Denne protokollen demonstrerer hvordan man isolerer humane navlestrengsavledede mesenkymale stamcellers små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) med en enkel benkeplateinnstilling i laboratorieskala. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, sEVs markører og morfologi av isolerte hUC-MSC-sEVs er preget av henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop.
Den ultrasentrifugeringsbaserte prosessen regnes som den vanlige metoden for isolasjon av små ekstracellulære vesikler (sEVs). Utbyttet fra denne isolasjonsmetoden er imidlertid relativt lavere, og disse metodene er ineffektive for å skille sEV-undertyper. Denne studien demonstrerer en enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere MSC små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) fra mennesker, vellykket separert ved ultrafiltrering fra det kondisjonerte mediet til hUC-MSC. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, eksosomale markører (CD9, CD81, TSG101) og morfologien til de isolerte hUC-MSC-sEVene ble karakterisert med henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop. De isolerte hUC-MSC-sEVs størrelse var 30-200 nm, med en partikkelkonsentrasjon på 7,75 × 10 10 partikler/ml og en proteinkonsentrasjon på80 μg/ml. Positive bånd for eksosomale markører CD9, CD81 og TSG101 ble observert. Denne studien viste at hUC-MSC-sEVs ble vellykket isolert fra hUC-MSCs betingede medium, og karakterisering viste at det isolerte produktet oppfylte kriteriene nevnt av Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
I følge MISEV 2018 er sEV ikke-replikerende lipid-dobbeltlagspartikler uten funksjonell kjerne tilstede, med en størrelse på 30-200 nm1. MSC-avledede sEV-er inneholder viktige signalmolekyler som spiller viktige roller i vevregenerering, for eksempel mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har i økende grad blitt et forsknings-“hotspot” innen regenerativ medisin og cellefri terapi. Mange studier har vist at MSC-avledede sEV-er er like effektive som MSC ved behandling av forskjellige forhold, for eksempel immunmodulering 2,3,4,5, forsterkende osteogenese 6, diabetes mellitus 7,8 eller vaskulær regenerering 9,10. Etter hvert som forsøkene i tidlig fase skrider frem, har tre hovednøkkelspørsmål i forhold til den kliniske oversettelsen av MSC-EV-er blitt fremhevet: utbyttet av elbilene, renheten til elbilene (fri for cellerester og andre biologiske forurensninger som protein og cytokiner) og integriteten til fosfolipid-dobbeltlagsmembranen til elbilene etter isolering.
Ulike metoder har blitt utviklet for å isolere sEVs, utnytte tettheten, formen, størrelsen og overflateproteinet til sEVs11. De to vanligste metodene i sEV-isolasjoner er ultrasentrifugeringsbaserte og ultrafiltreringsbaserte teknikker.
Ultrasentrifugeringsbaserte metoder regnes som gullstandardmetoder i sEVs isolasjon. To typer ultracentrifugation teknikker som vanligvis brukes er differensiell ultracentrifugation og tetthet gradient ultracentrifugation. Imidlertid resulterer ultrasentrifugeringsmetoder ofte i lavt utbytte og krever dyrt utstyr for høyhastighets ultrasentrifuge (100.000-200.000 × g)11. Videre er ultrasentrifugeringsteknikker alene ineffektive for å separere EV-subtyper (sEV og store EV), noe som resulterer i et urent sedimentlag11. Til slutt kan ultrasentrifugering av tetthetsgradient også være tidkrevende og kreve ytterligere forholdsregler som sukrosebuffertillegg for å hemme gradientskaden under akselerasjon og retardasjonstrinn12. Derfor fører ultrasentrifugering vanligvis til et relativt lavt utbytte og er ikke i stand til å diskriminere mellom forskjellige populasjoner av EV13, noe som begrenser søknaden om storskala EV-forberedelse11.
Den andre metoden for EV-isolasjon er via ultrafiltrering, som er basert på størrelsesfiltrering. Ultrafiltrering er relativt tids- og kostnadseffektivt sammenlignet med ultrasentrifugering, da det ikke innebærer dyrt utstyr eller lang saksbehandlingstid14. Derfor synes ultrafiltrering å være en mer effektiv isolasjonsteknikk enn begge de nevnte ultrasentrifugeringsmetodene. De isolerte produktene kan være mer spesifikke basert på porestørrelser og høyere utbytte15. Den ekstra kraften som påløper under filtreringsprosessen kan imidlertid føre til deformasjon eller utbrudd av elbilene16.
Det nåværende papiret foreslo en kostnads- og tidseffektiv benchtop-protokoll for isolering av MSC-avledede sEV-er for nedstrømsanalyse og terapeutiske formål. Metoden beskrevet i dette papiret kombinerte en enkel filtreringsmetode med benksentrifugering for å isolere høy avkastning og god kvalitet EV fra hUC-MSCs for nedstrømsanalyse, inkludert partikkelstørrelsesanalyse, biomarkøranalyse og elektronmikroskopisk avbildning.
Elbiler er en av de viktige undergruppene av sekretomet i MSC som spiller en avgjørende rolle under normale og patologiske prosesser. Imidlertid har sEV, med et størrelsesområde mellom 30 og 200 nm, steget som et potensielt verktøy for cellefri terapi det siste tiåret. Ulike teknikker ble utviklet for å isolere sEV-er fra MSC-er. Imidlertid har differensiell ultrasentrifugering, ultrafiltrering, polymerbasert nedbør, immunoaffinitetsfangst og mikrofluidikkbasert nedbør forskjellige fordeler og ulemper<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
Publiseringen av denne videoen ble støttet av My CytoHealth Sdn. Bhd.
40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |