Summary
Detta protokoll beskriver upprättandet av enteroider, en tredimensionell tarmmodell, från fostrets tarmvävnad. Immunofluorescerande avbildning av epitelbiomarkörer användes för modellkarakterisering. Apikal exponering av lipopolysackarider, ett bakteriellt endotoxin, med hjälp av mikroinjektionsteknik inducerad epitelpermeabilitet på ett dosberoende sätt mätt genom läckage av fluorescerande dextran.
Abstract
Mänskliga fostervävnadsderiverade enteroider växer fram som en lovande in vitro-modell för att studera tarmskador hos för tidigt födda barn. Enteroider uppvisar polaritet, bestående av en lumen med en apikal kant, täta korsningar och ett basolateralt yttre skikt utsatt för tillväxtmedia. Konsekvenserna av tarmskador inkluderar slemhinneinflammation och ökad permeabilitet. Att testa tarmpermeabilitet hos sårbara prematura människor är ofta inte genomförbart. Således behövs en in vitro-fostervävnadsbaserad tarmmodell för att studera tarmskador hos för tidigt födda barn. Enteroider kan användas för att testa förändringar i epitelpermeabilitet som regleras av täta korsningsproteiner. I enteroider differentieras tarmstamceller i alla epitelcelltyper och bildar en tredimensionell struktur på en källarmembranmatris som utsöndras av mussarkomceller. I den här artikeln beskriver vi de metoder som används för att etablera enteroider från fostrets tarmvävnad, karakterisera de enteroida täta korsningsproteinerna med immunofluorescerande avbildning och testa epitelpermeabilitet. Eftersom gramnegativ dominerande bakteriell dysbios är en känd riskfaktor för tarmskada använde vi lipopolysackarid (LPS), ett endotoxin som produceras av gramnegativa bakterier, för att inducera permeabilitet i enteroiderna. Fluoresceinmärkt dextran mikroinjicerades i enteroidlumen, och seriella dextrankoncentrationer som läckte ut i odlingsmediet mättes för att kvantifiera förändringarna i paracellulär permeabilitet. Experimentet visade att apikal exponering för LPS inducerar epitelpermeabilitet på ett koncentrationsberoende sätt. Dessa fynd stöder hypotesen att gramnegativ dominerande dysbios bidrar till mekanismen för tarmskada hos för tidigt födda barn.
Introduction
För tidigt födda barn utsätts för frekvent och långvarig inflammation som ger dem en ökad risk för tarmskada som resulterar i långvarig funktionsnedsättning eller död1. Forskningen inom detta område utmanas av den begränsade förmågan att utföra experiment på sårbara för tidigt födda barn. Dessutom har bristen på lämpliga modeller hindrat den omfattande studien av den för tidiga tarmmiljön2. Befintliga in vitro- och in vivo-modeller har misslyckats med att på ett heltäckande sätt representera den för tidiga mänskliga tarmmiljön. Specifikt kan enstaka epiteliala fostercellinjer inte bilda täta korsningar, och djurmodeller uppvisar olika inflammatoriska och immunologiska svar än mänskliga för tidigt födda barn. Med upptäckten av Wnt-signalering som en primär väg i spridningen och differentieringen av tarmkryptostamceller och de nya Lgr5+ vävnadsstamcellerna etablerades tarmvävnadsderiverade organoider såsom enteroider och koloider som in vitro-modeller 3,4,5. Med hjälp av denna teknik är det möjligt att skapa och använda tredimensionella (3D) enteroidmodeller som utvecklas från hela vävnaden eller biopsi i en tarm för att studera epitelsvar på tarmmiljön 6,7.
I motsats till typiska tarmcellinjer som odlas i odling uppvisar enteroider polaritet med en lumen förbunden med täta korsningsproteiner8. Detta möjliggör exponering för den basolaterala gränsen i tillväxtmediet, liksom luminal mikroinjektion för att bedöma den apikala gränsen. Vidare uppvisar enteroider liknande genetiska, fysiologiska och immunologiska egenskaper som det humana epitelet 9,10. Fostervävnad-härledda enteroider möjliggör undersökning av prematuritetens roll på epitelfunktionen. De unika egenskaperna hos enteroider kan likna den prematura tarmmiljön närmare9. Vävnadsderiverade enteroider kan användas för att testa för tät korsningsintegritet som en monolagerform eller som 3D-strukturer inbäddade i en stelnad källarmembranproteinblandning. En mikroinjektionsteknik krävs för den senare formen om en apikal exponering önskas. Mätningen av epitelsvar i enteroidmodeller inkluderar genuttryck genom RNA-sekvensering, biomarkörer med enzymbunden immunanalys (ELISA) eller avancerade avbildningstekniker. Tekniken som presenteras här ger ett annat genomförbart alternativ för att mäta grov permeabilitet med fluorometri.
Tarmskada hos för tidigt födda barn har en multifaktoriell patogenes som inkluderar obalansen i tarmmikrobiella samhället. Enteroider kan ge utmärkta modeller för att studera vissa aspekter av prematura tarmsjukdomar som nekrotiserande enterokolit som involverar epitelfunktioner11. Enteroider uppvisar liknande egenskaper som den mänskliga fostertarmen10. Att utsätta enteroider för lipopolysackarid (LPS), ett endotoxin som produceras av gramnegativa bakterier, i odlingsmediet som en basolateral exponering inducerar genuttryck som kan leda till ökad inflammation och tarmpermeabilitet7. Denna studie syftar till att utvärdera förändringarna i grov epitelpermeabilitet efter apikal exponering för bakterieprodukter som LPS. Resultaten kan ge insikt i de mikrob-epitelinteraktioner som är involverade i patogenesen av tarmskada. Metoden som är utformad för att testa grov permeabilitet kräver mikroinjektionsinställning och skicklighet.
Protocol
Samlingen av mänsklig vävnad godkändes av University of Washington Institutional Review Board (studie-ID: STUDY380 och CR ID: CR3603) och utfördes av Birth Defects Research Laboratory. Birth Defects Research Laboratory stöddes av NIH-prisnummer 5R24HD000836 från Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development. Proverna samlades in från samtyckande deltagare och skickades som avidentifierade och utan någon hälsoinformation. Tunntarmsproverna lagrades i iskalla Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) och skickades över natten till det mottagande laboratoriet.
1. Beredning av reagens
OBS: Se materialförteckningen för en lista över reagenser och katalognummer; De rekommenderade volymerna är för en 6-brunnsplatta om inte annat anges.
- Bered 0,1% bovint serumalbumin (BSA) genom att lösa 50 mg BSA-pulver i 50 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 100 μg / ml av ett bredspektrum antibiotikum primocin för att belägga alla plastvaror och spetsar som kommer i kontakt med vävnader eller enteroider.
- För att belägga med BSA, placera icke-filtrerade pipettspetsar i ett 50 ml koniskt rör med tillräckligt med BSA för att täcka spetsarna, tillsätt 1-2 ml BSA för att täcka petriskålens yta eller fyll 15 ml koniska rör med BSA i minst 20-30 minuter vid rumstemperatur före användning.
- Bered DPBS-media genom att blanda 50 ml DPBS med 100 μg/ml primocin och 50 μg/ml gentamicin. Förbered detta medium med och utan 2,5 μg/ml amfotericin.
- Förbered enteroidtillväxtmedia genom att blanda 2 ml organoid tillväxtmedium, 100 μg / ml primocin, 10 μM Y27632 och 2,5 μM CHIR99021. Gör färska medier dagligen och värm det i en cellodlingsinkubator vid 37 °C.
OBS: Utspädningsfaktorn för Y27632 är 1:250. För CHIR99021, späd CHIR-stamlösningen till 1:100 i varma medier och sedan till 1:40 i enteroidtillväxtmedia för att uppnå en utspädning på 1:4000. - Förbered källarmembranmatrisblandningen genom att lägga till stamkällarmembranmatrisen 10 μM Y27632 och 2,5 μM CHIR99021. Gör totalt 285 μl av den slutliga källarmembranmatrisblandningen vid en proteinkoncentration på 8 mg / ml för en brunn på en 6-brunnsplatta.
OBS: Källarmembranmatrisen måste vara iskall för att hålla sig i flytande form och stelnar vid varmare temperaturer. Proteinkoncentrationen i stamkällarmembranmatrisen bestämmer den volym som krävs för att göra en slutlig proteinkoncentration på 8 mg/ml med hjälp av ekvationen:
Volym 1 × Koncentration 1 = Volym 2 × Koncentration 2 - Bered 4% paraformaldehyd (PFA) genom att späda 32% lager PFA i PBS med 1:8 och förvara vid rumstemperatur. Gör 0,5 ml för varje brunn av enteroider som ska fixeras.
- Förbered blockeringsbuffert genom att tillsätta 5% getserum och 0,5% Triton X-100 i PBS. Förbered 1 ml för den första antikroppen per brunn och 0,5 ml för den ytterligare antikroppen per brunn.
OBS: Använd serum från samma art som värden för de sekundära antikropparna - Förbered primära och sekundära antikroppar, utspädda i blockerande buffert vid den koncentration som rekommenderas av tillverkaren för varje antikropp.
- Bered 5 μg/ml Dmidino-2-fenylindol (DAPI) genom att späda till 1:200 från 1 mg/ml stamlösning i PBS. Gör 0,5 ml per brunn av färgade enteroider.
- Förbered 70% glycerol i PBS och gör 0,5 ml för montering av enteroiderna på mikroskopglas.
- Bered 5 mg/ml dextran-FITC (fluorescein-isotiocyanat) genom att späda stamlösningen på 25 mg/ml i PBS med förhållandet 1:5. Gör 20 μl för mikroinjektion.
- Bered lipopolysackarider (LPS) och dextran-FITC genom att rekonstituera LPS-pulvret i PBS till en 5 mg/ml stamlösning. Späd stamlösningar av LPS och dextran i PBS till 0,1 mg/ml och 0,5 mg/ml LPS och 5 mg/ml dextran-FITC. Gör 20 μl för mikroinjektion.
- Bered etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraättiksyra (EGTA) genom att göra en stamlösning på 0,2 M genom att lösa EGTA-pulver i destillerat vatten och justera pH-värdet till cirka 8 med saltsyra (HCl). Bered en testkoncentration på 2 mM i odlingsmedier genom att utföra en utspädning på 1:100.
2. Insamling av prover
- När proverna har mottagits, utför epitelcellisolering och plätering inom 24 timmar efter provsamlingen.
3. Intestinal epitelcellplätering i källarmembranmatris från hela prover
OBS: Denna procedur följer modifierade protokoll från Translational Tissue Modeling Laboratory vid University of Michigan12,13,14. Att använda tillväxtmedia med en hög Wnt-faktor ger konsekventa resultat för enteroid etablering. När enteroiderna är etablerade, använd samma media med en hög Wnt-faktor för att driva enteroiderna till sfäriska former för mikroinjektion.
- Överför tarmsegmenten till en 60 mm x 15 mm petriskål med iskall DPBS med amfotericin och blötlägg i 20 min på is. Medan vävnaden suger, identifiera regionerna (tolvfingertarmen, jejunum eller ileum) i tunntarmen och ta bort bindväven och blodkärlen med pincett och sax. Tvätta lumenhalten efter behov med en liten 23-25 G nål och en 3 ml spruta utan att störa epitelet.
- Skär tarmsegmenten i 3-5 mm bitar med en skalpell och placera 1-2 stycken (för plätering i en brunn på en 6-brunnsplatta) i en 35 mm x 15 mm petriskål som innehåller 0,5-1 ml organoid tillväxtmedium på is.
- Använd dissekering av mikrosax och pincett, skär tarmröret i längdriktningen. Använd pincettspetsen för att skrapa epitelcellerna från fascian under ett 10x stereomikroskop. Ta bort fascian och virvla skålen för att bryta upp cellklumparna.
- Använd en 20 μL pipettskuren spets för att överföra cellerna och mediet i ökningen 5-10 μL till källarmembranmatrisblandningen för att göra en 285 μL lösning vid en 8 mg / ml matrisproteinkoncentration. Pipett upp och ner långsamt 20x för att blanda celler i källarmembranmatris på is med en 200 μL skurspets.
- Placera fem 50 μL-remsor av cellkällarmembranmatrisblandningen i en brunn i en förvärmd 6-brunnsplatta som hålls på en varm skumsten. Inkubera plattan i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C och 5%CO2 i 10 minuter så att källarmembranmatrisen kan polymerisera och härda.
- Tillsätt 2 ml av enteroidtillväxtmediet i brunnen i de stelnade källarmembranmatrisremsorna och placera tillbaka inuti cellodlingsinkubatorn. Ändra media dagligen för att öka enteroid tillväxt. Kontrollera om tarmstamcellsdifferentiering sker under ett 10x inverterat mikroskop dagligen.
- Efter 10-14 dagar, passera enteroiderna i en brunn på en 12-brunns- eller 6-brunnsplatta, beroende på enteroiddensiteten. Börja byta media varannan dag och passera i ett 1: 2-förhållande var 5-7: e dag när enteroiderna börjar trivas.
- Ta bort cellerna som inte skiljer sig åt i enteroider med källarmembranmatrisskiktet under passager. Skapa ett fryst lager av enteroider med låg passage genom att frysa dem i 80% tillväxtmedia, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 10% dimetylsulfoxid (DMSO), om det behövs.
4. Immunofluorescerande färgning av enteroider
OBS: Processen med fixering och färgning tar 3 dagar. I detta protokoll fixade och färgade vi för kärnor (DAPI), epitelmarkörer (villin, CDX2), lysozym, mucin och täta korsningsproteiner (claudin 2, claudin 3, ockludin, zonula occluden-1) med hjälp av ett modifierat protokoll15. Fluorescerande bilder togs av ett konfokalmikroskop.
- Fastställande
OBS: Denna process görs vanligtvis samtidigt som enteroidpassagen eller frysningsproceduren.- Placera enteroidplattan på is. Ta bort tillväxtmediet och tvätta försiktigt 2x med kalla DPBS.
- Identifiera enteroiderna som ska fixas och färgas. Överför dem till en 12-brunnsplatta genom att försiktigt pipettera dem med en 200 μL skärspets eller använda en 1 μL ympningsslinga. Placera enteroider i separata brunnar om färgning med olika antikroppar ska göras.
- Ta bort så mycket vätska med en 200 μL spets som möjligt utan att störa enteroiderna. Tillsätt 0,5 ml 4% PFA och inkubera i 30 min vid rumstemperatur. Virvla plattan ibland för att underlätta avlägsnande av enteroiderna från källarmembranmatrisen.
- Undersök grovt för att bestämma avlägsnandet av enteroiderna från källarmembranmatrisen. Aspirera försiktigt och kassera vätskan PFA utan att störa enteroiderna. Tvätta med PBS 3x för att ta bort PFA och eventuell kvarvarande källarmembranmatris
OBS: Aspirering av vätskan under ett stereomikroskop kan vara till hjälp för att undvika enteroiderna. Fasta enteroider kan förvaras i PBS vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Blockering
- Ta försiktigt bort kvarvarande PBS med en 200 μL pipett, utan att störa enteroiderna. Tillsätt 0,5 ml blockerande buffert och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Ta bort och kassera blockeringsbufferten med en pipett på 200 μl, var försiktig så att du inte stör enteroiderna.
- Antikroppsfärgning
- Tillsätt 500 μl primär antikropp i blockerande buffert till varje brunn med enteroider. För primära antikroppar och för lysozym är utspädningsfaktorn 1:100, för CDX2 är utspädningsfaktorn 1:100 och för villin är utspädningsfaktorn 1:50. Inkubera vid 4 °C över natten.
- Följande dag, ta bort antikroppslösningen och tvätta 3x med PBS. Tillåt 10-15 min inkubationstid för varje tvätt.
- Upprepa steg 4.3.1–4.3.2. för den sekundära antikroppen med en utspädningsfaktor på 1:400.
- Tillsätt 500 μl DAPI vid 5 μg/ml i PBS och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Tvätta 3x med PBS efter inkubation och låt 10-15 min inkubationstid för varje tvätt
- Beslag
- Ta bort så mycket PBS som möjligt. Tvätta de färgade enteroiderna med 70% glycerol 1x.
- Lyft enteroiderna ur plattan med en 1 μL ympningsögla eller en skuren 200 μL spets och montera med 70% glycerol på ett glasmikroskopglas.
- För att bevara enteroidernas 3D-struktur, se till att det finns ett utrymme på 0,5-1 mm mellan den nedre glasskivan och täckglaset. Använd utskärningar av tunt kiselgummiark eller glasöverdrag för att skapa ett utrymme mellan glasskivan och täckglaset. Enteroiderna kan nu avbildas med ett konfokalmikroskop.
5. Förberedelse för mikroinjektion av enteroider
OBS: Mikroinjektionsprotokollet är ett modifierat protokoll från Hill et al.16 för att passa resurserna och inställningen. Några av förberedelsestegen måste slutföras några dagar i förväg.
- Ställa in mikroinjektionsinställningen
- Ställ in mikroinjektorapparaten antingen inuti ett biosäkerhetsskåp eller på en ren räknare, beroende på syftet med experimenten, enligt följande: ett stereomikroskop för visning, en mikromanipulator med X-, Y- och Z-axelkontrollnobbar monterade på ett tungt stativ bredvid mikroskopet, en mikropipetthållare monterad på mikromanipulatorarmen, en mikroinjektorslang som förbinder mikropipetthållaren och en spruta med en trevägs stoppkran, sedan till en pneumatisk pump och en väggluftkälla ansluten till pumpen (figur 1).
- Desinficera mikroinjektionsapparaten med 70% etanol före experimentell användning och därefter. Testa placeringen av mikroskopet och mikromanipulatorn för att passa de önskade fysiska specifikationerna, inklusive att flytta axelknapparna för att säkerställa att mikropipetten kan nå det riktade provet.
- Framställning av mikropipetten
OBS: Utför dessa steg i förväg.- Använd en mikropipettdragare för att dra in glaskapillärrören i mikropipetterna.
- Under stereomikroskopet placerar du mikropipetten på en horisontell mikropipetthållare (figur 2), fokuserar på spetsarna och skär spetsarna med en mikrosax medan du tittar genom mikroskopets okular. Förbered cirka 10-15 mikropipetter med en liknande spetsstorlek för varje experiment.
- Testa spetsstorleken genom att dra upp 0,5-1 μL vätska och räkna hur många pumpar som behövs för att tömma volymen. Testa flera spetsstorlekar för att hitta rätt storlek för experimentet. En lämplig spetsstorlek matar ut cirka 10-30 nL volym per pump.
- Förvara de skurna glasmikropipetterna i en ren låda eller ett rör utan att skada spetsarna.
OBS: Förskurna mikropipetter finns tillgängliga kommersiellt.
- Enteroid beredning
- Lägg en tallrik med mestadels stora och sfäriska enteroider på is. Byt ut det gamla tillväxtmediet med färskt medium.
- Dissociera försiktigt källarmembranmatrisprickarna från plattan med en celllyftare. Virvla gelprickarna från sida till sida på is för att bryta upp källarmembranmatrisen utan att störa enteroiderna.
- Välj cirka 10-15 sfäriska enteroider med en skuren 20 μL pipettspets under ett stereomikroskop och lägg till källarmembranmatrisen för att göra 285 μL av 8 mg / ml proteinkoncentrationsblandning.
- Pipett upp och ner försiktigt med en skuren 200 μL spets för att blanda enteroiderna utan att bryta dem. Platta fem 50 μL gelprickar i mitten av en rund 35 mm x 10 mm cellodling petriskål eller en med liknande dimensioner.
- Inkubera enteroidgelprickarna vid 37 °C i 10 minuter för att stelna. Tillsätt sedan 1 ml färskt tillväxtmedium i skålen. Inkubera enteroiderna i minst 2-3 dagar för stabilisering och tills enteroiderna når en lämplig storlek på 0,5-1 μl.
OBS: Det är viktigt att ha en skål med låg vägg för enklare åtkomst till enteroiderna och en liten diameter för mindre volym tillväxtmedium.
- Mikroinjektion av dextran-FITC och testat material
- Stäng av trevägsstoppkranen till den pneumatiska pumpen. Fyll mikropipetten med det injicerade materialet, i detta fall dextran-FITC med eller utan LPS.
- Förbered en petriskål täckt med en remsa transparent film. Placera två till fyra 1 μL prickar injicerat material på filmen.
- Använd mikromanipulatorn för att driva mikropipettens spets till precis inuti vätskan men ovanför filmen under visualiseringen av ett stereomikroskop. Dra försiktigt i sprutan för att dra tillbaka det injicerade materialet i mikropipetten.
- Fyll mikropipetten med 2-4 μL injicerat material och tryck på sprutan för att avlägsna luft vid mikropipettens spets. Kontrollera den injicerade materialkolonnen i mikropipetten för att se till att det inte finns någon luftficka. Registrera volymen injicerat material som drog sig tillbaka inuti mikropipetten.
OBS: Vätskan är synlig i en grönaktig färg på grund av dextran-FITC. - Slå på luftkällan som är ansluten till den pneumatiska pumpen, vilket ger ett lufttryck på cirka 60 psi. Slå på pumpen och ställ in pumpens varaktighet på 10-15 ms. Vrid stoppkranen på sprutan för att öppna ledningen från pumpen till mikropipetten.
OBS: Den längre pumptiden gör att mer material kan släppas per pump. Det rekommenderas att använda samma pumpvaraktighet och mikropipetter med liknande spetsstorlekar för hela experimentet för uppskattning av den injicerade volymen. - Ta bort enteroiderna från cellodlingsinkubatorn och placera diskarna ovanpå en varm skumsten i en täckt behållare för att begränsa ljusexponeringen efter mikroinjektion.
- Placera petriskålen med enteroider under stereomikroskopet och flytta mikromanipulatorknapparna för att placera mikropipettens spets i cirka 35 ° -45 ° vinkel mot den horisontella ytan (figur 3). Detta kräver lite övning i förväg.
- Visualisera och kartlägg enteroiderna i varje petriskål under mikroskopet för att göra en plan för att injicera cirka 3-5 sfäriska enteroider per maträtt.
- När spetsen på mikropipetten är nära vätskeytan, titta in i mikroskopets okular för att föra spetsen mot den riktade enteroiden.
- Punktera enteroiden med mikropipettspetsen genom att föra z-axelvredet framåt med en exakt långsam rörelse. Enteroidväggen kommer att trycka ner och dyka upp igen när spetsen går igenom enteroidytan, vid vilken tidpunkt framsteget ska sluta.
- Tryck på pumppedalen med en fot och fyll enteroiden med den grönaktiga dextran-FITC-lösningen tills den är något expanderad. Registrera antalet pumpar för att beräkna pumpvolymen och dextrankoncentrationen.
- Dra ut spetsen på mikropipetten efter avslutad mikroinjektion och flytta till nästa enteroid. Med övning kan processen gå smidigt.
- Om spetsen går sönder, byt ut den med en annan mikropipett med liknande spetsstorlek. Dra tillräckligt med volym injicerat material för alla enteroider i samma exponeringsgrupp och byt mikropipett mellan injicerade material för att undvika korskontaminering.
- Placera den injicerade enteroidskålen under skydd för att undvika ljusexponering.
- Dextran-FITC insamling och mätning
- Efter mikroinjektionsproceduren, ta omedelbart bort odlingsmediet. Tvätta med färskt tillväxtmedium 2x för att ta bort eventuell kvarvarande dextran-FITC. Lägg till färska medier och registrera tiden som tid 0 efter mikroinjektion.
OBS: Du kan behöva en andra person för att utföra detta steg utan att störa mikroinjektionsprocessen. - Samla 200 μl odlingsmedia i ett ogenomskinligt 0,5 ml mikrofugerör och ersätt sedan det borttagna odlingsmediet med samma volym färskt tillväxtmedium vid 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h och 12 h efter mikroinjektioner.
OBS: Tidsintervallet kan variera beroende på experimentet. Vid en basolateral exponering bör ersättningsmediet innehålla exponeringen i samma koncentration. - Förvara de insamlade odlingsmedierna vid 4 °C och mät dextrankoncentrationen inom 24 timmar. Förvara överblivna medier vid −80 °C för andra analyser. I slutet av kulturmediesamlingen, skörda enteroiderna för RNA-extraktion eller avbildning, om det behövs.
- Mät dextran-FITC-koncentrationer med en fluorescensmikroplattläsare. Konstruera en standardkurva för varje platta med hjälp av seriella utspädningar och genom att montera en linjär regressionslinje enligt figur 4.
- Korrigera absorbansen för den borttagna volymen odlingsmedier som innehåller dextran som ersattes med färskt tillväxtmedium utan dextran enligt följande: avlägsnande av 200 μL av 2 ml odlingsmedier är 10 volymprocent.
Korrigerad absorbans vid 2 h = (absorbans vid 1 h x 10%) + uppmätt absorbans vid 2 h
Absorbansen hos det första korrigerade mediet behöver inte korrigeras. Beräkna sedan dextrankoncentrationen från det korrigerade absorbansvärdet med hjälp av standardkurvekvationen. - För normalisering, dela dextrankoncentrationen med det totala antalet pumpar för varje petriskål och multiplicera sedan med det största totala antalet pumpar per maträtt.
OBS: All exponering utförs i tre exemplar (tre petriskålar per exponering med 3-5 mikroinjicerade enteroider per maträtt). Medelvärdena för tredubblarna jämförs mellan exponeringar med hjälp av ett Students t-test.
- Efter mikroinjektionsproceduren, ta omedelbart bort odlingsmediet. Tvätta med färskt tillväxtmedium 2x för att ta bort eventuell kvarvarande dextran-FITC. Lägg till färska medier och registrera tiden som tid 0 efter mikroinjektion.
Representative Results
Vi etablerade en enteroid cellinje från donerad ileum fostervävnad efter modifierade protokoll från våra medarbetare vid University of Michigan Translational Tissue Modeling Laboratory12. Den enteroida cellinjen testade negativt för Mycoplasma-infektion . Enteroiderna färgade positivt för villin, CDX2, lysozym, mucin, claudin, ockludin och zonula-ockluden 1 (figur 5), vilket bekräftar deras tunntarmsepiteliala ursprung. Enteroiderna mikroinjicerades med 4 kDa dextran-FITC vid 5 mg/ml i PBS (figur 6). Testexponeringarna var LPS i olika koncentrationer, 0,1 mg/ml och 0,5 mg/ml, blandat med dextran-FITC för apikal exponering. Som en positiv kontroll använde vi 2 mM EGTA och tillsatte den till odlingsmediet vid 4 timmar efter mikroinjektion av dextran. EGTA är en kalciumchelator som ökar permeabiliteten hos täta korsningar. De negativa kontrollerna mikroinjicerades med dextran-FITC enbart i PBS. För basolateral exponering hade ersättningsmediet för insamling av seriella odlingsmedier samma koncentration av exponeringen (dvs. 2 mM EGTA). Resultaten visar en tydlig ökning av dextrankoncentrationen i odlingsmedier efter tillsats av EGTA jämfört med den negativa kontrollen, PBS. Apikal exponering av LPS inducerade högre permeabilitet av dextran med början cirka 8 timmar efter exponering på ett koncentrationsberoende sätt (figur 7).
Bild 1: Inställning av mikroinjektor. Installationen inkluderar ett stereomikroskop, mikromanipulator monterad på ett magnetiskt stativ på en tung stålplatta, en mikropipetthållare ansluten till en spruta med en trevägs stoppkran och en pneumatisk pump. Vägglufttillförseln ger lufttrycket, som regleras av pumpen för att generera en jämn pumpvolym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Horisontell mikropipetthållare. Denna plastplattform är utformad för att hålla mikropipetten efter att ha dragit av glaskapillärröret för att skära spetsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mikropipettpositionering. En vinkel på 35°-45° är idealisk för injektion av enteroider som ligger mitt i petriskålen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Dextran-standardkurva. Kurvan konstruerades med fluorescerande absorbans av 10 seriella utspädningar av dextran i dubbletter. En linjär regressionslinje anpassades för att generera en regressionsekvation. Felstaplarna är SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Fluorescerande biomarkörer för enteroider. DAPI för kärnfläck är blå. Följande biomarkörer visas: (A) villin, (B) CDX2, (C) lysozym, (D) mucin, (E) klaudin, (F) ockludering och (G) zonula-ockluden 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Enteroider i olika stadier . (A) En enteroid vid 7-10 dagar gammal är liten och med en tjock vägg. (B) En enteroid som är klar för mikroinjektion med stor storlek, en lumen och en tankevägg och (C) fluorescerande dextran-FITC inuti en enteroid 2 dagar efter mikroinjektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Permeabilitet för dextran-FITC efter mikroinjektion . (A) Uppmätta dextrannivåer i media var högre efter tillsats av EGTA jämfört med PBS. (B) Mikroinjicerad 0,5 mg / ml LPS inducerade större läckage av dextran från enteroidlumen till mediet än mikroinjicerat 0,1 mg / ml LPS började vid 8 timmar efter injektionen. *p-värde < 0,05, felstaplar är SEM, n = 3, ett Students t-test användes för att beräkna signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll beskriver upprättandet av enteroider från fostrets tarmvävnad, samt modellkarakterisering med immunofluorescerande färgning och epitelial permeabilitetstestning. Enteroidernas permeabilitet testades med hjälp av en mikroinjektionsteknik och seriella tidsförloppsmätningar av läckt dextran-FITC-koncentration i odlingsmediet. Nyheten i detta protokoll är den apikala exponeringen som mer liknar människans tarmfysiologi jämfört med basolateral exponering i odlingsmediet7. i tidigare studier använde Hill et al. seriell avbildning och beräkning av fluorescensintensiteten över tid16. exponerade det basolaterala membranet i en epitelmodell för LPS och jämförde sedan det cellulära genuttrycksmönstret7. I jämförelse använder vi apikal exponering av de testade reagenserna och undersöker sedan potentiella förändringar i grov permeabilitet genom att mäta seriella koncentrationer av läckt dextran i odlingsmediet. Vår metod möjliggör också seriell jämförande analys av cytokiner som produceras av epitelceller i odlingsmedier och genuttryck genom att samla cellulärt mRNA. LPS har ofta använts för att studera tarmskada hos djur- och in vitro-modeller på grund av dess förmåga att inducera permeabilitet och inflammation 7,17. När LPS testades i denna modell differentierades epitelpermeabiliteten genom exponeringskoncentration. Detta protokoll kan utvidgas för att studera andra sjukdomspatologier med hjälp av olika mikroinjicerade material och resultatmätningar.
Kritiska steg i detta protokoll inkluderar etablering av enteroider från fostrets tarmvävnader, enteroid karakterisering och mikroinjektionstekniken. Integriteten hos denna studie beror på korrekt cellprovtagning. Att använda anatomiska landmärken och blodkärl är till hjälp för att säkerställa valet av tunntarmsceller. På grund av den robusta tillväxten och differentieringen av fostrets tarmstamceller är ett omfattande förfarande för att isolera stamcellerna från andra epitelceller inte nödvändigt. Efter att enteroiderna har fastställts är det viktigt att bekräfta modellens egenskaper genom färgning för proteiner och cellmarkörer. I detta protokoll färgades enteroiderna för enterocyter med villin och CDX2, Paneth-celler med lysozym och bägare celler med mucin, alla celler som finns i tunntarmsepitelet18,19,20. Till skillnad från traditionella enskilda cellinjer som visar en celltyp, etablerar enteroider alla celltyper från tarmstamcellerna8. Färgningsdelen av detta protokoll kan modifieras för de specifika cellulära markörerna av intresse. Avgörande för tillförlitligheten i detta protokoll är mikroinjektionstekniken. Konsistensen hos mikropipettspetsarna kan verifieras genom att mäta volymen per pump med dextran-FITC-lösning och visualisera spetsarnas diameter under mikroskopet. På grund av risken för kontaminering kan samma mikropipett inte användas för mer än en exponering. Dessutom kan enteroidernas form och tillväxt påverkas av innehållet i deras tillväxtmedier. Vi fann att de sfäriska snarare än blomkålformade enteroiderna gav bättre modeller för mikroinjektion. Den sfäriska formen kan induceras av en större Wnt-faktor i mediet21.
Detta protokoll beror till stor del på artistens skicklighet i mikroinjektion för att minska variationer, särskilt i tidskänsliga mätningar. Variationer kan minimeras genom att ha samma erfarna artist med konsekventa tekniker, använda samma cellursprung för att undvika genetisk variation, testa vid samma passage för att ta bort mognadsbias och odla cellerna i samma typ av media för liknande celldifferentiering. Komponenterna i tillväxtmediet kan inducera varierande differentiering av stamceller in vitro snarare än i en in vivo-miljö . Till exempel, in vivo, uttrycks lysozym inte förrän vecka 22-24 av graviditetsutveckling när Paneth-celler bildas och blir funktionella22. Vi kunde dock upptäcka lysozym i våra enteroider etablerade från 10-veckors fostertarmar. Denna metod kan begränsa antalet testade exponeringar samtidigt på grund av den höga tekniska skicklighet som krävs för mikroinjektion. Dextranläckaget från mikroinjektionspunktionshålet kan påverka bedömningen av permeabilitet. För att eliminera denna effekt rekommenderas trippeltvättar omedelbart efter mikroinjektionen för att avlägsna kvarvarande dextran från proceduren. Dextrankoncentrationen i mediet bör mätas varje timme i 4-6 timmar efter mikroinjektion. Experiment med en signifikant ökning av dextrankoncentrationen inom 2-4 timmar efter injektion bör uteslutas från den slutliga analysen.
Denna metod har flera fördelar. Det kräver en lägre kostnad och färre resurser jämfört med enteroid-härledda monolager på transwell. Dessutom kan det utvidgas till andra exponeringar som levande bakterier eller virus för att studera den initiala interaktionen mellan tarmmikrober och epitelet. Enteroidens slutna lumen kan upprätthålla en stabil tillväxt av mikroinjicerade levande bakterier utan kontaminering av tillväxtmediet13. Till skillnad från monolagret som utsätts för tillväxtmedia och inkubationssyre är det slutna lumen ett tätt, isolerat utrymme. En sluten lumen möjliggör ingen kommunikation till tillväxtmediet och en luminal syrehalt som är lägre över tid med levande bakterietillväxt13.
Användningen av fostrets tarmvävnad visar mer exakt tarmepitelet hos för tidigt födda barn jämfört med vuxna tarmstamceller eller djurmodeller7. Vidare möjliggör polariteten hos enteroider både apikala och basolaterala exponeringar och mätningar23. Enteroiderna bildar en sluten lumen med lägre syresättningskoncentration, som närmare efterliknar tarmarnas syresättningskoncentration24. Till skillnad från mer tekniskt avancerade protokoll16 möjliggör användningen av bruttomediemätningar större tillgänglighet för denna teknik. Experimentet visade att epitelläckage kan induceras av apikal exponering för LPS och är koncentrationsberoende. Eftersom denna metod undersöker förändringarna i läckt koncentration av dextran är den användbar för att upptäcka grova funktionella förändringar i snäva korsningar. Messenger RNA-insamling och sekvensering av de exponerade enteroiderna och western blot-analys kan komplettera analysen av de grova funktionella förändringarna. Denna modell studerar tarmepitelintegritet i ett system som mycket liknar den prematura miljön och därmed kan användas för att få en bättre förståelse för prematura tarmskador och andra sjukdomspatologier.
Disclosures
Alla författare förklarar att de inte har några intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Ian Glass och personalen vid Birth Defects Research Laboratory vid University of Washington för att dela fostervävnaderna. Vi tackar också Dr. Michael Dame och Dr. Jason Spence vid Translational Tissue Modeling Laboratory vid University of Michigan för deras oändliga stöd och vägledning under hela processen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
- Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
- Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132 (2017).
- Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
- Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587 (2020).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).
