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
  7. Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
  8. Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
  9. Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  10. Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).

Tags

Biokemi udgave 184
Peel-Blot-teknikken: En Cryo-EM-prøveforberedelsesmetode til adskillelse af enkeltlag fra flerlags eller koncentrerede biologiske prøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnson, M. C., Grant, A. J.,More

Johnson, M. C., Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples. J. Vis. Exp. (184), e64099, doi:10.3791/64099 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter