Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

اختبار النفاذية الظهارية في الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64108
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2
1Morsani College of Medicine, University of South Florida, 2Department of Pediatrics, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 3Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

يفصل هذا البروتوكول إنشاء المعوية ، وهي نموذج معوي ثلاثي الأبعاد ، من الأنسجة المعوية الجنينية. تم استخدام التصوير المناعي الفلورسنت للمؤشرات الحيوية الظهارية لتوصيف النموذج. التعرض القمي لعديدات السكاريد الشحمية، وهو سم داخلي بكتيري، باستخدام تقنية الحقن المجهري يحفز النفاذية الظهارية بطريقة تعتمد على الجرعة تقاس بتسرب الدكستران الفلوري.

Abstract

تظهر الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين البشري كنموذج واعد في المختبر لدراسة الإصابات المعوية عند الأطفال الخدج. تظهر الأمعاء قطبية ، تتكون من تجويف ذو حدود قمية ، وتقاطعات ضيقة ، وطبقة خارجية بازوجانبية معرضة لوسائط النمو. تشمل عواقب الإصابات المعوية التهاب الغشاء المخاطي وزيادة النفاذية. غالبا ما يكون اختبار نفاذية الأمعاء في الأشخاص الخدج الضعفاء غير ممكن. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج معوي مشتق من أنسجة الجنين في المختبر لدراسة الإصابات المعوية عند الأطفال الخدج. يمكن استخدام المعوية لاختبار التغيرات في النفاذية الظهارية التي تنظمها بروتينات الوصلة الضيقة. في الأمعاء ، تتمايز الخلايا الجذعية المعوية إلى جميع أنواع الخلايا الظهارية وتشكل بنية ثلاثية الأبعاد على مصفوفة غشاء سفلي تفرزها خلايا ساركوما الفئران. في هذه المقالة ، نصف الطرق المستخدمة لإنشاء الأمعاء من الأنسجة المعوية الجنينية ، وتوصيف بروتينات الوصلة الضيقة المعوية مع التصوير المناعي الفلوري ، واختبار النفاذية الظهارية. نظرا لأن dysbiosis البكتيري المهيمن سالب الجرام هو عامل خطر معروف للإصابة المعوية ، فقد استخدمنا عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، وهو سم داخلي تنتجه البكتيريا سالبة الجرام ، للحث على النفاذية في الأمعاء. تم حقن الدكستران المسمى بالفلوريسين في تجويف الأمعاء ، وتم قياس تركيزات الدكستران التسلسلية التي تسربت إلى وسائط الثقافة لتحديد التغيرات في نفاذية الخلايا شبه الخلوية. أظهرت التجربة أن التعرض القمي ل LPS يحفز النفاذية الظهارية بطريقة تعتمد على التركيز. تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن dysbiosis السائد سالب الجرام يساهم في آلية الإصابة المعوية عند الأطفال الخدج.

Introduction

يتعرض الأطفال الخدج لالتهاب متكرر وطويل الأمد يعرضهم لخطر متزايد للإصابة المعوية مما يؤدي إلى إعاقة طويلة الأجل أو الوفاة1. وتواجه البحوث في هذا المجال تحديا يتمثل في محدودية القدرة على إجراء تجارب على الأطفال الخدج الضعفاء. علاوة على ذلك ، أعاق عدم وجود نماذج مناسبة الدراسة الشاملة للبيئة المعوية المبكرة2. فشلت النماذج الموجودة في المختبر وفي الجسم الحي في تمثيل البيئة المعوية البشرية المبكرة بشكل شامل. على وجه التحديد ، قد لا تشكل خطوط الخلايا الجنينية الظهارية المفردة تقاطعات ضيقة ، وتظهر النماذج الحيوانية استجابات التهابية ومناعية مختلفة عن الأطفال الخدج البشريين. مع اكتشاف إشارات Wnt كمسار أساسي في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية للسرداب المعوي والخلايا الجذعية للأنسجة Lgr5 + الجديدة ، تم إنشاء المواد العضوية المشتقة من الأنسجة المعوية مثل الأمعاء والقولون كما هو الحال في النماذج المختبرية 3،4،5. باستخدام هذه التكنولوجيا ، من الممكن إنشاء واستخدام نماذج معوية ثلاثية الأبعاد (3D) يتم تطويرها من أنسجة كاملة أو خزعة من الأمعاء لدراسة الاستجابات الظهارية للبيئة المعوية 6,7.

على النقيض من خطوط الخلايا المعوية النموذجية التي تنمو في الثقافة ، تظهر الأمعاء قطبية مع تجويف متصل ببروتينات تقاطع ضيقة8. هذا يسمح بالتعرض للحدود القاعدية في وسائط النمو ، وكذلك الحقن المجهري اللمعاني لتقييم الحدود القمي. علاوة على ذلك ، تظهر الأمعاء خصائص وراثية وفسيولوجية ومناعية مماثلة للظهارة البشرية 9,10. تسمح الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين بفحص دور الخداج في الوظيفة الظهارية. يمكن أن تشبه الخصائص الفريدة للمعوية البيئة المعوية المبكرة بشكل أوثق9. يمكن استخدام الأمعاء المشتقة من الأنسجة لاختبار سلامة التقاطع الضيق كشكل أحادي الطبقة أو كهياكل 3D مضمنة في خليط بروتين غشاء سفلي صلب. مطلوب تقنية الحقن المجهري للشكل الأخير إذا كان التعرض القمي مطلوبا. يتضمن قياس الاستجابات الظهارية في النماذج المعوية التعبير الجيني عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي ، أو المؤشرات الحيوية عن طريق المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) ، أو تقنيات التصوير المتقدمة. توفر التقنية المعروضة هنا خيارا آخر ممكنا لقياس النفاذية الإجمالية باستخدام قياس الفلورومتر.

الإصابة المعوية عند الأطفال الخدج لديها إمراض متعدد العوامل يتضمن اختلال توازن المجتمع الميكروبي في الأمعاء. يمكن أن توفر المعوية نماذج ممتازة لدراسة جوانب معينة من الأمراض المعوية المبكرة مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر الذي ينطوي على وظائف ظهارية11. تظهر الأمعاء خصائص مماثلة لأمعاء الجنين البشري10. تعريض المعوية لعديد السكاريد الشحمي (LPS) ، وهو سم داخلي تنتجه البكتيريا سالبة الجرام ، في وسائط الثقافة كتعرض بازولي يحفز التعبير الجيني الذي يمكن أن يؤدي إلى زيادة الالتهاب والنفاذية المعوية7. تهدف هذه الدراسة إلى تقييم التغيرات في النفاذية الظهارية الإجمالية بعد التعرض القمي للمنتجات البكتيرية مثل LPS. قد توفر النتائج نظرة ثاقبة على التفاعلات الميكروبية الظهارية المشاركة في التسبب في الإصابة المعوية. تتطلب الطريقة المصممة لاختبار النفاذية الإجمالية إعداد الحقن المجهري ومهارته.

Protocol

تمت الموافقة على جمع الأنسجة البشرية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة واشنطن (معرف الدراسة: STUDY380 ومعرف CR: CR3603) وأجراه مختبر أبحاث العيوب الخلقية. تم دعم مختبر أبحاث العيوب الخلقية من قبل جائزة المعاهد الوطنية للصحة رقم 5R24HD000836 من معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. تم جمع العينات من المشاركين الموافقين وإرسالها على أنها غير محددة الهوية وبدون أي معلومات صحية. تم تخزين عينات الأمعاء الدقيقة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات في دولبيكو (DPBS) وإرسالها بالبريد بين عشية وضحاها إلى مختبر الاستقبال.

1. إعداد الكاشف

ملاحظة: انظر جدول المواد للاطلاع على قائمة بالكواشف وأرقام الكتالوج؛ الأحجام الموصى بها هي للوحة من 6 آبار ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. تحضير 0.1٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) عن طريق إذابة 50 ملغ من مسحوق BSA في 50 مل من الملح المخزن بالفوسفات (PBS) مع 100 ميكروغرام / مل من البريموسين المضاد الحيوي واسع الطيف لتغطية جميع الأدوات البلاستيكية والنصائح التي تتلامس مع الأنسجة أو الأمعاء.
    1. لتغطيتها ب BSA ، ضع أطراف ماصة غير مصفاة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع ما يكفي من BSA لتغطية الأطراف ، أو أضف 1-2 مل من BSA لتغطية سطح طبق Petri ، أو املأ أنابيب مخروطية 15 مل ب BSA لمدة 20-30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  2. تحضير وسائط DPBS عن طريق خلط 50 مل من DPBS مع 100 ميكروغرام / مل بريموسين و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين. قم بإعداد هذه الوسائط مع وبدون 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين.
  3. تحضير وسائط النمو المعوية عن طريق خلط 2 مل من وسط النمو العضوي ، 100 ميكروغرام / مل بريموسين ، 10 ميكرومتر Y27632 ، و 2.5 ميكرومتر CHIR99021. اصنع وسائط جديدة يوميا وقم بتسخينها في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: عامل التخفيف ل Y27632 هو 1:250. بالنسبة إلى CHIR99021 ، قم بتخفيف محلول مخزون CHIR إلى 1:100 في الوسائط الدافئة ثم إلى 1:40 في وسائط النمو المعوية لتحقيق تخفيف 1:4000.
  4. تحضير مزيج مصفوفة الغشاء السفلي عن طريق إضافة إلى مصفوفة الغشاء السفلي المخزون 10 ميكرومتر Y27632 و 2.5 ميكرومتر CHIR99021. اصنع ما مجموعه 285 ميكرولتر من مزيج مصفوفة الغشاء السفلي النهائي بتركيز بروتين 8 ملغم / مل لبئر واحد من صفيحة من 6 آبار.
    ملاحظة: يجب أن تكون مصفوفة الغشاء السفلي باردة للبقاء في شكل سائل وسوف تتصلب في درجات حرارة أكثر دفئا. يحدد تركيز البروتين في مصفوفة الغشاء السفلي للمخزون الحجم المطلوب لجعل تركيز البروتين النهائي 8 ملغ / مل باستخدام المعادلة:
    المجلد 1 تركيز × 1 = تركيز × 2
  5. تحضير 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) عن طريق تخفيف 32٪ من مخزون PFA في PBS بنسبة 1: 8 ، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. جعل 0.5 مل لكل بئر من الأمعاء ليتم إصلاحها.
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت للحجب عن طريق إضافة مصل الماعز بنسبة 5٪ و 0.5٪ Triton X-100 في PBS. تحضير 1 مل للجسم المضاد الأول لكل بئر و 0.5 مل للجسم المضاد الإضافي لكل بئر.
    ملاحظة: استخدم المصل من نفس النوع مثل مضيف الأجسام المضادة الثانوية
  7. تحضير الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، المخففة في المخزن المؤقت المانع بالتركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة لكل جسم مضاد.
  8. تحضير 5 ميكروغرام / مل Dmidino-2-phenylindole (DAPI) عن طريق التخفيف إلى 1:200 من محلول مخزون 1 mg / mL في PBS. جعل 0.5 مل لكل بئر من الأمعاء الملطخة.
  9. تحضير 70 ٪ من الجلسرين في PBS وجعل 0.5 مل لتركيب المعوية على شرائح المجهر.
  10. تحضير 5 ملغ / مل ديكستران - FITC (فلوريسين - إيزوثيوسيانات) عن طريق تخفيف محلول المخزون 25 ملغ / مل في PBS بنسبة 1: 5. جعل 20 ميكرولتر للحقن المجهري.
  11. تحضير عديدات السكاريد الشحمية (LPS) و dextran-FITC عن طريق إعادة تشكيل مسحوق LPS في PBS إلى محلول مخزون 5 مجم / مل. تمييع محاليل المخزون من LPS والدكستران في PBS إلى 0.1 ملغ / مل و 0.5 ملغ / مل LPS و 5 ملغ / مل dextran-FITC. جعل 20 ميكرولتر للحقن المجهري.
  12. تحضير الإيثيلين جلايكول-بيس (β-أمينو إيثيل الأثير) -N,N,N',N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) عن طريق صنع محلول مخزون من 0.2 متر عن طريق إذابة مسحوق EGTA في الماء المقطر وضبط الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك (HCl). قم بإعداد تركيز اختبار يبلغ 2 مللي متر في وسائط الثقافة عن طريق إجراء تخفيف بنسبة 1:100.

2. جمع العينات

  1. بمجرد استلام العينات ، قم بإجراء عزل الخلايا الظهارية والطلاء في غضون 24 ساعة من جمع العينات.

3. طلاء الخلايا الظهارية المعوية في مصفوفة الغشاء السفلي من عينات كاملة

ملاحظة: يتبع هذا الإجراء بروتوكولات معدلة من مختبر نمذجة الأنسجة الانتقالية في جامعة ميشيغان12،13،14. استخدام وسائط النمو مع عامل Wnt عالية يعطي نتائج متسقة لإنشاء الأمعاء. بمجرد إنشاء المعوية ، استخدم نفس الوسائط مع عامل Wnt مرتفع لدفع الأمعاء إلى أشكال كروية للحقن المجهري.

  1. انقل شرائح الأمعاء إلى طبق بتري 60 مم × 15 مم مع DPBS بارد مع الأمفوتريسين وانقع لمدة 20 دقيقة على الجليد. أثناء نقع الأنسجة ، حدد المناطق (الاثني عشر أو الصائم أو الدقاق) من الأمعاء الدقيقة وقم بإزالة النسيج الضام والأوعية الدموية باستخدام الملقط والمقص. اغسل محتوى التجويف حسب الحاجة باستخدام إبرة صغيرة 23-25 جم ومحقنة سعة 3 مل دون تعطيل الظهارة.
  2. قطع شرائح الأمعاء إلى قطع 3-5 مم باستخدام مشرط ووضع 1-2 قطعة (للطلاء في بئر واحد من طبق من 6 آبار) في طبق بتري 35 مم × 15 مم يحتوي على 0.5-1 مل من وسط النمو العضوي على الجليد.
  3. باستخدام تشريح المقص الدقيق والملقط ، قم بقطع الأنبوب المعوي طوليا. استخدم طرف الملقط لكشط الخلايا الظهارية من اللفافة تحت مجهر ستيريو 10x. إزالة اللفافة ودوامة الطبق لتفتيت كتل الخلايا.
  4. استخدم طرف قطع ماصة 20 ميكرولتر لنقل الخلايا والوسائط بزيادة 5-10 ميكرولتر إلى مزيج مصفوفة الغشاء السفلي لصنع محلول 285 ميكرولتر بتركيز بروتين مصفوفة 8 ملغم / مل. Pipet صعودا وهبوطا ببطء 20x لخلط الخلايا في مصفوفة الغشاء السفلي على الجليد باستخدام طرف قطع 200 ميكرولتر.
  5. ضع خمسة شرائط سعة 50 ميكرولتر من مزيج مصفوفة الغشاء السفلي للخلية في بئر واحد من صفيحة 6 آبار تم تسخينها مسبقا محفوظة على لبنة رغوية دافئة. احتضن الصفيحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق للسماح لمصفوفة الغشاء السفلي بالبلمرة والتصلب.
  6. أضف 2 مل من وسائط النمو المعوية إلى بئر شرائط مصفوفة الغشاء السفلي الصلبة وضعها مرة أخرى داخل حاضنة زراعة الخلايا. تغيير وسائل الإعلام يوميا لتعزيز نمو الأمعاء. تحقق من تمايز الخلايا الجذعية المعوية تحت المجهر المقلوب 10x يوميا.
  7. بعد 10-14 يوما ، مرر الأمعاء إلى بئر واحد من لوحة 12 بئرا أو 6 آبار ، اعتمادا على كثافة الأمعاء. ابدأ في تغيير الوسائط كل يومين وتمر بنسبة 1: 2 كل 5-7 أيام حيث تبدأ الأمعاء في الازدهار.
    1. إزالة الخلايا التي لا تتمايز إلى الأمعاء مع طبقة مصفوفة الغشاء السفلي أثناء الممرات. قم بإنشاء مخزون مجمد من الأمعاء ذات الممر المنخفض عن طريق تجميدها في 80٪ من وسائط النمو ، و 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 10٪ من ثاني أكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) ، إذا لزم الأمر.

4. تلطيخ الفلورسنت المناعي للأمعاء

ملاحظة: تستغرق عملية التثبيت والتلطيخ 3 أيام. في هذا البروتوكول ، قمنا بإصلاح وتلطيخ النوى (DAPI) ، والعلامات الظهارية (الفيلين ، CDX2) ، والليزوزيم ، والمسين ، وبروتينات التوصيل الضيقة (كلودين 2 ، كلودين 3 ، أوكلودين ، زونولا أوكلودين-1) باستخدام بروتوكولمعدل 15. تم التقاط صور الفلورسنت بواسطة مجهر متحد البؤرة.

  1. تحديد
    ملاحظة: عادة ما تتم هذه العملية في نفس الوقت الذي يتم فيه إجراء المرور المعوي أو التجميد.
    1. ضع الصفيحة المعوية على الجليد. قم بإزالة وسائط النمو واغسل بلطف 2x باستخدام DPBS البارد.
    2. تحديد المعوية المراد إصلاحها وتلطيخها. انقلها إلى صفيحة من 12 بئرا عن طريق سحبها بعناية بطرف مقطوع 200 ميكرولتر أو باستخدام حلقة تلقيح 1 ميكرولتر. ضع المعوية في آبار منفصلة إذا كان يجب تلطيخ بأجسام مضادة مختلفة.
    3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل باستخدام طرف 200 ميكرولتر قدر الإمكان دون تعطيل الأمعاء. أضف 0.5 مل من PFA بنسبة 4٪ واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير اللوحة من حين لآخر لتسهيل انفصال الأمعاء عن مصفوفة الغشاء السفلي.
    4. فحص بشكل صارخ لتحديد انفصال الأمعاء من مصفوفة الغشاء السفلي. استنشق بعناية وتخلص من PFA السائل دون تعطيل الأمعاء. يغسل باستخدام PBS 3x لإزالة PFA وأي مصفوفة غشاء سفلي متبقية
      ملاحظة: يمكن أن يكون شفط السائل تحت مجهر ستيريو مفيدا لتجنب الأمعاء. يمكن تخزين المعوية الثابتة في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  2. حظر
    1. قم بإزالة PBS المتبقية بعناية باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، دون تعطيل الأمعاء. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المانع واحتضنه لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإزالة وتجاهل المخزن المؤقت المانع باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، مع الحرص على تجنب تعطيل الأمعاء.
  3. تلطيخ الأجسام المضادة
    1. أضف 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت المانع لكل بئر مع الأمعاء. بالنسبة للأجسام المضادة الأولية والليزوزيم ، يكون عامل التخفيف 1:100 ، وبالنسبة ل CDX2 ، يكون عامل التخفيف 1:100 ، وبالنسبة للفيلين ، يكون عامل التخفيف 1:50. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة واغسل 3x باستخدام PBS. اسمح ب 10-15 دقيقة من وقت الحضانة لكل غسلة.
    3. كرر الخطوات 4.3.1.-4.3.2. للجسم المضاد الثانوي مع عامل تخفيف 1:400.
    4. أضف 500 ميكرولتر من DAPI عند 5 ميكروغرام / مل في PBS واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل 3x باستخدام PBS ، واسمح ب 10-15 دقيقة من وقت الحضانة لكل غسلة
  4. تصاعد
    1. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS. اغسل الأمعاء الملطخة بنسبة 70٪ جلسرين 1x.
    2. ارفع المعوية خارج اللوحة باستخدام حلقة تلقيح 1 ميكرولتر أو طرف مقطوع 200 ميكرولتر وقم بتركيبها بنسبة 70٪ جلسرين على شريحة مجهر زجاجية.
    3. للحفاظ على بنية 3D من المعوية ، تأكد من وجود مسافة 0.5-1 مم بين الشريحة الزجاجية السفلية والغطاء الزجاجي. استخدم قواطع من صفائح مطاط السيليكون الرقيقة أو الغطاء الزجاجي لإنشاء مسافة بين الشريحة الزجاجية والغطاء الزجاجي. يمكن الآن تصوير الأمعاء باستخدام مجهر متحد البؤرة.

5. التحضير للحقن المجهري للأمعاء

ملاحظة: بروتوكول الحقن المجهري هو بروتوكول معدل من Hill et al.16 ليناسب الموارد والإعدادات. يجب إكمال بعض خطوات التحضير قبل بضعة أيام.

  1. إعداد إعداد الحقن المجهري
    1. قم بإعداد جهاز الحاقن الدقيق إما داخل خزانة السلامة الأحيائية أو على عداد نظيف ، اعتمادا على الهدف من التجارب ، على النحو التالي: مجهر ستيريو للعرض ، ومناور دقيق مع نوبات تحكم في المحور X و Y و Z مثبتة على حامل ثقيل بجوار المجهر ، وحامل ماصة دقيقة مثبت على ذراع micromanipulator ، وأنبوب حاقن مجهري يربط حامل الماصة الدقيقة وحقنة مع stopcock ثلاثي الاتجاهات ، ثم إلى مضخة هوائية ، ومصدر هواء حائط متصل بالمضخة (الشكل 1).
    2. تطهير جهاز الحقن المجهري بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل الاستخدام التجريبي وبعده. اختبر وضع المجهر و micromanipulator لتناسب المواصفات الفيزيائية المطلوبة ، بما في ذلك تحريك مقابض المحور لضمان وصول الماصة الدقيقة إلى العينة المستهدفة.
  2. إعداد الماصة الدقيقة
    ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات مقدما.
    1. استخدم مجتذب الماصة الدقيقة لسحب الأنابيب الشعرية الزجاجية إلى الماصات الدقيقة.
    2. تحت المجهر الاستريو ، ضع الماصة الدقيقة على حامل ماصة مجهرية أفقي (الشكل 2) ، وركز على الأطراف ، وقطع الأطراف باستخدام زوج من المقصات الدقيقة أثناء النظر من خلال عدسات المجهر. قم بإعداد حوالي 10-15 ماصة دقيقة بحجم طرف مماثل لكل تجربة.
    3. اختبر حجم الطرف عن طريق سحب 0.5-1 ميكرولتر من السائل واحسب عدد المضخات اللازمة لتفريغ الحجم. اختبر عدة أحجام تلميحات للعثور على الحجم المناسب للتجربة. حجم الطرف المناسب يخرج حوالي 10-30 نانولتر لكل مضخة.
    4. قم بتخزين الماصات الدقيقة الزجاجية المقطوعة في صندوق أو أنبوب نظيف دون إتلاف الأطراف.
      ملاحظة: تتوفر الماصات الدقيقة المقطوعة مسبقا تجاريا.
  3. إعداد الأمعاء
    1. ضع طبقا من الأمعاء الكبيرة والكروية في الغالب على الجليد. استبدل وسط النمو القديم بوسط جديد.
    2. افصل نقاط مصفوفة الغشاء السفلي بلطف عن اللوحة باستخدام رافع الخلايا. قم بتدوير نقاط الجل من جانب إلى آخر على الجليد لتفتيت مصفوفة الغشاء السفلي دون إزعاج الأمعاء.
    3. حدد حوالي 10-15 معوية كروية مع طرف ماصة مقطوع 20 ميكرولتر تحت مجهر ستيريو وأضف إلى مصفوفة الغشاء السفلي لصنع 285 ميكرولتر من خليط تركيز البروتين 8 ملغ / مل.
    4. ضع لأعلى ولأسفل بلطف مع طرف قطع 200 ميكرولتر لخلط الأمعاء دون كسرها. لوحة خمس نقاط هلام 50 ميكرولتر في وسط طبق بتري دائري 35 مم × 10 مم من زراعة الخلايا أو واحد بأبعاد مماثلة.
    5. احتضان نقاط هلام الأمعاء عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتصلب. ثم أضف 1 مل من وسط النمو الطازج إلى الطبق. احتضان الأمعاء لمدة 2-3 أيام على الأقل لتحقيق الاستقرار وحتى تصل الأمعاء إلى حجم مناسب من 0.5-1 ميكرولتر.
      ملاحظة: من المهم أن يكون لديك طبق ذو جدار منخفض لتسهيل الوصول إلى الأمعاء وقطر صغير لحجم أقل من وسط النمو.
  4. الحقن المجهري للديكستران-FITC والمواد المختبرة
    1. أوقف تشغيل الحاجز الثلاثي الاتجاهات إلى المضخة الهوائية. املأ الماصة الدقيقة بالمواد المحقونة ، في هذه الحالة dextran-FITC مع أو بدون LPS.
    2. تحضير طبق بتري مغطى بشريط من الفيلم الشفاف. ضع نقطتين إلى أربع نقاط 1 ميكرولتر من المواد المحقونة على الفيلم.
    3. استخدم micromanipulator لدفع طرف الماصة الدقيقة إلى داخل السائل مباشرة ولكن فوق الفيلم تحت تصور مجهر ستيريو. اسحب المحقنة برفق لسحب المواد المحقونة إلى الماصة الدقيقة.
    4. املأ الماصة الدقيقة ب 2-4 ميكرولتر من المواد المحقونة وادفع على المحقنة لإزالة أي هواء عند طرف الماصة الدقيقة. افحص عمود المواد المحقونة في الماصة الدقيقة للتأكد من عدم وجود جيب هوائي. سجل حجم المواد المحقونة التي انسحبت داخل الماصة الدقيقة.
      ملاحظة: السائل مرئي بلون أخضر بسبب dextran-FITC.
    5. قم بتشغيل مصدر الهواء المتصل بالمضخة الهوائية ، والتي توفر ضغط هواء يبلغ حوالي 60 رطل لكل بوصة مربعة. قم بتشغيل المضخة واضبط مدة المضخة على 10-15 مللي ثانية. أدر مفتاح التوقف على المحقنة لفتح الخط من المضخة إلى الماصة الدقيقة.
      ملاحظة: تسمح مدة المضخة الأطول بإطلاق المزيد من المواد لكل مضخة. يوصى باستخدام نفس مدة المضخة والماصات الدقيقة ذات أحجام أطراف مماثلة للتجربة بأكملها لتقدير حجم الحقن.
    6. قم بإزالة المعوية من حاضنة زراعة الخلايا ووضع الأطباق فوق لبنة رغوية دافئة في حاوية مغطاة للحد من التعرض للضوء بعد الحقن المجهري.
    7. ضع طبق بتري مع المعوية تحت المجهر الاستريو وحرك مقابض micromanipulator لوضع طرف الماصة الدقيقة بزاوية 35 درجة -45 درجة تقريبا على السطح الأفقي (الشكل 3). وهذا يتطلب بعض الممارسة مقدما.
    8. تصور ورسم خريطة للمعوية في كل طبق بتري تحت المجهر لوضع خطة لحقن حوالي 3-5 معوية كروية لكل طبق.
    9. بمجرد أن يكون طرف الماصة الدقيقة قريبا من سطح السائل ، انظر إلى عدسات المجهر لدفع الطرف نحو الأمعاء المستهدفة.
    10. ثقب الأمعاء بطرف الماصة الدقيقة عن طريق تطوير مقبض المحور z باستخدام حركة بطيئة دقيقة. سوف يتراجع الجدار المعوي وينبثق مرة أخرى بمجرد أن يمر الطرف عبر سطح الأمعاء ، وعند هذه النقطة يجب أن يتوقف التقدم.
    11. اضغط على دواسة المضخة بقدم واحدة واملأ الأمعاء بمحلول dextran-FITC الأخضر حتى يتم توسيعه قليلا. سجل عدد المضخات لحساب حجم الضخ وتركيز الدكستران.
    12. اسحب طرف الماصة الدقيقة بعد الانتهاء من الحقن المجهري وانتقل إلى المعوية التالية. مع الممارسة ، يمكن أن تسير العملية بسلاسة.
      1. إذا انكسر الطرف ، فاستبدله بماصة صغيرة أخرى بحجم طرف مماثل. اسحب كمية كافية من المواد المحقونة لجميع المعوية في نفس مجموعة التعرض وقم بتغيير الماصة الدقيقة بين المواد المحقونة لتجنب التلوث المتبادل.
    13. ضع الطبق المعوي المحقون تحت الغطاء لتجنب التعرض للضوء.
  5. جمع وقياس Dextran-FITC
    1. بعد إجراء الحقن المجهري ، قم بإزالة وسائط الثقافة على الفور. يغسل بوسائط نمو جديدة 2x لإزالة أي بقايا ديكستران-FITC. أضف وسائط جديدة وسجل الوقت كوقت 0 بعد الحقن المجهري.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى شخص ثان لتنفيذ هذه الخطوة دون تعطيل عملية الحقن المجهري.
    2. اجمع 200 ميكرولتر من وسائط الاستزراع في أنبوب ميكروفوجي غير شفاف سعة 0.5 مل ثم استبدل وسائط الاستزراع التي تمت إزالتها بنفس الحجم من وسائط النمو الجديدة عند 1 ساعة و 2 ساعة و 4 ساعات و 6 ساعات و 8 ساعات و 10 ساعات و 12 ساعة بعد الحقن المجهري.
      ملاحظة: قد يختلف الفاصل الزمني حسب التجربة. مع التعرض القاعدي الجانبي ، يجب أن تحتوي الوسائط البديلة على التعرض بنفس التركيز.
    3. قم بتخزين وسائط الاستزراع التي تم جمعها عند 4 درجات مئوية وقياس تركيز الدكستران في غضون 24 ساعة. قم بتخزين الوسائط المتبقية عند -80 درجة مئوية لإجراء تحليلات أخرى. في نهاية جمع وسائط الثقافة ، قم بحصاد الأمعاء لاستخراج الحمض النووي الريبي أو التصوير ، إذا لزم الأمر.
    4. قم بقياس تركيزات dextran-FITC باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية. قم ببناء منحنى قياسي لكل لوحة باستخدام التخفيفات التسلسلية وعن طريق تركيب خط انحدار خطي كما هو موضح في الشكل 4.
    5. تصحيح الامتصاص للحجم الذي تمت إزالته من وسائط الثقافة التي تحتوي على ديكستران والتي تم استبدالها بوسائط نمو جديدة بدون ديكستران على النحو التالي: إزالة 200 ميكرولتر من 2 مل من وسائط الثقافة هي 10٪ من حيث الحجم.
      الامتصاص المصحح عند 2 ساعة = (الامتصاص عند 1 ساعة × 10٪) + الامتصاص المقاس عند 2 ساعة
      امتصاص أول وسيط مصحح لا يحتاج إلى تصحيح. ثم احسب تركيز الدكستران من قيمة الامتصاص المصححة باستخدام معادلة المنحنى القياسية.
    6. للتطبيع ، اقسم تركيز الدكستران على إجمالي عدد المضخات لكل طبق بتري ثم اضرب في أكبر عدد إجمالي من المضخات لكل طبق.
      ملاحظة: يتم إجراء جميع التعرضات في ثلاثة أفخم (ثلاثة أطباق بتري لكل تعرض مع 3-5 معوية مجهرية لكل طبق). تتم مقارنة القيم المتوسطة للثلاثة أضعاف بين التعرضات باستخدام اختبار t للطالب.

Representative Results

أنشأنا خط خلايا معوية من أنسجة الجنين اللفائفي المتبرع بها وفقا للبروتوكولات المعدلة التي قدمها المتعاونون معنا في مختبر نمذجة الأنسجة الانتقالية بجامعة ميشيغان12. اختبار خط الخلايا المعوية سلبي لعدوى الميكوبلازما . تلطخت المعوية إيجابية للفيلين ، CDX2 ، الليزوزيم ، الموسين ، كلودين ، أوكلودين ، وزونولا أوكلودين 1 (الشكل 5) ، مما يؤكد أصلها الظهاري للأمعاء الدقيقة. تم حقن الأمعاء الدقيقة مع 4 kDa dextran-FITC عند 5 ملغ / مل في PBS (الشكل 6). وكانت حالات التعرض للاختبار عبارة عن LPS بتركيزات مختلفة، 0.1 ملغم/مل و0.5 ملغم/مل، مختلطة مع دكستران-FITC للتعرض القمي. كعنصر تحكم إيجابي ، استخدمنا 2 mM EGTA وأضفناه إلى وسائط الثقافة في 4 ساعات بعد الحقن المجهري للديكستران. EGTA هو مخلب الكالسيوم الذي يزيد من نفاذية التقاطعات الضيقة. تم حقن الضوابط السلبية بالميكرو باستخدام dextran-FITC في PBS وحده. وبالنسبة للتعرض القاعدي، كان للوسائط البديلة لجمع وسائط الثقافة التسلسلية نفس تركيز التعرض (أي 2 مللي متر EGTA). أظهرت النتائج زيادة واضحة في تركيز الدكستران في وسائل الإعلام الثقافية بعد إضافة EGTA مقارنة بالتحكم السلبي ، PBS. أدى التعرض القمي ل LPS إلى زيادة نفاذية الدكستران بدءا من حوالي 8 ساعات بعد التعرض بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 7).

Figure 1
الشكل 1: إعداد الحاقن الدقيق. يتضمن الإعداد مجهرا ستيريو ، ومناولا دقيقا مثبتا على حامل مغناطيسي على لوحة قاعدة فولاذية ثقيلة ، وحامل ماصة دقيقة متصل بحقنة مع ستوك ثلاثي الاتجاهات ، ومضخة هوائية. يوفر مصدر هواء الجدار ضغط الهواء ، والذي تنظمه المضخة لتوليد حجم مضخة ثابت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: حامل الماصة الدقيقة الأفقي. تم تصميم هذه المنصة البلاستيكية لعقد الماصة الدقيقة بعد سحب الأنبوب الشعري الزجاجي لقطع الطرف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد المواقع الماصة الدقيقة. زاوية 35 ° -45 ° مثالية لحقن المعوية الموجودة في منتصف طبق Petri. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: منحنى ديكستران القياسي. تم بناء المنحنى مع امتصاص الفلورسنت من 10 تخفيفات تسلسلية من ديكستران في نسخ. تم تركيب خط انحدار خطي لإنشاء معادلة انحدار. أشرطة الخطأ هي SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: المؤشرات الحيوية الفلورية للأمعاء. DAPI لبقعة النواة أزرق. يتم عرض المؤشرات الحيوية التالية: (A) الفيلين ، (B) CDX2 ، (C) الليزوزيم ، (D) mucin، (E) claudin ، (F) الانسداد ، و (G) zonula-occluden 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الأمعاء في مراحل مختلفة . (أ) الأمعاء في عمر 7-10 أيام صغيرة وذات جدار سميك. (B) معوي جاهز للحقن المجهري بحجم كبير ، تجويف ، وجدار تفكير ، و (C) ديكستران - FITC فلورسنت داخل معوي بعد 2 أيام من الحقن المجهري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: نفاذية dextran-FITC بعد الحقن المجهري . (أ) كانت مستويات الدكستران المقاسة في الوسائط أعلى بعد إضافة EGTA مقارنة ب PBS. (ب) أدى الحقن الدقيق 0.5 ملغم/مل LPS إلى تسرب أكبر للديكستران من تجويف الأمعاء إلى الوسط مقارنة بالحقن الدقيق 0.1 ملغم/مل LPS ابتداء من 8 ساعات بعد الحقن. * قيمة p < 0.05 ، أشرطة الخطأ هي SEM ، n = 3 ، تم استخدام اختبار t للطالب لحساب الدلالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يفصل هذا البروتوكول إنشاء الأمعاء من الأنسجة المعوية الجنينية ، بالإضافة إلى توصيف النموذج مع تلطيخ الفلورسنت المناعي واختبار النفاذية الظهارية. تم اختبار نفاذية الأمعاء باستخدام تقنية الحقن المجهري وقياسات الدورة الزمنية التسلسلية لتركيز dextran-FITC المتسرب في وسائط الثقافة. حداثة هذا البروتوكول هي التعرض القمي الذي يشبه إلى حد كبير فسيولوجيا الأمعاء البشرية مقارنة بالتعرض القاعدي الجانبي في وسائل الإعلام الثقافية7. في الدراسات السابقة ، استخدم هيل وآخرون التصوير التسلسلي وحساب شدة التألق بمرور الوقت16. قام آريس وآخرون بتعريض الغشاء القاعدي الجانبي لنموذج ظهاري إلى LPS ثم قارنوا نمط التعبير الجيني الخلوي7. وبالمقارنة، نستخدم التعرض القمي للكواشف المختبرة ثم ندرس التغيرات المحتملة في النفاذية الإجمالية عن طريق قياس التركيزات التسلسلية للديكستران المتسرب في وسائط الثقافة. تسمح طريقتنا أيضا بإجراء تحليل مقارن تسلسلي للسيتوكينات التي تنتجها الخلايا الظهارية في وسائط الثقافة والتعبير الجيني عن طريق جمع الحمض النووي الريبوزي المرسال الخلوي. يستخدم LPS بشكل شائع لدراسة الإصابات المعوية في النماذج الحيوانية والمختبرية بسبب قدرته على تحفيز النفاذية والالتهابات 7,17. عندما تم اختبار LPS في هذا النموذج ، تم تمييز النفاذية الظهارية من خلال تركيز التعرض. يمكن توسيع هذا البروتوكول لدراسة أمراض الأمراض الأخرى باستخدام مواد مختلفة عن طريق الحقن الدقيق وقياسات النتائج.

تشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول إنشاء الأمعاء من أنسجة الأمعاء الجنينية ، وتوصيف الأمعاء ، وتقنية الحقن المجهري. تعتمد سلامة هذه الدراسة على أخذ عينات دقيقة من الخلايا. استخدام المعالم التشريحية والأوعية الدموية مفيد لضمان اختيار الخلايا المعوية الصغيرة. نظرا للنمو القوي والتمايز بين الخلايا الجذعية المعوية الجنينية ، ليس من الضروري إجراء مكثف لعزل الخلايا الجذعية عن الخلايا الظهارية الأخرى. بعد إنشاء المعوية ، من المهم تأكيد خصائص النموذج عن طريق تلطيخ البروتينات وعلامات الخلايا. في هذا البروتوكول ، تم تلطيخ الأمعاء للخلايا المعوية باستخدام الفيلين و CDX2 ، وخلايا Paneth باستخدام الليزوزيم ، وخلايا الكأس باستخدام mucin، وجميع الخلايا الموجودة داخل ظهارة الأمعاء الدقيقة18،19،20. على النقيض من خطوط الخلية الواحدة التقليدية التي تعرض نوعا واحدا من الخلايا ، تحدد المعوية جميع أنواع الخلايا من الخلايا الجذعية السلفية المعوية8. يمكن تعديل جزء التلطيخ من هذا البروتوكول للعلامات الخلوية المحددة ذات الاهتمام. من الأمور الحاسمة لموثوقية هذا البروتوكول تقنية الحقن المجهري. يمكن التحقق من اتساق أطراف الماصة الدقيقة عن طريق قياس الحجم لكل مضخة باستخدام محلول dextran-FITC وتصور قطر الأطراف تحت المجهر. نظرا لخطر التلوث ، لا يمكن استخدام نفس الماصة الدقيقة لأكثر من تعرض واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يتأثر شكل ونمو الأمعاء بمحتويات وسائط نموها. وجدنا أن المعوية الكروية بدلا من القرنبيط على شكل قرنبيط قدمت نماذج أفضل للحقن المجهري. قد يكون الشكل الكروي ناتجا عن عامل Wnt أكبر في الوسائط21.

يعتمد هذا البروتوكول إلى حد كبير على مهارة المؤدي في الحقن المجهري لتقليل الاختلافات ، خاصة في القياسات الحساسة للوقت. يمكن تقليل الاختلافات من خلال وجود نفس الأداء المتمرس مع تقنيات متسقة ، واستخدام نفس أصل الخلية لتجنب التباين الجيني ، والاختبار في نفس الممر لإزالة تحيز النضج ، وتنمية الخلايا في نفس النوع من الوسائط لتمايز الخلايا المماثلة. قد تحفز مكونات وسائط النمو تمايزا متفاوتا للخلايا الجذعية في المختبر بدلا من بيئة الجسم الحي . على سبيل المثال ، في الجسم الحي ، لا يتم التعبير عن الليزوزيم حتى الأسابيع 22-24 من تطور الحمل عندما تتشكل خلايا Paneth وتصبح وظيفية22. ومع ذلك ، تمكنا من اكتشاف الليزوزيم في أمعائنا المعوية التي تم إنشاؤها من أمعاء الجنين لمدة 10 أسابيع. يمكن لهذه الطريقة أن تحد من عدد التعرضات التي تم اختبارها في وقت واحد بسبب المهارة التقنية العالية المطلوبة للحقن المجهري. يمكن أن يؤثر تسرب الدكستران من ثقب ثقب الحقن المجهري على تقييم النفاذية. للقضاء على هذا التأثير ، يوصى بالغسل الثلاثي مباشرة بعد الحقن المجهري لإزالة الدكستران المتبقي من الإجراء. يجب قياس تركيز الدكستران في الوسائط كل ساعة لمدة 4-6 ساعات بعد الحقن المجهري. يجب استبعاد التجارب التي تحتوي على ارتفاع كبير في تركيز الدكستران في غضون 2-4 ساعات بعد الحقن من التحليل النهائي.

