Summary
该协议详细介绍了从胎儿肠道组织建立肠样,一种三维肠道模型。上皮生物标志物的免疫荧光成像用于模型表征。脂多糖(一种细菌内毒素)的顶端暴露,使用显微注射技术以剂量依赖性方式诱导上皮通透性,通过荧光葡聚糖的泄漏来测量。
Abstract
人类胎儿组织来源的类肠正在成为研究早产儿肠道损伤的有前途的 体外 模型。肠样肠表现出极性,包括具有顶端边界的管腔、紧密的连接和暴露于生长培养基的基底外层。肠道损伤的后果包括粘膜炎症和通透性增加。在脆弱的早产儿受试者中检测肠道通透性通常是不可行的。因此,需要一个 体外 胎儿组织来源的肠道模型来研究早产儿的肠道损伤。肠样可用于测试由紧密连接蛋白调节的上皮通透性的变化。在肠样细胞中,肠道干细胞分化成所有上皮细胞类型,并在小鼠肉瘤细胞分泌的基底膜基质上形成三维结构。在本文中,我们描述了用于从胎儿肠道组织建立肠样蛋白的方法,用免疫荧光成像表征肠紧密连接蛋白,并测试上皮通透性。由于革兰氏阴性显性细菌生态失调是肠损伤的已知危险因素,我们使用脂多糖(LPS),一种由革兰氏阴性细菌产生的内毒素,来诱导肠通透性。将荧光素标记的葡聚糖显微注射到肠腔中,并测量泄漏到培养基中的系列葡聚糖浓度以量化细胞旁通透性的变化。实验表明,顶端暴露于LPS以浓度依赖性方式诱导上皮通透性。这些发现支持革兰氏阴性显性遗传失调有助于早产儿肠道损伤机制的假设。
Introduction
早产儿暴露于频繁和长期的炎症中,这使他们面临肠道损伤的风险增加,导致长期残疾或死亡1。这一领域的研究受到对脆弱早产儿进行实验的能力有限的挑战。此外,缺乏合适的模型阻碍了对早产肠道环境的全面研究2。现有的体外和体内模型都未能全面代表人类早产肠道环境。具体来说,单个上皮胎儿细胞系可能不会形成紧密的连接,并且动物模型表现出与人类早产儿不同的炎症和免疫反应。随着Wnt信号传导作为肠隐窝干细胞和新型Lgr5+组织干细胞增殖和分化的主要途径的发现,肠组织来源的类器官(如肠类和结肠类)被建立为体外模型3,4,5。使用这项技术,可以创建和利用从整个组织或肠道活检开发的三维(3D)肠样模型来研究上皮对肠道环境的反应6,7。
与培养物中生长的典型肠道细胞系相比,类肠表现出极性,其腔由紧密连接蛋白连接8。这允许暴露于生长培养基中的基底外侧边界,以及腔内显微注射以评估顶端边界。此外,类肠表现出与人类上皮相似的遗传、生理和免疫特征9,10。胎儿组织来源的类肠可以检查早产儿对上皮功能的作用。类肠的独特特征可以更接近早产肠道环境9。组织来源的肠样蛋白可用于测试单层形式的紧密连接完整性或嵌入固化基底膜蛋白混合物中的 3D 结构。如果需要顶端暴露,后一种形式需要显微注射技术。肠样模型中上皮反应的测量包括通过RNA测序进行基因表达,通过酶联免疫测定(ELISA)或高级成像技术进行生物标志物。这里介绍的技术为使用荧光测定法测量总通透性提供了另一种可行的选择。
早产儿肠道损伤具有多因素发病机制,包括肠道微生物群落失衡。类肠可以为研究早产肠道疾病的某些方面提供极好的模型,例如涉及上皮功能的坏死性小肠结肠炎11。肠样蛋白表现出与人胎儿肠道相似的特征10。将肠样暴露在培养基中的脂多糖(LPS)(一种由革兰氏阴性菌产生的内毒素)中,作为基底外侧暴露诱导基因表达,从而导致炎症和肠道通透性增加7。本研究旨在评估顶端暴露于LPS等细菌产物后上皮通透性的总体变化。研究结果可能为肠道损伤发病机制中涉及的微生物-上皮相互作用提供见解。用于测试总渗透性的方法需要显微注射装置和技能。
Protocol
人体组织采集由华盛顿大学机构审查委员会批准(研究编号:STUDY380和CR ID:CR3603),并由出生缺陷研究实验室执行。出生缺陷研究实验室得到了Eunice Kennedy Shriver国家儿童健康与人类发展研究所的NIH奖励编号5R24HD000836的支持。标本是从同意的参与者那里收集的,并作为去识别化且没有任何健康信息发送。将小肠标本储存在冰冷的Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中,并在一夜之间邮寄到接收实验室。
1. 试剂制备
注意:有关试剂和目录号的列表,请参阅 材料表 ;除非另有说明,否则推荐的体积适用于 6 孔板。
- 制备 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA),将 50 mg BSA 粉末与 50 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与 100 μg/mL 广谱抗生素普罗莫星溶解,以涂覆与组织或肠样接触的所有塑料器皿和吸头。
- 要涂上 BSA,请将未过滤的移液管吸头放入具有足够 BSA 以覆盖吸头的 50 mL 锥形管中,加入 1-2 mL BSA 以覆盖培养皿表面,或在使用前在室温下用 BSA 填充 15 mL 锥形管至少 20-30 分钟。
- 通过将 50 mL DPBS 与 100 μg/mL 伯莫星和 50 μg/mL 庆大霉素混合来制备 DPBS 培养基。制备含有和不含 2.5 μg/mL 两性霉素的培养基。
- 通过混合 2 mL 类器官生长培养基、100 μg/mL 伯莫星、10 μM Y27632 和 2.5 μM CHIR99021 制备肠样生长培养基。每天制作新鲜培养基,并在37°C的细胞培养箱中加热。
注:Y27632的稀释系数为1:250。对于 CHIR99021,将 CHIR 储备溶液在温热培养基中稀释至 1:100,然后在肠样生长培养基中稀释至 1:40,以达到 1:4000 稀释度。 - 通过将10μM Y27632和2.5μM CHIR99021添加到原液基底膜基质中来制备基底膜基质混合物。在 6 孔板的一个孔中,以 8 mg/mL 蛋白质浓度总共制备 285 μL 的最终基底膜基质混合物。
注意:基底膜基质需要冰冷才能保持液态,并在较温暖的温度下凝固。基底膜基质原液的蛋白质浓度使用以下公式确定使最终蛋白质浓度达到 8 mg/mL 所需的体积:
第 1 卷 × 浓度 1 = 第 2 卷×浓度 2 - 通过将 PBS 中的 32% 原液 PFA 按 1:8 稀释来制备 4% 多聚甲醛 (PFA),并在室温下储存。为要固定的类肠的每个孔制作 0.5 mL。
- 通过在PBS中加入5%山羊血清和0.5%Triton X-100来制备封闭缓冲液。每孔制备 1 mL 用于第一个抗体,每孔准备 0.5 mL 用于其他抗体。
注意:使用与二抗宿主相同物种的血清 - 制备一抗和二抗,在封闭缓冲液中以制造商为每种抗体推荐的浓度稀释。
- 从 PBS 中的 1 mg/mL 储备溶液稀释至 1:200,制备 5 μg/mL 二氨基-2-苯基吲哚 (DAPI)。每孔制备 0.5 mL 染色的类肠。
- 在PBS中制备70%甘油,并制成0.5 mL用于将肠样体安装到显微镜载玻片上。
- 通过将 25 mg/mL 储备溶液在 PBS 中以 1:5 的比例稀释来制备 5 mg/mL 葡聚糖-FITC(荧光素-异硫氰酸酯)。制作 20 μL 用于显微注射。
- 通过将 PBS 中的 LPS 粉末重新配制成 5 mg/mL 储备溶液来制备脂多糖 (LPS) 和葡聚糖-FITC。将 PBS 中的 LPS 和葡聚糖储备溶液稀释至 0.1 mg/mL 和 0.5 mg/mL LPS 和 5 mg/mL 葡聚糖-FITC。制作 20 μL 用于显微注射。
- 通过将EGTA粉末溶解在蒸馏水中并使用盐酸(HCl)将pH调节至约8,制备乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA),方法是制备0.2M的储备溶液。通过进行1:100稀释在培养基中制备2mM的测试浓度。
2. 标本采集
- 收到样品后,在标本收集后24小时内进行上皮细胞分离和铺板。
3.整个标本基底膜基质中的肠上皮细胞镀层
注意:此过程遵循密歇根大学转化组织建模实验室12,13,14的修改方案。使用具有高Wnt因子的生长培养基可产生一致的肠样建立结果。一旦肠样建立,使用具有高Wnt因子的相同培养基将肠驱动到球形进行显微注射。
- 将肠段转移到带有两性霉素的冰冷DPBS的60mm x 15mm培养皿中,并在冰上浸泡20分钟。当组织浸泡时,识别小肠的区域(十二指肠、空肠或回肠),并用镊子和剪刀取出结缔组织和血管。根据需要使用23-25 G小针头和3 mL注射器冲洗出管腔内容物,而不会破坏上皮。
- 使用手术刀将肠段切成 3-5 毫米的碎片,并将 1-2 块(用于接种在 6 孔板的一个孔中)放入含有 0.5-1 mL 类器官生长培养基的 35 mm x 15 mm 培养皿中冰上。
- 使用解剖的微型剪刀和镊子,纵向切割肠管。使用镊子尖端在10倍体视显微镜下从筋膜上刮下上皮细胞。取下筋膜并旋转培养皿以分解细胞团块。
- 使用 20 μL 移液器切割吸头以 5-10 μL 的增量将细胞和培养基转移到基底膜基质混合物中,以制备 8 mg/mL 基质蛋白浓度的 285 μL 溶液。缓慢上下移液 20 倍,使用 200 μL 切割吸头在冰上混合基底膜基质中的细胞。
- 将五条50 μL细胞基底膜基质混合物置于一个预热的6孔板的孔中,该孔保持在温暖的泡沫砖上。将板在细胞培养箱中于37°C和5%CO2 孵育10分钟,以使基底膜基质聚合并硬化。
- 将 2 mL 肠样生长培养基加入固化的基底膜基质条的孔中,并放回细胞培养箱内。每天更换培养基以促进肠样生长。每天在10倍倒置显微镜下检查肠道干细胞分化。
- 10-14 天后,根据肠密度,将肠样蛋白传递到 12 孔或 6 孔板的一个孔中。开始每隔一天更换培养基,每 5-7 天以 1:2 的比例通过,因为肠样开始茁壮成长。
- 在传代过程中用基底膜基质层去除未分化为肠样的细胞。如果需要,通过在 80% 生长培养基、10% 胎牛血清 (FBS) 和 10% 二甲基亚砜 (DMSO) 中冷冻低传代肠类肠道来创建冷冻原液。
4.肠类免疫荧光染色
注意:固定和染色过程需要3天。在该协议中,我们使用修改的方案固定和染色细胞核(DAPI),上皮标志物(绒毛,CDX2),溶菌酶,粘蛋白和紧密连接蛋白(claudin 2,claudin 3,occludin,zonula occluden-1)。荧光图像由共聚焦显微镜拍摄。
- 定影
注意:此过程通常与肠通过或冷冻程序同时进行。- 将肠样板放在冰上。取出生长培养基,用冷DPBS轻轻洗涤2次。
- 确定要固定和染色的肠样。用 200 μL 切割吸头小心地移液或使用 1 μL 接种环将它们转移到 12 孔板中。如果要用不同的抗体染色,则将肠样放入单独的孔中。
- 用 200 μL 吸头尽可能多地去除液体,而不会破坏肠样。加入 0.5 mL 的 4% PFA,并在室温下孵育 30 分钟。偶尔旋转平板,以促进肠样从基底膜基质中分离。
- 粗略检查以确定肠样从基底膜基质中分离。小心吸出并丢弃液体PFA,而不会破坏肠样。用PBS 3x洗涤以去除PFA和任何残留的基底膜基质
注意:在体视显微镜下吸出液体有助于避免肠样。固定肠可以在4°C的PBS中储存长达1个月。
- 阻塞
- 用 200 μL 移液器小心去除残留的 PBS,而不会破坏肠样。加入0.5mL封闭缓冲液,在室温下孵育2小时。
- 用 200 μL 移液器取出并丢弃封闭缓冲液,小心避免破坏肠道样。
- 抗体染色
- 在封闭缓冲液中加入 500 μL 一抗到每个具有类肠的孔中。对于一抗和溶菌酶,稀释因子为1:100,CDX2的稀释因子为1:100,绒毛的稀释因子为1:50。在4°C孵育过夜。
- 第二天,取出抗体溶液并用PBS洗涤3次。每次洗涤允许10-15分钟的孵育时间。
- 重复步骤 4.3.1.-4.3.2。用于稀释因子为1:400的二抗。
- 在 PBS 中以 5 μg/mL 加入 500 μL DAPI,并在室温下孵育 15 分钟。孵育后,用PBS洗涤3次,每次洗涤留出10-15分钟的孵育时间
- 安装
- 尽可能多地去除 PBS。用70%甘油1x洗涤染色的肠类。
- 使用 1 μL 接种环或切割的 200 μL 吸头将肠样蛋白从平板中取出,并用 70% 甘油安装到玻璃显微镜载玻片上。
- 为了保持肠样的3D结构,请确保底部载玻片和盖玻片之间有0.5-1毫米的空间。使用薄硅橡胶板或玻璃盖玻片的切口在载玻片和盖玻片之间留出空间。肠样现在可以用共聚焦显微镜成像。
5.肠溶显微注射制剂
注意:显微注射方案是Hill等人16 的修改方案,以适应资源和设置。一些准备步骤需要提前几天完成。
- 设置显微注射设置
- 根据实验目的,将微量注射器装置设置在生物安全柜内或干净的柜台上,如下所示:用于观察的体视显微镜,带有X轴,Y轴和Z轴控制头的显微操纵器安装在显微镜旁边的重型支架上,安装在显微操纵臂上的微量移液器支架,连接微量移液器支架和带有三通旋塞阀的注射器的显微注射器管, 然后连接到气动泵,并与泵连接的壁式气源(图1)。
- 在实验使用之前和之后用70%乙醇对显微注射装置进行消毒。测试显微镜和显微操纵器的位置,以适应所需的物理规格,包括移动轴旋钮以确保微量移液器可以到达目标标本。
- 微量移液器的制备
注意:请提前执行这些步骤。- 使用微量移液器拉拔器将玻璃毛细管拉入微量移液器中。
- 在体视显微镜下,将微量移液器放在水平微量移液器支架上(图2),聚焦在尖端上,并在通过显微镜目镜观察时使用一把微型剪刀切割尖端。每次实验准备约10-15个吸头尺寸相似的微量移液器。
- 通过拉起 0.5-1 μL 液体来测试吸头尺寸,并计算清空体积所需的泵数。测试几种吸头尺寸,为实验找到合适的尺寸。适当的吸头尺寸可喷射每个泵约 10-30 nL 的体积。
- 将切割好的玻璃微量移液器存放在干净的盒子或管中,而不会损坏吸头。
注意:预切微量移液器已上市。
- 肠样制剂
- 将一盘大部分大而球形的小肠放在冰上。用新鲜培养基替换旧的生长培养基。
- 用细胞提升器轻轻地将基底膜基质点从板上解离。在冰上左右旋转凝胶点,在不干扰肠样的情况下分解基底膜基质。
- 在体视显微镜下用切开的 20 μL 移液器吸头选择大约 10-15 个球形肠样,并添加到基底膜基质中,制成 285 μL 8 mg/mL 蛋白质浓度混合物。
- 用切好的 200 μL 吸头轻轻上下移液,以混合肠样而不破坏它们。将五个 50 μL 凝胶点接种在圆形 35 mm x 10 mm 细胞培养皿或具有类似尺寸的培养皿的中心。
- 将肠样凝胶点在37°C孵育10分钟以固化。然后,向培养皿中加入 1 mL 新鲜生长培养基。将类肠孵育至少 2-3 天以稳定,直到类肠达到 0.5-1 μL 的适当大小。
注意:重要的是要有一个带有矮壁的培养皿,以便于接近肠样,并且直径小,以减少生长培养基的体积。
- 葡聚糖-FITC 和测试材料的显微注射
- 关闭气动泵的三通旋塞阀。用注入的材料填充微量移液器,在这种情况下,含或不带LPS的葡聚糖-FITC。
- 准备一个用透明薄膜条覆盖的培养皿。将两到四个 1 μL 注入材料点放在薄膜上。
- 在体视显微镜的可视化下,使用显微操纵器将微量移液器的尖端驱动到液体内部但薄膜上方。轻轻拉动注射器,将注射的材料撤回微量移液器中。
- 用 2-4 μL 注入材料填充微量移液器并推动注射器以去除微量移液器尖端的任何空气。检查微量移液器中注入的材料柱,确保没有气穴。记录在微量移液器内退出的注射材料的体积。
注意:由于葡聚糖-FITC的成分,液体呈绿色可见。 - 打开连接到气动泵的气源,该气压约为 60 psi。打开泵并将泵持续时间设置为 10-15 毫秒。转动注射器上的旋塞阀以打开从泵到微量移液器的管路。
注意:泵的持续时间越长,每个泵可以释放更多的材料。建议在整个实验中使用相同的泵持续时间和具有相似吸头尺寸的微量移液器,以估计进样体积。 - 从细胞培养箱中取出肠样,并将培养皿放在有盖容器中的温泡沫砖上,以限制显微注射后的光照。
- 将带有肠样的培养皿放在体视显微镜下,并移动显微操纵器旋钮,将微量移液器的尖端与水平表面成约35°-45°角(图3)。这需要提前进行一些练习。
- 在显微镜下可视化并绘制每个培养皿中的肠样,以制定每个培养皿注射约3-5个球形肠的计划。
- 一旦微量移液器的尖端靠近液体表面,观察显微镜目镜,将尖端推进到目标肠样。
- 通过使用精确的慢动作推进z轴旋钮,用微量移液器尖端刺穿肠样肠。一旦尖端穿过肠表面,肠壁就会凹陷并弹出,此时应该停止前进。
- 用一只脚轻敲泵踏板,用绿色的葡聚糖-FITC溶液填充肠,直到它略微膨胀。记录泵的次数以计算泵送体积和葡聚糖浓度。
- 完成显微注射后撤回微量移液器的尖端,然后移动到下一个肠样。通过练习,这个过程可以顺利进行。
- 如果吸头断裂,请更换另一个具有类似吸头尺寸的微量移液器。为同一暴露组中的所有肠类物质拉出足够体积的注射材料,并在注射材料之间更换微量移液器以避免交叉污染。
- 将注射的小肠培养皿盖在盖子下,以避免光照。
- 葡聚糖-FITC 收集和测量
- 显微注射程序后,立即取出培养基。用新鲜生长培养基洗涤2倍以去除任何残留的葡聚糖-FITC清洗。加入新培养基并将时间记录为显微注射后的时间0。
注意:您可能需要第二个人来执行此步骤,而不会中断显微注射过程。 - 在不透明的 0.5 mL 微量离心管中收集 200 μL 培养基,然后在显微注射后 1 小时、2 小时、4 小时、6 小时、8 小时、10 小时和 12 小时用相同体积的新鲜生长培养基替换去除的培养基。
注意:时间间隔可能因实验而异。对于基底外侧暴露,替代培养基应包含相同浓度的暴露。 - 将收集的培养基储存在4°C,并在24小时内测量葡聚糖浓度。将剩余培养基储存在-80°C以进行其他分析。在培养基收集结束时,如果需要,收获肠样用于RNA提取或成像。
- 用荧光酶标仪测量葡聚糖-FITC浓度。使用连续稀释液和拟合线性回归线为每个板构建标准曲线,如图 4所示。
- 校正用不含葡聚糖的新鲜生长培养基替换的含有葡聚糖的去除体积的吸光度,如下所示:从 2 mL 培养基中去除 200 μL 的体积为 10%。
2小时校正吸光度=(1小时x 10%的吸光度)+2小时测量的吸光度
第一次校正培养基的吸光度不需要校正。然后,使用标准曲线方程从校正后的吸光度值计算葡聚糖浓度。 - 为了归一化,将葡聚糖浓度除以每个培养皿的泵总数,然后乘以每个培养皿的最大泵总数。
注意:所有暴露一式三份进行(每次暴露三个培养皿,每培养皿3-5显微注射肠)。使用学生 t 检验在暴露之间比较一式三份的平均值。
- 显微注射程序后,立即取出培养基。用新鲜生长培养基洗涤2倍以去除任何残留的葡聚糖-FITC清洗。加入新培养基并将时间记录为显微注射后的时间0。
Representative Results
我们按照密歇根大学转化组织建模实验室12的合作者提供的修改方案,从捐赠的回肠胎儿组织中建立了肠样细胞系。肠样细胞系的 支原体 感染检测呈阴性。小肠染色呈绒毛、CDX2、溶菌酶、粘蛋白、克莱丁、闭塞素和闭锁带 1 阳性(图 5),证实了它们的小肠上皮起源。在PBS中以5mg / mL的4 kDa右旋糖酐-FITC显微注射肠样(图6)。测试暴露是不同浓度的LPS,0.1 mg / mL和0.5 mg / mL,与葡聚糖-FITC混合用于顶点暴露。作为阳性对照,我们使用2 mM EGTA,并在显微注射葡聚糖后4小时将其添加到培养基中。EGTA是一种钙螯合剂,可增加紧密连接的渗透性。阴性对照仅在PBS中用葡聚糖-FITC显微注射。对于基底外侧暴露,用于连续培养基收集的替代培养基具有相同的暴露浓度(即2mM EGTA)。结果表明,与阴性对照PBS相比,添加EGTA后培养基中的葡聚糖浓度明显增加。LPS的顶点暴露以浓度依赖性方式在暴露后约8小时开始诱导右旋糖酐的更高渗透性(图7)。
图 1:微量注射器设置。 该装置包括体视显微镜、安装在重型钢底板上磁性支架上的显微操纵器、连接到带有三通旋塞阀的注射器的微量移液器支架以及气动泵。壁式空气供应提供气压,由泵调节以产生一致的泵体积。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:水平微量移液器支架。 该塑料平台设计用于在拉动玻璃毛细管以切割尖端后保持微量移液器。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:微量移液器定位。 35°-45°的角度非常适合注射位于培养皿中间的肠样。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:葡聚糖标准曲线。 曲线是用10个系列稀释的葡聚糖重复的荧光吸光度构建的。拟合线性回归线以生成回归方程。误差线为 SEM。 请点击此处查看此图的大图。
图5:肠样的荧光生物标志物。 细胞核染色的 DAPI 为蓝色。显示了以下生物标志物:(A)绒毛,(B)CDX2,(C)溶菌酶,(D)粘蛋白,(E)claudin,(F)闭塞和(G)带状 - 闭塞1。 请点击此处查看此图的大图。
图6:不同阶段的肠样 。 (A)7-10日龄的小肠小肠,壁厚。(B)准备显微注射的肠样,具有大尺寸,管腔和思维壁,以及(C)显微注射后2天肠内荧光葡聚糖-FITC内。 请点击此处查看此图的大图。
图7:显微注射后葡聚糖-FITC的渗透性 。 (A)与PBS相比,添加EGTA后,培养基中测得的葡聚糖水平更高。(B)显微注射0.5mg / mL LPS诱导的葡聚糖从肠腔泄漏到培养基中比显微注射0.1mg / mL LPS在注射后8小时开始。*p 值< 0.05,误差线为 SEM,n = 3,学生 t 检验用于计算显著性。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
该协议详细介绍了胎儿肠道组织中肠样的建立,以及免疫荧光染色和上皮通透性测试的模型表征。使用显微注射技术和培养基中泄漏的葡聚糖-FITC浓度的连续时程测量测试肠的通透性。该方案的新颖之处在于,与培养基中的基底外侧暴露相比,顶端暴露更接近人类肠道生理学7。在以前的研究中,Hill等人利用连续成像和随时间推移的荧光强度计算16。Ares等人将上皮模型的基底外侧膜暴露于LPS,然后比较细胞基因表达模式7。相比之下,我们使用测试试剂的顶点暴露,然后通过测量培养基中泄漏的葡聚糖的连续浓度来检查总渗透性的潜在变化。我们的方法还允许通过收集细胞mRNA对培养基中上皮细胞产生的细胞因子和基因表达进行连续比较分析。LPS因其诱导通透性和炎症的能力而常用于研究动物和 体外 模型中的肠道损伤7,17。当在该模型中测试LPS时,上皮通透性通过暴露浓度来区分。该协议可以扩展到使用不同的显微注射材料和结果测量来研究其他疾病病理。
该方案中的关键步骤包括从胎儿肠道组织建立肠样、肠样表征和显微注射技术。这项研究的完整性取决于准确的细胞采样。使用解剖标志和血管有助于确保小肠细胞的选择。由于胎儿肠道干细胞的生长和分化健壮,因此不需要从其他上皮细胞中分离干细胞的广泛程序。建立肠样蛋白后,通过蛋白质和细胞标志物染色来确认模型的特征非常重要。在该协议中,使用绒毛和CDX2对肠细胞,使用溶菌酶对Paneth细胞和使用粘蛋白对杯状细胞进行肠细胞染色,所有细胞均在小肠上皮18,19,20内发现。与显示一种细胞类型的传统单细胞系相比,类肠从肠道祖细胞中建立所有细胞类型8。该协议的染色部分可以针对感兴趣的特定细胞标志物进行修改。对于该协议的可靠性至关重要的是显微注射技术。通过使用葡聚糖-FITC溶液测量每个泵的体积并在显微镜下可视化吸头的直径,可以验证微量移液器吸头的一致性。由于存在污染风险,同一微量移液器不能用于多次暴露。此外,肠样的形状和生长会受到其生长培养基内容物的影响。我们发现球形而不是花椰菜形肠为显微注射提供了更好的模型。球形可以由介质中更大的Wnt因子诱导21。
该协议在很大程度上取决于执行者在显微注射方面的技能,以减少变化,特别是在时间敏感的测量中。通过让具有相同经验的执行者具有一致的技术,使用相同的细胞来源以避免遗传变异,在同一通道进行测试以消除成熟偏差,以及在同一类型的培养基中培养细胞以进行相似的细胞分化,可以最大限度地减少变异。生长培养基的组分可能在 体外 而不是 体内 环境中诱导干细胞的不同分化。例如, 在体内,溶菌酶直到妊娠发育的第22-24周才表达,此时潘氏细胞形成并变得有功能22。然而,我们能够在从10周胎儿肠道建立的肠中检测到溶菌酶。由于显微注射所需的高技术技能,这种方法可以限制一次测试的曝光次数。微量注射穿刺孔的葡聚糖泄漏会影响渗透性的评估。为了消除这种影响,建议在显微注射后立即进行三次洗涤,以去除手术中残留的葡聚糖。显微注射后4-6小时应每小时测量培养基中的葡聚糖浓度。注射后2-4小时内右旋糖酐浓度显着升高的实验应从最终分析中排除。
这种方法有几个优点。与Transwell上的肠源性单层相比,它需要更低的成本和资源。此外,它可以扩展到其他暴露,如活细菌或病毒,以研究肠道微生物和上皮之间的初始相互作用。肠样的封闭腔可以保持显微注射活细菌的稳定生长,而不会污染生长培养基13。与暴露于生长培养基和孵育氧气的单层不同,封闭的腔是一个紧密、孤立的空间。封闭的管腔允许不与生长培养基通信,并且随着活细菌生长,管腔氧含量随着时间的推移而降低13。
与成人肠道干细胞或动物模型相比,使用胎儿肠道组织更准确地描绘了早产儿的肠上皮7。此外,肠样的极性允许顶端和基底外侧暴露和测量23。肠形成具有较低氧合浓度的封闭腔,其更接近于模拟肠道的氧合浓度24。与技术更先进的协议16相比,使用粗大介质测量可以提高该技术的可访问性。实验表明,LPS的顶端暴露可诱发上皮渗漏,且具有浓度依赖性。由于该方法检查右旋糖酐泄漏浓度的变化,因此可用于检测紧密连接处的粗大功能变化。暴露肠的信使RNA收集和测序以及蛋白质印迹分析可以补充对大体功能变化的分析。该模型研究与早产环境高度相似的系统中的肠上皮完整性,因此可用于更好地了解早产肠损伤和其他疾病病理。
Disclosures
所有作者都声明他们没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Ian Glass博士和华盛顿大学出生缺陷研究实验室的工作人员分享胎儿组织。我们还要感谢密歇根大学转化组织建模实验室的Michael Dame博士和Jason Spence博士在整个过程中给予的无尽支持和指导。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Wall air supply | N/A | N/A | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
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