Summary
פרוטוקול זה מפרט את התבססותם של אנטרואידים, מודל מעיים תלת-ממדי, מרקמת המעי העוברית. הדמיה אימונופלואורסצנטית של סמנים ביולוגיים אפיתליאליים שימשה לאפיון מודלים. חשיפה אפית של ליפופוליסכרידים, אנדוטוקסין חיידקי, באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה המושרה חדירות אפיתל באופן תלוי מינון שנמדד על ידי דליפה של דקסטרן פלואורסצנטי.
Abstract
אנטרואידים אנושיים שמקורם ברקמות עובריות מתגלים כמודל מבטיח במבחנה לחקר פגיעות מעיים בפגים. האנטרוידים מפגינים קוטביות, המורכבת מלומן עם גבול אפיקלי, צמתים הדוקים ושכבה חיצונית בזולטרלית החשופה למדיית צמיחה. ההשלכות של פציעות מעיים כוללות דלקת רירית וחדירות מוגברת. בדיקת חדירות מעיים בנבדקים אנושיים פגים פגיעים היא לעתים קרובות לא אפשרית. לפיכך, יש צורך במודל מעיים שמקורו ברקמת עובר חוץ גופית כדי לחקור פגיעות מעיים בפגים. ניתן להשתמש באנטרוידים כדי לבדוק שינויים בחדירות אפיתל המווסתת על ידי חלבוני צומת הדוקים. באנטרואידים, תאי גזע מעיים מתמיינים לכל סוגי תאי האפיתל ויוצרים מבנה תלת-ממדי על מטריצת קרום מרתף המופרשת על ידי תאי סרקומה של עכברים. במאמר זה נתאר את השיטות המשמשות לביסוס אנטרואידים מרקמת המעי העוברית, לאפיון חלבוני הצומת הצמודים האנטרואידיים עם הדמיה אימונופלואורסצנטית, ולבדיקת חדירות אפיתל. מכיוון שדיסביוזיס חיידקי דומיננטי גראם-שלילי הוא גורם סיכון ידוע לפגיעה במעיים, השתמשנו בליפופוליסכריד (LPS), אנדוטוקסין המיוצר על-ידי חיידקים גראם-שליליים, כדי לגרום לחדירות באנטרואידים. דקסטרן עם תווית פלואורסצין הוזרק ללומן האנטרואידי, וריכוזי דקסטרן סדרתיים שדלפו למדיית התרבית נמדדו כדי לכמת את השינויים בחדירות העל-תאית. הניסוי הראה כי חשיפה אפיקלית ל-LPS גורמת לחדירות אפיתל באופן תלוי ריכוז. ממצאים אלה תומכים בהשערה כי דיסביוזיס דומיננטי גראם שלילי תורם למנגנון של פגיעה במעיים אצל פגים.
Introduction
פגים חשופים לדלקת תכופה וממושכת המעמידה אותם בסיכון מוגבר לפגיעה במעיים וכתוצאה מכך לנכות ארוכת טווח או למוות1. המחקר בתחום זה מאותגר על ידי היכולת המוגבלת לערוך ניסויים על פגים פגיעים. יתר על כן, מחסור במודלים מתאימים פגע במחקר המקיף של סביבת המעיים המוקדמת2. מודלים קיימים של in vitro ו- in vivo לא הצליחו לייצג באופן מקיף את סביבת המעי האנושית המוקדמת. באופן ספציפי, קווי תאי עובר אפיתל בודדים עשויים שלא ליצור צמתים הדוקים, ומודלים של בעלי חיים מפגינים תגובות דלקתיות ואימונולוגיות שונות מאשר פגים אנושיים. עם גילוי איתות ה-Wnt כמסלול ראשוני בהתרבות והתמיינות של תאי גזע קריפטה במעיים ותאי גזע חדשניים של רקמת Lgr5+, אורגנואידים שמקורם ברקמות מעיים כגון אנטרואידים וקולונואידים נקבעו כמודלים במבחנה 3,4,5. באמצעות טכנולוגיה זו ניתן ליצור ולהשתמש במודלים אנטרואידיים תלת-ממדיים (3D) המפותחים מרקמה שלמה או ביופסיה של המעי כדי לחקור תגובות אפיתל לסביבת המעי 6,7.
בניגוד לקווי תאי מעיים טיפוסיים הגדלים בתרבית, אנטרוידים מפגינים קוטביות עם לומן המחובר על ידי חלבוני צומת הדוקים8. זה מאפשר חשיפה לגבול הבזולטרלי במדיית הגידול, כמו גם מיקרו-הזרקה לומינלית להערכת הגבול האפיקלי. יתר על כן, אנטרואידים מציגים מאפיינים גנטיים, פיזיולוגיים ואימונולוגיים דומים לאלה של האפיתל האנושי 9,10. אנטרוידים שמקורם ברקמת העובר מאפשרים בחינה של תפקיד הפגות על תפקוד האפיתל. המאפיינים הייחודיים של אנטרוידים יכולים להידמות יותר לסביבת המעיים המוקדמת9. ניתן להשתמש באנטרוידים שמקורם ברקמות כדי לבדוק את שלמות הצומת ההדוק כצורה חד-שכבתית או כמבנים תלת-ממדיים המוטבעים בתערובת חלבונים של קרום ממברנת מרתף מוצקה. טכניקת מיקרו-הזרקה נדרשת לצורה האחרונה אם רוצים חשיפה אפית. מדידת תגובות אפיתל במודלים אנטרואידיים כוללת ביטוי גנים על ידי ריצוף RNA, סמנים ביולוגיים על ידי אימונואסאי הקשור לאנזים (ELISA), או טכניקות הדמיה מתקדמות. הטכניקה המוצגת כאן מספקת אפשרות אפשרית נוספת למדידת חדירות ברוטו עם פלואורומטריה.
לפגיעה במעיים אצל פגים יש פתוגנזה רב-גורמית הכוללת את חוסר האיזון של הקהילה המיקרוביאלית של המעיים. אנטרואידים יכולים לספק מודלים מצוינים לחקר היבטים מסוימים של מחלות מעיים מוקדמות כגון דלקת מעיים נמקית הכוללת פונקציות אפיתל11. אנטרוידים מציגים מאפיינים דומים לאלה של המעי העוברי האנושי10. חשיפת אנטרוידים לליפופוליסכריד (LPS), אנדוטוקסין המיוצר על ידי חיידקים גראם שליליים, במדיית התרבית כחשיפה בזולטרלית גורמת לביטוי גנים שיכול להוביל לדלקת מוגברת ולחדירות מעיים7. מחקר זה נועד להעריך את השינויים בחדירות אפיתל ברוטו לאחר חשיפה אפיקלית למוצרים חיידקיים כגון LPS. התוצאות עשויות לספק תובנה לגבי יחסי הגומלין בין מיקרוב לאפיתל המעורבים בפתוגנזה של פגיעה במעיים. השיטה שנועדה לבדוק חדירות ברוטו דורשת הגדרת מיקרו הזרקה ומיומנות.
Protocol
איסוף הרקמות האנושיות אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת וושינגטון (מזהה מחקר: STUDY380 ו- CR ID: CR3603) ובוצע על ידי המעבדה לחקר מומים מולדים. המעבדה לחקר מומים מולדים נתמכה על ידי פרס NIH מספר 5R24HD000836 מהמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר. הדגימות נאספו מהמשתתפים שהסכימו לכך ונשלחו ללא זיהוי וללא כל מידע בריאותי. דגימות המעי הדק אוחסנו בתמיסת מלח מאוחסנת בפוספטים (DPBS) של דולבקו הקרה כקרח, ונשלחו במשך הלילה למעבדה המקבלת.
1. הכנת מגיב
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של ריאגנטים ומספרים קטלוגיים; הכרכים המומלצים הם לצלחת של 6 בארות, אלא אם כן צוין אחרת.
- יש להכין אלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1% על-ידי המסת 50 מ"ג של אבקת BSA ב-50 מ"ל של תמיסת מלח עם מאגר פוספט (PBS) עם 100 מיקרוגרם/מ"ל של אנטיביוטיקה פרימוצין רחבת טווח כדי לצפות את כל כלי הפלסטיק והקצוות שבאים במגע עם רקמות או אנטרואידים.
- כדי לצפות ב-BSA, הניחו קצוות פיפט לא מסוננים בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם מספיק BSA כדי לכסות את הקצוות, הוסיפו 1-2 מ"ל של BSA כדי לכסות את משטח צלחת פטרי, או מלאו 15 מ"ל צינורות חרוטיים ב-BSA למשך 20-30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- הכן את מדיית ה-DPBS על-ידי ערבוב של 50 מ"ל של DPBS עם 100 מיקרוגרם/מ"ל פרימוצין ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין. הכן מדיה זו עם ובלי 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין.
- הכן מדיית גידול אנטרואידית על ידי ערבוב 2 מ"ל של מדיום גידול אורגנואידים, 100 מיקרוגרם / מ"ל פרימוצין, 10 מיקרומטר Y27632 ו- 2.5 מיקרומטר CHIR99021. הכינו מדיה טרייה מדי יום וחממו אותה באינקובטור של תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: מקדם הדילול עבור Y27632 הוא 1:250. עבור CHIR99021, דלל את פתרון מלאי CHIR ל- 1:100 במדיה חמה ולאחר מכן ל- 1:40 במדיית צמיחה אנטרואידית כדי להשיג דילול של 1:4000. - הכן את תערובת המטריצה של ממברנת המרתף על ידי הוספה למלאי של מטריצת ממברנת המרתף 10 μM Y27632 ו- 2.5 μM CHIR99021. הכינו סך של 285 מיקרו-ליטר מתערובת מטריצת קרום המרתף הסופית בריכוז חלבון של 8 מ"ג/מ"ל עבור באר אחת של צלחת בת 6 בארות.
הערה: מטריצת קרום המרתף צריכה להיות קרה כקרח כדי להישאר בצורה נוזלית ותתמצק בטמפרטורות חמות יותר. ריכוז החלבון של מטריצת קרום מרתף המניות קובע את הנפח הנדרש ליצירת ריכוז חלבון סופי של 8 מ"ג/מ"ל באמצעות המשוואה:
כרך 1 × ריכוז 1 = כרך 2 × ריכוז 2 - יש להכין 4% פרפורמלדהיד (PFA) על ידי דילול 32% PFA ב-PBS ב-1:8, ולאחסן בטמפרטורת החדר. הפוך 0.5 מ"ל עבור כל באר של enteroids להיות קבוע.
- הכן מאגר חסימה על ידי הוספת 5% סרום עיזים ו-0.5% טריטון X-100 ב-PBS. הכינו 1 מ"ל לנוגדן הראשון לכל באר ו-0.5 מ"ל לנוגדן הנוסף לכל באר.
הערה: יש להשתמש בסרום מאותו המין שבו נמצא המארח של הנוגדנים המשניים - הכינו נוגדנים ראשוניים ומשניים, מדוללים בחסימת חיץ בריכוז המומלץ על ידי היצרן לכל נוגדן.
