Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Mikrotensiometer til konfokal mikroskopi Visualisering af dynamiske grænseflader

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Dette manuskript beskriver design og drift af et mikrotensiometer / konfokalt mikroskop til at foretage samtidige målinger af grænsefladespænding og overfladedilatationel reologi, mens man visualiserer grænseflademorfologien. Dette giver realtidskonstruktion af struktur-ejendomsforhold af grænseflader, der er vigtige inden for teknologi og fysiologi.

Abstract

Adsorption af overfladeaktive molekyler til væske-væske-grænseflader er allestedsnærværende. Karakterisering af disse grænseflader kræver måling af overfladeaktive stoffers adsorptionshastigheder, evaluering af ligevægtsoverfladespændinger som funktion af koncentrationen af overfladeaktive stoffer i bulk og relaterer, hvordan overfladespændingen ændres med ændringer i grænsefladeområdet efter ligevægt. Samtidig visualisering af grænsefladen ved hjælp af fluorescensbilleddannelse med et højhastighedskonfokalmikroskop muliggør direkte evaluering af struktur-funktionsforhold. I kapillærtrykmikrotensiometeret (CPM) fastgøres en halvkugleformet luftboble i slutningen af kapillæren i et 1 ml volumen væskereservoir. Kapillærtrykket over boblegrænsefladen styres via en kommerciel mikrofluidisk flowregulator, der giver mulighed for modelbaseret tryk- eller boblekrumningskontrol eller bobleområdekontrol baseret på Laplace-ligningen. Sammenlignet med tidligere teknikker som Langmuir-trug og vedhængsdråbe forbedres måle- og kontrolpræcisionen og responstiden kraftigt; kapillærtrykvariationer kan påføres og kontrolleres i millisekunder. Boblegrænsefladens dynamiske respons visualiseres via en anden optisk linse, når boblen udvider sig og trækker sig sammen. Boblekonturen passer til en cirkulær profil for at bestemme boblekrumningsradius, R, samt eventuelle afvigelser fra cirkularitet, der ville ugyldiggøre resultaterne. Laplace-ligningen bruges til at bestemme grænsefladens dynamiske overfladespænding. Efter ækvilibrering kan små trykoscillationer pålægges af den computerstyrede mikrofluidpumpe for at svinge bobleradiusen (frekvenser på 0,001-100 cyklusser / min) for at bestemme dilatationsmodulet Systemets overordnede dimensioner er tilstrækkeligt små til, at mikrotensiometeret passer under linsen i et højhastighedskonfokalmikroskop, der gør det muligt at spore fluorescerende mærkede kemiske arter kvantitativt med submikron lateral opløsning.

Introduction

Luft-vand-grænseflader, der er dækket af overfladeaktive film, er allestedsnærværende i det daglige liv. Injektioner med overfladeaktivt vand bruges til at forbedre olieindvindingen fra udtømte felter og bruges som hydrauliske fraktureringsløsninger til skifergas og olie. Gas-flydende skum og flydende-flydende emulsioner er fælles for mange industrielle og videnskabelige processer som smøremidler og rengøringsmidler og er almindelige i fødevarer. Overfladeaktive stoffer og proteiner ved grænseflader stabiliserer antistofkonformationer under emballering, opbevaring og administration 1,2,3,4,5, tårefilmstabilitet i øjet 6,7,8 og lungemekanik 9,10,11,12,13,14 15.

Undersøgelsen af overfladeaktive stoffer eller overfladeaktive stoffer, der adsorberer til grænseflader og deres egenskaber, har en lang historie med mange forskellige eksperimentelle teknikker 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . En nylig udvikling er kapillærtrykmikrotensiometeret (CPM), som gør det muligt at undersøge grænsefladeegenskaber på stærkt buede grænseflader i meget mindre længdeskalaer, mens der anvendes betydeligt færre materialer end andre almindelige metoder 9,23,24,25. Konfokal fluorescensmikroskopi (CFM) kan bruges til at studere morfologien af lipider og proteiner ved luft-vand-grænsefladerne i CPM22 eller på Langmuir-trugene 20,26,27,28,29. Her er en CPM og CFM blevet kombineret for at forbinde morfologiske fænomener med dynamiske og ligevægts-grænsefladeegenskaber for at udvikle struktur-funktionsforhold for biologiske og teknologiske grænseflader.

Der er adskillige parametre af betydning i grænsefladeoverfladeaktive stoffer, der er tilgængelige for CPM-CFM. I CPM er en luftboble på 30-200 μm diameter fastgjort til spidsen af et glaskapillærrør. I tidligere versioner af CPM blev kapillærtrykforskellen mellem indersiden og ydersiden af boblen styret via en vandsøjle og oscillerende sprøjtepumpe 9,30 ; den nye version, der er beskrevet her, erstatter disse med en computerstyret mikrofluidisk pumpe med højere præcision. Overfladespændingen (γ) bestemmes via Laplace-ligningen, ΔP = 2γ / R, fra trykfaldet over grænsefladen indstillet af pumpen, ΔP, og optisk analyse af boblens krumningsradius, R. Grænsefladens dynamiske overfladespænding kan bestemmes med en tidsopløsning på 10 ms efter dannelsen af en ny boble i kontakt med en bulkvæske indeholdende et opløseligt overfladeaktivt stof. Det overfladeaktive stofs adsorptionsdynamik kan beskrives ved den klassiske Ward-Tordai-ligning10,31 for at bestemme det overfladeaktive stofs væsentlige egenskaber, herunder diffusivitet, overfladedækning og forholdet mellem bulkkoncentration og ligevægtsoverfladespænding. Når en ligevægtsoverfladespænding er opnået, kan grænsefladeområdet oscilleres for at måle dilatationsmodulet, Equation 1ved at registrere ændringerne i overfladespændingen, induceret af små ændringer i boblens overfladeareal, A32. For mere komplekse grænseflader, der udvikler deres egne indre strukturer såsom sammenfiltrede polymerer eller proteiner, erstattes overfladespændingen, , af en mere generel overfladespænding 4,33, Equation 2.

Lungestabilitet under vejrtrækning kan være direkte bundet til at opretholde både en lav overfladespænding og et højt dilatationsmodul ved den alveolære luft-væske-grænseflade 9,10. Alle indre lungeoverflader er foret med en kontinuerlig, mikrontyk film af epitelforingsvæske for at opretholde vævshydrering34. Denne epitelforingsvæske er primært vand med salte og forskellige andre proteiner, enzymer, sukkerarter og lungeoverfladeaktive stoffer. Som det er tilfældet for enhver buet væske-damp-grænseflade, induceres et kapillærtryk med trykket højere på indersiden af alveolus (eller boblen). Men hvis overfladespændingen var konstant overalt i lungerne, viser Laplace-ligningen, ΔP = 2γ / R, at mindre alveoler ville have et højere indre tryk i forhold til større alveoler, hvilket tvinger gasindholdet i de mindre alveoler til at strømme til større alveoler med lavere tryk. Dette er kendt som "Laplace Instability"9,35. Nettoresultatet er, at de mindste alveoler ville kollapse og blive fyldt med væske og blive vanskelige at puste op igen, hvilket fik en del af lungen til at kollapse, og andre dele ville overoppustes, som begge er typiske symptomer på akut respiratorisk nødsyndrom (ARDS). I en korrekt fungerende lunge ændres overfladespændingen imidlertid dynamisk, da luft-epitelvæskegrænsefladen i alveolus-grænsefladeområdet udvides og trækker sig sammen under vejrtrækning. Hvis Equation 3, eller Equation 4, falder Laplace-trykket med faldende radius og stiger med stigende radius for at eliminere Laplace-ustabiliteten og derved stabilisere lungen9. Derfor, Equation 5, og hvordan det afhænger af frekvens, monolagsmorfologi og sammensætning, og alveolær væskesammensætning kan være afgørende for lungestabilitet. CPM-CFM har også givet de første demonstrationer af virkningerne af grænsefladekrumning på overfladeaktiv adsorption25, monolagsmorfologi22 og dilatationsmodul9. Det lille volumen (~ 1 ml) af reservoiret i CPM muliggør hurtig introduktion, fjernelse eller udveksling af væskefasen og minimerer den krævede mængde dyre proteiner eller overfladeaktive stoffer10.

Kontrast i et CPM-CFM-billede skyldes fordelingen af små fraktioner af fluorescerende mærkede lipider eller proteiner ved grænsefladen16,27. Todimensionale overfladeaktive monolag udviser ofte lateral faseadskillelse som en funktion af overfladespænding eller overfladetryk, Equation 6 π er forskellen mellem overfladespændingen af en ren væske-væske-grænseflade, γ0, og en overfladeaktivt stofdækket grænseflade, γ. π kan betragtes som 2-D "trykket" forårsaget af interaktionerne mellem overfladeaktive molekyler ved grænsefladen, der virker til at sænke den rene væskeoverfladespænding. Ved lavt overfladetryk er lipidmonolag i en væskelignende uorganiseret tilstand; dette er kendt som den væskeudvidede (LE) fase. Når overfladetrykket stiger, og arealet pr. lipidmolekyle falder, orienterer lipiderne sig med hinanden og kan gennemgå en første ordensfaseovergang til den langtrækkende bestilte væske kondenserede (LC) fase 16,20,27. LE- og LC-faserne kan eksistere sammen ved forskellige overfladetryk og kan visualiseres, da fluorescerende mærkede lipider udelukkes fra LC-fasen og adskilles til LE-fasen. LE-fasen er således lys, og LC-fasen er mørk, når den er afbildet med CFM16.

Målet med dette manuskript er at beskrive de trin, der er nødvendige for at opbygge og betjene det kombinerede konfokale mikroskop mikrotensiometer. Dette vil gøre det muligt for læseren at udføre adsorptionsundersøgelser, måle overfladespænding, reologisk adfærd og undersøge grænseflademorfologi samtidigt på en mikronskala luft / vand eller olie / vand-grænseflade. Dette inkluderer en diskussion af, hvordan man trækker, skærer og hydrofoberer de krævede kapillærer, instruktioner til brug af tryk-, krumnings- og overfladearealkontroltilstande og grænsefladeoverførsel af uopløseligt overfladeaktivt middel til mikrotensiometerets buede grænseflade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af kapillærrør

  1. Placer kapillæren i en kapillærudtrækker, og kør det ønskede trækprogram for at fremstille to koniske kapillærer med en udvendig diameter (OD) på ~ 1 μm ved spidsen.
    BEMÆRK: KAPILLÆRENS OD før træk skal være OD specificeret til at passe i kapillærholderen i mikrotensiometercellen. Kapillærens indre diameter (ID) kan variere, men vil påvirke kapillærens kritiske radius efter træk. Et trækprogram vælges således, at den resulterende konus oprindeligt reducerer kapillær OD og ID hurtigt, derefter når en radius nær den ønskede kapillær OD og ID og derefter reduceres langsommere i diameter. Dette vil skabe en større kapillærlængde, der kan scores for at give en brugbar kapillær på 30-100 μm i ID.
  2. Scor spidsen af kapillæren på det ønskede sted for at opnå et ID på 30-100 μm og afbryd spidsen. Kapillæren vil nu have en OD og ID for den ønskede radius ved spidsen (figur 1A). Kapillærerne kan opbevares indtil trin 2.
    BEMÆRK: Kapillærens afskårne kant skal være en 90° ren pause. Enhver defekt i den afskårne kant vil føre til dårlig fastgørelse af boblen til kapillæren og dårlige overfladeegenskabsmålinger. Koniske kapillærspidser er meget sarte. De vil blive ødelagt, hvis de kommer i kontakt med andet end opløsningerne (f.eks. hætteglasvægge, luftdyse).

2. Hydrofobisering af kapillærer

  1. Saml trukket glaskapillærer, syrerensningsopløsning, plastpincet, deioniseret (DI) vand, hydrofobiseringsopløsning (2% silan i ethanol), vakuumpumpe og ethanolopløsning. Se Materialetabel for at få flere oplysninger.
    FORSIGTIG: Syrerensningsopløsning er ekstremt giftig, forårsager hud- og øjenkorrosion / irritation, oxiderer. Hydrofobiseringsopløsning er en hud / øje / åndedrætsirriterende. Brug øjenbeskyttelse, kitler og handsker, og arbejd med løsninger i en røghætte.
  2. Syre-ren kapillæren
    BEMÆRK: Syrerensning af kapillæren fjerner eventuelle organiske rester inde i kapillæren og forbereder glasoverfladen til silaniseringsreaktionen, der gør kapillærhydrofoben.
    1. Tag en kapillær fast nær sin brede ende med pincetten.
    2. Dyp den koniske spids i syrerensningsopløsningen, mens slangen fastgøres fra vakuumpumpen til den brede ende af kapillæren. Dette vil suge opløsningen ind i kapillæren.
      BEMÆRK: En pipettespids kan fastgøres til enden af kapillærslangen for at give en bedre pasform med kapillærenden.
    3. Stop, når syrerensningsopløsningen har fyldt ca. halvdelen af kapillæren.
      BEMÆRK: Efter fjernelse af kapillærspidsen fra syrerensningsopløsningen danner opløsningen på ydersiden af kapillæren ofte en perle nær kapillærspidsen. Rør forsigtigt kapillæren til halsen på hætteglasset med opløsningen for at fjerne overskydende opløsning.
    4. Syrerensningsopløsningen forbliver i kapillærerne i mindst 30 minutter, og sørg for, at væskens prop forbliver i den tilspidsede ende af kapillæren.
    5. Fjern syrerensningsopløsningen fra kapillæren ved at holde kapillæren fast med pincetten og bruge vakuumslangen til at trække væsken ud af den store ende af kapillæren.
  3. Skyl kapillæren
    1. Nedsænk den koniske ende af kapillæren i DI-vand, så den er nedsænket dybt nok til at dække ethvert ydre, der var nedsænket i syrerensningsopløsningen. Mens spidsen er nedsænket, skal du bruge vakuumslangen til at trække DI-vand gennem kapillæren. Fjern kapillæren fra vandet og fjern det resterende vand med vakuumslangen.
    2. Gentag ovenstående trin mindst 4x.
  4. Trin 2.3 udføres igen, hvor du erstatter DI-vand med ethanol.
  5. Påfør sugning kontinuerligt, indtil ethanolen helt fordamper fra det indre af kapillæren. Kapillæren bliver uklar og kølig at røre ved, da ethanolen begynder at fordampe, men vil rydde efter 30 til 45 s.
  6. Overtræk kapillæren med hydrofobiseringsopløsningen
    1. Dyp kort den brede ende af kapillæren i ~ 2% silan i ethanolopløsning. Kapillærvirkning vil få belægningsopløsningen til at stige inden for kapillæren. Fjern kapillæren fra opløsningen, når et stik på ~ 1 cm er steget inden for kapillæren.
    2. Orienter kapillæren, så den koniske spids vender nedad, så belægningsopløsningen falder med tyngdekraften mod den koniske spids.
    3. Lad belægningsopløsningen forblive i kapillæren i mindst 3 minutter.
      BEMÆRK: Der må ikke være luftbobler i stikket på belægningsopløsningen, der er i kontakt med det indre af den koniske spids. Hvis der er en luftboble, blev kapillærinteriøret sandsynligvis ikke tilstrækkeligt tørret i trin 2.5. For at afhjælpe dette skal du gentage trin 2.4-2.6 efter behov.
  7. Kapillærerne skylles med ethanol 1x på samme måde som trin 2.3.
  8. Indstil den hydrofobe belægning på kapillæren
    1. Anbring rene og tørre hætteglas med scintillation i en vakuumovn, der er indstillet til 120 °C. Anbring overtrukne kapillærer i hætteglassene (ideelt set en kapillær pr. hætteglas) med brede ender hvilende på bunden af hætteglasset. Kapillærerne forbliver i ovnen i mindst 6 timer (foretrækkes natten over) for at opnå permanent binding af det hydrofobe silanlag til kapillærerne. Kapillærerne kan opbevares indtil trin 4.

3. Forberedelse og opbevaring af prøver

  1. Bland og opbevar overfladeaktive stoffer og fluoroforopløsninger i rene syrevaskede hætteglas for at undgå forurening.
    BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige lipider skal være af højeste renhed og opbevares mellem brug ved - 20 °C. Gamle eller forurenede lipider forårsager ofte, at resultaterne er vanskelige at reproducere.

4. Opsætning af mikrotensiometeret

  1. Saml CPM-cellen som beskrevet i figur 2.
    1. Placer den store side af kapillæren i toppen af CPM-cellen, indtil den skubber igennem til undersiden af cellen.
    2. Stram forsigtigt PEEK-stikket for at fastgøre kapillæren, og fastgør derefter røret fra mikrofluidpumpen til den store side af kapillæren. Pas på ikke at røre ved den tilspidsede kapillærspids.
  2. Fastgør om nødvendigt reservoirudvekslings- og / eller temperaturreguleringsslangerne til de respektive indløb og udløb på CPM-cellen (figur 2); Ellers skal du tilslutte de ubrugte indløb og stikkontakter.
  3. Fastgør CPM-cellen til det konfokale mikroskoptrin, og tilpas den nogenlunde til CFM-målet, CPM-kameraet og CPM-lyskilden (figur 3).
  4. Åbn gasstrømmen til mikrofluidpumpen ved pumpens anbefalede driftstryk (150 mbar for den mikrofluidpumpe, der anvendes her), og sørg for, at strømmen til kapillæren er åben.
  5. Start med at køre den virtuelle CPM-grænseflade (Supplemental Coding File 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) i trykreguleringstilstand med kapillærtryksoscillationsfrekvensen og amplituden indstillet til nul (figur 4-7). Figur 4 viser et skærmbillede af den virtuelle grænseflade. For DI-vand og en kapillærradius på ~ 35 μm sikrer et tryk på ~ 20 mbar, at der ikke kommer vand ind i kapillæren.
  6. Fyld CPM-cellen med vand ved hjælp af en pipette.
  7. Fokuser på kapillærspidsen ved hjælp af mikrotensiometerkameraet.
  8. Fokuser på kapillærspidsen med CFM. Hvis der er problemer med at finde kapillæren, skal du bruge CPM-kameraet til at finde CFM-målet. Dette vil hjælpe med at tilnærme afstanden mellem CFM-målet og boblen og opnå den korrekte arbejdsafstand.
  9. Når annulus (grøn sektorprojektion) er centreret om boblen, skal du manuelt justere fokus, så boblekanten kan ses tydeligt (figur 4-3).
    BEMÆRK: Ringmusens position, start- og slutvinkel og indre og ydre radier kan justeres via menuen under visningsvinduet.
  10. Klik på Nulstil boble, og sørg for, at der dannes en ny boble (man vil kunne høre den gamle boble poppe, og den nye boble vil kunne observeres fra kontrolpanelets visningsvindue; Figur 4-3). Hvis boblen ikke springer, skal du øge nulstillingstrykket eller øge nulstillingsforsinkelsestiden under fanen Bobleindstilling under visningsvinduet. Kontroller, om overfladespændingen er omkring 73 mN/m (for saltvands- eller vand/luftbobler) (figur 4-9).
  11. Tag vandet ud via sprøjten direkte til celle (figur 3-13), tøm det, og sæt det på igen. Prøven er klar til indlæsning for at køre eksperimentet.

5. Adsorptionsundersøgelse

  1. Fyld cellen med den ønskede prøve ved hjælp af en autoklaveret pipette, der holder CPM-softwaren i trykreguleringstilstand . Sørg for, at den oprindelige overfladespænding er omkring 73 mN/m, når der oprettes en ny boblegrænseflade.
  2. Bestem radius for den nydannede boble, og indtast denne værdi i midterlinjeområdekontrollen (figur 4-7), og skift kontroltypen til områdekontrol ved at klikke på fanen Områdekontrol (figur 4-8).
    BEMÆRK: Konstant trykregulering kan også bruges, men dette får bobleradiusen til at ændre sig kontinuerligt, når grænsefladens overfladespænding ændres. Dette skiftende område kan komplicere analysen af overfladeaktive stoffers adsorptionshastigheder og få boblen til at springe under undersøgelsen.
  3. Begynd at optage den konfokale video.
  4. Klik på Nulstil boble (figur 4-5), og klik straks på Indsaml data (figur 4-6). Signallyset på knappen bliver grønt.
  5. Dataregistreringshastigheden justeres i henhold til prøvens koncentration ved at skubbe stangen vist i figur 4-6. For langsommere adsorptioner skal du bruge en langsommere registreringshastighed. Dette kan justeres midt i en kørsel, hvis der ønskes en højere optagelseshastighed tidligt, men en langsommere hastighed foretrækkes til lange undersøgelser for at reducere filstørrelsen.
  6. Efter afslutningen af eksperimentet (når et endeligt overfladespændingsplateau er nået), skal du gemme filen ved at vælge den korrekte filsti (figur 4-1) og klikke på knappen Gem (figur 4-2).
  7. Stop og gem også optagelsen på CFM.

6. Undersøgelse af svingning/afslapning

  1. Fyld cellen med prøven ved hjælp af en autoklaveret pipette, der holder CPM-softwaren i trykreguleringstilstand . Sørg for, at overfladespændingen er omkring 73 mN/m, når der oprettes en ny boblegrænseflade.
  2. Vent, indtil prøven er fuldt adsorberet til grænsefladen. Dette kan udføres direkte efter en adsorptionsundersøgelse i stedet for at starte forfra med en ny boblegrænseflade.
  3. Bestem, om oscillation vil være en trykoscillation, områdeoscillation eller krumningsoscillation ved at vælge den relevante fane (figur 4-8) og indtaste den ønskede baselineværdi, svingning% og svingningsfrekvens (figur 4-7).
    BEMÆRK: Savtand, firkantede og trekantede bølgeområdeoscillationer er også tilgængelige fra rullemenuen under fanen Andet områdeoscillation .
  4. Start optagelsen af den konfokale video, og klik på Indsaml data (figur 4-6) på CPM-softwaren.
  5. Start svingningen. Sørg for at registrere mindst syv cyklusser for at opnå de bedste resultater. Vælg en dataindsamlingshastighed (figur 4-6) for at give et passende antal datapunkter for hver svingningscyklus.
  6. Hvis der ønskes andre oscillationsamplituder eller frekvenser, skal du ændre værdierne under eksperimentet.
  7. Gem resultaterne som i trin 5.6 og 5.7.

7. Undersøgelse af udveksling af opløsningsmidler

  1. Fyld cellen med prøven ved hjælp af en autoklaveret pipette, der holder CPM-softwaren i trykreguleringstilstand. Sørg for, at overfladespændingen er omkring 73 mN/m, når der oprettes en ny boblegrænseflade.
    BEMÆRK: Adsorptions- og/eller oscillationsundersøgelser kan udføres forud for undersøgelsen af udveksling af opløsningsmidler.
  2. Tilslut indløbsrøret med flasken med den ønskede udvekslingsopløsning (figur 3-11) til den peristaltiske pumpe (figur 3-10).
  3. Start optagelsen af videoen i konfokal software, og klik på Indsaml data (figur 4-6) på CPM-softwaren.
  4. Indstil den peristaltiske pumpehastighed. Dette vil kontrollere væskeudvekslingshastigheden og skal vælges ud fra kravene til eksperimentet, dvs. hvor hurtigt opløsningsmidlet skal udskiftes.
  5. Hvis der skal udskiftes flere væsker, skal du stoppe den peristaltiske pumpe og tilslutte indløbet til en anden udvekslingsløsning.
  6. Når udvekslingen er afsluttet (~20 min),skal du gemme resultaterne som i trin 5.6 og 5.7.

8. Adsorption af uopløselige overfladeaktive stoffer

BEMÆRK: Hvis det overfladeaktive stof, der skal adsorberes, ikke er opløseligt i reservoirvæsken, kan denne metode anvendes til at overføre et monolag fra cellens luft/vand-grænseflade til bobleoverfladen. Mange dobbeltlagsdannende lipider er næsten uopløselige i saltopløsning og absorberes ikke spontant til boblen, når de suspenderes i reservoiropløsningen.

  1. Fyld cellen med prøven ved hjælp af en autoklaveret pipette, der holder CPM-softwaren i trykreguleringstilstand . Sørg for, at overfladespændingen er omkring 73 mN/m, når der oprettes en ny boblegrænseflade.
  2. Aflejring af et monolag af uopløseligt overfladeaktivt stof på luft-vand-grænsefladen af cellen fra en opløsning i en flygtig organisk opløsning. Brug en sprøjte til at deponere små dråber ved grænsefladen og lade opløsningsmidlet fordampe og efterlade lipidet som en tynd film.
    FORSIGTIG: Chloroform anvendes som opløsningsmiddel til fosfolipider såsom phosphatidylcholiner og fedtsyrer. Spredningsopløsninger er normalt 0,01-0,02 mg lipid pr. Ml af opløsningsmidlet. Chloroform er akut giftig, kan forårsage hud- og øjenirritation og er kræftfremkaldende. Brug passende øjenbeskyttelse, kittel og handsker, og lav opløsningen i en røghætte.
  3. Reducer overfladearealet via boblens midterlinjetrykregulering (figur 4-7), indtil den er næsten flad. Dette forhindrer boblen i at springe, efter at det overfladeaktive stof er adsorberet.
  4. Fjern reservoirvæsken fra cellen via sprøjten direkte til celle, indtil luft/vand-grænsefladen bevæger sig forbi spidsen af kapillæren. Mens en sprøjtepumpe kan bruges, kan dette trin opnås ved manuelt at bruge sprøjten.
  5. Forøg reservoirets væskehøjde til dets oprindelige niveau.
    BEMÆRK: Når spidsen er genindsendt, vil boblen være større på grund af det overfladeaktive stof, der nu adsorberes på grænsefladen. Monolaget vil nu være klar til oscillations- eller opløsningsmiddeludvekslingsforsøg.

9. Ryd op

  1. Sluk for CFM.
  2. Skift til trykreguleringstilstand .
  3. Fjern prøven fra cellen ved hjælp af en pipette. Indlæs cellen med DI-vand, og skru trykket op til ~ 50 mbar for at få bobler til konstant at undslippe kapillæren og rense kapillærspidsen. Gentag denne proces 2x.
  4. Luk sikkerhedsventilen, og sluk for CPM ved at klikke på den røde knap i øverste venstre hjørne, sluk for det lyse og blå trykkontrolpanel, og luk trykkilden.
  5. Fjern cellen fra det konfokale mikroskopstadium. Skyl cellen ud med ethanol og DI-vand. Fjern kapillarrøret fra CPM-cellen.

10. Rengøring af cellen

  1. Skil cellen ad. Børst indervæggen med en tandbørste, mens du skyller under DI-vand. Nedsænk delene i ethanol og sonikere det i ~ 30 min.
  2. Skyl alle dele med DI-vand et par gange. Tør delene ved enten at blæse dem med nitrogengas eller tørre dem inde i en vakuumovn.

11. Analyse af oscillation

  1. Kør Dilatational_Rheology_Analysis-koden (Supplemental Coding File 2), og vælg den ønskede fil, der er gemt fra CPM's virtuelle grænseflade. Eksempeldata er inkluderet i de supplerende filer.
  2. Tryk vs. tidsdiagrammet vises som vist i supplerende figur 1. Venstreklik på det punkt, hvor svingningen starter, og venstreklik igen, hvor svingningen slutter. Hvis dataene indeholder flere svingninger, skal du gentage denne proces for alle svingninger.
    1. Når alle start- og slutpunkter er blevet venstreklikket, skal du højreklikke med musen hvor som helst. For eksempel, som vist i supplerende figur 1, kan man venstreklikke på punkt 1, 2, 3 og 4 efterfulgt af et højreklik.
      BEMÆRK: Koden beregner dilatationsmodulet og fasevinklen, og resultaterne skrives til en ny .csv fil på den oprindelige filplacering. Resultaterne for eksempeldataene kan ses i koderesultaterne i den supplerende kodningsfil 2. MATLAB vil også generere flere grafiske repræsentationer af dataene som vist i supplerende figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En væsentlig kilde til målefejl stammer fra kapillærerne, der har defekter enten fra skæreprocessen (figur 5A, B) eller belægningsprocessen (figur 5D). Begge typer defekter fører til fejl ved bestemmelse af bobleformen og størrelsen af det optiske billedanalysesystem, hvilket fører til unøjagtige overfladespændingsværdier. Det er vigtigt at undersøge hver ny kapillær omhyggeligt, efter at den er trukket og belagt under det optiske mikroskop, inden kapillæren indsættes i CPM. En fejlskåret kapillær skal kasseres, men en dårligt belagt kapillær kan syrerenses og overtrækkes igen for at forbedre boblefastgørelsen i slutningen af kapillæren (trin 2 i protokollen). Kapillærer fungerer bedst, hvis endeskæringen er perfekt vinkelret på kapillæren (figur 5C) og boblestifterne direkte i slutningen af kapillæren (figur 5E). Den hydrofobe belægning på kapillæren bliver mindre effektiv ved fastgørelse ved brug, hvilket kræver, at kapillæren rengøres igen og genovertrækkes.

Repræsentative data for adsorption af overfladeaktive stoffer vs. tid fremgår af figur 6. Tidligere eksperimentelle teknikker såsom et vedhæng eller sessile dråber, der blev brugt til at måle adsorption af overfladeaktive stoffer, havde ikke en mekanisme til dynamisk justering af kapillærtrykket, da ændringen i overfladespændingen får bobleområdet til at ændre sig under adsorption 30,36,37. For større bobler og dråber kræves der faktisk ændringer i boble- eller dråbeformen (og dermed overfladearealet) for at bestemme overfladespændingen ud fra analysen af grænsefladeformen, da kapillærtrykket ikke måles uafhængigt, og kapillærtrykket varierer over dråbe- eller bobleoverfladen37. Dette komplicerer også analysen af adsorptionen, fordi overfladeaktivt stof adsorberer til grænsefladen, falder overfladespændingen, og for at tilfredsstille Laplace-ligningen skal boblens overfladeareal øges, hvilket kræver yderligere overfladeaktivt stof at adsorbere for at nå ligevægt. I CPM kræver et fast kapillærtryk, at den indledende bobleradius skal være inden for et lille område før adsorption af overfladeaktive stoffer for at forhindre boblen i at udstøde fra kapillæren, hvis overfladespændingen falder for meget. Overfladeaktiv adsorptionsdynamik modelleres ofte af den klassiske Ward-Tordai ligning31, som beskriver adsorptionen af overfladeaktive molekyler til en ren grænseflade af konstant grænseflade af konstant grænseflade. Mens Ward-Tordai-ligningen kan ændres for at tage højde for det skiftende overfladeareal, introducerer dette yderligere parametre og komplicerer analysen38,39.

For at overvinde disse problemer blev der udviklet en modelbaseret feedbacksløjfe ved hjælp af Laplace-ligningen, der holder boblens krumning (og overfladeareal) konstant gennem adsorptionsprocessen ved dynamisk at justere kapillærtrykket. Der er betydelige forskelle i ændringshastigheden for overfladespændingen, fordi bobleområdet ikke konstant stiger. Ændringerne i bobleområdet under adsorption er ikke konstante med tiden, da overfladespændingen først ændrer sig langsomt og derefter accelererer hurtigt inden ækvilibrering. En yderligere komplikation er, at den fraktionerede ændring i området afhænger af den oprindelige bobleradius. En yderligere fordel ved konstant bobleradius er, at billeddannelse af grænsefladen forenkles, da bobleoverfladen forbliver fast, hvilket forenkler fokuseringen af CFM. Under adsorptionsprocessen, da overfladeaktivt stof adsorberer til grænsefladen (Video 1), øges det fluorescerende signal fra grænsefladen. Hvis det overfladeaktive stof danner overfladedomæner, kan disse domæner observeres danne og vokse22.

Ændringerne i overfladespænding under områdeoscillationer er vist i figur 7. I tidligere versioner af CPM blev der foretaget svingninger i boblekapillærtrykket; Generering af en sinusbølge i kapillærtryk oversættes imidlertid ikke direkte til en sinusbølge i overfladeareal, da de to er relateret via Laplace-ligningen. Ved at drage fordel af en modelbaseret feedbacksløjfe ved hjælp af Laplace-ligningen skabes svingninger i området snarere end i kapillærtryk, hvilket fører til data, der er lettere at analysere og indsamle over et større udvalg af amplituder. Som følge heraf kan overfladespænding vs. arealdata indsamlet fra denne metode bruges til direkte at beregne grænsefladedilatationsmodulet for det overfladeaktive lag: Equation 7 (Figur 8), hvor Equation 8 er systemets samlede stress og τ-stresser ikke-isotrop deviatorisk stress ofte fraværende i enkle overfladeaktive opløsninger 4,33. Således for et simpelt overfladeaktivt system, Equation 9. For grænseflader, hvor elastiske netværk kan dannes, såsom overfladeaktive proteiner, er der ofte ekstra spændinger til stede og skal derfor tages højde for, når dilatationsmodulet defineres. Video 2 viser en CFM-video af bevægelsen af sorte LC-domæner i en kontinuerlig farvet LE-fasematrix i fosfolipidmonolag. De forskellige LC-domæner på grænsefladen omorganiseres til et forgreningsnetværk, der dækker grænsefladen, når svingninger finder sted på den buede boble22,40. Fanen Andre områdeoscillationer kan bruges til at oprette savtand, firkantede og trekantede bølger som vist i supplerende figur 3, og fanen Komprimering giver mulighed for komprimering og udvidelse af areal med konstant hastighed.

Til udveksling af opløsningsmidler tillades et overfladeaktivt stof først at adsorbere til grænsefladen, og derefter udveksles reservoirvæsken for at tillade en anden overfladeaktiv art at komme i kontakt med denne grænseflade. Det er muligt at undersøge ændringen i overfladespændingen, da det andet overfladeaktive stof konkurrerer med det oprindelige overfladeaktive stof ved grænsefladen. Overfladedilatationsmodulet er ofte en mere følsom sonde af den overfladeaktive udveksling sammen med overflademorfologien via CFM. Figur 9 viser ændringen i overfladespænding, overfladedilatationsmodul og overflademorfologi, da en sådan opløsningsmiddeludveksling finder sted. Mens specifikationerne for en sådan udveksling kan variere, kan en ændring af en af de tre egenskaber indikere integration af den anden komponent i monolaget eller opløsning af den primære komponent i bulk. Et andet fluorescerende mærke kunne fastgøres til den sekundære art for at observere dens interaktion med grænsefladen fra CFM-billederne.

Figure 1
Figur 1: Kapillærbehandling. (A) Billede, der viser scoringen af kapillæren. Glasscorekeramiken holdes i en klemme for at holde den stabil. (B) Syrerensning af kapillæren. Syrerensningsopløsningen trækkes ind i kapillæren med vakuumpumpen. (C) Hydrofobisering af kapillæren. Silanopløsningsstik, der holdes inde i kapillæren Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Cellekonstruktion. (1) Stor aluminiumscelleholder, (2) Fluorelastomerpakning (fire i alt), (3) glasglas (to i alt), (4) PEEK-celle og (5) lille aluminiumscelleholder. Når den er samlet, placeres en fluorelastomerpakning på hver side af hvert glasglas. Cellen holdes sammen med skruer og bolte. Det zoomede billede af PEEK-cellen viser placeringen af de forskellige porte: (6) kapillærport, (7) opløsningsmiddeludvekslingsindløb, (8) opløsningsmiddeludvekslingsudgang og (9,10) temperaturreguleringskappeindløb og -udløb. Et PEEK-stik kan bruges til at fastgøre slangen eller kapillæren til cellen. Porte, der ikke bruges, kan lukkes helt af stik uden kanaler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk over CPM/CFM, ikke til skalering. (1) CPM-cellen, (2) kapillarrøret med en boble i spidsen, (3) konfokalt mikroskopmål, (4) mikroskopkameramål med filter, (5) CPM-lyskilde, (6) mikrofluidpumpe, (7) sikkerhedsventil, (8) væskeudvekslingsindløb, (9) væskeudvekslingsudløb, (10) peristaltisk pumpe, (11) udvekslingsvæskereservoir, (12) væskeudvekslingsaffald, (13) direkte til cellesprøjte, (13) direkte til cellesprøjte, (14) temperaturreguleringskappe indløb og udløb og (15) temperaturstyret reservoir og pumpe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: CPM virtuel grænseflade. (1) filstien, hvor dataene gemmes; (2) systemparametre, kommentarer og Gem knap. Alle felter i dette område gemmes i den endelige datafil; (3) CPM-kamerabilledet; (4) indstillinger, der styrer billedanalysen, ringmåling, bobleindstilling og sporing af rammer pr. sekund; (5) knappen Nulstil boble; (6) knappen Indsaml data, kontrol af dataregistreringshastighed og dataindsamlingsindikatorer; (7) kontroller for alle driftstilstands centerlinjeværdier, svingningsamplitude og svingningsfrekvens; (8) parameter for driftstilstand: Hvis du klikker på hver fane, ændres den pågældende kontroltilstand. Hver tilstand viser det tryksignal, der sendes til pumpen i grafen "Tryksignal" samt nogle yderligere kontroller; 9) data om spænding af levende overflade 10) data om levende tryk 11) levende radius af krumningsdata 12) data om levende overfladeareal og (13) data om levende overfladespænding og overfladeareal, som kan bruges til groft at bestemme fasevinklen under en svingningsundersøgelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Kapillære defekter. (A) og (B) Forkert skårne kapillærer; (C) korrekt skåret kapillær, (D) kapillær med dårlig fastgørelse på grund af dårlig eller nedbrudt belægning og (E) korrekt fastgjort kapillær. De røde pile i D og E angiver, hvor boblerne er fastgjort. For de bedste resultater fastgøres boblen ved kapillærspidsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Adsorptionsundersøgelse mikrotensiometer resultater for både konstant tryk (orange) og konstant areal (blå) adsorptioner. Bobleoverfladearealet for adsorptionen af det konstante område øges betydeligt gennem hele undersøgelsen og får adsorptionen til at tage længere tid at nå den samme overfladespænding. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Typisk overfladearealkontroloscillation. (A) Tryk, (B) krumning og (C) overfladearealdata. Overfladearealdataene er sinusformede, mens tryk- og krumningsdataene ikke er, som det fremgår af, at centerlinjeværdierne ikke er i svingningens midtpunkt. Det matematiske forhold mellem de tre værdier betyder, at kun en kan være en sand sinusoid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Prøve reologiske resultater efter analyse. Dilatationsmodul af Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin) som en funktion af frekvensen for at øge koncentrationerne af Lyso PC for ~ 45 μm radius bobler. Koncentrationer >0,1 mM Lyso PC, der ledsager inflammation, reducerer dilatationsmodulet over området for normal ventilation / vejrtrækningshastighed (gul) for at gøre 2 ε-γ < 0, hvilket er crossover-værdien til inducering af Laplace-ustabilitet (stiplet rød linje). Lave koncentrationer af Lyso PC ≤0,01 mM, der kan forekomme i normale lunger, fremkalder ikke ustabilitet. Ved frekvenser >10 rad / sek er alle Lyso PC-koncentrationer over delefilteret og ville ikke være modtagelige for Laplace-ustabiliteten. Faste røde linjer passer til teorien til dataene. Figur gengivet fra reference9. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: CFM- og CPM-resultater for en opløsningsmiddeludvekslingsundersøgelse for lungeoverfladeaktive stoffer udvekslet med DI-vand og derefter Lyso PC. (A) viser, hvordan overfladespænding og overfladedilatationsmodul ændrer sig gennem hele undersøgelsen. Grafen er opdelt i fire regioner: når lungeoverfladeaktivt stof adsorberes til grænsefladen (blå), når LS udveksles med DI-vand (grøn), når udvekslingsopløsningen skiftes til en Lyso PC-opløsning (rød), og når cellen er fyldt med Lyso PC-opløsningen (orange). Egenskaberne kan ses at ændre sig gennem de forskellige udvekslinger, hvilket indikerer, at grænsefladen ændrer sig. (B) viser et konfokalt billede af det lungeoverfladeaktive stof, der adsorberes til grænsefladen før udveksling, og (C) viser den samme overflade, efter at udvekslingen med Lyso PC-opløsningen er afsluttet. I begge tilfælde angiver den hvide stiplede cirkel kapillærens indre kant. Strukturen af domænerne på monolaget ændres drastisk efter opløsningsmiddeludvekslingen, hvilket bekræfter CPM-resultaterne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Konfokal video af adsorptionsundersøgelse med konstant tryk for lungeoverfladeaktivt stof. Den falske farve viser afstanden i z-retningen med farvebjælken i venstre side af videoen, hvor lilla angiver boblen nær kapillæren og grøn er toppen af boblen. Grænsefladen er oprindeligt svagt belyst, da kun lidt af det fluorescerende overfladeaktive stof adsorberes. Efterhånden som flere og flere overfladeaktive stoffer adsorberer, begynder boblen at vokse, da farven skifter mere til grøn, og grænsefladen bliver befolket af sorte LC-domæner, der kan bevæge sig på tværs af grænsefladen. Aggregater af overfladeaktive stoffer i opløsningen kan ses flydende i opløsningen som lyse amorfe former, og flere sætter sig på boblegrænsefladen, opløses og deponerer deres overfladeaktive stof på grænsefladen. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Konfokal video af svingningsundersøgelse for lungeoverfladeaktivt stof. Den falske farve viser afstanden i z-retningen med farvelinjen i venstre side af videoen. Overfladen udsættes for flere forskellige svingningsfrekvenser, og de mørke LC-domæner på grænsefladen kan ses at ændre sig gennem svingningerne. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende figur 1: Eksempel på et mellemliggende trin i koden til bestemmelse af dilatationsreologien. Når dette skærmbillede vises, skal brugeren venstreklikke i kanten længst til venstre af svingningen for at analysere og derefter venstreklikke på kanten længst til højre. Flere svingninger kan analyseres, så brugeren kan venstreklikke på 1, 2, 3 og 4 og derefter højreklikke for at analysere disse to svingninger. De viste svingninger er af forskellige amplituder og frekvenser. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Eksempel på de grafiske resultater, der produceres af dilatations-reologikoden. Dette viser sinusoidernes tilpasning til svingningerne i tryk, radius, overfladeareal og overfladespænding samt Fourier-transformationen af hver svingning. Ideelt set bør den anden harmoniske i Fourier-transformationen være mindre end 10% af den første harmoniske for overfladearealet og overfladespændingen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Alternative driftstilstande. (A) Sinusbølge, (B) Savtandbølge, (C) Firkantet bølge, (D) Trekantet bølge, (E) Konstant hastighedsudvidelse og (F) Komprimering med konstant hastighed. Kompressions- og ekspansive tilstande gør det muligt at skabe isotermer af Langmuir-typen til uopløselige overfladeaktive stoffer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: Mikrotensiometer Virtuel Interface.vi. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: Dilatational_Rheology_Analysis.m. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kombinerede CPM /CFM er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af grænsefladedynamik, ligevægte og morfologi. Denne protokol beskriver de trin, der er nødvendige for at indhente data med CPM/CFM.

Figur 2 viser celledesignet med kanaler til kapillær, opløsningsmiddel og varmeveksling angivet. Indløbet til opløsningsmiddeludveksling skal være i bunden af cellen, mens udløbet skal være øverst, så cellen ikke løber over under udvekslingen. I praksis kan indløbs- og udløbshastighederne være lidt forskellige for den samme peristaltiske pumpe. Et almindeligt problem med dette celledesign lækker fra cellen. Dette skyldes oftest en dårlig forbindelse mellem cellen og en af forbindelserne, men hvis alle forbindelser er tørre og ikke lækker, kan det skyldes en revne i cellens glasglas på grund af overspænding af boltene omkring cellen.

Figur 3 viser forbindelserne mellem de forskellige pumper og cellen samt justeringen af cellen med CFM- og CPM-målene. CPM-kameraet (4) bruges til at afbilde bobleformen under drift. CPM-kameraet skal være udstyret med et optisk filter, der forhindrer CFM-spændende laserlys i at komme ind i CPM-kameraet. Ellers gør CFM-laseren billeder i CPM-kameraet ekstremt støjende og vanskelige at passe ved hjælp af billedanalyse. En sikkerhedsventil forbinder kapillæren og mikrofluidpumpen (7) og gør det muligt at foretage ændringer i pumpen og lufttrykkilden uden risiko for tilbagestrømning fra cellen, der når pumpen. En anden ventil (13) giver adgang til en sprøjte for at tillade direkte injektion af væske ind og ud af reservoiret. Det kan være nødvendigt at tilsætte væske til reservoiret i tilfælde af lækage og skal muligvis fjernes til trin 8 i protokollen (uopløselig overfladeaktiv adsorption) eller for at fjerne bobler renset fra kapillæren, hvis de har fastgjort til konfokalmålet.

Under hvert eksperiment skal flere nøgletrin udføres omhyggeligt. De fleste af de problemer, der opstår, når instrumentet kører, involverer kapillæren selv. Som sådan kan omhyggelig skæring og belægning minimere vanskeligheder. Skæring af kapillæren til den ønskede diameter er en vanskelig og lav udbytteproces. Enhver chip eller ujævnhed i spidsen af kapillæren vil føre til dårlige aflæsninger af bobleradiusen. Derudover, hvis den hydrofobe belægning ikke påføres korrekt, eller hvis den nedbrydes over tid og brug, vil boblen ikke fastgøres korrekt ved spidsen af kapillæren. Dette kan indikeres ved, at boblen ser ud til at være fastgjort inde i kapillæren eller glider langs indersiden af kapillæren under en oscillerende undersøgelse. En kapillær, der er skåret godt, men ikke fastgjort ordentligt, kan recleaned og hydrofobt behandles.

Et andet vigtigt trin og mulig fejlkilde er rengøring af cellereservoiret, slanger og kapillær mellem forskellige materialer eller forskellige koncentrationer af det samme materiale. Der er mange små sprækker i reservoiret, og det overfladeaktive stof kan adsorbere og ændre målinger foretaget på senere tidspunkter, hvis de ikke rengøres ordentligt. Komplet demontering og blødgøring af cellen er ofte påkrævet for at sikre fjernelse af overskydende overfladeaktivt materiale. Det er bedre at starte med at bruge den laveste koncentration, hvis en række koncentrationer af det samme overfladeaktive stof skal undersøges.

Til tider kan det være svært at fore kapillarrøret med det konfokale mål. Mikrotensiometerkameraet kan bruges til at hjælpe med at justere det konfokale mål, men for en stor arbejdsafstand af CFM-målet er dette muligvis ikke nyttigt. Hvis det konfokale mikroskop er fokuseret ud over kapillærens spids, kan kapillærtværsnittet, et område uden fluorescerende materiale, også bruges til at hjælpe med at orientere målet. Hvis kapillærboblen ikke skubbes ud, kan der være et problem med trykket, der tilføres kapillæren (som formodes at være 150 mbar under normal drift). Dette kan kontrolleres ved at gå ind i trykreguleringstilstand og indstille trykket til en høj værdi. Hvis trykket ikke når det indstillede tryk, er der sandsynligvis en lækage i slangen fra mikrofluidpumpen, eller pumpen modtager ikke tilstrækkeligt gastryk. Som med mange undersøgelser, der involverer overfladevidenskab, er det vigtigt at sikre, at der ikke på noget tidspunkt introduceres forurenende materialer til løsningerne. Hvis aflæsningerne ikke er som forventet (overfladespændingen starter for lavt eller falder for hurtigt), er det også et godt tidligt trin i fejlfinding at lave en ny prøve eller bruge en velundersøgt prøve eller ren væske.

Der kan foretages flere ændringer af apparatet for at nå andre eksperimentelle mål. Olie eller vand kan tilsættes til kapillæren, hvilket gør det muligt at studere olie-vand i stedet for luft-vand-grænseflader39. Dette øger risikoen for tilbagestrømning i pumpen, så der skal udvises ekstra forsigtighed, potentielt kan det endda være nødvendigt at tilføje en oliefælde til slangen mellem pumpen og kapillæren.

Der er flere begrænsninger for CPM/CFM. CPM har et begrænset arbejdsområde af kapillærstørrelse, 20-300 μm for kapillær OD for pumpen og optikken i systemet. Mens det er muligt at tilføje uopløseligt overfladeaktivt stof til grænsefladen ved hjælp af opløsningsmiddeludveksling41 eller den metode, der er beskrevet her, kan overfladekoncentrationen kun udledes ved at lave overfladespænding vs. arealisotermer og sammenligne med dem, der opnås fra et Langmuir-trug. CFM kan kun detektere fluorescerende materialer, så ikke-fluorescerende eller ikke-fluorescerende mærkede materialer kan ikke visualiseres. Mange overfladeaktive stoffer er små molekyler, og mærkning af dem kan potentielt ændre deres egenskaber, selvom dette burde være et mindre problem for større overfladeaktive molekyler såsom proteiner eller polymerer26,27.

Denne metode har flere vigtige fordele i forhold til tidligere CPM- og CFM-analyser af overfladeaktive grænseflader. Det vigtigste er, at hybridinstrumentet giver mulighed for visualisering af grænsefladen, mens forskellige dynamiske og ligevægtsoverfladeegenskaber måles. Ændringer i grænsefladens morfologi kan være direkte forbundet med grænsefladedynamikken og de reologiske egenskaber. Tidligere CFM af overfladeaktive grænseflader blev udført ved hjælp af et fladt Langmuir-trug 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, mens metoden beskrevet her kan udføres på stærkt buede grænseflader 22 . Derudover kan hele grænsefladen afbildes på én gang, hvilket viser en sporbar ændring i realtid af specifikke domæner, mens overfladestrømme på Langmuir-truget førte til, at domæner strømmer ind og ud af det konfokale visuelle vindue. Overfladekompressioner på dette apparat er også isotropiske, mens barriererne på Langmuir-trug har særlige kompressionsretninger. CPM giver mulighed for meget hurtigere områdesvingninger, end det ville være muligt på et Langmuir-trug.

Den nye krumning og områdebaserede kontrol i denne undersøgelse har store fordele i forhold til tidligere versioner af CPM30. Typisk blev boblestørrelsen kontrolleret ved at indstille et fast kapillærtryk; til dilatationelle modulimålinger blev kapillærtrykket oscilleret. Når kapillærtrykket holdes konstant, som overfladeaktivt stof adsorberer til grænsefladen, falder boblens overfladespænding. For at tilfredsstille Laplace-ligningen, ΔP = 2γ/ R, skal krumningsradiusen falde, når overfladespændingen falder. For den halvkugleformede boble i CPM øger bobleradius for krumning bobleområdet 9,48:

Equation 10

hvor Rcer kapillærradius og R er bobleradius af krumning. Boblens skiftende radius ændrer grænsefladens område under adsorption, hvilket komplicerer analysen af adsorptionen ved hjælp af Ward-Tordai-ligningerne10,38 Hvis boblens overfladespænding sænkes tilstrækkeligt, bliver bobleradiusen mindre end kapillærradiusen, og boblen skubbes ud. Feedbacksløjfen i denne nyere CPM/CFM holder bobleområdet konstant under hele adsorptionen, hvilket betyder, at den oprindelige Ward-Tordai-ligning kan bruges, der er ingen risiko for bobleudstødning, og adsorption sker hurtigere, da overfladen ikke stiger i området. Til oscillerende undersøgelser producerer en sinusbølge i trykket ikke en sinusbølge i overfladearealet48. Tidligere CPM-metoder var afhængige af at holde svingninger små for at områdeændringen forårsaget af den trykdrevne svingning kunne tilnærme sig en sinusbølge48. Den beskrevne metode styrer direkte bobleområdet og kan bruges til at skabe ægte sinusbølgeoscillationer i grænsefladeområdet. Det er muligt direkte at relatere spændingen (ændring i overfladespænding) til grænsefladestammen (ændring i overfladeareal) for at beregne dilatationsmodulet.

For at hjælpe med implementeringen af denne protokol beskrives en kort beskrivelse af koden, der styrer mikrotensiometeret her. Koden består af tre segmenter i en løkke: en udsteder kommandoer til mikrofluidiskpumpen, en styrer boblens nulstillingsmekanisme og en måler boblens radius og gemmer de beregnede værdier. Pumpestyringen har tre hoveddriftstilstande: trykregulering, krumningskontrol og områdestyring. Ved trykregulering indtaster brugeren direkte et sætpunkt for det tryk, der skabes af pumpen. Denne tilstand er vigtig, fordi den ikke kræver en feedbacksløjfe, og som sådan er den mest stabile af tilstande. Krumningskontrol bruger det tidligere målte overfladetryk og Laplace-ligningen til at beregne, hvilket tryk der kræves for at skabe en grænseflade af en given krumning. Overfladearealstyringstilstanden bygger på dette ved at beregne, hvilken krumning der kræves for at skabe et givet overfladeareal baseret på geometrien af den sfæriske hætte, hvilket også kræver en præcis måling af kapillærradiusen. Disse to tilstande er især nyttige til adsorptions- og oscillationsundersøgelser, men kræver en jævn strøm af konsistente overfladetrykdata. Som sådan skal feedet til disse to controllere muligvis udjævnes fra de rå data for bedre funktion. Når løsningen ikke er klar nok, ofte på grund af en meget uklar prøve, fungerer denne tilstand ikke korrekt, da det ikke er muligt at få et godt billede af boblegrænsefladen. Kontrollerne for svingningen er også inkluderet i dette afsnit af koden. Det midterste segment af koden gør det muligt at rydde boblen fra kapillæren. Her indstilles kapillærens indstillede tryk til en høj værdi og holdes der i et bestemt tidsrum, så boblen kan springe og oprettes en ny grænseflade. Den sidste del af koden bruger vision acquisition software til at spore kanten af boblen og måle dens radius. Denne radius bruges derefter med Laplace-ligningen til at beregne overfladespændingen, som derefter føres til den indledende del af sløjfen.

Denne hybridE CPM/CFM-teknik har vist sig at være yderst gavnlig for vores studier af model og kliniske lungeoverfladeaktive stoffer ved luft-vand-grænseflader. Bobledimensionerne tilnærmer sig dem i alveolerne i den menneskelige lunge, og virkningerne af grænsefladekrumning på morfologien og dynamikken i lungeoverfladeaktive monolag kan observeres 9,10,22. Hybridinstrumentet vil også være vigtigt for undersøgelser af andre overfladeaktive materialer, der er allestedsnærværende med applikationer lige fra petrokemiske til husholdningskemikalier, fra tårefilm til antistofstabilisering. Den kombinerede CPM/CFM giver os mulighed for at undersøge dynamiske grænsefladeegenskaber på skalaen af faseseparerede domæner og visualisere morfologierne på overfladen, når eksterne forhold ændrer sig. Denne metode er især nyttig i applikationer, hvor dyre materialer kræver brug af prøver i minimal størrelse. Den samtidige observation af grænsefladedynamikken og monolagsmorfologien er næsten umulig med enhver anden teknik, hvilket gør den bredt anvendelig inden for grænsefladevidenskab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Alle de konfokale mikroskopibilleder blev opnået ved hjælp af Nikon A1RHD Multiphoton opretstående konfokalmikroskop. Vi anerkender vejledning og hjælp fra supportpersonalet, især Guillermo Marques, ved University Imaging Center ved University of Minnesota. Dette arbejde blev støttet af NIH Grant HL51177. SI blev støttet af en Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Tags

Ingeniørarbejde udgave 187 kapillærtrykmikrotensiometer grænsefladereologi lungeoverfladeaktivt stof konfokal mikroskopi overflademorfologi mikrofluidik
Mikrotensiometer til konfokal mikroskopi Visualisering af dynamiske grænseflader
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter