Summary
Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.
Abstract
İnsan fetal dokusu kaynaklı enteroidler, preterm bebeklerde bağırsak yaralanmalarını incelemek için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmaktadır. Enteroidler, apikal kenarlıklı bir lümen, sıkı bağlantılar ve büyüme ortamına maruz kalan bazolateral bir dış tabakadan oluşan polarite sergiler. Bağırsak yaralanmalarının sonuçları mukozal inflamasyonu ve artan geçirgenliği içerir. Savunmasız preterm insan deneklerde bağırsak geçirgenliğinin test edilmesi genellikle mümkün değildir. Bu nedenle, preterm bebeklerde bağırsak yaralanmalarını incelemek için in vitro fetal doku kaynaklı bir bağırsak modeline ihtiyaç vardır. Enteroidler, sıkı bağlantı proteinleri tarafından düzenlenen epitel geçirgenliğindeki değişiklikleri test etmek için kullanılabilir. Enteroidlerde, bağırsak kök hücreleri tüm epitel hücre tiplerine farklılaşır ve fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan bir bazal membran matrisi üzerinde üç boyutlu bir yapı oluşturur. Bu makalede, fetal bağırsak dokusundan enteroidlerin oluşturulmasında, enteroid sıkı bileşke proteinlerinin immünofloresan görüntüleme ile karakterize edilmesinde ve epitel geçirgenliğinin test edilmesinde kullanılan yöntemler anlatılmaktadır. Gram-negatif dominant bakteriyel dysbiosis intestinal yaralanma için bilinen bir risk faktörü olduğundan, enteroidlerde geçirgenliği indüklemek için gram-negatif bakteriler tarafından üretilen bir endotoksin olan lipopolisakkarit (LPS) kullandık. Floresein etiketli dekstran, enteroid lümene mikroenjekte edildi ve parasellüler geçirgenlikteki değişiklikleri ölçmek için kültür ortamına sızan seri dekstran konsantrasyonları ölçüldü. Deney, LPS'ye apikal maruziyetin konsantrasyona bağlı bir şekilde epitel geçirgenliğini indüklediğini göstermiştir. Bu bulgular, gram-negatif dominant dysbiosis'in preterm bebeklerde intestinal yaralanma mekanizmasına katkıda bulunduğu hipotezini desteklemektedir.
Introduction
Preterm bebekler sık ve uzun süreli inflamasyona maruz kalırlar ve bu da onları uzun süreli sakatlık veya ölümle sonuçlanan bağırsak yaralanması riski altına sokar1. Bu alandaki araştırmalar, savunmasız preterm bebekler üzerinde deneyler yapma konusundaki sınırlı yetenek nedeniyle zorlanmaktadır. Ayrıca, uygun modellerin eksikliği, prematüre bağırsak ortamının kapsamlı bir şekilde incelenmesini engellemiştir2. Mevcut in vitro ve in vivo modeller, prematüre insan bağırsak ortamını kapsamlı bir şekilde temsil edememiştir. Spesifik olarak, tek epitelyal fetal hücre hatları sıkı kavşaklar oluşturmayabilir ve hayvan modelleri, insan preterm bebeklerinden farklı enflamatuar ve immünolojik yanıtlar sergiler. Bağırsak kript kök hücrelerinin ve yeni Lgr5+ doku kök hücrelerinin çoğalması ve farklılaşmasında birincil yol olarak Wnt sinyalizasyonunun keşfi ile enteroidler ve kolonoidler gibi bağırsak dokusundan türetilmiş organoidler in vitro modeller 3,4,5 olarak kurulmuştur. Bu teknolojiyi kullanarak, bağırsak ortamına epitel yanıtlarını incelemek için tüm dokudan veya bir bağırsağın biyopsisinden geliştirilen üç boyutlu (3D) enteroid modeller oluşturmak ve kullanmak mümkündür 6,7.
Kültürde yetişen tipik bağırsak hücre hatlarının aksine, enteroidler sıkı bağlantı proteinleri8 ile bağlanmış bir lümen ile polarite sergiler. Bu, büyüme ortamındaki bazolateral sınıra maruz kalmanın yanı sıra apikal sınırı değerlendirmek için luminal mikroenjeksiyona izin verir. Ayrıca, enteroidler insan epiteli 9,10 ile benzer genetik, fizyolojik ve immünolojik özellikler gösterirler. Fetal doku kaynaklı enteroidler, prematüritenin epitel fonksiyonu üzerindeki rolünün incelenmesine izin verir. Enteroidlerin benzersiz özellikleri, preterm bağırsak ortamına daha yakından benzeyebilir9. Doku kaynaklı enteroidler, tek katmanlı bir form olarak veya katılaşmış bir bazal membran protein karışımına gömülü 3D yapılar olarak sıkı bağlantı bütünlüğünü test etmek için kullanılabilir. Apikal maruziyet isteniyorsa, ikinci form için bir mikroenjeksiyon tekniği gereklidir. Enteroid modellerde epitel yanıtlarının ölçümü, RNA dizilimi ile gen ekspresyonunu, enzime bağlı immünoassay (ELISA) ile biyobelirteçleri veya ileri görüntüleme tekniklerini içerir. Burada sunulan teknik, florometri ile brüt geçirgenliği ölçmek için başka bir uygulanabilir seçenek sunmaktadır.
Preterm bebeklerde intestinal hasar, bağırsak mikrobiyal topluluğunun dengesizliğini içeren multifaktöriyel bir patogeneze sahiptir. Enteroidler, epitel fonksiyonlarını içeren nekrotizan enterokolit gibi erken bağırsak hastalıklarının belirli yönlerini incelemek için mükemmel modeller sağlayabilir11. Enteroidler, insan fetal bağırsağı10 ile benzer özellikler gösterir. Enteroidleri, gram-negatif bakteriler tarafından üretilen bir endotoksin olan lipopolisakkarite (LPS) maruz bırakmak, kültür ortamında, bazolateral maruziyet olarak, inflamasyonun artmasına ve bağırsak geçirgenliğine yol açabilecek gen ekspresyonunu indükler7. Bu çalışma, LPS gibi bakteriyel ürünlere apikal maruziyet sonrası brüt epitel geçirgenliğindeki değişiklikleri değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Sonuçlar, intestinal hasarın patogenezinde rol oynayan mikrop-epitel etkileşimleri hakkında fikir verebilir. Brüt geçirgenliği test etmek için tasarlanan yöntem, mikroenjeksiyon kurulumu ve becerisi gerektirir.
Protocol
İnsan dokusu koleksiyonu, Washington Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma kimliği: STUDY380 ve CR ID: CR3603) tarafından onaylanmış ve Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı tarafından gerçekleştirilmiştir. Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü'nden 5R24HD000836 numaralı NIH ödülü ile desteklenmiştir. Örnekler rıza gösteren katılımcılardan toplandı ve kimliksizleştirilmiş ve herhangi bir sağlık bilgisi olmadan gönderildi. İnce bağırsak örnekleri, buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) saklandı ve bir gecede alıcı laboratuvara postalandı.
1. Reaktif hazırlama
NOT: Reaktiflerin ve katalog numaralarının listesi için Malzeme Tablosu'na bakın; Önerilen hacimler, aksi belirtilmedikçe 6 delikli bir plaka içindir.
- Dokularla veya enteroidlerle temas eden tüm plastik eşyaları ve uçları kaplamak için 50 mg BSA tozunu 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 100 μg / mL geniş spektrumlu bir antibiyotik primosin ile çözerek% 0.1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın.
- BSA ile kaplamak için, filtrelenmemiş pipet uçlarını, uçları örtecek kadar BSA'ya sahip 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin, Petri kabı yüzeyini kaplamak için 1-2 mL BSA ekleyin veya kullanımdan önce oda sıcaklığında en az 20-30 dakika boyunca 15 mL konik tüpleri BSA ile doldurun.
- 50 mL DPBS'yi 100 μg/mL primosin ve 50 μg/mL gentamisin ile karıştırarak DPBS ortamını hazırlayın. Bu ortamı 2,5 μg / mL amfoterisin ile ve olmadan hazırlayın.
- 2 mL organoid büyüme ortamı, 100 μg / mL primosin, 10 μM Y27632 ve 2,5 μM CHIR99021'i karıştırarak enteroid büyüme ortamı hazırlayın. Günlük taze medya yapın ve 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe ısıtın.
NOT: Y27632 için seyreltme faktörü 1:250'dir. CHIR99021 için, CHIR stok çözeltisini sıcak ortamda 1:100'e ve daha sonra enteroid büyüme ortamında 1:40'a kadar seyrelterek 1:400 seyreltme elde edin. - Stok bazal membran matrisine 10 μM Y27632 ve 2,5 μM CHIR99021 ekleyerek bazal membran matris karışımını hazırlayın. 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için 8 mg / mL'lik bir protein konsantrasyonunda toplam 285 μL nihai bazal membran matris karışımı yapın.
NOT: Bodrum membran matrisinin sıvı halde kalması için buz gibi soğuk olması gerekir ve daha sıcak sıcaklıklarda katılaşır. Stok bazal membran matrisinin protein konsantrasyonu, denklemi kullanarak 8 mg / mL'lik bir nihai protein konsantrasyonu yapmak için gereken hacmi belirler:
Cilt 1 × Konsantrasyon 1 = Cilt 2 × Konsantrasyon 2 - PBS'deki %32'lik stok PFA'yı 1:8 oranında seyrelterek %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. Enteroidlerin sabitlenmesi için her bir kuyucuk için 0,5 mL yapın.
- PBS'ye %5 keçi serumu ve %0,5 Triton X-100 ekleyerek blokaj tamponu hazırlayın. Kuyu başına ilk antikor için 1 mL ve kuyu başına ek antikor için 0,5 mL hazırlayın.
NOT: İkincil antikorların konakçısı ile aynı türden serum kullanın - Her bir antikor için üretici tarafından önerilen konsantrasyonda bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil ve ikincil antikorlar hazırlayın.
- PBS'de 1 mg/mL stok çözeltisinden 1:200'e kadar seyrelterek 5 μg/mL Dmidino-2-fenilindol (DAPI) hazırlayın. Lekeli enteroidlerin kuyusu başına 0,5 mL yapın.
- PBS'de% 70 gliserol hazırlayın ve enteroidleri mikroskop slaytlarına monte etmek için 0.5 mL yapın.
- PBS'deki 25 mg/mL stok çözeltisini 1:5 oranında seyrelterek 5 mg/mL dekstran-FITC (Floresein-İzotiyosiyanat) hazırlayın. Mikroenjeksiyon için 20 μL yapın.
- PBS'deki LPS tozunu 5 mg / mL'lik bir stok çözeltisine yeniden yapılandırarak lipopolisakkaritler (LPS) ve dekstran-FITC'yi hazırlayın. LPS ve dekstran stok çözeltilerini PBS'de 0.1 mg / mL ve 0.5 mg / mL LPS ve 5 mg / mL dextran-FITC'ye seyreltin. Mikroenjeksiyon için 20 μL yapın.
- Etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA), EGTA tozunu damıtılmış suda çözerek ve hidroklorik asit (HCl) kullanarak pH'ı yaklaşık 8'e ayarlayarak 0.2 M'lik bir stok çözeltisi yaparak hazırlayın. Kültür ortamında 1:100 seyreltme yaparak 2 mM'lik bir test konsantrasyonu hazırlayın.
2. Örnek toplama
- Numuneler alındıktan sonra, numune toplama işleminden sonraki 24 saat içinde epitel hücre izolasyonu ve kaplaması yapın.
3. Tüm örneklerden bazal membran matrisinde intestinal epitel hücre kaplaması
NOT: Bu prosedür, Michigan Üniversitesi12,13,14'teki Translasyonel Doku Modelleme Laboratuvarı'ndan modifiye edilmiş protokolleri takip eder. Yüksek Wnt faktörüne sahip büyüme ortamlarının kullanılması, enteroid oluşumu için tutarlı sonuçlar verir. Enteroidler kurulduktan sonra, enteroidleri mikroenjeksiyon için küresel şekillere sürmek için yüksek Wnt faktörüne sahip aynı ortamı kullanın.
- Bağırsak segmentlerini, amfoterisin ile buz gibi soğuk DPBS ile 60 mm x 15 mm Petri kabına aktarın ve buzda 20 dakika bekletin. Doku ıslanırken, ince bağırsağın bölgelerini (duodenum, jejunum veya ileum) tanımlayın ve forseps ve makasla bağ dokusunu ve kan damarlarını çıkarın. Epiteli bozmadan küçük bir 23-25 G iğne ve 3 mL'lik bir şırınga kullanarak lümen içeriğini gerektiği gibi yıkayın.
- Bağırsak segmentlerini bir neşter kullanarak 3-5 mm'lik parçalara bölün ve buz üzerinde 0.5-1 mL organoid büyüme ortamı içeren 35 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına 1-2 parça (6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna kaplama için) yerleştirin.
- Diseksiyon mikro makas ve forseps kullanarak, bağırsak tüpünü uzunlamasına kesin. Epitel hücrelerini fasyadan 10x stereo mikroskop altında kazımak için forseps ucunu kullanın. Fasyayı çıkarın ve hücre kümelerini parçalamak için çanağı döndürün.
- 8 mg/mL matris protein konsantrasyonunda 285 μL'lik bir çözelti oluşturmak üzere hücreleri ve ortamları 5-10 μL'lik artışla bazal membran matris karışımına aktarmak için 20 μL'lik bir pipet kesme ucu kullanın. Pipet, 200 μL'lik bir kesme ucu kullanarak buz üzerindeki bazal membran matrisindeki hücreleri karıştırmak için yavaşça 20x yukarı ve aşağı iniyor.
- Hücre bazal membran matris karışımının beş adet 50 μL şeridini, ılık bir köpük tuğla üzerinde tutulan önceden ısıtılmış 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Bodrum membran matrisinin polimerize olmasına ve sertleşmesine izin vermek için hücre kültürü inkübatöründeki plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Katılaşmış bazal membran matris şeritlerinin kuyucuğuna 2 mL enteroid büyüme ortamı ekleyin ve hücre kültürü inkübatörünün içine geri yerleştirin. Enteroid büyümesini artırmak için medyayı günlük olarak değiştirin. Günlük 10x ters çevrilmiş mikroskop altında bağırsak kök hücre farklılaşmasını kontrol edin.
- 10-14 gün sonra, enteroid yoğunluğuna bağlı olarak, enteroidleri 12 kuyucuklu veya 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna geçirin. Medyayı her gün değiştirmeye başlayın ve enteroidler gelişmeye başladığında her 5-7 günde bir 1: 2 oranında geçin.
- Enteroidlere farklılaşmayan hücreleri, geçişler sırasında bazal membran matris tabakası ile çıkarın. Gerekirse,% 80 büyüme ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde dondurarak düşük pasajlı dondurulmuş bir enteroid stoğu oluşturun.
4. Enteroidlerin immünofloresan boyanması
NOT: Sabitleme ve boyama işlemi 3 gün sürer. Bu protokolde, modifiye edilmiş bir protokol15 kullanarak çekirdekler (DAPI), epitel belirteçleri (villin, CDX2), lizozim, müsin ve sıkı bağlantı proteinlerini (claudin 2, claudin 3, oklüdin, zonula oklüden-1) sabitledik ve boyadık. Floresan görüntüler konfokal mikroskopla alındı.
- Sabitleme
NOT: Bu işlem genellikle enteroid geçiş veya dondurma prosedürü ile aynı anda yapılır.- Enteroid plakayı buzun üzerine yerleştirin. Büyüme ortamını çıkarın ve soğuk DPBS ile 2 kat hafifçe yıkayın.
- Sabitlenecek ve boyanacak enteroidleri tanımlayın. 200 μL'lik bir kesme ucuyla dikkatlice pipetleyerek veya 1 μL'lik bir aşılama döngüsü kullanarak 12 delikli bir plakaya aktarın. Farklı antikorlarla boyama yapılacaksa enteroidleri ayrı kuyucuklara yerleştirin.
- Enteroidleri bozmadan 200 μL'lik bir uçla mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın. 0,5 mL% 4 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Enteroidlerin bazal membran matrisinden ayrılmasını kolaylaştırmak için plakayı ara sıra döndürün.
- Enteroidlerin bazal membran matrisinden ayrılmasını belirlemek için kabaca inceleyin. Enteroidleri bozmadan sıvı PFA'yı dikkatlice aspire edin ve atın. PFA'yı ve artık bazal membran matrisini çıkarmak için PBS 3x ile yıkayın
NOT: Sıvının stereo mikroskop altında aspire edilmesi, enteroidlerden kaçınmak için yararlı olabilir. Sabit enteroidler PBS'de 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
- Engelleme
- Artık PBS'yi enteroidleri bozmadan 200 μL'lik bir pipetle dikkatlice çıkarın. 0,5 mL bloke tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- Enteroidlerin bozulmasını önlemek için dikkatli olarak bloke edici tamponu 200 μL'lik bir pipetle çıkarın ve atın.
- Antikor boyama
- Enteroidlerle her bir oyuğa bloke edici tamponda 500 μL primer antikor ekleyin. Primer antikorlar ve lizozim için seyreltme faktörü 1:100, CDX2 için seyreltme faktörü 1:100 ve villin için seyreltme faktörü 1:50'dir. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, antikor çözeltisini çıkarın ve PBS ile 3x yıkayın. Her yıkama için 10-15 dakikalık kuluçka süresi bekleyin.
- 4.3.1.-4.3.2 arasındaki adımları yineleyin. seyreltme faktörü 1:400 olan ikincil antikor için.
- PBS'de 5 μg/mL'de 500 μL DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, PBS ile 3 kat yıkayın ve her yıkama için 10-15 dakikalık kuluçka süresi bekleyin
- Montaj
- Mümkün olduğunca çok PBS çıkarın. Lekeli enteroidleri% 70 gliserol 1x ile yıkayın.
- 1 μL aşılama halkası veya kesilmiş 200 μL'lik bir uç kullanarak enteroidleri plakadan çıkarın ve% 70 gliserol ile bir cam mikroskop slaydına monte edin.
- Enteroidlerin 3D yapısını korumak için, alt cam slayt ile kapak kayması arasında 0,5-1 mm'lik bir boşluk bırakın. Cam sürgü ile kapak kayması arasında bir boşluk oluşturmak için ince silikon kauçuk levha veya cam kapak kayması kesimlerini kullanın. Enteroidler artık konfokal mikroskopla görüntülenebilir.
5. Enteroidlerin mikroenjeksiyonu için hazırlık
NOT: Mikroenjeksiyon protokolü, Hill ve ark.16'nın kaynaklara ve ayarlara uyacak şekilde değiştirilmiş bir protokolüdür. Bazı hazırlık adımlarının birkaç gün önceden tamamlanması gerekir.
- Mikroenjeksiyon kurulumunun yapılması
- Mikroenjektör aparatını, deneylerin amacına bağlı olarak, bir biyogüvenlik kabininin içine veya temiz bir tezgaha aşağıdaki gibi kurun: görüntüleme için bir stereo mikroskop, mikroskobun yanındaki ağır bir standa monte edilmiş X-, Y- ve Z ekseni kontrol noblarına sahip bir mikromanipülatör, mikromanipülatör koluna monte edilmiş bir mikropipet tutucu, mikropipet tutucuyu birbirine bağlayan bir mikroenjektör borusu ve üç yönlü bir tıpa ile bir şırınga, daha sonra pnömatik bir pompaya ve pompaya bağlı bir duvar hava kaynağına (Şekil 1).
- Mikroenjeksiyon aparatını deneysel kullanımdan önce ve sonra %70 etanol ile dezenfekte edin. Mikropipetin hedeflenen numuneye ulaşabilmesini sağlamak için eksen düğmelerinin hareket ettirilmesi de dahil olmak üzere mikroskop ve mikromanipülatörün istenen fiziksel özelliklere uyacak şekilde konumlandırılmasını test edin.
- Mikropipetin hazırlanması
NOT: Bu adımları önceden gerçekleştirin.- Cam kılcal tüpleri mikropipetlerin içine çekmek için bir mikropipet çektirici kullanın.
- Stereo mikroskop altında, mikropipeti yatay bir mikropipet tutucuya yerleştirin (Şekil 2), uçlara odaklanın ve mikroskop göz merceklerine bakarken bir çift mikro makas kullanarak uçları kesin. Her deney için benzer uç boyutunda yaklaşık 10-15 mikropipet hazırlayın.
- 0,5-1 μL sıvı çekerek uç boyutunu test edin ve hacmi boşaltmak için kaç pompanın gerekli olduğunu sayın. Deneme için uygun boyutu bulmak üzere birkaç uç boyutunu test edin. Uygun bir uç boyutu, pompa başına yaklaşık 10-30 nL hacim çıkarır.
- Kesilmiş cam mikropipetleri, uçlara zarar vermeden temiz bir kutuda veya tüpte saklayın.
NOT: Önceden kesilmiş mikropipetler piyasada mevcuttur.
- Enteroid preparat
- Çoğunlukla büyük ve küresel enteroidlerden oluşan bir plakayı buzun üzerine yerleştirin. Eski büyüme ortamını taze ortamla değiştirin.
- Bodrum zarı matris noktalarını bir hücre kaldırıcı ile plakadan yavaşça ayırın. Enteroidleri rahatsız etmeden bazal membran matrisini parçalamak için jel noktalarını buz üzerinde bir yandan diğer yana döndürün.
- Stereo mikroskop altında kesilmiş 20 μL pipet ucu ile yaklaşık 10-15 küresel enteroid seçin ve 285 μL 8 mg / mL protein konsantrasyon karışımı yapmak için bazal membran matrisine ekleyin.
- Enteroidleri kırmadan karıştırmak için 200 μL'lik kesilmiş bir uçla hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Plaka beş 50 μL jel nokta, yuvarlak bir 35 mm x 10 mm hücre kültürü Petri kabının ortasında veya benzer boyutlarda bir tane.
- Enteroid jel noktalarını katılaşması için 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ardından, yemeğe 1 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Enteroidleri stabilizasyon için en az 2-3 gün boyunca ve enteroidler 0.5-1 μL'lik uygun bir boyuta ulaşana kadar inkübe edin.
NOT: Enteroidlere daha kolay erişim için alçak duvarlı bir tabağa ve daha az hacimli büyüme ortamı için küçük çaplı bir tabağa sahip olmak önemlidir.
- Dextran-FITC ve test edilmiş malzemenin mikroenjeksiyonu
- Üç yönlü durdurma musluğunu pnömatik pompaya kapatın. Mikropipeti enjekte edilen malzemeyle doldurun, bu durumda LPS'li veya LPS'siz dextran-FITC.
- Şeffaf bir film şeridi ile kaplı bir Petri kabı hazırlayın. Film üzerine iki ila dört adet 1 μL enjekte edilen malzeme noktası yerleştirin.
- Mikropipetin ucunu sıvının hemen içine ancak stereo mikroskobun görselleştirilmesi altında filmin üstüne sürmek için mikromanipülatörü kullanın. Enjekte edilen malzemeyi mikropipete çekmek için şırıngayı yavaşça çekin.
- Mikropipeti 2-4 μL enjekte edilen malzeme ile doldurun ve mikropipetin ucundaki havayı çıkarmak için şırıngayı itin. Hava cebi olmadığından emin olmak için mikropipetteki enjekte edilen malzeme sütununu kontrol edin. Mikropipetin içine çekilen enjekte edilen malzemenin hacmini kaydedin.
NOT: Sıvı, dekstran-FITC nedeniyle yeşilimsi bir renkte görülebilir. - Yaklaşık 60 psi hava basıncı sağlayan pnömatik pompaya bağlı hava kaynağını açın. Pompayı açın ve pompa süresini 10-15 ms'ye ayarlayın. Pompadan mikropipete giden hattı açmak için şırıngadaki musluğu çevirin.
NOT: Daha uzun pompa süresi, pompa başına daha fazla malzemenin serbest bırakılmasını sağlar. Enjekte edilen hacmin tahmini için tüm deney boyunca aynı pompa süresinin ve benzer uç boyutlarına sahip mikropipetlerin kullanılması önerilir. - Enteroidleri hücre kültürü inkübatöründen çıkarın ve mikroenjeksiyondan sonra ışığa maruz kalmayı sınırlamak için bulaşıkları kapalı bir kapta ılık bir köpük tuğlanın üzerine yerleştirin.
- Petri kabını enteroidlerle stereo mikroskop altına yerleştirin ve mikropipetin ucunu yatay yüzeye yaklaşık 35 ° -45 ° açıyla yerleştirmek için mikromanipülatör düğmelerini hareket ettirin (Şekil 3). Bu önceden biraz pratik gerektirir.
- Her Petri kabındaki enteroidleri mikroskop altında görselleştirin ve haritalandırın, böylece çanak başına yaklaşık 3-5 küresel enteroid enjekte etmek için bir plan yapın.
- Mikropipetin ucu sıvı yüzeye yakın olduğunda, ucu hedeflenen enteroide doğru ilerletmek için mikroskop göz merceklerine bakın.
- Hassas bir yavaş hareket kullanarak z ekseni düğmesini ilerlederek enteroidi mikropipet ucuyla delin. Enteroid duvar, uç enteroid yüzeyden geçtikten sonra bastırır ve geri döner, bu noktada ilerleme durmalıdır.
- Bir ayağınızla pompa pedalına dokunun ve enteroidi hafifçe genişleyene kadar yeşilimsi dekstran-FITC çözeltisiyle doldurun. Pompalanan hacmi ve dekstran konsantrasyonunu hesaplamak için pompa sayısını kaydedin.
- Mikroenjeksiyonu bitirdikten sonra mikropipetin ucunu geri çekin ve bir sonraki enteroide geçin. Uygulamayla, süreç sorunsuz bir şekilde ilerleyebilir.
- Uç kırılırsa, benzer uç boyutuna sahip başka bir mikropipetle değiştirin. Aynı maruz kalma grubundaki tüm enteroidler için yeterli miktarda enjekte edilen materyali çekin ve çapraz kontaminasyonu önlemek için mikropipeti enjekte edilen malzemeler arasında değiştirin.
- Işığa maruz kalmayı önlemek için enjekte edilen enteroid kabı örtünün altına yerleştirin.
- Dextran-FITC toplama ve ölçüm
- Mikroenjeksiyon işleminden sonra, kültür ortamını derhal çıkarın. Artık dekstran-FITC'yi çıkarmak için taze büyüme ortamı 2x ile yıkayın. Taze medya ekleyin ve zamanı mikroenjeksiyon sonrası 0 zaman olarak kaydedin.
NOT: Mikroenjeksiyon işlemini aksatmadan bu adımı gerçekleştirmek için ikinci bir kişiye ihtiyacınız olabilir. - Opak 0,5 mL mikrofüj tüpünde 200 μL kültür ortamı toplayın ve ardından çıkarılan kültür ortamını mikroenjeksiyonlardan sonra 1 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat, 8 saat, 10 saat ve 12 saat sonra aynı hacimde taze büyüme ortamı ile değiştirin.
NOT: Zaman aralığı deneye bağlı olarak değişebilir. Bazolateral maruziyet ile, yedek ortam pozlamayı aynı konsantrasyonda içermelidir. - Toplanan kültür ortamını 4 °C'de saklayın ve dekstran konsantrasyonunu 24 saat içinde ölçün. Diğer analizler için artık ortamları -80 °C'de saklayın. Kültür medya koleksiyonunun sonunda, gerekirse RNA ekstraksiyonu veya görüntüleme için enteroidleri toplayın.
- Dextran-FITC konsantrasyonlarını floresan mikroplaka okuyucu ile ölçün. Seri seyreltmeler kullanarak ve Şekil 4'te gösterildiği gibi doğrusal bir regresyon çizgisi takarak her plaka için standart bir eğri oluşturun.
- Dekstran içermeyen taze büyüme ortamı ile değiştirilen dekstran içeren kültür ortamının çıkarılan hacminin absorbansını aşağıdaki gibi düzeltin: 2 mL'lik kültür ortamından 200 μL'nin çıkarılması hacimce% 10'dur.
2 saatte düzeltilmiş absorbans = (1 h x %10'da absorbans + 2 saatte ölçülen absorbans
İlk düzeltilmiş ortamın emilimi düzeltmeye ihtiyaç duymaz. Ardından, standart eğri denklemini kullanarak düzeltilmiş absorbans değerinden dekstran konsantrasyonunu hesaplayın. - Normalizasyon için, dekstran konsantrasyonunu her Petri kabı için toplam pompa sayısına bölün ve ardından çanak başına en büyük toplam pompa sayısıyla çarpın.
NOT: Tüm maruziyetler üçlü olarak gerçekleştirilir (maruz kalma başına üç Petri kabı ve çanak başına 3-5 mikroenjeksiyonlu enteroid). Üçlülerin ortalama değerleri, bir Öğrencinin t-testi kullanılarak maruziyetler arasında karşılaştırılır.
- Mikroenjeksiyon işleminden sonra, kültür ortamını derhal çıkarın. Artık dekstran-FITC'yi çıkarmak için taze büyüme ortamı 2x ile yıkayın. Taze medya ekleyin ve zamanı mikroenjeksiyon sonrası 0 zaman olarak kaydedin.
Representative Results
Michigan Üniversitesi Translasyonel Doku Modelleme Laboratuvarı12'deki işbirlikçilerimiz tarafından sağlanan modifiye protokolleri takiben bağışlanan ileum fetal dokusundan bir enteroid hücre hattı kurduk. Enteroid hücre hattı Mikoplazma enfeksiyonu için negatif test edildi. Enteroidler villin, CDX2, lizozim, müsin, claudin, oklüdin ve zonula-oklüden 1 için pozitif boyandı ve ince bağırsak epitel kökenlerini doğruladı. Enteroidler PBS'de 5 mg/mL'de 4 kDa dekstran-FITC ile mikroenjekte edildi (Şekil 6). Test maruziyetleri, apikal maruziyet için dextran-FITC ile karıştırılmış farklı konsantrasyonlarda, 0.1 mg / mL ve 0.5 mg / mL'de LPS idi. Pozitif kontrol olarak 2 mM EGTA kullandık ve dekstranın mikroenjeksiyonundan 4 saat sonra kültür ortamına ekledik. EGTA, sıkı bağlantıların geçirgenliğini artıran bir kalsiyum şelatördür. Negatif kontroller sadece PBS'de dextran-FITC ile mikroenjekte edildi. Bazolateral pozlama için, seri kültür ortam koleksiyonu için yedek ortam, pozlamanın aynı konsantrasyonuna sahipti (yani, 2 mM EGTA). Sonuçlar, negatif kontrol PBS'ye kıyasla EGTA'nın eklenmesinden sonra kültür ortamındaki dekstran konsantrasyonunda belirgin bir artış olduğunu göstermektedir. LPS'nin apikal maruziyeti, konsantrasyona bağlı bir şekilde maruziyetten yaklaşık 8 saat sonra başlayan dekstranın daha yüksek geçirgenliğine neden olmuştur (Şekil 7).
Resim 1: Mikroenjektör kurulumu. Kurulum bir stereo mikroskop, ağır çelik taban plakası üzerindeki manyetik bir standa monte edilmiş mikromanipülatör, üç yönlü bir stopcock ile bir şırıngaya bağlı bir mikropipet tutucu ve bir pnömatik pompa içerir. Duvar hava beslemesi, tutarlı bir pompa hacmi oluşturmak için pompa tarafından düzenlenen hava basıncını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Yatay mikropipet tutucu. Bu plastik platform, ucu kesmek için cam kılcal borunun çekilmesinden sonra mikropipeti tutmak için tasarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikropipet konumlandırma. 35°-45°'lik bir açı, Petri kabının ortasında bulunan enteroidleri enjekte etmek için idealdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Dextran standart eğrisi. Eğri, kopyalar halinde 10 seri dekstran seyreltmesinin floresan emilimi ile inşa edilmiştir. Bir regresyon denklemi oluşturmak için doğrusal bir regresyon çizgisi takıldı. Hata çubukları SEM'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Enteroidlerin floresan biyobelirteçleri. Çekirdek boyası için DAPI mavidir. Aşağıdaki biyobelirteçler gösterilmiştir: (A) villin, (B) CDX2, (C) lizozim, (D) müsin, (E) claudin, (F) tıkayıcı ve (G) zonula-oklüden 1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Farklı aşamalardaki enteroidler . (A) 7-10 günlükken bir enteroid küçüktür ve kalın bir duvara sahiptir. (B) Büyük boyutlu, lümen ve düşünce duvarı ile mikroenjeksiyona hazır bir enteroid ve (C) mikroenjeksiyondan 2 gün sonra bir enteroid içinde floresan dekstran-FITC. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Mikroenjeksiyon sonrası dekstran-FITC geçirgenliği . (A) Ortamdaki ölçülen dekstran seviyeleri, EGTA ilavesinden sonra PBS'ye kıyasla daha yüksekti. (B) Mikroenjeksiyonlu 0.5 mg / mL LPS, enteroid lümenden ortama mikroenjekte edilen 0.1 mg / mL LPS'nin enjeksiyondan sonraki 8 saatte başladığından daha fazla dekstran sızıntısına neden oldu. *p-değeri 0.05 <, hata çubukları SEM, n = 3'tür, anlamlılığı hesaplamak için bir Öğrencinin t-testi kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan enteroidlerin oluşturulmasının yanı sıra immünofloresan boyama ve epitel geçirgenlik testi ile model karakterizasyonunu detaylandırır. Enteroidlerin geçirgenliği, bir mikroenjeksiyon tekniği ve kültür ortamında sızan dekstran-FITC konsantrasyonunun seri zaman çizelgesi ölçümleri kullanılarak test edildi. Bu protokolün yeniliği, kültür medyasındaki bazolateral maruziyete kıyasla insan bağırsak fizyolojisine daha çok benzeyen apikal maruziyettir7. Önceki çalışmalarda, Hill ve ark. seri görüntüleme ve zaman içindeki floresan yoğunluğunun hesaplanmasını kullanmışlardır16. Ares ve ark. bir epitel modelinin bazolateral membranını LPS'ye maruz bıraktılar ve daha sonra hücresel gen ekspresyon paterni7'yi karşılaştırdılar. Buna karşılık, test edilen reaktiflerin apikal maruziyetini kullanıyoruz ve daha sonra kültür ortamındaki sızan dekstranın seri konsantrasyonlarını ölçerek brüt geçirgenlikteki potansiyel değişiklikleri inceliyoruz. Yöntemimiz ayrıca kültür ortamındaki epitel hücreleri tarafından üretilen sitokinlerin seri karşılaştırmalı analizine ve hücresel mRNA'yı toplayarak gen ekspresyonuna izin verir. LPS, geçirgenlik ve inflamasyonu indükleme kabiliyeti nedeniyle hayvan ve in vitro modellerde bağırsak hasarını incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır 7,17. LPS bu modelde test edildiğinde, epitel geçirgenliği maruz kalma konsantrasyonu ile ayırt edildi. Bu protokol, farklı mikroenjeksiyonlu materyaller ve sonuç ölçümleri kullanarak diğer hastalık patolojilerini incelemek için genişletilebilir.
Bu protokoldeki kritik adımlar arasında fetal bağırsak dokularından enteroidlerin oluşturulması, enteroid karakterizasyonu ve mikroenjeksiyon tekniği yer almaktadır. Bu çalışmanın bütünlüğü doğru hücre örneklemesine bağlıdır. Anatomik işaretleri ve kan damarlarını kullanmak, ince bağırsak hücrelerinin seçimini sağlamak için yararlıdır. Fetal bağırsak kök hücrelerinin sağlam büyümesi ve farklılaşması nedeniyle, kök hücreleri diğer epitel hücrelerinden izole etmek için kapsamlı bir prosedür gerekli değildir. Enteroidler kurulduktan sonra, proteinler ve hücre belirteçleri için boyama yaparak modelin özelliklerini doğrulamak önemlidir. Bu protokolde, enteroidler villin ve CDX2 kullanılarak enterositler, lizozim kullanan Paneth hücreleri ve müsin kullanan kadeh hücreleri, ince bağırsak epiteli18,19,20 içinde bulunan tüm hücreler için boyanmıştır. Bir hücre tipini gösteren geleneksel tek hücreli çizgilerin aksine, enteroidler tüm hücre tiplerini bağırsak progenitör kök hücrelerindenoluşturur 8. Bu protokolün boyama kısmı, ilgilenilen spesifik hücresel belirteçler için değiştirilebilir. Bu protokolün güvenilirliği için çok önemli olan mikroenjeksiyon tekniğidir. Mikropipet uçlarının tutarlılığı, dextran-FITC çözeltisi kullanılarak pompa başına hacmin ölçülmesi ve uçların çapının mikroskop altında görselleştirilmesiyle doğrulanabilir. Kontaminasyon riski nedeniyle, aynı mikropipet birden fazla maruziyet için kullanılamaz. Ek olarak, enteroidlerin şekli ve büyümesi, büyüme ortamlarının içeriğinden etkilenebilir. Karnabahar şeklindeki enteroidlerden ziyade küresel enteroidlerin mikroenjeksiyon için daha iyi modeller sağladığını bulduk. Küresel şekil, ortam21'deki daha büyük bir Wnt faktörü tarafından indüklenebilir.
Bu protokol büyük ölçüde, özellikle zamana duyarlı ölçümlerde, varyasyonları azaltmak için sanatçının mikroenjeksiyondaki becerisine bağlıdır. Varyasyonlar, tutarlı tekniklerle aynı deneyimli performansçıya sahip olmak, genetik varyasyonu önlemek için aynı hücre kökenini kullanmak, olgunluk yanlılığını ortadan kaldırmak için aynı pasajda test etmek ve benzer hücre farklılaşması için hücreleri aynı tür ortamlarda büyütmek suretiyle en aza indirilebilir. Büyüme ortamının bileşenleri, kök hücrelerin in vivo bir ortamdan ziyade in vitro olarak farklılaşmasına neden olabilir. Örneğin, in vivo, lizozim, Paneth hücreleri oluştuğundave fonksiyonel hale geldiğinde gestasyonel gelişimin 22-24. haftalarına kadar eksprese edilmez. Bununla birlikte, 10 haftalık fetal bağırsaklardan kurulan enteroidlerimizde lizozimi tespit edebildik. Bu yöntem, mikroenjeksiyon için gereken yüksek teknik beceri nedeniyle bir kerede test edilen maruziyet sayısını sınırlayabilir. Mikroenjeksiyon delinme deliğinden dekstran sızıntısı geçirgenliğin değerlendirilmesini etkileyebilir. Bu etkiyi ortadan kaldırmak için, mikroenjeksiyondan hemen sonra üçlü yıkamalar, artık dekstranı prosedürden çıkarmak için tavsiye edilir. Ortamdaki dekstran konsantrasyonu, mikroenjeksiyon sonrası 4-6 saat boyunca saatlik olarak ölçülmelidir. Enjeksiyon sonrası 2-4 saat içinde dekstran konsantrasyonunda önemli bir artış olan deneyler son analizin dışında tutulmalıdır.
Bu yöntemin birkaç avantajı vardır. Transwell üzerindeki enteroid türevli monokatmanlara kıyasla daha düşük bir maliyet ve daha az kaynak gerektirir. Ek olarak, bağırsak mikropları ve epitel arasındaki ilk etkileşimi incelemek için canlı bakteri veya virüsler gibi diğer maruziyetlere genişletilebilir. Enteroidin kapalı lümeni, büyüme ortamının kontaminasyonu olmadan mikroenjekte canlı bakterilerin stabil bir büyümesini sağlayabilir13. Tek katmanın büyüme ortamına ve kuluçka oksijenine maruz kalmasının aksine, kapalı lümen sıkı, izole bir alandır. Kapalı bir lümen, büyüme ortamıyla iletişim kurulmamasına ve canlı bakteri büyümesi ile zamanla daha düşük bir luminal oksijen içeriğine izin vermez13.
Fetal bağırsak dokusunun kullanımı, preterm bebeklerin bağırsak epitelini yetişkin bağırsak kök hücrelerine veya hayvan modellerine kıyasla daha doğru bir şekilde tasvir eder7. Ayrıca, enteroidlerin polaritesi hem apikal hem de bazolateral maruziyetlere ve ölçümlere izin verir23. Enteroidler, bağırsakların oksijenasyon konsantrasyonunu daha yakından taklit eden daha düşük oksijenasyon konsantrasyonuna sahip kapalı bir lümen oluşturur24. Teknolojik olarak daha gelişmiş protokoller16'nın aksine, brüt ortam ölçümlerinin kullanılması, bu tekniğin daha fazla erişilebilirliğini sağlar. Deney, epitel sızıntısının LPS'ye apikal maruz kalma ile indüklenebileceğini ve konsantrasyona bağlı olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, sızdırılan dekstran konsantrasyonundaki değişiklikleri incelediğinden, dar kavşaklardaki brüt fonksiyonel değişiklikleri tespit etmek için yararlıdır. Maruz kalan enteroidlerin haberci RNA toplanması ve dizilimi ve batı leke analizi, brüt fonksiyonel değişikliklerin analizini tamamlayabilir. Bu model, erken evre ortama oldukça benzeyen bir sistemde bağırsak epitel bütünlüğünü inceler ve böylece erken bağırsak yaralanmalarını ve diğer hastalık patolojilerini daha iyi anlamak için kullanılabilir.
Disclosures
Tüm yazarlar, açıklayacakları hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Dr. Ian Glass'a ve Washington Üniversitesi Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı personeline fetal dokuları paylaştıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Michigan Üniversitesi Translasyonel Doku Modelleme Laboratuvarı'ndan Dr. Michael Dame ve Dr. Jason Spence'a süreç boyunca sonsuz destekleri ve rehberlikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
- Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
- Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
- Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
- Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132 (2017).
- Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
- Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
- Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587 (2020).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).