- יש להכין 5 מיקרוגרם/מ"ל דמידינו-2-פנילינדול (DAPI) על-ידי דילול ל-1:200 מתמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS. לעשות 0.5 מ"ל לכל באר של אנטרואידים מוכתמים.
- הכינו 70% גליצרול ב-PBS והכינו 0.5 מ"ל להרכבת האנטרואידים על שקופיות מיקרוסקופ.
- הכן 5 מ"ג/מ"ל דקסטרון-FITC (פלואורסצאין-איזותיוציאנט) על ידי דילול תמיסת המלאי של 25 מ"ג/מ"ל ב-PBS ביחס של 1:5. הכינו 20 מיקרו-ליטר למיקרו-הזרקה.
- הכינו ליפופוליסכרידים (LPS) ודקסטרון-FITC על ידי שחזור אבקת ה-LPS ב-PBS לתמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל. יש לדלל את תמיסות המלאי של LPS ו-dextran ב-PBS ל-0.1 מ"ג/מ"ל ול-LPS של 0.5 מ"ג/מ"ל ול-5 מ"ג/מ"ל דקסטרן-FITC. הכינו 20 מיקרו-ליטר למיקרו-הזרקה.
- הכן אתילן גליקול-ביס(β-אמינואתיל אתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA) על ידי יצירת תמיסת מלאי של 0.2 M על ידי המסת אבקת EGTA במים מזוקקים והתאמת ה-pH לכ-8 באמצעות חומצה הידרוכלורית (HCl). הכן ריכוז בדיקה של 2 mM במדיה תרבותית על ידי ביצוע דילול 1:100.
2. אוסף דגימות
- לאחר קבלת הדגימות, יש לבצע בידוד וציפוי של תאי אפיתל בטווח של 24 שעות מאיסוף הדגימות.
3. ציפוי תאי אפיתל מעיים במטריצת קרום מרתף מדגימות שלמות
הערה: הליך זה תואם לפרוטוקולים ששונו מהמעבדה למידול רקמות תרגומיות באוניברסיטת מישיגן12,13,14. שימוש במדיית צמיחה עם מקדם Wnt גבוה מניב תוצאות עקביות עבור הקמה אנטרואידית. לאחר התבססות האנטרואידים, השתמש באותה מדיה עם גורם Wnt גבוה כדי להניע את האנטרואידים לצורות כדוריות עבור מיקרו הזרקה.
- מעבירים את מקטעי המעי לצלחת פטרי בגודל 60 מ"מ על 15 מ"מ עם DPBS קרים כקרח עם אמפוטריצין ומשרים במשך 20 דקות על קרח. בזמן שהרקמה נספגת, זהה את האזורים (תריסריון, ג'ג'ונום או איליאום) של המעי הדק והסר את רקמת החיבור וכלי הדם באמצעות מלקחיים ומספריים. יש לשטוף את תכולת הלומן לפי הצורך באמצעות מחט קטנה של 23-25 גרם ומזרק 3 מ"ל מבלי לשבש את האפיתל.
- חותכים את מקטעי המעי לחתיכות 3-5 מ"מ באמצעות אזמל ומניחים 1-2 חתיכות (לציפוי בבאר אחת של צלחת 6 בארות) בצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 15 מ"מ המכילה 0.5-1 מ"ל של מדיום גידול אורגנואידים על קרח.
- באמצעות ניתוח מיקרו מספריים ומלקחיים, לחתוך את צינור המעי לאורך. השתמש בקצה המלקחיים כדי לגרד את תאי האפיתל מהחיתולית תחת מיקרוסקופ סטריאו 10x. הסר את החיתולית ומערבב את המנה כדי לשבור את גושי התאים.
- השתמש בקצה חיתוך פיפטה של 20 μL כדי להעביר את התאים והמדיה במרווחים של 5-10 μL לתערובת מטריצת קרום המרתף כדי ליצור תמיסה של 285 μL בריכוז חלבון מטריצה של 8 מ"ג/מ"ל. צניחה למעלה ולמטה באיטיות של פי 20 כדי לערבב תאים במטריצת קרום המרתף על קרח באמצעות קצה חיתוך של 200 μL.
- מניחים חמש רצועות של 50 μL של תערובת מטריצת קרום מרתף התא בבאר אחת של צלחת 6 מחוממת מראש שנשמרה על לבנה קצף חמה. דגירה של הצלחת באינקובטור תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 10 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר ולהתקשות.
- הוסף 2 מ"ל של מדיית הצמיחה האנטרואידית לתוך הבאר של רצועות מטריצת קרום המרתף המתמצקת והניח בחזרה בתוך אינקובטור תרבית התא. שנה את המדיה מדי יום כדי להגביר את הצמיחה האנטרואידית. בדוק אם יש התמיינות של תאי גזע מעיים תחת מיקרוסקופ הפוך פי 10 מדי יום.
- לאחר 10-14 ימים, להעביר את האנטרוידים לתוך באר אחת של צלחת 12-well או 6-well, בהתאם צפיפות enteroid. התחל לשנות את המדיה כל יומיים ולעבור ביחס של 1:2 כל 5-7 ימים כאשר האנטרוידים מתחילים לשגשג.
- הסר את התאים שאינם מתמיינים לאנטרוידים עם שכבת המטריצה של קרום המרתף במהלך המעברים. צור מלאי קפוא של אנטרוידים עם מעבר נמוך על ידי הקפאתם ב-80% מדיית גדילה, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO), במידת הצורך.
4. צביעה אימונופלואורסצנטית של אנטרואידים
הערה: תהליך התיקון וההכתמה אורך 3 ימים. בפרוטוקול זה תיקנו והוכתמנו גרעינים (DAPI), סמני אפיתל (villin, CDX2), ליזוזימה, מוצין וחלבוני צומת הדוקים (claudin 2, claudin 3, occludin, zonula occluden-1) באמצעות פרוטוקול שונה15. תמונות פלואורסצנטיות צולמו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי.
- תיקון
הערה: תהליך זה נעשה בדרך כלל במקביל למעבר האנטרואיד או להליך ההקפאה.- מניחים את צלחת האנטרואיד על קרח. הסר את מדיית הצמיחה ושטוף בעדינות 2x עם DPBS קר.
- זהה את האנטרוידים שיש לתקן ולהכתים. העבירו אותם לצלחת של 12 בארות על ידי ניקודם בזהירות עם קצה חתך של 200 μL או באמצעות לולאת חיסון של 1 μL. מניחים אנטרואידים בבארות נפרדות אם יש לבצע צביעה בנוגדנים שונים.
- הסר כמה שיותר נוזלים עם קצה של 200 μL מבלי להפריע לאנטרואידים. מוסיפים 0.5 מ"ל של 4% PFA ומדגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו את הצלחת מדי פעם כדי להקל על ניתוק האנטרוידים ממטריצת קרום המרתף.
- בחן באופן גס כדי לקבוע את הניתוק של האנטרואידים ממטריצת קרום המרתף. שאפו בזהירות והשליכו את ה- PFA הנוזלי מבלי לשבש את האנטרואידים. יש לשטוף עם PBS 3x כדי להסיר PFA וכל מטריצת קרום מרתף שיורית
הערה: שאיפת הנוזל תחת מיקרוסקופ סטריאו יכולה לעזור להימנע מאנטרואידים. אנטרואידים קבועים ניתן לאחסן PBS ב 4 °C (64 °F) עד 1 חודש.
- חסימת
- הסר בזהירות PBS שיורי עם פיפטה 200 μL, מבלי להפריע את enteroids. הוסיפו 0.5 מ"ל של חיץ חוסם ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
- הסר והשלך את המאגר החוסם עם פיפטה 200 μL, נזהר כדי למנוע הפרעה אנטרואידים.
- צביעת נוגדנים
- הוסף 500 μL של נוגדן ראשוני בחסימת חיץ לכל באר עם אנטרואידים. עבור נוגדנים ראשוניים ועבור ליזוזים, מקדם הדילול הוא 1:100, עבור CDX2 מקדם הדילול הוא 1:100, ועבור villin גורם הדילול הוא 1:50. לדגור ב 4 °C (84 °F) לילה.
- ביום שלמחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים ושטוף 3x עם PBS. אפשר 10-15 דקות של זמן דגירה לכל שטיפה.
- חזור על שלבים 4.3.1.-4.3.2. עבור הנוגדן המשני עם מקדם דילול של 1:400.
- יש להוסיף 500 μL של DAPI ב-5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, יש לשטוף 3x עם PBS, ולאפשר זמן דגירה של 10-15 דקות לכל כביסה
- הרכבה
- הסר כמה שיותר PBS. לשטוף את האנטרואידים המוכתמים עם 70% גליצרול 1x.
- הרם את האנטרואידים מהצלחת באמצעות לולאת חיסון של 1 μL או קצה חתך של 200 μL והרכב עם 70% גליצרול על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית.
- כדי לשמר את המבנה התלת-ממדי של האנטרואידים, הקפידו על רווח של 0.5-1 מ"מ בין מגלשת הזכוכית התחתונה לבין הכיסוי. השתמש בחתכים של יריעת גומי סיליקון דקה או כיסוי זכוכית כדי ליצור רווח בין מגלשת הזכוכית למכסה הזכוכית. כעת ניתן לדמות את האנטרוידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
5. הכנה למיקרו הזרקה של אנטרואידים
הערה: פרוטוקול המיקרו-הזרקה הוא פרוטוקול שונה מ- Hill et al.16 כדי להתאים למשאבים ולהגדרה. חלק משלבי ההכנה צריכים להסתיים כמה ימים מראש.
- הגדרת הגדרת המיקרו-הזרקות
- הגדר את מנגנון המיקרו-אינז'קטור בתוך ארון ביו-בטיחות או על דלפק נקי, בהתאם למטרת הניסויים, כדלקמן: מיקרוסקופ סטריאו לצפייה, מיקרומניפולטור עם nobs בקרה על ציר X, Y ו- Z המותקן על מעמד כבד ליד המיקרוסקופ, מחזיק מיקרופיפטה המותקן על זרוע המיקרומניפולטור, צינור מיקרו-אינז'קטור המחבר את מחזיק המיקרופיפטה ומזרק עם פקק תלת-כיווני, ולאחר מכן למשאבה פנאומטית ולמקור אוויר בקיר המחובר למשאבה (איור 1).
- יש לחטא את מנגנון המיקרו-הזרקה ב-70% אתנול לפני השימוש הניסיוני ולאחריו. בדוק את מיקום המיקרוסקופ והמיקרומניפולטור כך שיתאימו למפרט הפיזיקלי הרצוי, כולל הזזת ידיות הציר כדי להבטיח שהמיקרופיפטה יכולה להגיע לדגימה הממוקדת.
- הכנת המיקרופיפטה
הערה: בצע שלבים אלה מראש.- השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך את צינורות נימי הזכוכית לתוך המיקרופיפטים.
- מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, הניחו את המיקרופיפטה על מחזיק מיקרופיפטה אופקי (איור 2), התמקדו בקצוות וחתכו את הקצוות באמצעות זוג מספריים זעירים תוך כדי התבוננות דרך עיניות המיקרוסקופ. הכינו כ-10-15 מיקרו-פיפטות בגודל קצה דומה לכל ניסוי.
- בדוק את גודל הקצה על ידי משיכת 0.5-1 μL של נוזל וספור כמה משאבות דרושות כדי לרוקן את הנפח. בדוק כמה גדלי טיפים כדי למצוא את הגודל המתאים לניסוי. גודל קצה מתאים פולט כ-10-30 nL נפח לכל משאבה.
- אחסנו את המיקרופיפטים מזכוכית חתוכה בקופסה או בצינור נקיים מבלי לפגוע בקצוות.
הערה: מיקרו-פיפטות חתוכות מראש זמינות באופן מסחרי.
- הכנה אנטרואידית
- מניחים צלחת של אנטרואידים גדולים וכדוריים בעיקר על קרח. החלף את מדיום הצמיחה הישן במדיום טרי.
- נתקו בעדינות את נקודות המטריצה של קרום המרתף מהצלחת בעזרת מרים תאים. סובבו את נקודות הג'ל מצד לצד על הקרח כדי לשבור את מטריצת קרום המרתף מבלי להפריע לאנטרואידים.
- בחרו כ-10-15 אנטרוידים כדוריים עם קצה פיפטה חתוך של 20 μL מתחת למיקרוסקופ סטריאו והוסיפו למטריצת קרום המרתף כדי ליצור 285 μL של תערובת ריכוז חלבון של 8 מ"ג/מ"ל.
- פיפט מעלה ומטה בעדינות עם קצה חתוך של 200 μL כדי לערבב את האנטרואידים מבלי לשבור אותם. צלחת חמש נקודות ג'ל 50 μL במרכז צלחת עגולה של 35 מ"מ x 10 מ"מ תרבית תאים פטרי או אחת עם ממדים דומים.
- דגירה של נקודות ג'ל אנטרואיד ב-37°C למשך 10 דקות כדי להתמצק. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי למנה. לדגור את האנטרואידים לפחות 2-3 ימים לייצוב ועד האנטרואידים להגיע לגודל מתאים של 0.5-1 μL.
הערה: חשוב שתהיה מנה עם דופן נמוכה לגישה קלה יותר לאנטרואידים וקוטר קטן לנפח קטן של מדיום הצמיחה.
- מיקרו-הזרקה של דקסטרן-FITC וחומר נבדק
- כבו את הפקק התלת-כיווני אל המשאבה הפנאומטית. למלא את micropipette עם החומר מוזרק, במקרה זה dextran-FITC עם או בלי LPS.
- הכינו צלחת פטרי מכוסה ברצועת סרט שקוף. מניחים שתיים עד ארבע נקודות 1 μL של חומר מוזרק על הסרט.
- השתמש במיקרומניפולטור כדי להניע את קצה המיקרופיפטה רק לתוך הנוזל אך מעל הסרט תחת הדמיה של מיקרוסקופ סטריאו. משוך בעדינות את המזרק כדי למשוך את החומר המוזרק לתוך micropipette.
- ממלאים את המיקרופיפטה ב-2-4 מיקרון ליטר של חומר מוזרק ודוחפים על המזרק כדי להסיר אוויר בקצה המיקרופיפט. בדוק את עמודת החומר המוזרק במיקרופיפטה כדי לוודא שאין כיס אוויר. רשום את נפח החומר המוזרק שנסוג בתוך המיקרופיפטה.
הערה: הנוזל נראה בצבע ירקרק עקב dextran-FITC. - הפעל את מקור האוויר המחובר למשאבה הפנאומטית, המספקת לחץ אוויר של כ -60 psi. הפעל את המשאבה והגדר את משך המשאבה ל-10-15 אלפיות השנייה. סובבו את הפקק על המזרק כדי לפתוח את הקו מהמשאבה למיקרופיפטה.
הערה: משך המשאבה הארוך יותר מאפשר לשחרר יותר חומר לכל משאבה. מומלץ להשתמש באותו משך משאבה ומיקרופיפטים עם גדלי קצה דומים לכל הניסוי לצורך הערכת נפח ההזרקה. - הסר את האנטרואידים מאינקובטור תרביות התאים והנח את הכלים על גבי לבנה קצף חמה במיכל מכוסה כדי להגביל את החשיפה לאור לאחר מיקרו הזרקה.
- הניחו את צלחת הפטרי עם האנטרואידים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו והזיזו את ידיות המיקרומניפולטור כדי למקם את קצה המיקרופיפטה בזווית של כ-35°-45° למשטח האופקי (איור 3). זה דורש קצת תרגול מראש.
- דמיינו ומפה את האנטרואידים בכל צלחת פטרי מתחת למיקרוסקופ כדי להכין תוכנית להזרקת כ-3-5 אנטרוידים כדוריים לכל מנה.
- ברגע שקצה המיקרופיפטה קרוב למשטח הנוזל, הביטו לתוך עיניות המיקרוסקופ כדי לקדם את הקצה לעבר האנטרואיד הממוקד.
- נקבו את האנטרואיד עם קצה המיקרופיפטה על ידי קידום ידית ציר ה-z באמצעות תנועה איטית ומדויקת. הקיר האנטרואידי ידכא ויקפוץ בחזרה ברגע שהקצה יעבור דרך המשטח האנטרואידי, ואז ההתקדמות צריכה להיפסק.
- הקש על דוושת המשאבה ברגל אחת ומלא את האנטרואיד בתמיסת dextran-FITC הירקרק עד שהוא מורחב מעט. רשום את מספר המשאבות כדי לחשב את נפח השאיבה ואת ריכוז הדקסטרון.
- למשוך את קצה micropipette לאחר סיום microinjection ולעבור אנטרואיד הבא. עם תרגול, התהליך יכול לעבור בצורה חלקה.
- אם הקצה נשבר, החלף אותו במיקרופיפטה אחרת בגודל קצה דומה. משכו נפח מספיק של חומר מוזרק עבור כל האנטרוידים באותה קבוצת חשיפה ושנו את המיקרופיפטה בין חומרים מוזרקים כדי למנוע זיהום צולב.
- הניחו את צלחת האנטרואיד המוזרקת מתחת לכיסוי כדי למנוע חשיפה לאור.
- איסוף ומדידה של דקסטרן-FITC
- לאחר הליך המיקרו הזרקה, הסר מיד את מדיה התרבית. יש לשטוף עם מדיית צמיחה טרייה פי 2 כדי להסיר שאריות של dextran-FITC. הוסף מדיה טרייה ורשום את הזמן כזמן 0 לאחר מיקרו הזרקה.
הערה: ייתכן שתזדקק לאדם שני כדי לבצע שלב זה מבלי לשבש את תהליך המיקרו-הזרקה. - אסוף 200 μL של מדיית תרבית בצינור מיקרופוגה אטום של 0.5 מ"ל ולאחר מכן החלף את מדיית התרבות שהוסרה באותו נפח של מדיית צמיחה טרייה ב-1 שעות, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, 8 שעות, 10 שעות ו-12 שעות לאחר מיקרו-הזרקות.
הערה: מרווח הזמן עשוי להשתנות בהתאם לניסוי. בחשיפה בזולטרלית, המדיה החלופית צריכה להכיל את החשיפה באותו ריכוז. - אחסן את מדיית התרבית שנאספה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומדוד את ריכוז הדקסטרן תוך 24 שעות. אחסן שאריות מדיה ב- −80 °C לניתוחים אחרים. בסוף אוסף המדיה של התרבית, קצרו את האנטרוידים להפקת RNA או הדמיה, במידת הצורך.
- מדוד ריכוזי דקסטרן-FITC באמצעות קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי. בנה עקומה סטנדרטית עבור כל לוח באמצעות דילולים סדרתיים ועל ידי התאמת קו רגרסיה ליניארי כפי שמוצג באיור 4.
- תקן את הספיגה עבור הנפח שהוסר של מדיה תרבותית המכילה dextran שהוחלף במדיית צמיחה טרייה ללא דקסטרן כדלקמן: הסרה של 200 μL מתוך 2 מ"ל של מדיה תרבותית היא 10% לפי נפח.
ספיגה מתוקנת ב-2 שעות = (ספיגה ב-1 שעות x 10%) + ספיגה מדודה בשעתיים
ספיגה של המדיום המתוקן הראשון אינה זקוקה לתיקון. לאחר מכן, חשב את ריכוז הדקסטרן מערך הספיגה המתוקן באמצעות משוואת העקומה הסטנדרטית. - לצורך הנורמליזציה, חלקו את ריכוז הדקסטרן במספר הכולל של המשאבות עבור כל צלחת פטרי ולאחר מכן הכפל במספר הכולל הגדול ביותר של משאבות לכל מנה.
הערה: כל החשיפות מבוצעות במשולשים (שלוש צלחות פטרי לכל חשיפה עם 3-5 אנטרואידים מיקרו-מוזרקים למנה). הערכים הממוצעים של המשולשים מושווים בין חשיפות באמצעות מבחן t של סטודנט.
- לאחר הליך המיקרו הזרקה, הסר מיד את מדיה התרבית. יש לשטוף עם מדיית צמיחה טרייה פי 2 כדי להסיר שאריות של dextran-FITC. הוסף מדיה טרייה ורשום את הזמן כזמן 0 לאחר מיקרו הזרקה.
Representative Results
הקמנו קו תאים אנטרואידים מרקמת עובר אילאום שנתרמה בעקבות פרוטוקולים ששונו שסופקו על ידי משתפי הפעולה שלנו במעבדה למידול רקמות תרגומיות12 של אוניברסיטת מישיגן. קו התאים האנטרואידים נבדק שלילי לזיהום מיקופלסמה . האנטרוידים הוכתמו חיוביים עבור villin, CDX2, ליזוזימה, מוצין, קלודין, occludin ו- zonula-occluden 1 (איור 5), ואישרו את מקורם האפיתליאלי במעי הדק. האנטרוידים הוזרקו במיקרו-אינסטרן עם 4 kDa dextran-FITC ב-5 מ"ג/מ"ל ב-PBS (איור 6). חשיפות הבדיקה היו LPS בריכוזים שונים, 0.1 מ"ג/מ"ל ו-0.5 מ"ג/מ"ל, מעורבב עם דקסטרן-FITC לחשיפה אפית. כבקרה חיובית, השתמשנו ב-2 mM EGTA והוספנו אותו למדיית התרבות ב-4 שעות לאחר מיקרו-הזרקה של דקסטרן. EGTA הוא כלאטור סידן המגביר את החדירות של צמתים הדוקים. הבקרות השליליות הוזרקו במיקרו-אינסטרן עם dextran-FITC ב-PBS בלבד. עבור חשיפה בזולטרלית, המדיה החלופית לאיסוף מדיה של תרבות סדרתית הייתה באותו ריכוז של החשיפה (כלומר, 2 mM EGTA). התוצאות מראות עלייה ברורה בריכוז הדקסטרן במדיה התרבותית לאחר הוספת EGTA בהשוואה לבקרה השלילית, PBS. חשיפה אפית של LPS גרמה לחדירות גבוהה יותר של דקסטרן החל מ-8 שעות לאחר החשיפה באופן תלוי ריכוז (איור 7).
איור 1: מערך מיקרו-אינז'קטור. ההתקנה כוללת מיקרוסקופ סטריאו, מיקרומניפולטור המותקן על מעמד מגנטי על לוח בסיס פלדה כבד, מחזיק מיקרופיפטה המחובר למזרק עם פקק תלת-כיווני, ומשאבה פנאומטית. אספקת האוויר בקיר מספקת את לחץ האוויר, המווסת על ידי המשאבה כדי ליצור נפח משאבה עקבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מחזיק מיקרופיפטה אופקי. פלטפורמת פלסטיק זו נועדה להחזיק את micropipette לאחר משיכת צינור נימי זכוכית לחיתוך הקצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיקום מיקרופיפטה. זווית של 35°-45° אידיאלית להזרקת אנטרוידים הממוקמים באמצע צלחת פטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: עקומה סטנדרטית דקסטרנית. העקומה נבנתה עם ספיגה פלואורסצנטית של 10 דילולים סדרתיים של דקסטרן בכפילויות. קו רגרסיה ליניארי הותאם ליצירת משוואת רגרסיה. קווי השגיאה הם SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים של אנטרואידים. DAPI עבור כתם הגרעין הוא כחול. הסמנים הביולוגיים הבאים מוצגים: (A) villin, (B) CDX2, (C) lysozyme, (D) mucin, (E) claudin, (F) occluding, ו- (G) zonula-occluden 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: אנטרואידים בשלבים שונים . (A) אנטרואיד בגיל 7-10 ימים הוא קטן ובעל דופן עבה. (B) אנטרואיד שמוכן למיקרו-הזרקה עם גודל גדול, לומן וקיר חשיבה, ו-(C) דקסטרן-FITC פלואורסצנטי בתוך אנטרואיד יומיים לאחר המיקרו-הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: חדירות של דקסטרן-FITC לאחר מיקרו-הזרקה . (A) רמות הדקסטרן שנמדדו בתקשורת היו גבוהות יותר לאחר הוספת EGTA בהשוואה ל-PBS. (B) LPS של 0.5 מ"ג/מ"ל במיקרו-הזרקה גרמה לדליפה גדולה יותר של דקסטרן מהלומן האנטרואידי למדיה מאשר 0.1 מ"ג/מ"ל LPS במיקרו-הזרקה החל מ-8 שעות לאחר ההזרקה. *ערך p < 0.05, קווי השגיאה הם SEM, n = 3, מבחן t של סטודנט שימש לחישוב מובהקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
פרוטוקול זה מפרט הקמת אנטרוידים מרקמת המעי העוברית, כמו גם אפיון מודל עם צביעה אימונופלואורסצנטית ובדיקת חדירות אפיתל. החדירות של האנטרוידים נבדקה באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה ומדידות מסלול זמן סדרתיות של ריכוז dextran-FITC שדלף במדיה התרבית. החידוש של פרוטוקול זה הוא החשיפה האפית הדומה יותר לפיזיולוגיה של המעי האנושי בהשוואה לחשיפה הבזולטרלית בתקשורת התרבות7. במחקרים קודמים, Hill et al. השתמשו בהדמיה סדרתית ובחישוב עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן16. ארס ואחרים חשפו את הממברנה הבזולטרלית של מודל אפיתל ל-LPS ולאחר מכן השוו את תבנית ביטוי הגנים התאית7. לשם השוואה, אנו משתמשים בחשיפה אפית של הריאגנטים שנבדקו ולאחר מכן בוחנים שינויים פוטנציאליים בחדירות ברוטו על ידי מדידת ריכוזים סדרתיים של דקסטרן שדלף בתקשורת התרבית. השיטה שלנו מאפשרת גם ניתוח השוואתי סדרתי של ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי אפיתל במדיה תרבית וביטוי גנים על ידי איסוף mRNA תאי. LPS משמש בדרך כלל לחקר פגיעות מעיים במודלים של בעלי חיים ובמבחנה בגלל יכולתו לגרום לחדירות ולדלקת 7,17. כאשר LPS נבדק במודל זה, חדירות אפיתל הובחן על ידי ריכוז החשיפה. ניתן להרחיב פרוטוקול זה כדי לחקור פתולוגיות אחרות של מחלות תוך שימוש בחומרים מיקרו-מוזרקים שונים ומדידות תוצאה.
שלבים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים הקמת אנטרוידים מרקמות המעי העובריות, אפיון אנטרואיד וטכניקת המיקרו-הזרקה. שלמות המחקר תלויה בדגימת תאים מדויקת. שימוש בציוני דרך אנטומיים ובכלי דם עוזר להבטיח את הבחירה של תאי המעי הדק. בשל הצמיחה וההתמיינות החזקה של תאי גזע מעי עובריים, אין צורך בהליך נרחב לבידוד תאי הגזע מתאי אפיתל אחרים. לאחר שהאנטרוידים הוקמו, חשוב לאשר את המאפיינים של המודל על ידי צביעה עבור חלבונים וסמני התא. בפרוטוקול זה, האנטרואידים הוכתמו עבור אנטרוציטים באמצעות villin ו- CDX2, תאי Paneth באמצעות lysozyme, ותאי גביע באמצעות mucin, כל התאים אשר נמצאים בתוך אפיתל המעי הדק18,19,20. בניגוד לקווים מסורתיים של תאים בודדים המציגים סוג תא אחד, אנטרוידים קובעים את כל סוגי התאים מתאי הגזע של אבות המעיים8. ניתן לשנות את החלק המכתים של פרוטוקול זה עבור הסמנים התאיים הספציפיים המעניינים. חיונית לאמינות של פרוטוקול זה היא טכניקת המיקרו-הזרקה. ניתן לאמת את העקביות של קצות המיקרופיפטה על ידי מדידת הנפח לכל משאבה באמצעות תמיסת dextran-FITC והדמיית קוטר הקצוות מתחת למיקרוסקופ. בשל הסיכון של זיהום, אותו micropipette לא יכול לשמש יותר מחשיפה אחת. בנוסף, הצורה והצמיחה של האנטרואידים יכולים להיות מושפעים מהתוכן של מדיית הצמיחה שלהם. מצאנו שהאנטרואידים הכדוריים ולא בצורת כרובית סיפקו מודלים טובים יותר למיקרו-הזרקות. הצורה הכדורית עשויה להיות מושרית על ידי גורם Wnt גדול יותר בתקשורת21.
פרוטוקול זה תלוי במידה רבה במיומנותו של המבצע במיקרו-הזרקה כדי להפחית וריאציות, במיוחד במדידות תלויות זמן. ניתן למזער את הווריאציות על ידי כך שיש את אותו מבצע מנוסה עם טכניקות עקביות, תוך שימוש באותו מקור תאים כדי למנוע שונות גנטית, בדיקה באותו מעבר כדי להסיר הטיית בגרות, וגידול התאים באותו סוג של מדיה להתמיינות תאים דומה. המרכיבים של מדיית הגדילה עשויים לגרום להתמיינות משתנה של תאי גזע במבחנה ולא בסביבת in vivo . לדוגמה, in vivo, ליזוזים אינם באים לידי ביטוי עד שבועות 22-24 של התפתחות הריון כאשר תאי Paneth נוצרים והופכים פונקציונליים22. עם זאת, הצלחנו לזהות ליזוזים באנטרואידים שלנו שנוצרו ממעיים עובריים של 10 שבועות. שיטה זו יכולה להגביל את מספר החשיפות הנבדקות בו זמנית בשל המיומנות הטכנית הגבוהה הנדרשת למיקרו-הזרקה. דליפת הדקסטרן מחור ניקוב המיקרו-הזרקה יכולה להשפיע על הערכת החדירות. כדי למנוע השפעה זו, שטיפות משולשות מיד לאחר microinjection מומלץ להסיר dextran שיורי מן ההליך. ריכוז הדקסטרן בתקשורת צריך להימדד מדי שעה במשך 4-6 שעות לאחר מיקרו הזרקה. ניסויים עם עלייה משמעותית בריכוז הדקסטרן תוך 2-4 שעות לאחר ההזרקה צריכים להיות מחוץ לניתוח הסופי.
לשיטה זו מספר יתרונות. זה דורש עלות נמוכה יותר ופחות משאבים בהשוואה monolayers נגזר enteroid על transwell. בנוסף, ניתן להרחיב אותו לחשיפות אחרות כגון חיידקים חיים או וירוסים כדי לחקור את האינטראקציה הראשונית בין חיידקי המעיים לאפיתל. לומן סגור של אנטרואיד יכול לשמור על צמיחה יציבה של חיידקים חיים microinjected ללא זיהום של מדיה הצמיחה13. שלא כמו החד-שכבתי שנחשף למדיית גדילה ולחמצן הדגירה, הלומן הסגור הוא חלל צר ומבודד. לומן סגור אינו מאפשר תקשורת למדיית הצמיחה ותכולת חמצן לומינלית נמוכה יותר לאורך זמן עם צמיחת חיידקים חיים13.
השימוש ברקמת מעיים עוברית מתאר בצורה מדויקת יותר את אפיתל המעיים של פגים בהשוואה לתאי גזע של מעיים בוגרים או מודלים של בעלי חיים7. יתר על כן, הקוטביות של אנטרוידים מאפשרת חשיפות אפיקליות ובזולטרליות ומדידות23. האנטרואידים יוצרים לומן סגור עם ריכוז חמצון נמוך יותר, אשר מחקה באופן הדוק יותר את ריכוז החמצון של המעיים24. בניגוד לפרוטוקולים מתקדמים יותר מבחינה טכנולוגית16, השימוש במדידות מדיה ברוטו מאפשר נגישות רבה יותר של טכניקה זו. הניסוי הראה כי דליפת אפיתל יכולה להיגרם על ידי חשיפה אפית ל-LPS והיא תלוית ריכוז. מכיוון ששיטה זו בוחנת את השינויים בריכוז דליפה של דקסטרן, היא שימושית לאיתור שינויים תפקודיים גולמיים בצמתים הדוקים. איסוף RNA שליח וריצוף של האנטרוידים החשופים וניתוח כתמים מערביים יכולים להשלים את ניתוח השינויים התפקודיים הגסים. מודל זה חוקר את שלמות אפיתל המעיים במערכת הדומה מאוד לסביבה המוקדמת, ולכן ניתן להשתמש בו כדי להשיג הבנה טובה יותר של פגיעות מעיים פגות ופתולוגיות אחרות של מחלות.
Disclosures
כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר איאן גלאס ולאנשי המעבדה לחקר מומים מולדים באוניברסיטת וושינגטון על שיתוף רקמות העובר. אנו מודים גם לד"ר מייקל דאם ולד"ר ג'ייסון ספנס במעבדה למידול רקמות תרגומיות באוניברסיטת מישיגן על התמיכה והליווי האינסופיים שלהם לאורך כל התהליך.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
- Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
- Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132 (2017).
- Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
- Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587 (2020).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).