هذه الطريقة لها العديد من المزايا. يتطلب تكلفة أقل وموارد أقل مقارنة بالطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء على transwell. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيعه إلى التعرض الآخر مثل البكتيريا الحية أو الفيروسات لدراسة التفاعل الأولي بين ميكروبات الأمعاء والظهارة. يمكن أن يحافظ التجويف المغلق للمعوية على نمو مستقر للبكتيريا الحية المحقونة بالميكرو دون تلوث وسائط النمو13. على عكس الطبقة الأحادية التي تتعرض لوسائط النمو وأكسجين الحضانة ، فإن التجويف المغلق هو مساحة ضيقة ومعزولة. لا يسمح التجويف المغلق بأي اتصال بوسائط النمو ومحتوى أكسجين مضيء أقل بمرور الوقت مع نمو البكتيريا الحية13.

استخدام الأنسجة المعوية الجنينية يصور بدقة أكبر الظهارة المعوية للأطفال الخدج بالمقارنة مع الخلايا الجذعية المعوية البالغة أو النماذج الحيوانية7. علاوة على ذلك ، فإن قطبية الأمعاء تسمح بكل من التعرض القمي والقاعدي والقياسات23. تشكل الأمعاء تجويفا مغلقا بتركيز أكسجين أقل ، والذي يحاكي بشكل أوثق تركيز الأوكسجين في الأمعاء24. وعلى النقيض من البروتوكولات16 الأكثر تقدما من الناحية التكنولوجية، فإن استخدام قياسات الوسائط الإجمالية يسمح بزيادة إمكانية الوصول إلى هذه التقنية. أظهرت التجربة أن التسرب الظهاري يمكن أن يحدث عن طريق التعرض القمي ل LPS ويعتمد على التركيز. نظرا لأن هذه الطريقة تفحص التغيرات في تركيز الدكستران المتسرب ، فمن المفيد اكتشاف التغيرات الوظيفية الإجمالية في التقاطعات الضيقة. يمكن أن يكمل جمع الحمض النووي الريبي الرسول وتسلسل الأمعاء المكشوفة وتحليل اللطخة الغربية تحليل التغيرات الوظيفية الإجمالية. يدرس هذا النموذج سلامة الظهارة المعوية في نظام يشبه إلى حد كبير البيئة المبكرة ، وبالتالي ، يمكن استخدامه للحصول على فهم أفضل للإصابات المعوية المبكرة وغيرها من أمراض الأمراض.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتور إيان غلاس والعاملين في مختبر أبحاث العيوب الخلقية في جامعة واشنطن على مشاركة أنسجة الجنين. كما نشكر الدكتور مايكل دام والدكتور جيسون سبنس في مختبر نمذجة الأنسجة الانتقالية في جامعة ميشيغان على دعمهما وتوجيههما الذي لا نهاية لهما طوال العملية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin 250 uL/mL Gibco 15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal Biogenex MU392A-5UC
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) abcam ab53032
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) abcam ab15102
Anti-LYZ antibody produced in rabbit Millipore Sigma HPA066182-100UL
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 Santa Cruz sc-515032
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal Biogenex NUA42-5UC
Bovine Serum Albumin (BSA) Millipore Sigma A8806
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates  USA Scientific Inc 50-754-1395
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates  USA Scientific Inc 50-754-1560
Centrifuge with 15 mL tube buckets Eppendorf  05-413-110
CHIR 99021 Tocris Bioscience 4423
Confocal microscope  Olympus FV1200 N/A Or a similar microscope
Conical centrifuge tubes, 15 ml Falcon 05-527-90
Cover glass for microscope slides Fisher Scientific 12-544-DP
Disposable scalpels Mopec 22-444-272
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) Fisher Scientific 62248
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) Fisher Scientific AAJ67802K2
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) Millipore Sigma E8145-10G
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa Millipore Sigma 46944
Fuorescence microplate reader Agilent BioTek Synergy HTX
Gentamicin 50 mg/mL Gibco 15-750-060
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) A-M systems 626500
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 Fisher Scientific A32742
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Fisher Scientific A32731
Goat Serum Fisher Scientific 16210064
ImageJ software NIH N/A https://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell  Technologies  06010
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Millipore Sigma L4391-1MG
Magnetic stand World Precision Instruments  M10
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL  Corning 354234  protein concentration > 9 mg/mL preferably
Micro forceps Fisher Scientific 13-820-078
Micro scissors Fisher Scientific 08-953-1B
Micromanipulator World Precision Instruments  M3301
Micropipette puller World Precision Instruments  SU-P1000 Or a similar equipment
Microscope slides Fisher Scientific 22-034486
Occludin Polyclonal Antibody Fisher Scientific  71-1500
Paraformaldehyde 32% aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES RT 15714
Petri Dishes, 35x10 mm Fisher Scientific 150318
Petri Dishes, 60x15 mm Fisher Scientific 12-565-94
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific 10010031
PicoPump foot switch World Precision Instruments 3260
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL Fisher Scientific 21-402-47
Pipette tips, non-filtered, 20 uL Fisher Scientific 21-402-41
Pipette tips, non-filtered, 200 uL Fisher Scientific 21-236-54
Pneumatic PicoPump system World Precision Instruments SYS-PV820 or a similar picopump system
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial InvivoGen ant-pm-1
Steel base plate World Precision Instruments 5052
Stereo microscope Zeiss stemi 350 Or a similar microscope
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks Sonoco 03-531-53
Triton X-100 Millipore Sigma T8787
Wall air supply N/A N/A
Y-27632 dihydrochloride Tocris Bioscience 1254
ZO-1 Polyclonal Antibody Fisher Scientific 61-7300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
  2. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  3. Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  7. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  8. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  9. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  10. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  11. Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
  12. Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
  13. Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132 (2017).
  14. Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  15. Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
  16. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
  17. Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
  18. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
  19. Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
  20. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  21. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  22. Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587 (2020).
  23. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
  24. Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).

Tags

الطب، العدد 184،
اختبار النفاذية الظهارية في الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Llerena, A., Urmi, S., Amin, J.,… More

Llerena, A., Urmi, S., Amin, J., Cha, B., Ho, T. T. Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids. J. Vis. Exp. (184), e64108, doi:10.3791/64108 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter