Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi, un modello intestinale tridimensionale, dal tessuto intestinale fetale. L'imaging immunofluorescente dei biomarcatori epiteliali è stato utilizzato per la caratterizzazione del modello. L'esposizione apicale dei lipopolisaccaridi, un'endotossina batterica, utilizzando la tecnica della microiniezione ha indotto la permeabilità epiteliale in modo dose-dipendente misurata dalla fuoriuscita di destrano fluorescente.
Abstract
Gli enteroidi derivati dal tessuto fetale umano stanno emergendo come un promettente modello in vitro per studiare le lesioni intestinali nei neonati pretermine. Gli enteroidi mostrano polarità, costituita da un lume con un bordo apicale, giunzioni strette e uno strato esterno basolaterale esposto ai mezzi di crescita. Le conseguenze delle lesioni intestinali includono l'infiammazione della mucosa e l'aumento della permeabilità. Testare la permeabilità intestinale in soggetti umani pretermine vulnerabili spesso non è fattibile. Pertanto, è necessario un modello intestinale derivato dal tessuto fetale in vitro per studiare le lesioni intestinali nei neonati pretermine. Gli enteroidi possono essere utilizzati per testare i cambiamenti nella permeabilità epiteliale regolata da proteine a giunzione stretta. Negli enteroidi, le cellule staminali intestinali si differenziano in tutti i tipi di cellule epiteliali e formano una struttura tridimensionale su una matrice di membrana basale secreta dalle cellule del sarcoma di topo. In questo articolo, descriviamo i metodi utilizzati per stabilire enteroidi dal tessuto intestinale fetale, caratterizzando le proteine enteroidi a giunzione stretta con imaging immunofluorescente e testando la permeabilità epiteliale. Poiché la disbiosi batterica dominante gram-negativa è un noto fattore di rischio per il danno intestinale, abbiamo usato il lipopolisaccaride (LPS), un'endotossina prodotta da batteri gram-negativi, per indurre permeabilità negli enteroidi. Il destrano marcato con fluoresceina è stato microiniettato nel lume enteroide e le concentrazioni seriali di destrano fuoriuscite nei terreni di coltura sono state misurate per quantificare i cambiamenti nella permeabilità paracellulare. L'esperimento ha dimostrato che l'esposizione apicale agli LPS induce permeabilità epiteliale in modo dipendente dalla concentrazione. Questi risultati supportano l'ipotesi che la disbiosi dominante gram-negativa contribuisca al meccanismo del danno intestinale nei neonati pretermine.
Introduction
I neonati pretermine sono esposti a un'infiammazione frequente e prolungata che li mette ad aumentato rischio di lesioni intestinali con conseguente disabilità a lungo termine o morte1. La ricerca in questo settore è messa alla prova dalla limitata capacità di condurre esperimenti su neonati pretermine vulnerabili. Inoltre, la mancanza di modelli adeguati ha ostacolato lo studio completo dell'ambiente intestinale prematuro2. I modelli esistenti in vitro e in vivo non sono riusciti a rappresentare in modo completo l'ambiente intestinale umano prematuro. In particolare, singole linee cellulari fetali epiteliali potrebbero non formare giunzioni strette e i modelli animali mostrano risposte infiammatorie e immunologiche diverse rispetto ai neonati pretermine umani. Con la scoperta della segnalazione Wnt come via primaria nella proliferazione e differenziazione delle cellule staminali della cripta intestinale e delle nuove cellule staminali tissutali Lgr5+, sono stati stabiliti organoidi derivati dal tessuto intestinale come enteroidi e colonoidi come modelli in vitro 3,4,5. Utilizzando questa tecnologia, è possibile creare e utilizzare modelli enteroidi tridimensionali (3D) sviluppati da tessuto intero o biopsia di un intestino per studiare le risposte epiteliali all'ambiente intestinale 6,7.
In contrasto con le tipiche linee cellulari intestinali coltivate in coltura, gli enteroidi mostrano polarità con un lume collegato da proteine a giunzione stretta8. Ciò consente l'esposizione al bordo basolaterale nei mezzi di crescita, nonché la microiniezione luminale per valutare il bordo apicale. Inoltre, gli enteroidi mostrano caratteristiche genetiche, fisiologiche e immunologiche simili a quelle dell'epitelio umano 9,10. Gli enteroidi derivati dal tessuto fetale consentono l'esame del ruolo della prematurità sulla funzione epiteliale. Le caratteristiche uniche degli enteroidi possono assomigliare più da vicino all'ambiente intestinale pretermine9. Gli enteroidi di derivazione tissutale possono essere utilizzati per testare l'integrità della giunzione stretta come forma monostrato o come strutture 3D incorporate in una miscela proteica di membrana basale solidificata. Per quest'ultima forma è necessaria una tecnica di microiniezione se si desidera un'esposizione apicale. La misurazione delle risposte epiteliali in modelli enteroidi include l'espressione genica mediante sequenziamento dell'RNA, biomarcatori mediante saggio immunologico enzimatico (ELISA) o tecniche di imaging avanzate. La tecnica qui presentata fornisce un'altra opzione fattibile per misurare la permeabilità lorda con fluorometria.
Il danno intestinale nei neonati pretermine ha una patogenesi multifattoriale che include lo squilibrio della comunità microbica intestinale. Gli enteroidi possono fornire ottimi modelli per studiare alcuni aspetti delle malattie intestinali pretermine come l'enterocolite necrotizzante che coinvolge le funzioni epiteliali11. Gli enteroidi mostrano caratteristiche simili a quelle dell'intestino fetale umano10. L'esposizione degli enteroidi al lipopolisaccaride (LPS), un'endotossina prodotta da batteri gram-negativi, nei terreni di coltura come esposizione basolaterale induce l'espressione genica che può portare ad un aumento dell'infiammazione e della permeabilità intestinale7. Questo studio mira a valutare i cambiamenti nella permeabilità epiteliale grossolana dopo esposizione apicale a prodotti batterici come LPS. I risultati possono fornire informazioni sulle interazioni microbi-epiteliali coinvolte nella patogenesi del danno intestinale. Il metodo progettato per testare la permeabilità lorda richiede la configurazione e l'abilità della microiniezione.
Protocol
La raccolta di tessuti umani è stata approvata dall'Institutional Review Board dell'Università di Washington (ID studio: STUDY380 e CR ID: CR3603) ed eseguita dal Birth Defects Research Laboratory. Il laboratorio di ricerca sui difetti alla nascita è stato supportato dal premio NIH numero 5R24HD000836 dell'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development. I campioni sono stati raccolti dai partecipanti consenzienti e inviati come de-identificati e senza alcuna informazione sanitaria. I campioni di intestino tenue sono stati conservati nella soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) e spediti durante la notte al laboratorio ricevente.
1. Preparazione del reagente
NOTA: vedere la tabella dei materiali per un elenco dei reagenti e dei numeri di catalogo; I volumi consigliati sono per una piastra a 6 pozzetti, se non diversamente specificato.
- Preparare l'albumina sierica bovina allo 0,1% (BSA) sciogliendo 50 mg di polvere di BSA in 50 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) con 100 μg/ml di una primocina antibiotica ad ampio spettro per rivestire tutti gli oggetti di plastica e le punte che vengono a contatto con tessuti o enteroidi.
- Per rivestire con BSA, posizionare le punte delle pipette non filtrate in un tubo conico da 50 mL con BSA sufficiente a coprire le punte, aggiungere 1-2 ml di BSA per coprire la superficie della piastra di Petri o riempire 15 mL di tubi conici con BSA per almeno 20-30 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Preparare i terreni DPBS miscelando 50 mL di DPBS con 100 μg/mL di primocina e 50 μg/mL di gentamicina. Preparare questo terreno con e senza 2,5 μg/mL di amfotericina.
- Preparare i terreni di crescita enteroidi mescolando 2 ml di terreno di crescita organoide, 100 μg/mL di primocina, 10 μM Y27632 e 2,5 μM CHIR99021. Preparare quotidianamente terreni freschi e riscaldarli in un incubatore per colture cellulari a 37 °C.
NOTA: il fattore di diluizione per Y27632 è 1:250. Per CHIR99021, diluire la soluzione madre CHIR a 1:100 in mezzi caldi e quindi a 1:40 in terreni di crescita enteroidi per ottenere una diluizione 1:4000. - Preparare la miscela di matrice della membrana basale aggiungendo alla matrice della membrana basale 10 μM Y27632 e 2,5 μM CHIR99021. Fare un totale di 285 μL della miscela finale della matrice della membrana basale ad una concentrazione proteica di 8 mg/ml per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
NOTA: La matrice della membrana basale deve essere ghiacciata per rimanere in forma liquida e solidificarsi a temperature più calde. La concentrazione proteica della matrice della membrana basale determina il volume richiesto per ottenere una concentrazione proteica finale di 8 mg/ml utilizzando l'equazione:
Volume 1 × Concentrazione 1 = Volume 2 × Concentrazione 2 - Preparare la paraformaldeide (PFA) al 4% diluendo il 32% di PFA in PBS di 1: 8 e conservare a temperatura ambiente. Fare 0,5 ml per ogni pozzetto di enteroidi da fissare.
- Preparare il tampone bloccante aggiungendo il 5% di siero di capra e lo 0,5% di Triton X-100 in PBS. Preparare 1 mL per il primo anticorpo per pozzetto e 0,5 mL per l'anticorpo aggiuntivo per pozzetto.
NOTA: Utilizzare siero della stessa specie dell'ospite degli anticorpi secondari - Preparare anticorpi primari e secondari, diluiti in tampone bloccante alla concentrazione raccomandata dal produttore per ciascun anticorpo.
- Preparare 5 μg/mL di Dmidino-2-fenilindolo (DAPI) diluendo a 1:200 da 1 mg/mL di soluzione madre in PBS. Fare 0,5 ml per pozzetto di enteroidi colorati.
- Preparare il 70% di glicerolo in PBS e fare 0,5 ml per il montaggio degli enteroidi su vetrini da microscopio.
- Preparare 5 mg/mL di destrano-FITC (fluoresceina-isotiocianato) diluendo la soluzione madre da 25 mg/mL in PBS in rapporto 1:5. Fare 20 μL per microiniezione.
- Preparare lipopolisaccaridi (LPS) e destrano-FITC ricostituendo la polvere LPS in PBS in una soluzione madre da 5 mg/ml. Diluire le soluzioni madre di LPS e destrano in PBS a 0,1 mg/mL e 0,5 mg/mL LPS e 5 mg/mL dextran-FITC. Fare 20 μL per microiniezione.
- Preparare l'acido etilenglicole-bis(β-amminoetiletere)-N,N,N',N'-tetraacetico (EGTA) producendo una soluzione madre di 0,2 M sciogliendo la polvere di EGTA in acqua distillata e regolando il pH a circa 8 utilizzando acido cloridrico (HCl). Preparare una concentrazione di prova di 2 mM nei terreni di coltura eseguendo una diluizione 1:100.
2. Raccolta di campioni
- Una volta ricevuti i campioni, eseguire l'isolamento e la placcatura delle cellule epiteliali entro 24 ore dalla raccolta dei campioni.
3. Placcatura delle cellule epiteliali intestinali nella matrice della membrana basale da campioni interi
NOTA: Questa procedura segue protocolli modificati dal Translational Tissue Modeling Laboratory presso l'Università del Michigan12,13,14. L'utilizzo di terreni di coltura con un alto fattore Wnt produce risultati coerenti per l'insediamento di enteroidi. Una volta stabiliti gli enteroidi, utilizzare lo stesso mezzo con un alto fattore Wnt per guidare gli enteroidi verso forme sferiche per la microiniezione.
- Trasferire i segmenti intestinali in una capsula di Petri di 60 mm x 15 mm con DPBS ghiacciato con amfotericina e immergere per 20 minuti sul ghiaccio. Mentre il tessuto si impregna, identificare le regioni (duodeno, digiuno o ileo) dell'intestino tenue e rimuovere il tessuto connettivo e i vasi sanguigni con pinze e forbici. Lavare il contenuto di lumen secondo necessità utilizzando un piccolo ago da 23-25 G e una siringa da 3 ml senza interrompere l'epitelio.
- Tagliare i segmenti di intestino in pezzi di 3-5 mm usando un bisturi e posizionare 1-2 pezzi (per placcare in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) in una capsula di Petri da 35 mm x 15 mm che contiene 0,5-1 ml di terreno di crescita organoide su ghiaccio.
- Usando micro forbici e pinze da dissezione, tagliare longitudinalmente il tubo intestinale. Utilizzare la punta del forcipe per raschiare le cellule epiteliali dalla fascia sotto un microscopio stereo 10x. Rimuovere la fascia e ruotare il piatto per rompere i grumi di cellule.
- Utilizzare una punta di taglio della pipetta da 20 μL per trasferire le cellule e i mezzi con un incremento di 5-10 μL alla miscela della matrice della membrana basale per ottenere una soluzione da 285 μL a una concentrazione proteica della matrice di 8 mg/ml. Pipet su e giù lentamente 20 volte per mescolare le cellule nella matrice della membrana basale sul ghiaccio usando una punta di taglio da 200 μL.
- Posizionare cinque strisce da 50 μL della miscela di matrice della membrana basale della cella in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti preriscaldata mantenuta su un mattone di schiuma calda. Incubare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO2 per 10 minuti per consentire alla matrice della membrana basale di polimerizzare e indurirsi.
- Aggiungere 2 ml del mezzo di crescita enteroide nel pozzetto delle strisce della matrice della membrana basale solidificata e riposizionare all'interno dell'incubatore di coltura cellulare. Cambia i media ogni giorno per aumentare la crescita degli enteroidi. Controllare la differenziazione delle cellule staminali intestinali sotto un microscopio invertito 10x al giorno.
- Dopo 10-14 giorni, passare gli enteroidi in un pozzetto di una piastra a 12 o 6 pozzetti, a seconda della densità enteroide. Inizia a cambiare il mezzo a giorni alterni e passa in un rapporto 1: 2 ogni 5-7 giorni quando gli enteroidi iniziano a prosperare.
- Rimuovere le cellule che non si differenziano in enteroidi con lo strato di matrice della membrana basale durante i passaggi. Creare uno stock congelato di enteroidi con un basso passaggio congelandoli in 80% di terreno di crescita, 10% siero fetale bovino (FBS) e 10% dimetilsolfossido (DMSO), se necessario.
4. Colorazione immunofluorescente degli enteroidi
NOTA: Il processo di fissaggio e colorazione richiede 3 giorni. In questo protocollo, abbiamo fissato e colorato nuclei (DAPI), marcatori epiteliali (villina, CDX2), lisozima, mucina e proteine a giunzione stretta (claudina 2, claudina 3, occludina, zonula occluden-1) utilizzando un protocollo modificato15. Le immagini fluorescenti sono state prese da un microscopio confocale.
- Fissaggio
NOTA: Questo processo viene solitamente eseguito contemporaneamente al passaggio enteroide o alla procedura di congelamento.- Posizionare la piastra enteroide sul ghiaccio. Rimuovere il substrato di crescita e lavare delicatamente 2 volte con DPBS freddo.
- Identificare gli enteroidi da fissare e colorare. Trasferirli su una piastra a 12 pozzetti pipettandoli accuratamente con una punta di taglio da 200 μL o utilizzando un circuito di inoculazione da 1 μL. Posizionare gli enteroidi in pozzetti separati se deve essere eseguita la colorazione con anticorpi diversi.
- Rimuovere quanto più liquido possibile con una punta da 200 μL senza interrompere gli enteroidi. Aggiungere 0,5 ml di PFA al 4% e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Ruotare la piastra di tanto in tanto per facilitare il distacco degli enteroidi dalla matrice della membrana basale.
- Esaminare grossolanamente per determinare il distacco degli enteroidi dalla matrice della membrana basale. Aspirare con cautela e scartare il PFA liquido senza interrompere gli enteroidi. Lavare con PBS 3x per rimuovere PFA e qualsiasi matrice residua della membrana basale
NOTA: Aspirare il liquido sotto uno stereomicroscopio può essere utile per evitare gli enteroidi. Gli enteroidi fissi possono essere conservati in PBS a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Inceppamento
- Rimuovere con cautela il PBS residuo con una pipetta da 200 μL, senza interrompere gli enteroidi. Aggiungere 0,5 ml di tampone bloccante e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere ed eliminare il tampone bloccante con una pipetta da 200 μL, facendo attenzione a evitare di interrompere gli enteroidi.
- Colorazione anticorpale
- Aggiungere 500 μL di anticorpo primario nel tampone bloccante a ciascun pozzetto con enteroidi. Per gli anticorpi primari e per il lisozima, il fattore di diluizione è 1:100, per CDX2 il fattore di diluizione è 1:100 e per villin il fattore di diluizione è 1:50. Incubare a 4 °C durante la notte.
- Il giorno seguente, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare 3 volte con PBS. Lasciare 10-15 minuti di tempo di incubazione per ogni lavaggio.
- Ripetere i passaggi 4.3.1.-4.3.2. per l'anticorpo secondario con un fattore di diluizione di 1:400.
- Aggiungere 500 μL di DAPI a 5 μg/mL in PBS e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, lavare 3 volte con PBS e lasciare 10-15 minuti di tempo di incubazione per ogni lavaggio
- Montante
- Rimuovere il più PBS possibile. Lavare gli enteroidi colorati con glicerolo al 70% 1x.
- Sollevare gli enteroidi dalla piastra utilizzando un anello di inoculazione da 1 μL o una punta da 200 μL tagliata e montare con glicerolo al 70% su un vetrino da microscopio di vetro.
- Per preservare la struttura 3D degli enteroidi, assicurarsi uno spazio di 0,5-1 mm tra il vetrino inferiore e il vetrino. Utilizzare ritagli di sottile foglio di gomma siliconica o vetrino per creare uno spazio tra il vetrino e il vetrino. Gli enteroidi possono ora essere ripresi con un microscopio confocale.
5. Preparazione per microiniezione di enteroidi
NOTA: Il protocollo di microiniezione è un protocollo modificato da Hill et al.16 per adattarsi alle risorse e all'impostazione. Alcuni dei passaggi di preparazione devono essere completati con qualche giorno di anticipo.
- Impostazione della configurazione della microiniezione
- Installare l'apparecchio di microiniettore all'interno di un armadio di biosicurezza o su un contatore pulito, a seconda dell'obiettivo degli esperimenti, come segue: un microscopio stereo per la visualizzazione, un micromanipolatore con nobs di controllo degli assi X, Y e Z montato su un supporto pesante accanto al microscopio, un supporto per micropipette montato sul braccio del micromanipolatore, un tubo del microiniettore che collega il supporto per micropipette e una siringa con un rubinetto di arresto a tre vie, quindi a una pompa pneumatica e a una fonte d'aria a parete collegata alla pompa (Figura 1).
- Disinfettare l'apparecchio di microiniezione con etanolo al 70% prima dell'uso sperimentale e successivamente. Testare il posizionamento del microscopio e del micromanipolatore per adattarlo alle specifiche fisiche desiderate, incluso lo spostamento delle manopole dell'asse per garantire che la micropipetta possa raggiungere il campione mirato.
- Preparazione della micropipetta
Nota : eseguire questi passaggi in anticipo.- Utilizzare un estrattore di micropipette per tirare i tubi capillari di vetro nelle micropipette.
- Sotto il microscopio stereo, posizionare la micropipetta su un supporto per micropipette orizzontale (Figura 2), mettere a fuoco le punte e tagliare le punte usando un paio di microforbici mentre si guarda attraverso gli oculari del microscopio. Preparare circa 10-15 micropipette con una dimensione della punta simile per ogni esperimento.
- Testare la dimensione della punta tirando su 0,5-1 μL di liquido e contare quante pompe sono necessarie per svuotare il volume. Testare diverse dimensioni delle punte per trovare la dimensione appropriata per l'esperimento. Una punta di dimensioni appropriate espelle circa 10-30 nL di volume per pompa.
- Conservare le micropipette di vetro tagliate in una scatola o tubo pulito senza danneggiare le punte.
NOTA: le micropipette pretagliate sono disponibili in commercio.
- Preparazione enteroide
- Posizionare una piastra di enteroidi per lo più grandi e sferici sul ghiaccio. Sostituire il vecchio mezzo di crescita con un terreno fresco.
- Dissociare delicatamente i punti della matrice della membrana basale dalla piastra con un sollevatore cellulare. Ruotare i punti di gel da un lato all'altro sul ghiaccio per rompere la matrice della membrana basale senza disturbare gli enteroidi.
- Selezionare circa 10-15 enteroidi sferici con una punta di pipetta da 20 μL tagliata al microscopio stereoscopico e aggiungere alla matrice della membrana basale per ottenere 285 μL di miscela di concentrazione proteica da 8 mg/ml.
- Pipet su e giù delicatamente con una punta tagliata da 200 μL per mescolare gli enteroidi senza romperli. Placcare cinque punti di gel da 50 μL al centro di una capsula di Petri rotonda di coltura cellulare di 35 mm x 10 mm o di dimensioni simili.
- Incubare i punti di gel enteroide a 37 °C per 10 minuti per solidificare. Quindi, aggiungere 1 ml di terreno di crescita fresco al piatto. Incubare gli enteroidi per almeno 2-3 giorni per la stabilizzazione e fino a quando gli enteroidi raggiungono una dimensione appropriata di 0,5-1 μL.
NOTA: È importante avere un piatto con una parete bassa per un più facile accesso agli enteroidi e un diametro ridotto per un minor volume di terreno di crescita.
- Microiniezione di destrano-FITC e materiale testato
- Spegnere il rubinetto a tre vie sulla pompa pneumatica. Riempire la micropipetta con il materiale iniettato, in questo caso dextran-FITC con o senza LPS.
- Preparare una capsula di Petri coperta da una striscia di pellicola trasparente. Posizionare da due a quattro punti da 1 μL di materiale iniettato sul film.
- Utilizzare il micromanipolatore per guidare la punta della micropipetta appena all'interno del liquido ma sopra la pellicola sotto la visualizzazione di un microscopio stereo. Tirare delicatamente la siringa per aspirare il materiale iniettato nella micropipetta.
- Riempire la micropipetta con 2-4 μL di materiale iniettato e spingere sulla siringa per rimuovere l'aria sulla punta della micropipetta. Ispezionare la colonna di materiale iniettato nella micropipetta per assicurarsi che non vi sia alcuna sacca d'aria. Registrare il volume di materiale iniettato che si è ritirato all'interno della micropipetta.
NOTA: Il liquido è visibile in un colore verdastro a causa di destrano-FITC. - Accendere la fonte d'aria collegata alla pompa pneumatica, che fornisce una pressione dell'aria di circa 60 psi. Accendere la pompa e impostare la durata della pompa su 10-15 ms. Ruotare il rubinetto sulla siringa per aprire la linea dalla pompa alla micropipetta.
NOTA: La maggiore durata della pompa consente di rilasciare più materiale per pompa. Si raccomanda di utilizzare la stessa durata della pompa e micropipette con dimensioni di punta simili per l'intero esperimento per la stima del volume iniettato. - Rimuovere gli enteroidi dall'incubatore di coltura cellulare e posizionare i piatti sopra un mattone di schiuma calda in un contenitore coperto per limitare l'esposizione alla luce dopo la microiniezione.
- Posizionare la capsula di Petri con enteroidi sotto il microscopio stereoscopico e spostare le manopole del micromanipolatore per posizionare la punta della micropipetta con un angolo di circa 35°-45° rispetto alla superficie orizzontale (Figura 3). Ciò richiede un po 'di pratica in anticipo.
- Visualizza e mappa gli enteroidi in ogni capsula di Petri al microscopio per fare un piano per iniettare circa 3-5 enteroidi sferici per piatto.
- Una volta che la punta della micropipetta è vicina alla superficie liquida, guardare negli oculari del microscopio per far avanzare la punta verso l'enteroide mirato.
- Forare l'enteroide con la punta della micropipetta facendo avanzare la manopola dell'asse z con un movimento lento e preciso. La parete enteroide si deprimerà e tornerà indietro una volta che la punta attraversa la superficie enteroide, a quel punto l'avanzamento dovrebbe fermarsi.
- Picchiettare il pedale della pompa con un piede e riempire l'enteroide con la soluzione verdastra di destrano-FITC fino a quando non è leggermente espanso. Registrare il numero di pompe per calcolare il volume pompato e la concentrazione di destrano.
- Prelevare la punta della micropipetta dopo aver terminato la microiniezione e passare all'enteroide successivo. Con la pratica, il processo può andare liscio.
- Se la punta si rompe, sostituirla con un'altra micropipetta con una dimensione della punta simile. Tirare un volume sufficiente di materiale iniettato per tutti gli enteroidi nello stesso gruppo di esposizione e cambiare la micropipetta tra i materiali iniettati per evitare la contaminazione incrociata.
- Posizionare il piatto enteroide iniettato sotto copertura per evitare l'esposizione alla luce.
- Raccolta e misurazione del Dextran-FITC
- Dopo la procedura di microiniezione, rimuovere immediatamente il terreno di coltura. Lavare con terreno di coltura fresco 2x per rimuovere eventuali residui di destrano-FITC. Aggiungere nuovi supporti e registrare l'ora come tempo 0 dopo la microiniezione.
NOTA: Potrebbe essere necessaria una seconda persona per eseguire questo passaggio senza interrompere il processo di microiniezione. - Raccogliere 200 μL di terreno di coltura in una provetta opaca da 0,5 mL di microfugo e quindi sostituire i terreni di coltura rimossi con lo stesso volume di terreno di coltura fresco a 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h e 12 h dopo le microiniezioni.
Nota : l'intervallo di tempo può variare a seconda dell'esperimento. Con un'esposizione basolaterale, il mezzo di sostituzione dovrebbe contenere l'esposizione alla stessa concentrazione. - Conservare i terreni di coltura raccolti a 4 °C e misurare la concentrazione di destrano entro 24 ore. Conservare i residui di terreno a -80 °C per altre analisi. Alla fine della raccolta dei terreni di coltura, raccogliere gli enteroidi per l'estrazione dell'RNA o l'imaging, se necessario.
- Misurare le concentrazioni di destrano-FITC con un lettore di micropiastre a fluorescenza. Costruire una curva standard per ogni piastra utilizzando diluizioni seriali e adattando una linea di regressione lineare come mostrato nella Figura 4.
- Correggere l'assorbanza per il volume rimosso di terreni di coltura contenenti destrano che è stato sostituito con terreni di crescita freschi senza destrano come segue: la rimozione di 200 μL su 2 ml di terreno di coltura è del 10% in volume.
Assorbanza corretta a 2 h = (assorbanza a 1 h x 10%) + assorbanza misurata a 2 h
L'assorbanza del primo mezzo corretto non ha bisogno di correzione. Quindi, calcolare la concentrazione di destrano dal valore di assorbanza corretto utilizzando l'equazione della curva standard. - Per la normalizzazione, dividere la concentrazione di destrano per il numero totale di pompe per ciascuna capsula di Petri, quindi moltiplicare per il maggior numero totale di pompe per piatto.
NOTA: Tutte le esposizioni vengono eseguite in triplice copia (tre piastre di Petri per esposizione con 3-5 enteroidi microiniettati per piatto). I valori medi dei triplicati vengono confrontati tra le esposizioni utilizzando un t-test di Student.
- Dopo la procedura di microiniezione, rimuovere immediatamente il terreno di coltura. Lavare con terreno di coltura fresco 2x per rimuovere eventuali residui di destrano-FITC. Aggiungere nuovi supporti e registrare l'ora come tempo 0 dopo la microiniezione.
Representative Results
Abbiamo stabilito una linea cellulare enteroide da tessuto fetale ileo donato seguendo protocolli modificati forniti dai nostri collaboratori presso l'Università del Michigan Translational Tissue Modeling Laboratory12. La linea cellulare enteroide è risultata negativa per l'infezione da Mycoplasma . Gli enteroidi sono risultati positivi per villin, CDX2, lisozima, mucina, claudina, occludina e zonula-occluden 1 (Figura 5), confermando la loro origine epiteliale dell'intestino tenue. Gli enteroidi sono stati microiniettati con 4 kDa dextran-FITC a 5 mg/mL in PBS (Figura 6). Le esposizioni di prova erano LPS a diverse concentrazioni, 0,1 mg / ml e 0,5 mg / ml, miscelate con destrano-FITC per l'esposizione apicale. Come controllo positivo, abbiamo usato 2 mM EGTA e lo abbiamo aggiunto ai terreni di coltura a 4 ore dopo la microiniezione di destrano. EGTA è un chelante del calcio che aumenta la permeabilità delle giunzioni strette. I controlli negativi sono stati microiniettati con destrano-FITC nella sola PBS. Per l'esposizione basolaterale, il mezzo di sostituzione per la raccolta seriale dei terreni di coltura aveva la stessa concentrazione dell'esposizione (cioè 2 mM EGTA). I risultati mostrano un chiaro aumento della concentrazione di destrano nei terreni di coltura dopo l'aggiunta di EGTA rispetto al controllo negativo, PBS. L'esposizione apicale di LPS ha indotto una maggiore permeabilità del destrano a partire da circa 8 ore dopo l'esposizione in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 7).
Figura 1: Configurazione del microiniettore. La configurazione include un microscopio stereo, un micromanipolatore montato su un supporto magnetico su una piastra di base in acciaio pesante, un supporto per micropipette collegato a una siringa con un rubinetto a tre vie e una pompa pneumatica. L'alimentazione dell'aria a parete fornisce la pressione dell'aria, che è regolata dalla pompa per generare un volume costante della pompa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Portapipette orizzontale. Questa piattaforma in plastica è progettata per contenere la micropipetta dopo aver tirato il tubo capillare di vetro per tagliare la punta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Posizionamento delle micropipette. Un angolo di 35°-45° è ideale per iniettare enteroidi situati al centro della capsula di Petri. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Curva standard di destrano. La curva è stata costruita con assorbanza fluorescente di 10 diluizioni seriali di destrano in duplicati. Una linea di regressione lineare è stata adattata per generare un'equazione di regressione. Le barre di errore sono SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Biomarcatori fluorescenti di enteroidi. DAPI per la colorazione del nucleo è blu. Sono mostrati i seguenti biomarcatori: (A) villina, (B) CDX2, (C) lisozima, (D) mucina, (E) claudina, (F) occlusiva e (G) zonula-occlusione 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Enteroidi in diverse fasi . (A) Un enteroide di 7-10 giorni è piccolo e con una parete spessa. (B) Un enteroide pronto per la microiniezione con una grande dimensione, un lume e un muro di pensiero, e (C) dextran-FITC fluorescente all'interno di un enteroide 2 giorni dopo la microiniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Permeabilità del destron-FITC dopo microiniezione . (A) I livelli misurati di destrano nei mezzi erano più alti dopo l'aggiunta di EGTA rispetto al PBS. (B) L'LPS microiniettato da 0,5 mg/ml ha indotto una maggiore perdita di destrano dal lume enteroide nel mezzo rispetto all'LPS microiniettato da 0,1 mg/ml a partire da 8 ore dopo l'iniezione. *valore p < 0,05, le barre di errore sono SEM, n = 3, un test t di Student è stato utilizzato per calcolare la significatività. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di enteroidi dal tessuto intestinale fetale, nonché la caratterizzazione del modello con colorazione immunofluorescente e test di permeabilità epiteliale. La permeabilità degli enteroidi è stata testata utilizzando una tecnica di microiniezione e misurazioni seriali del dedestrano-FITC fuoriuscito nei terreni di coltura. La novità di questo protocollo è l'esposizione apicale che assomiglia più da vicino alla fisiologia intestinale umana rispetto all'esposizione basolaterale nei terreni di coltura7. In studi precedenti, Hill et al. hanno utilizzato l'imaging seriale e il calcolo dell'intensità della fluorescenza nel tempo16. Ares et al. hanno esposto la membrana basolaterale di un modello epiteliale a LPS e poi hanno confrontato il modello di espressione genica cellulare7. In confronto, utilizziamo l'esposizione apicale dei reagenti testati e quindi esaminiamo potenziali alterazioni della permeabilità lorda misurando le concentrazioni seriali di destrano fuoriuscito nei terreni di coltura. Il nostro metodo consente anche l'analisi comparativa seriale delle citochine prodotte dalle cellule epiteliali nei terreni di coltura e nell'espressione genica raccogliendo mRNA cellulare. LPS è stato comunemente usato per studiare il danno intestinale in modelli animali e in vitro a causa della sua capacità di indurre permeabilità e infiammazione 7,17. Quando LPS è stato testato in questo modello, la permeabilità epiteliale è stata differenziata in base alla concentrazione di esposizione. Questo protocollo può essere ampliato per studiare altre patologie patologiche utilizzando diversi materiali microiniettati e misurazioni dei risultati.
I passaggi critici in questo protocollo includono la creazione di enteroidi dai tessuti intestinali fetali, la caratterizzazione enteroide e la tecnica di microiniezione. L'integrità di questo studio dipende da un accurato campionamento cellulare. L'uso di punti di riferimento anatomici e vasi sanguigni è utile per garantire la selezione delle piccole cellule intestinali. A causa della robusta crescita e differenziazione delle cellule staminali intestinali fetali, non è necessaria una procedura estensiva per isolare le cellule staminali da altre cellule epiteliali. Dopo che gli enteroidi sono stati stabiliti, è importante confermare le caratteristiche del modello colorando per proteine e marcatori cellulari. In questo protocollo, gli enteroidi sono stati colorati per gli enterociti usando villin e CDX2, le cellule di Paneth usando il lisozima e le cellule caliciformi usando la mucina, tutte le cellule che si trovano all'interno dell'epitelio dell'intestino tenue18,19,20. In contrasto con le tradizionali linee cellulari singole che mostrano un tipo di cellula, gli enteroidi stabiliscono tutti i tipi di cellule dalle cellule staminali progenitrici intestinali8. La porzione di colorazione di questo protocollo può essere modificata per i marcatori cellulari specifici di interesse. Fondamentale per l'affidabilità di questo protocollo è la tecnica di microiniezione. La consistenza delle punte delle micropipette può essere verificata misurando il volume per pompa utilizzando la soluzione dextran-FITC e visualizzando il diametro delle punte al microscopio. A causa del rischio di contaminazione, la stessa micropipetta non può essere utilizzata per più di un'esposizione. Inoltre, la forma e la crescita degli enteroidi possono essere influenzate dal contenuto dei loro mezzi di crescita. Abbiamo scoperto che gli enteroidi sferici piuttosto che a forma di cavolfiore hanno fornito modelli migliori per la microiniezione. La forma sferica può essere indotta da un fattore Wnt maggiore nel mezzo21.
Questo protocollo dipende in gran parte dall'abilità dell'esecutore nella microiniezione per ridurre le variazioni, specialmente nelle misurazioni sensibili al tempo. Le variazioni possono essere ridotte al minimo avendo lo stesso esecutore esperto con tecniche coerenti, utilizzando la stessa origine cellulare per evitare variazioni genetiche, testando allo stesso passaggio per rimuovere la distorsione della maturità e facendo crescere le cellule nello stesso tipo di mezzo per differenziazione cellulare simile. I componenti dei terreni di crescita possono indurre una differenziazione variabile delle cellule staminali in vitro piuttosto che in un ambiente in vivo . Ad esempio, in vivo, il lisozima non è espresso fino alle settimane 22-24 dello sviluppo gestazionale quando le cellule di Paneth si formano e diventano funzionali22. Tuttavia, siamo stati in grado di rilevare il lisozima nei nostri enteroidi stabiliti da intestini fetali di 10 settimane. Questo metodo può limitare il numero di esposizioni testate contemporaneamente a causa dell'elevata competenza tecnica richiesta per la microiniezione. La perdita di destrano dal foro di puntura della microiniezione può influire sulla valutazione della permeabilità. Per eliminare questo effetto, si consiglia di lavare tre lavaggi immediatamente dopo la microiniezione per rimuovere il destrano residuo dalla procedura. La concentrazione di destrano nel mezzo deve essere misurata ogni ora per 4-6 ore dopo la microiniezione. Gli esperimenti con un aumento significativo della concentrazione di destrano entro 2-4 ore dall'iniezione devono essere esclusi dall'analisi finale.
Questo metodo ha diversi vantaggi. Richiede un costo inferiore e meno risorse rispetto ai monostrati derivati da enteroidi su transwell. Inoltre, può essere esteso ad altre esposizioni come batteri vivi o virus per studiare l'interazione iniziale tra microbi intestinali ed epitelio. Il lume racchiuso dell'enteroide può mantenere una crescita stabile di batteri vivi microiniettati senza contaminazione del terreno di crescita13. A differenza del monostrato esposto ai substrati di crescita e all'ossigeno di incubazione, il lume racchiuso è uno spazio ristretto e isolato. Un lume chiuso non consente alcuna comunicazione con i substrati di crescita e un contenuto di ossigeno luminale che è inferiore nel tempo con la crescita batterica viva13.
L'uso del tessuto intestinale fetale descrive più accuratamente l'epitelio intestinale dei neonati pretermine rispetto alle cellule staminali intestinali adulte o ai modelli animali7. Inoltre, la polarità degli enteroidi consente esposizioni e misurazioni sia apicali che basolaterali23. Gli enteroidi formano un lume chiuso con una concentrazione di ossigenazione inferiore, che imita più da vicino la concentrazione di ossigenazione dell'intestino24. A differenza dei protocolli tecnologicamente più avanzati16, l'uso di misurazioni di supporti lordi consente una maggiore accessibilità di questa tecnica. L'esperimento ha dimostrato che la perdita epiteliale può essere indotta dall'esposizione apicale agli LPS ed è dipendente dalla concentrazione. Poiché questo metodo esamina i cambiamenti nella concentrazione fuoriuscita di destrano, è utile per rilevare grossolani cambiamenti funzionali nelle giunzioni strette. La raccolta dell'RNA messaggero e il sequenziamento degli enteroidi esposti e l'analisi western blot possono integrare l'analisi dei cambiamenti funzionali grossolani. Questo modello studia l'integrità dell'epitelio intestinale in un sistema che assomiglia molto all'ambiente pretermine e, quindi, può essere utilizzato per ottenere una migliore comprensione delle lesioni intestinali pretermine e di altre patologie patologiche.
Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Ian Glass e il personale del Laboratorio di Ricerca sui Difetti alla Nascita dell'Università di Washington per aver condiviso i tessuti fetali. Ringraziamo anche il Dr. Michael Dame e il Dr. Jason Spence del Translational Tissue Modeling Laboratory dell'Università del Michigan per il loro infinito supporto e guida durante tutto il processo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
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