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Engineering

Microtensiometro per microscopia confocale Visualizzazione di interfacce dinamiche

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Questo manoscritto descrive la progettazione e il funzionamento di un microscopio microtensiometrico / confocale per eseguire misurazioni simultanee della tensione interfacciale e della reologia dilatazionale superficiale visualizzando la morfologia interfacciale. Ciò fornisce la costruzione in tempo reale di relazioni struttura-proprietà di interfacce importanti nella tecnologia e nella fisiologia.

Abstract

L'adsorbimento di molecole tensioattive in interfacce fluido-fluido è onnipresente in natura. La caratterizzazione di queste interfacce richiede la misurazione dei tassi di adsorbimento dei tensioattivi, la valutazione delle tensioni superficiali di equilibrio in funzione della concentrazione di tensioattivi di massa e la relazione su come la tensione superficiale cambia con i cambiamenti nell'area interfacciale dopo l'equilibrio. La visualizzazione simultanea dell'interfaccia utilizzando l'imaging a fluorescenza con un microscopio confocale ad alta velocità consente la valutazione diretta delle relazioni struttura-funzione. Nel microtensiometro a pressione capillare (CPM), una bolla d'aria emisferica viene bloccata all'estremità del capillare in un serbatoio liquido di volume di 1 mL. La pressione capillare attraverso l'interfaccia della bolla è controllata tramite un regolatore di flusso microfluidico commerciale che consente il controllo della pressione, della curvatura della bolla o dell'area della bolla basato su modello basato sull'equazione di Laplace. Rispetto alle tecniche precedenti come il trogolo Langmuir e la goccia pendente, la precisione di misurazione e controllo e il tempo di risposta sono notevolmente migliorati; le variazioni di pressione capillare possono essere applicate e controllate in millisecondi. La risposta dinamica dell'interfaccia a bolle viene visualizzata tramite una seconda lente ottica mentre la bolla si espande e si contrae. Il contorno della bolla è adatto a un profilo circolare per determinare il raggio di curvatura della bolla, R, nonché eventuali deviazioni dalla circolarità che invaliderebbero i risultati. L'equazione di Laplace viene utilizzata per determinare la tensione superficiale dinamica dell'interfaccia. Dopo l'equilibrio, piccole oscillazioni di pressione possono essere imposte dalla pompa microfluidica controllata dal computer per oscillare il raggio della bolla (frequenze di 0,001-100 cicli / min) per determinare il modulo dilatazionale Le dimensioni complessive del sistema sono sufficientemente piccole che il microtensiometro si adatta sotto la lente di un microscopio confocale ad alta velocità consentendo di tracciare quantitativamente le specie chimiche marcate con fluorescenza con risoluzione laterale submicronica.

Introduction

Le interfacce aria-acqua coperte da pellicole tensioattive sono onnipresenti nella vita quotidiana. Le iniezioni di tensioattivi-acqua vengono utilizzate per migliorare il recupero del petrolio dai campi esauriti e vengono utilizzate come soluzioni di fratturazione idraulica per gas e petrolio di scisto. Le schiume gas-liquido e le emulsioni liquido-liquide sono comuni a molti processi industriali e scientifici come lubrificanti e detergenti e sono comuni negli alimenti. Tensioattivi e proteine alle interfacce stabilizzano le conformazioni anticorpali durante il confezionamento, lo stoccaggio e la somministrazione 1,2,3,4,5, la stabilità del film lacrimale nell'occhio 6,7,8 e la meccanica polmonare 9,10,11,12,13,14, 15.

Lo studio dei tensioattivi o tensioattivi adsorbenti alle interfacce e delle loro proprietà ha una lunga storia con molte tecniche sperimentali diverse 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Uno sviluppo recente è il microtensiometro a pressione capillare (CPM), che consente l'esame delle proprietà interfacciali su interfacce altamente curve, a scale di lunghezza molto più piccole, utilizzando significativamente meno materiali rispetto ad altri metodi comuni 9,23,24,25. La microscopia a fluorescenza confocale (CFM) può essere utilizzata per studiare la morfologia dei lipidi e delle proteine alle interfacce aria-acqua nel CPM22 o sulle depressioni di Langmuir 20,26,27,28,29. Qui un CPM e cfM sono stati combinati per collegare i fenomeni morfologici alle proprietà interfacciali dinamiche e di equilibrio per sviluppare relazioni struttura-funzione per interfacce biologiche e tecnologiche.

Esistono numerosi parametri importanti nei sistemi di tensioattivi interfacciali accessibili al CPM-CFM. Nel CPM, una bolla d'aria di 30-200 μm di diametro è bloccata sulla punta di un tubo capillare di vetro. Nelle versioni precedenti del CPM, la differenza di pressione capillare tra l'interno e l'esterno della bolla era controllata tramite una colonna d'acqua e una pompa oscillatoria a siringa 9,30 ; la nuova versione qui descritta li sostituisce con una pompa microfluidica controllata da computer a maggiore precisione. La tensione superficiale (γ) è determinata tramite l'equazione di Laplace, ΔP = 2γ/R, dalla caduta di pressione attraverso l'interfaccia impostata dalla pompa, ΔP, e l'analisi ottica del raggio di curvatura della bolla, R. La tensione superficiale dinamica dell'interfaccia può essere determinata con una risoluzione temporale di 10 ms a seguito della generazione di una nuova bolla a contatto con un liquido sfuso contenente un tensioattivo solubile. La dinamica di adsorbimento dei tensioattivi può essere descritta dalla classica equazionedi Ward-Tordai 10,31 per determinare le proprietà essenziali del tensioattivo, tra cui la diffusività, la copertura superficiale e la relazione tra concentrazione di massa e tensione superficiale di equilibrio. Una volta raggiunta una tensione superficiale di equilibrio, l'area interfacciale può essere oscillata per misurare il modulo dilatazionale, Equation 1, registrando le variazioni della tensione superficiale, indotte da piccoli cambiamenti nella superficie della bolla, A32. Per interfacce più complesse che sviluppano proprie strutture interne come polimeri o proteine entangled, la tensione superficiale, , è sostituita da una più generale sollecitazione superficiale 4,33, Equation 2.

La stabilità polmonare durante la respirazione può essere direttamente legata al mantenimento sia di una bassa tensione superficiale che di un elevato modulo dilatazionale all'interfaccia aria-liquido alveolare 9,10. Tutte le superfici polmonari interne sono rivestite con un film continuo di fluido epiteliale di rivestimento denso di micron per mantenere l'idratazione dei tessuti34. Questo fluido di rivestimento epiteliale è principalmente acqua, con sali e varie altre proteine, enzimi, zuccheri e tensioattivi polmonari. Come nel caso di qualsiasi interfaccia liquido-vapore curva, viene indotta una pressione capillare con la pressione più alta all'interno dell'alveolo (o bolla). Tuttavia, se la tensione superficiale fosse costante ovunque all'interno dei polmoni, l'equazione di Laplace, ΔP = 2γ/R, mostra che gli alveoli più piccoli avrebbero una pressione interna più elevata rispetto agli alveoli più grandi, costringendo il contenuto di gas degli alveoli più piccoli a fluire verso alveoli più grandi e a bassa pressione. Questo è noto come "Instabilità di Laplace"9,35. Il risultato netto è che gli alveoli più piccoli collasserebbero e si riempirebbero di liquido e diventerebbero difficili da rigonfiare causando il collasso di parte del polmone, e altre parti si gonfierebbero eccessivamente, entrambi sintomi tipici della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Tuttavia, in un polmone correttamente funzionante, la tensione superficiale cambia dinamicamente quando l'interfaccia aria-liquido epiteliale nell'area interfacciale dell'alveolo si espande e si contrae durante la respirazione. Se Equation 3, o Equation 4, la pressione di Laplace diminuisce con raggio decrescente e aumenta con l'aumentare del raggio in modo da eliminare l'instabilità di Laplace, stabilizzando così il polmone9. Quindi, Equation 5e come dipende dalla frequenza, dalla morfologia e dalla composizione del monostrato e dalla composizione del fluido alveolare può essere essenziale per la stabilità polmonare. Il CPM-CFM ha inoltre fornito le prime dimostrazioni degli effetti della curvatura interfacciale sull'adsorbimento dei tensioattivi25, sulla morfologia monostrato22 e sul modulo dilatazionale9. Il piccolo volume (~ 1 mL) del serbatoio nel CPM consente la rapida introduzione, rimozione o scambio della fase liquida e riduce al minimo la quantità richiesta di costose proteine o tensioattivi10.

Il contrasto in un'immagine CPM-CFM è dovuto alla distribuzione di piccole frazioni di lipidi o proteine marcati fluorescentemente all'interfaccia16,27. I monostrati bidimensionali di tensioattivi spesso presentano una separazione di fase laterale in funzione della tensione superficiale o della pressione superficiale, Equation 6 π è la differenza tra la tensione superficiale di un'interfaccia fluido-fluido pulita, γ0, e un'interfaccia ricoperta di tensioattivo, γ. π può essere pensato come la "pressione" 2D causata dalle interazioni delle molecole di tensioattivo all'interfaccia che agisce per abbassare la tensione superficiale del fluido puro. A basse pressioni superficiali, i monostrati lipidici sono in uno stato disorganizzato simile a un liquido; questa è nota come fase espansa liquida (LE). Man mano che la pressione superficiale aumenta e l'area per molecola lipidica diminuisce, i lipidi si orientano tra loro e possono subire una transizione di fase di primo ordine alla fasecondensata liquida ordinata (LC) a lungo raggio 16,20,27. Le fasi LE e LC possono coesistere a varie pressioni superficiali e possono essere visualizzate come lipidi marcati fluorescentemente sono esclusi dalla fase LC e si segregano nella fase LE. Pertanto, la fase LE è luminosa e la fase LC è scura quando viene visualizzata con CFM16.

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere i passaggi necessari per costruire e far funzionare il microscopio confocale combinato microtensiometro. Ciò consentirà al lettore di eseguire studi di adsorbimento, misurare la tensione superficiale, il comportamento reologico ed esaminare simultaneamente la morfologia interfacciale su scala micron aria/acqua o olio/acqua. Ciò include una discussione su come tirare, tagliare e idrofobizzare i capillari richiesti, istruzioni per l'utilizzo delle modalità di controllo della pressione, della curvatura e della superficie e trasferimento interfacciale del tensioattivo insolubile all'interfaccia curva del microtensiometro.

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Protocol

1. Preparazione dei tubi capillari

  1. Posizionare il capillare in un estrattore capillare ed eseguire il programma di trazione desiderato per creare due capillari affusolati con un diametro esterno (OD) di ~ 1 μm sulla punta.
    NOTA: L'OD del capillare prima di tirare deve essere l'OD specificato per adattarsi al supporto capillare nella cella del microtensiometro. Il diametro interno (ID) del capillare può variare, ma influenzerà il raggio critico del capillare dopo la trazione. Viene scelto un programma di trazione in modo che il cono risultante riduca inizialmente rapidamente l'OD e l'ID capillare, quindi raggiunga un raggio vicino all'OD e all'ID capillare desiderato e quindi si riduca di diametro più lentamente. Ciò creerà una maggiore lunghezza capillare che può essere valutata per produrre un capillare utilizzabile di 30-100 μm in ID.
  2. Segnare la punta del capillare nel punto desiderato per ottenere un ID di 30-100 μm e rompere la punta. Il capillare avrà ora un OD e un ID del raggio desiderato sulla punta (Figura 1A). I capillari possono essere conservati fino al passaggio 2.
    NOTA: Il bordo tagliato del capillare deve essere una rottura netta a 90°. Qualsiasi difetto nel bordo tagliato porterà a un cattivo bloccaggio della bolla al capillare e a scarse misurazioni delle proprietà superficiali. Le punte capillari affusolate sono molto delicate. Saranno distrutti se entrano in contatto con qualcosa di diverso dalle soluzioni (ad esempio, pareti del flaconcino, ugello dell'aria).

2. Idrofobizzazione dei capillari

  1. Raccogliere capillari di vetro tirati, soluzione detergente acida, pinzette di plastica, acqua deionizzata (DI), soluzione di idrofobizzazione (silano al 2% in etanolo), pompa per vuoto e soluzione di etanolo. Vedere Tabella dei materiali per i dettagli.
    ATTENZIONE: La soluzione detergente acida è acutamente tossica, provoca corrosione/irritazione della pelle e degli occhi, è ossidante. La soluzione di idrofobizzazione è irritante per la pelle/gli occhi/le vie respiratorie. Indossa protezioni per gli occhi, camici da laboratorio e guanti e lavora con soluzioni in una cappa aspirante.
  2. Acido-pulire il capillare
    NOTA: La pulizia acida del capillare rimuove eventuali residui organici all'interno del capillare e prepara la superficie del vetro per la reazione di silanizzazione che rende il capillare idrofobo.
    1. Afferrare un capillare saldamente vicino alla sua estremità larga con le pinzette.
    2. Immergere la punta conica nella soluzione detergente acida mentre si collega il tubo dalla pompa per vuoto all'estremità larga del capillare. Questo risucchierà la soluzione nel capillare.
      NOTA: una punta della pipetta può essere attaccata all'estremità del tubo capillare per consentire una migliore aderenza con l'estremità capillare.
    3. Fermarsi quando la soluzione detergente acida ha riempito circa la metà del capillare.
      NOTA: Dopo la rimozione della punta capillare dalla soluzione detergente acida, la soluzione all'esterno del capillare spesso forma una perla vicino alla punta capillare. Toccare delicatamente il capillare al collo del flaconcino della soluzione per rimuovere la soluzione in eccesso.
    4. Lasciare che la soluzione detergente acida rimanga nei capillari per almeno 30 minuti, assicurandosi che il tappo del liquido rimanga all'estremità affusolata del capillare.
    5. Rimuovere la soluzione detergente acida dal capillare tenendo saldamente il capillare con le pinzette e utilizzando il tubo del vuoto per estrarre il liquido dall'estremità grande del capillare.
  3. Risciacquare il capillare
    1. Immergere l'estremità affusolata del capillare in acqua DI assicurandosi che sia immersa abbastanza in profondità da coprire qualsiasi esterno che è stato immerso nella soluzione di pulizia acida. Mentre la punta è sommersa, utilizzare il tubo del vuoto per tirare l'acqua DI attraverso il capillare. Rimuovere il capillare dall'acqua e rimuovere l'acqua rimanente con il tubo del vuoto.
    2. Ripetere il passaggio precedente almeno 4 volte.
  4. Eseguire nuovamente il passaggio 2.3 sostituendo l'etanolo con l'acqua DI.
  5. Applicare l'aspirazione continuamente fino a quando l'etanolo evapora completamente dall'interno del capillare. Il capillare diventerà torbido e fresco al tatto quando l'etanolo inizierà ad evaporare ma si schiarirà dopo 30-45 s.
  6. Rivestire il capillare con la soluzione di idrofobizzazione
    1. Immergere brevemente l'estremità larga del capillare nel silano ~ 2% in soluzione di etanolo. L'azione capillare farà salire la soluzione di rivestimento all'interno del capillare. Rimuovere il capillare dalla soluzione una volta che un tappo di circa 1 cm è salito all'interno del capillare.
    2. Orientare il capillare in modo che la punta affusolata sia rivolta verso il basso, consentendo alla soluzione di rivestimento di cadere con gravità verso la punta affusolata.
    3. Lasciare che la soluzione di rivestimento rimanga nel capillare per almeno 3 minuti.
      NOTA: non devono esserci bolle d'aria nel tappo della soluzione di rivestimento che è a contatto con l'interno della punta affusolata. Se c'è una bolla d'aria, è probabile che l'interno capillare non sia stato sufficientemente asciugato nel passaggio 2.5. Per rimediare a questo, ripetere i passaggi 2.4-2.6 se necessario.
  7. Risciacquare i capillari con etanolo 1x nello stesso modo del passaggio 2.3.
  8. Impostare il rivestimento idrofobo sul capillare
    1. Introdurre flaconcini di scintillazione puliti e asciutti in un forno sottovuoto impostato a 120 °C. Posizionare i capillari rivestiti nei flaconcini (idealmente un capillare per flaconcino) con estremità larghe appoggiate sulla base del flaconcino. Lasciare che i capillari rimangano nel forno per almeno 6 ore (preferibilmente durante la notte) per ottenere un legame permanente dello strato di silano idrofobo ai capillari. I capillari possono essere conservati fino al passaggio 4.

3. Preparazione e conservazione dei campioni

  1. Mescolare e conservare le soluzioni di tensioattivi e fluorofori in flaconcini puliti lavati con acido per evitare la contaminazione.
    NOTA: i lipidi disponibili in commercio devono essere della massima purezza e conservati tra l'uso a - 20 °C. I lipidi vecchi o contaminati spesso causano risultati difficili da riprodurre.

4. Impostazione del microtensiometro

  1. Assemblare la cella CPM come descritto nella Figura 2.
    1. Posizionare il lato grande del capillare nella parte superiore della cellula CPM fino a quando non si spinge verso la parte inferiore della cellula.
    2. Stringere delicatamente il tappo in PEEK per fissare il capillare, quindi collegare il tubo dalla pompa microfluidica al lato grande del capillare. Fare attenzione a non toccare la punta capillare affusolata.
  2. Se necessario, collegare lo scambio del serbatoio e/o i tubi di controllo della temperatura alle rispettive entrate e uscite sulla cella CPM (Figura 2); in caso contrario, collegare gli ingressi e le prese inutilizzati.
  3. Collegare la cellula CPM allo stadio del microscopio confocale, allineandola approssimativamente con l'obiettivo CFM, la telecamera CPM e la sorgente luminosa CPM (Figura 3).
  4. Aprire il flusso di gas alla pompa microfluidica alla pressione di esercizio raccomandata della pompa (150 mbar per la pompa microfluidica utilizzata qui) e assicurarsi che il flusso verso il capillare sia aperto.
  5. Iniziare a eseguire l'interfaccia virtuale CPM (Supplemental Coding File 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) in modalità Controllo della pressione con la frequenza e l'ampiezza dell'oscillazione della pressione capillare impostate su zero (Figura 4-7). La Figura 4 mostra uno screenshot dell'interfaccia virtuale. Per l'acqua DI e un raggio capillare di ~ 35 μm, una pressione di ~ 20 mbar assicura che nessuna acqua entri nel capillare.
  6. Riempire la cella CPM con acqua usando una pipetta.
  7. Mettere a fuoco la punta capillare utilizzando la fotocamera del microtensiometro.
  8. Concentrati sulla punta capillare con il CFM. Se c'è difficoltà a trovare il capillare, utilizzare la telecamera CPM per trovare l'obiettivo CFM. Ciò contribuirà ad approssimare la distanza tra l'obiettivo CFM e la bolla, ottenendo la corretta distanza di lavoro.
  9. Dopo che l'anulus (proiezione del settore verde) è centrato sulla bolla, regolare manualmente la messa a fuoco in modo che il bordo della bolla possa essere visto chiaramente (Figura 4-3).
    NOTA: la posizione, l'angolo iniziale e finale e i raggi interni ed esterni dell'anulus possono essere regolati tramite il menu sotto la finestra di visualizzazione.
  10. Fai clic su Ripristina bolla e assicurati che si formi una nuova bolla (si sarà in grado di sentire il vecchio scoppio della bolla e la nuova bolla sarà osservabile dalla finestra di visualizzazione del pannello di controllo; Figura 4-3). Se la bolla non si apre, aumentare la pressione di ripristino o aumentare il tempo di ritardo di ripristino nella scheda Ripristino bolle sotto la finestra di visualizzazione. Verificare se la tensione superficiale è di circa 73 mN/m (per bolle saline o acqua/aria) (Figura 4-9).
  11. Estrarre l'acqua tramite la siringa diretta alla cellula (Figura 3-13), svuotarla e ricollegarla. L'esempio è pronto per il caricamento per eseguire l'esperimento.

5. Studio di adsorbimento

  1. Riempire la cella con il campione desiderato utilizzando una pipetta autoclavata mantenendo il software CPM in modalità di controllo della pressione . Assicurarsi che la tensione superficiale iniziale sia di circa 73 mN/m quando viene creata una nuova interfaccia a bolle.
  2. Determinare il raggio della bolla appena formata e immettere tale valore nel controllo area asse di mezzeria (Figura 4-7) e modificare il tipo di controllo in controllo area facendo clic sulla scheda Controllo area (Figura 4-8).
    NOTA: è possibile utilizzare anche il controllo della pressione costante, ma questo fa sì che il raggio della bolla cambi continuamente al variare della tensione superficiale dell'interfaccia. Questa area di cambiamento può complicare l'analisi dei tassi di adsorbimento dei tensioattivi e causare lo scoppio della bolla durante lo studio.
  3. Inizia a registrare il video confocale.
  4. Fare clic su Reset Bubble (Figura 4-5) e fare immediatamente clic su Raccogli dati (Figura 4-6). La spia di segnalazione sul pulsante diventerà verde.
  5. Regolare la velocità di registrazione dei dati in base alla concentrazione del campione facendo scorrere la barra mostrata nella Figura 4-6. Per adsorbimenti più lenti, utilizzare una velocità di registrazione più lenta. Questo può essere regolato nel bel mezzo di una corsa se si desidera una velocità di registrazione più elevata all'inizio, ma una velocità più lenta è preferibile per studi lunghi al fine di ridurre le dimensioni del file.
  6. Dopo la fine dell'esperimento (quando è stato raggiunto un plateau di tensione superficiale finale), salvare il file scegliendo il percorso corretto del file (Figura 4-1) e facendo clic sul pulsante Salva (Figura 4-2).
  7. Interrompi e salva anche la registrazione sul CFM.

6. Studio dell'oscillazione/rilassamento

  1. Riempire la cella con il campione utilizzando una pipetta autoclavata mantenendo il software CPM in modalità di controllo della pressione . Assicurarsi che la tensione superficiale sia di circa 73 mN/m quando viene creata una nuova interfaccia a bolle.
  2. Attendere che il campione sia completamente adsorbito nell'interfaccia. Questo può essere eseguito direttamente dopo uno studio di adsorbimento invece di ricominciare da capo con una nuova interfaccia a bolle.
  3. Decidere se l'oscillazione sarà un'oscillazione di pressione, un'oscillazione di area o un'oscillazione di curvatura selezionando la scheda appropriata (Figura 4-8) e inserendo il valore di base desiderato, la percentuale di oscillazione e la frequenza di oscillazione (Figura 4-7).
    NOTA: le oscillazioni dell'area d'onda a dente di sega, quadrata e triangolare sono accessibili anche dal menu a discesa nella scheda Oscillazione altra area .
  4. Avviare la registrazione del video confocale e fare clic su Raccogli dati (Figura 4-6) sul software CPM.
  5. Avviare l'oscillazione. Assicurati di registrare almeno sette cicli per ottenere i migliori risultati. Scegliere una velocità di acquisizione dati (Figura 4-6) per fornire un numero adeguato di punti dati per ogni ciclo di oscillazione.
  6. Se si desiderano altre ampiezze o frequenze di oscillazione, modificare i valori durante l'esperimento.
  7. Salvare i risultati come nei passaggi 5.6 e 5.7.

7. Studio sullo scambio di solventi

  1. Riempire la cella con il campione utilizzando una pipetta autoclavata mantenendo il software CPM in modalità di controllo della pressione. Assicurarsi che la tensione superficiale sia di circa 73 mN/m, quando viene creata una nuova interfaccia a bolle.
    NOTA: gli studi di adsorbimento e/o oscillazione possono essere eseguiti prima dello studio sullo scambio di solventi.
  2. Collegare il tubo di ingresso con la bottiglia della soluzione di scambio desiderata (Figura 3-11) alla pompa peristaltica (Figura 3-10).
  3. Avviare la registrazione del video in software confocale e fare clic su Raccogli dati (Figura 4-6) sul software CPM.
  4. Impostare la velocità della pompa peristaltica. Questo controllerà la velocità di scambio del fluido e deve essere scelto in base ai requisiti per l'esperimento, cioè alla velocità con cui il solvente deve essere scambiato.
  5. Se è necessario sostituire più fluidi, arrestare la pompa peristaltica e collegare l'ingresso a un'altra soluzione di scambio.
  6. Al termine dello scambio (~ 20 min), salvare i risultati come nei passaggi 5.6 e 5.7.

8. Adsorbimento insolubile di tensioattivi

NOTA: se il tensioattivo da adsorbire non è solubile nel liquido del serbatoio, questo metodo può essere utilizzato per trasferire un monostrato dall'interfaccia aria/acqua della cella alla superficie della bolla. Molti lipidi che formano due strati sono quasi insolubili in soluzione salina e non assorbono spontaneamente la bolla quando sono sospesi nella soluzione del serbatoio.

  1. Riempire la cella con il campione utilizzando una pipetta autoclavata mantenendo il software CPM in modalità di controllo della pressione . Assicurarsi che la tensione superficiale sia di circa 73 mN/m, quando viene creata una nuova interfaccia a bolle.
  2. Depositare un monostrato di tensioattivo insolubile sull'interfaccia aria-acqua della cella da una soluzione in una soluzione organica volatile. Utilizzando una siringa, depositare piccole goccioline all'interfaccia e consentire al solvente di evaporare lasciando il lipide dietro di sé come un film sottile.
    ATTENZIONE: Il cloroformio è usato come solvente per fosfolipidi come fosfatidilcoline e acidi grassi. Le soluzioni di diffusione sono solitamente 0,01-0,02 mg di lipidi per ml del solvente. Il cloroformio è acutamente tossico, può causare irritazione della pelle e degli occhi ed è cancerogeno. Indossare un'adeguata protezione per gli occhi, un cappotto da laboratorio e guanti e preparare la soluzione in una cappa aspirante.
  3. Diminuire la superficie tramite il controllo della pressione della linea mediana (Figura 4-7) della bolla fino a quando non è quasi piatta. Ciò impedisce alla bolla di scoppiare dopo che il tensioattivo è adsorbito.
  4. Rimuovere il liquido del serbatoio dalla cella tramite la siringa diretta a cella fino a quando l'interfaccia aria/acqua non si sposta oltre la punta del capillare. Mentre è possibile utilizzare una pompa a siringa, questo passaggio può essere ottenuto utilizzando manualmente la siringa.
  5. Aumentare l'altezza del liquido del serbatoio al suo livello iniziale.
    NOTA: dopo che la punta è stata ripresentata, la bolla sarà più grande a causa del tensioattivo che ora è adsorbito sull'interfaccia. Il monostrato sarà ora pronto per esperimenti di oscillazione o scambio di solventi.

9. Pulisci

  1. Disattivare il CFM.
  2. Passare alla modalità controllo pressione .
  3. Rimuovere il campione dalla cella utilizzando una pipetta. Caricare la cella con acqua DI e aumentare la pressione a ~ 50 mbar per far sì che le bolle fuoriescano costantemente dal capillare e puliscano la punta capillare. Ripeti questo processo 2x.
  4. Chiudere la valvola di sicurezza e spegnere il CPM facendo clic sul pulsante rosso nell'angolo in alto a sinistra, spegnere il pannello di controllo della pressione blu e della luce e chiudere la fonte di pressione.
  5. Rimuovere la cellula dallo stadio del microscopio confocale. Risciacquare la cella con etanolo e acqua DI. Rimuovere il tubo capillare dalla cellula CPM.

10. Pulizia della cella

  1. Smontare la cella. Spazzolare la parete interna con uno spazzolino da denti mentre si risciacqua sotto l'acqua DI. Immergere le parti in etanolo e sonicarlo per ~ 30 minuti.
  2. Risciacquare tutte le parti con acqua DI un paio di volte. Asciugare le parti soffiandole con gas azoto o asciugandole all'interno di un forno a vuoto.

11. Analisi dell'oscillazione

  1. Eseguire il codice Dilatational_Rheology_Analysis.m (Supplemental Coding File 2), scegliendo il file desiderato salvato dall'interfaccia virtuale CPM. I dati di esempio sono inclusi nei file supplementari.
  2. Il grafico pressione vs tempo apparirà come mostrato nella Figura supplementare 1. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul punto in cui inizia l'oscillazione e fare nuovamente clic con il pulsante sinistro del mouse nel punto in cui termina l'oscillazione. Se i dati contengono più oscillazioni, ripetere questo processo per tutte le oscillazioni.
    1. Quando tutti i punti iniziale e finale sono stati cliccati con il pulsante sinistro del mouse, fare clic con il pulsante destro del mouse in un punto qualsiasi. Ad esempio, come mostrato nella Figura 1 supplementare, è possibile fare clic con il pulsante sinistro del mouse ai punti 1, 2, 3 e 4, seguito da un clic destro.
      NOTA: il codice calcolerà il modulo dilatazionale e l'angolo di fase e i risultati verranno scritti in un nuovo file .csv nella posizione originale del file. I risultati per i dati di esempio possono essere visualizzati nei risultati del codice forniti nel file di codifica supplementare 2. MATLAB genererà anche diverse rappresentazioni grafiche dei dati come mostrato nella Figura supplementare 2.

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Representative Results

Una delle principali fonti di errore di misurazione deriva dai capillari che presentano difetti sia dal processo di taglio (Figura 5A,B) che dal processo di rivestimento (Figura 5D). Entrambi i tipi di difetti portano a errori nel determinare la forma e la dimensione della bolla da parte del sistema di analisi ottica delle immagini, portando a valori di tensione superficiale imprecisi. È importante esaminare attentamente ogni nuovo capillare dopo che è stato tirato e rivestito al microscopio ottico prima di inserire il capillare nel CPM. Un capillare mal tagliato deve essere scartato, ma un capillare mal rivestito può essere pulito con acido e rivestito per migliorare l'appuntamento della bolla alla fine del capillare (fase 2 del protocollo). I capillari funzionano meglio se il taglio finale è perfettamente perpendicolare al capillare (Figura 5C) e i perni della bolla direttamente all'estremità del capillare (Figura 5E). Il rivestimento idrofobico sul capillare diventerà meno efficace nel fissare con l'uso, richiedendo che il capillare venga ri-pulito e rivestito.

I dati rappresentativi per l'adsorbimento dei tensioattivi rispetto al tempo sono presentati nella Figura 6. Le precedenti tecniche sperimentali come un ciondolo o gocce sessili utilizzate per misurare l'adsorbimento del tensioattivo non avevano un meccanismo per regolare dinamicamente la pressione capillare poiché il cambiamento della tensione superficiale fa cambiare l'area della bolla durante l'adsorbimento 30,36,37. Infatti, per bolle e gocce più grandi, sono necessari cambiamenti nella forma della bolla o della goccia (e quindi dell'area superficiale) per determinare la tensione superficiale dall'analisi della forma dell'interfaccia poiché la pressione capillare non viene misurata in modo indipendente e la pressione capillare varia sulla superficie della goccia o della bolla37. Ciò complica anche l'analisi dell'adsorbimento perché quando il tensioattivo assorbe all'interfaccia, la tensione superficiale diminuisce e per soddisfare l'equazione di Laplace la superficie della bolla deve aumentare, richiedendo un tensioattivo aggiuntivo da assorbire per raggiungere l'equilibrio. Nel CPM, una pressione capillare fissa richiede che il raggio iniziale della bolla debba essere all'interno di un piccolo intervallo prima dell'adsorbimento del tensioattivo per evitare che la bolla esca dal capillare se la tensione superficiale diminuisce troppo. Le dinamiche di adsorbimento dei tensioattivi sono spesso modellate dalla classica equazione di Ward-Tordai31, che descrive l'adsorbimento delle molecole di tensioattivo in un'interfaccia pulita di area interfacciale costante. Mentre l'equazione di Ward-Tordai può essere modificata per tenere conto della superficie mutevole, questo introduce parametri aggiuntivi e complica notevolmente l'analisi38,39.

Per superare questi problemi, è stato sviluppato un ciclo di feedback basato su modelli utilizzando l'equazione di Laplace che mantiene costante la curvatura (e l'area superficiale) della bolla durante tutto il processo di adsorbimento regolando dinamicamente la pressione capillare. Ci sono differenze significative nel tasso di variazione della tensione superficiale perché l'area della bolla non è in costante aumento. I cambiamenti nell'area della bolla durante l'adsorbimento non sono costanti nel tempo poiché la tensione superficiale cambia lentamente all'inizio, e poi accelera rapidamente prima dell'equilibrio. Un'ulteriore complicazione è che il cambiamento frazionario nell'area dipende dal raggio iniziale della bolla. Un ulteriore vantaggio del raggio costante della bolla è che l'imaging dell'interfaccia è semplificato poiché la superficie della bolla rimane fissa, il che semplifica la messa a fuoco del CFM. Durante il processo di adsorbimento, poiché il tensioattivo assorbe all'interfaccia (Video 1), il segnale fluorescente dall'interfaccia aumenta. Se il tensioattivo forma domini di superficie, questi domini possono essere osservati formarsi e crescere22.

Le variazioni della tensione superficiale durante le oscillazioni dell'area sono mostrate nella Figura 7. Nelle versioni precedenti del CPM, le oscillazioni venivano effettuate nella pressione capillare della bolla; tuttavia, la generazione di un'onda sinusoidale in pressione capillare non si traduce direttamente in un'onda sinusoidale in superficie poiché le due sono correlate tramite l'equazione di Laplace. Sfruttando un ciclo di feedback basato su modelli utilizzando l'equazione di Laplace, le oscillazioni vengono create nell'area piuttosto che nella pressione capillare, portando a dati più facili da analizzare e raccogliere su un intervallo più ampio di ampiezze. Di conseguenza, i dati sulla tensione superficiale rispetto all'area raccolti da questo metodo possono essere utilizzati per calcolare direttamente il modulo dilatazionale interfacciale dello strato tensioattivo: Equation 7 (Figura 8), dove Equation 8 è la sollecitazione totale del sistema e τstress è lo stressdeviatorio non isotropo spesso assente in soluzioni tensioattive semplici 4,33. Quindi, per un semplice sistema tensioattivo, Equation 9. Per le interfacce in cui possono formarsi reti elastiche, come le proteine tensioattive, sono spesso presenti sollecitazioni extra e quindi devono essere prese in considerazione quando si definisce il modulo dilatazionale. Il video 2 mostra un video CFM del movimento dei domini LC neri in una matrice di fase LE colorata continua in monostrati fosfolipidici. I domini LC distinti sull'interfaccia si riorganizzano in una rete ramificata che copre l'interfaccia quando le oscillazioni avvengono sulla bolla curva22,40. La scheda Oscillazioni altra area può essere utilizzata per creare onde a dente di sega, quadrate e triangolari come illustrato nella Figura 3 supplementare e la scheda Compressione consente la compressione e l'espansione dell'area a velocità costante.

Per gli studi sullo scambio di solventi, un tensioattivo viene prima autorizzato ad adsorbire all'interfaccia, quindi il liquido del serbatoio viene scambiato per consentire a una seconda specie tensioattiva di contattare tale interfaccia. È possibile esaminare il cambiamento di tensione superficiale poiché il secondo tensioattivo compete con il tensioattivo originale all'interfaccia. Il modulo dilatazionale superficiale è spesso una sonda più sensibile dello scambio di tensioattivi insieme alla morfologia superficiale tramite CFM. La Figura 9 mostra il cambiamento della tensione superficiale, del modulo dilatazionale superficiale e della morfologia superficiale in cui avviene uno di questi scambi di solventi. Mentre le specifiche di tale scambio possono variare, una modifica a una qualsiasi delle tre proprietà potrebbe indicare l'integrazione del secondo componente nel monostrato o la solvatazione del componente primario nella massa. Un secondo tag fluorescente potrebbe essere attaccato alla specie secondaria per osservare la sua interazione con l'interfaccia dalle immagini CFM.

Figure 1
Figura 1: Trattamento capillare. (A) Immagine che mostra il punteggio del capillare. La ceramica di punteggio del vetro è tenuta in un morsetto per tenerla ferma. B) Pulizia acida del capillare. La soluzione detergente acida viene estratta nel capillare con la pompa per vuoto. (C) Idrofobizzazione del capillare. Spina di soluzione silana tenuta all'interno del capillare Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Costruzione della cella. (1) Grande supporto per celle in alluminio, (2) guarnizione in fluoroelastomero (quattro in totale), (3) vetrino (due in totale), (4) cella PEEK e (5) piccolo supporto per celle in alluminio. Una volta assemblata, una guarnizione in fluoroelastomero viene posizionata su entrambi i lati di ciascun vetrino. La cella è tenuta insieme con viti e bulloni. L'immagine ingrandita della cella PEEK mostra le posizioni delle varie porte: (6) porta capillare, (7) ingresso scambio solvente, (8) uscita scambio solvente e (9,10) ingresso e uscita della camicia di controllo della temperatura. Un tappo in PEEK può essere utilizzato per fissare il tubo o il capillare alla cellula. Le porte che non vengono utilizzate possono essere completamente chiuse da spine senza canali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Schema di CPM/CFM, non in scala. (1) la cellula CPM, (2) il tubo capillare con una bolla sulla punta, (3) l'obiettivo del microscopio confocale, (4) l'obiettivo della telecamera del microscopio con filtro, (5) la sorgente luminosa CPM, (6) la pompa microfluidica, (7) la valvola di sicurezza, (8) l'ingresso dello scambio fluido, (9) l'uscita dello scambio del fluido, (10) la pompa peristaltica, (11) il serbatoio del fluido di scambio, (12) i rifiuti di scambio fluido, (13) la siringa direttamente alla cella, (14) ingresso e uscita della camicia di controllo della temperatura e (15) serbatoio e pompa a temperatura controllata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Interfaccia virtuale CPM. (1) il percorso del file in cui verranno salvati i dati; (2) parametri di sistema, commenti e il pulsante Salva. Tutti i campi in quest'area vengono salvati nel file di dati finale; (3) l'immagine della telecamera CPM; (4) impostazioni che controllano l'analisi delle immagini, la misurazione dell'anulus, il ripristino delle bolle e il tracciamento dei fotogrammi al secondo; (5) il pulsante Bubble Reset; (6) il pulsante Raccogli dati, il controllo della velocità di registrazione dei dati e gli indicatori di raccolta dei dati; (7) controlli per tutti i valori dell'asse di mezzeria della modalità operativa, l'ampiezza dell'oscillazione e la frequenza di oscillazione; (8) interruttore della modalità operativa: facendo clic su ciascuna scheda si passa a tale modalità di controllo. Ogni modalità mostra il segnale di pressione inviato alla pompa nel grafico "Segnale di pressione" e alcuni controlli aggiuntivi; (9) dati in tempo reale sulla tensione superficiale; (10) dati sulla pressione in tempo reale; (11) dati sul raggio di curvatura in tempo reale; (12) dati sulla superficie in tempo reale; e (13) dati sulla tensione superficiale in tempo reale e sull'area superficiale, che possono essere utilizzati per determinare approssimativamente l'angolo di fase durante uno studio di oscillazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Difetti capillari. (A) e (B) Miscut capillari; (C) tagliato correttamente capillare, (D) capillare con cattivo bloccaggio a causa di un rivestimento scadente o degradato e (E) capillare correttamente appuntato. Le frecce rosse in D ed E indicano dove sono bloccate le bolle. Per ottenere i migliori risultati, la bolla si appunterà sulla punta capillare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Risultati dello studio di adsorbimento del microtensiometro sia per gli adsorbimento a pressione costante (arancione) che ad area costante (blu). L'area della superficie della bolla per l'adsorbimento dell'area costante aumenta significativamente durante lo studio e fa sì che l'adsorbimento richieda più tempo per raggiungere la stessa tensione superficiale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Oscillazione tipica del controllo dell'area superficiale. (A) Dati di pressione, (B) curvatura e (C) superficie. I dati di superficie sono una sinusoide mentre i dati di pressione e curvatura non lo sono, come evidenziato dai valori dell'asse di mezzeria che non si trovano nel punto medio dell'oscillazione. La relazione matematica tra i tre valori significa che solo uno può essere una vera sinusoide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Risultati reologici del campione dopo l'analisi. Modulo dilatazionale di Lyso PC (1-palmitoil-2-idrossi-sn-glicero-3-fosfocolina) in funzione della frequenza per l'aumento delle concentrazioni di Lyso PC per bolle di raggio ~ 45 μm. Le concentrazioni >0,1 mM di Lyso PC che accompagnano l'infiammazione diminuiscono il modulo dilatazionale nell'intervallo delle normali frequenze di ventilazione / respirazione (giallo) per produrre 2 ε-γ < 0, che è il valore di crossover per indurre l'instabilità di Laplace (linea rossa tratteggiata). Basse concentrazioni di Lyso PC ≤0,01 mM, che possono verificarsi nei polmoni normali non inducono instabilità. A frequenze >10 rad/sec, tutte le concentrazioni di PC di Lyso sono superiori al crossover e non sarebbero suscettibili all'instabilità di Laplace. Le linee rosse solide sono adattamenti teorici ai dati. Figura riprodotta dal riferimento9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Risultati CFM e CPM per uno studio sullo scambio di solventi per tensioattivi polmonari scambiati con acqua DI e quindi Lyso PC. (A) mostra come la tensione superficiale e il modulo dilatazionale superficiale cambiano durante lo studio. Il grafico è diviso in quattro regioni: quando il tensioattivo polmonare viene adsorbito all'interfaccia (blu), quando l'LS viene scambiato con acqua DI (verde), quando la soluzione di scambio viene commutata in una soluzione Lyso PC (rosso) e quando la cella viene riempita con la soluzione Lyso PC (arancione). Le proprietà possono essere viste cambiare attraverso i vari scambi indicando che l'interfaccia sta cambiando. (B) mostra un'immagine confocale del tensioattivo polmonare adsorbito all'interfaccia prima dello scambio e (C) mostra la stessa superficie dopo che lo scambio con la soluzione di Lyso PC è stato completato. In entrambi i casi, il cerchio tratteggiato bianco indica il bordo interno del capillare. La struttura dei domini sul monostrato cambia drasticamente dopo lo scambio di solventi, confermando i risultati del CPM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Video confocale di studio di adsorbimento a pressione costante per tensioattivo polmonare. Il falso colore mostra la distanza nella direzione z con la barra dei colori sul lato sinistro del video, con il viola che indica la bolla vicino al capillare e il verde che è la parte superiore della bolla. L'interfaccia è inizialmente scarsamente illuminata poiché solo una piccola parte del tensioattivo fluorescente viene adsorbita. Man mano che sempre più tensioattivi assorbono, la bolla inizia a crescere man mano che il colore si sposta più verso il verde e l'interfaccia diventa popolata da domini LC neri che possono spostarsi attraverso l'interfaccia. Gli aggregati di tensioattivo nella soluzione possono essere visti fluttuare nella soluzione come forme amorfe brillanti e molti si depositano sull'interfaccia a bolle, disintegrandosi e depositando il loro tensioattivo sull'interfaccia. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Video confocale dello studio dell'oscillazione per tensioattivo polmonare. Il falso colore mostra la distanza nella direzione z con la barra dei colori sul lato sinistro del video. La superficie è soggetta a diverse frequenze di oscillazione e i domini LC scuri sull'interfaccia possono essere visti cambiare durante le oscillazioni. Clicca qui per scaricare questo video.

Figura 1 supplementare: Esempio di un passaggio intermedio nel codice per determinare la reologia dilatazionale. Quando viene visualizzata questa schermata, l'utente deve fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul bordo più sinistro dell'oscillazione da analizzare, quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul bordo più a destra. È possibile analizzare più oscillazioni in modo che l'utente possa fare clic con il pulsante sinistro del mouse su 1, 2, 3 e 4, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per analizzare queste due oscillazioni. Le oscillazioni mostrate sono di diverse ampiezze e frequenze. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Esempio dei risultati grafici prodotti dal codice reologico dilatazionale. Questo mostra gli adattamenti delle sinusoidi alle oscillazioni di pressione, raggio, superficie e tensione superficiale, nonché la trasformata di Fourier di ogni oscillazione. Idealmente, la seconda armonica nella trasformata di Fourier dovrebbe essere inferiore al 10% della prima armonica per l'area superficiale e la tensione superficiale. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Modalità operative alternative. (A) Onda sinusoidale, (B) Onda a dente di sega, (C) Onda quadra, (D) Onda triangolare, (E) Espansione a velocità costante e (F) Compressione a velocità costante. Le modalità di compressione ed espansiva consentono di creare isoterme di tipo Langmuir per tensioattivi insolubili. Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 1: Microtensiometro Virtual Interface.vi. Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 2: Dilatational_Rheology_Analysis Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il CPM /CFM combinato è un potente strumento per esaminare le dinamiche interfacciali, gli equilibri e la morfologia. Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere dati con CPM/CFM.

La Figura 2 mostra il design della cella con i canali per lo scambio capillare, solvente e termico indicati. L'ingresso per lo scambio di solventi dovrebbe essere nella parte inferiore della cella mentre l'uscita dovrebbe essere nella parte superiore, consentendo alla cella di non traboccare durante lo scambio. In pratica, le portate di ingresso e di uscita possono essere leggermente diverse per la stessa pompa peristaltica. Un problema comune con questo design della cella è la fuoriuscita dalla cella. Ciò è spesso causato da una scarsa connessione tra la cella e una delle connessioni, ma se tutte le connessioni sono asciutte e non perdono, ciò potrebbe essere dovuto a una fessura nella slitta di vetro della cella a causa del serraggio eccessivo dei bulloni che circondano la cella.

La Figura 3 mostra le connessioni tra le varie pompe e la cella, nonché l'allineamento della cella con gli obiettivi CFM e CPM. La telecamera CPM (4) viene utilizzata per visualizzare la forma a bolla durante il funzionamento. La telecamera CPM deve essere dotata di un filtro ottico che impedisca all'eccitante luce laser CFM di entrare nella telecamera CPM. In caso contrario, il laser CFM rende le immagini nella telecamera CPM estremamente rumorose e difficili da adattare utilizzando l'analisi delle immagini. Una valvola di sicurezza collega il capillare e la pompa microfluidica (7) e consente di apportare modifiche alla pompa e alla sorgente di pressione dell'aria, senza il rischio che il riflusso dalla cella raggiunga la pompa. Una seconda valvola (13) consente l'accesso a una siringa per consentire l'iniezione diretta di fluido dentro e fuori dal serbatoio. Potrebbe essere necessario aggiungere fluido al serbatoio in caso di perdita e potrebbe essere necessario rimuoverlo per la fase 8 del protocollo (adsorbimento insolubile del tensioattivo) o per rimuovere le bolle spurgate dal capillare se si sono attaccate all'obiettivo confocale.

Durante ogni esperimento, diversi passaggi chiave devono essere eseguiti con attenzione. La maggior parte dei problemi che si verificano una volta che lo strumento è in funzione, coinvolgono il capillare stesso. Pertanto, un taglio e un rivestimento accurati possono ridurre al minimo le difficoltà. Tagliare il capillare al diametro desiderato è un processo difficile e a basso rendimento. Qualsiasi chip o irregolarità nella punta del capillare porterà a scarse letture del raggio della bolla. Inoltre, se il rivestimento idrofobo non viene applicato correttamente, o se si degrada nel tempo e nell'uso, la bolla non si appunterà correttamente sulla punta del capillare. Questo può essere indicato dalla bolla che sembra essere bloccata all'interno del capillare o che scivola lungo l'interno del capillare durante uno studio oscillatorio. Un capillare che viene tagliato bene ma non appuntato correttamente può essere ripulito e trattato idrofobicamente.

Un altro passaggio chiave e possibile fonte di errore è la pulizia del serbatoio cellulare, del tubo e del capillare tra materiali diversi o diverse concentrazioni dello stesso materiale. Ci sono molte piccole fessure nel serbatoio e il tensioattivo può assorbire e alterare le misurazioni prese in tempi successivi se non pulito correttamente. Lo smontaggio completo e l'ammollo della cella sono spesso necessari per garantire la rimozione di qualsiasi materiale tensioattivo in eccesso. È meglio iniziare utilizzando la concentrazione più bassa se si deve studiare una serie di concentrazioni dello stesso tensioattivo.

A volte, allineare il tubo capillare con l'obiettivo confocale può essere difficile. La telecamera microtensiometrica può essere utilizzata per aiutare ad allineare l'obiettivo confocale, ma per una grande distanza di lavoro dell'obiettivo CFM, questo potrebbe non essere utile. Se il microscopio confocale è focalizzato oltre la punta del capillare, la sezione trasversale capillare, una regione priva di qualsiasi materiale fluorescente, può anche essere utilizzata per aiutare a orientare l'obiettivo. Se la bolla capillare non si espelle, potrebbe esserci un problema con la pressione fornita al capillare (che dovrebbe essere di 150 mbar durante il normale funzionamento). Questo può essere verificato entrando in modalità di controllo della pressione e impostando la pressione su un valore elevato. Se la pressione non raggiunge la pressione impostata, è probabile che ci sia una perdita nel tubo dalla pompa microfluidica o che la pompa non riceva una pressione del gas sufficiente. Come per molti studi che coinvolgono la scienza delle superfici, è importante assicurarsi che nessun materiale contaminante venga introdotto nelle soluzioni in nessun momento. Se le letture non sono come previsto (la tensione superficiale inizia troppo bassa o diminuisce troppo rapidamente), fare un nuovo campione o utilizzare un campione ben studiato o un liquido puro è anche un buon primo passo nella risoluzione dei problemi.

Diverse modifiche possono essere apportate all'apparato per raggiungere altri obiettivi sperimentali. Olio o acqua possono essere aggiunti nel capillare consentendo lo studio delle interfacce olio-acqua invece di aria-acqua39. Ciò aumenta il rischio di riflusso nella pompa, quindi è necessario prestare ulteriore attenzione, potenzialmente potrebbe essere necessario anche aggiungere una trappola dell'olio al tubo tra la pompa e il capillare.

Esistono diverse limitazioni al CPM/CFM. Il CPM ha un campo di lavoro limitato di dimensioni capillari, 20-300 μm per l'OD capillare per la pompa e l'ottica nel sistema. Mentre è possibile aggiungere tensioattivo insolubile all'interfaccia usando lo scambio di solventi41 o il metodo qui descritto, la concentrazione superficiale può essere dedotta solo facendo tensione superficiale rispetto alle isoterme dell'area e confrontandole con quelle ottenute da una depressione di Langmuir. CFM può rilevare solo materiali fluorescenti, quindi non è possibile visualizzare qualsiasi materiale non fluorescente o non contrassegnato con fluorescenza. Molti tensioattivi sono piccole molecole e etichettarli può potenzialmente cambiare le loro proprietà, anche se questo dovrebbe essere meno un problema per molecole più grandi attive in superficie come proteine o polimeri26,27.

Questo metodo presenta diversi vantaggi chiave rispetto alle precedenti analisi CPM e CFM di interfacce cariche di tensioattivi. Il più importante è che lo strumento ibrido consente la visualizzazione dell'interfaccia mentre vengono misurate varie proprietà della superficie dinamica e di equilibrio. I cambiamenti nella morfologia dell'interfaccia possono essere direttamente collegati alla dinamica interfacciale e alle proprietà reologiche. Il precedente CFM di interfacce cariche di tensioattivi è stato eseguito utilizzando un trogolo Langmuir piatto 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, mentre il metodo qui descritto può essere eseguito su interfacce altamente curve 22 . Inoltre, l'intera interfaccia può essere ripresa contemporaneamente, mostrando un cambiamento tracciabile in tempo reale di domini specifici, mentre i flussi di superficie sul trogolo di Langmuir hanno portato a domini che fluiscono dentro e fuori dalla finestra visiva confocale. Anche le compressioni superficiali su questo apparato sono isotrope, mentre le barriere sulle depressioni di Langmuir hanno particolari direzioni di compressione. Il CPM consente oscillazioni di area molto più veloci di quelle che sarebbero possibili su un trogolo di Langmuir.

Il nuovo controllo basato sulla curvatura e sull'area in questo studio presenta importanti vantaggi rispetto alle versioni precedenti del CPM30. Tipicamente, la dimensione della bolla è stata controllata impostando una pressione capillare fissa; per le misure dei moduli dilatazionali, la pressione capillare è stata oscillata. Quando la pressione capillare viene mantenuta costante, poiché il tensioattivo assorbe all'interfaccia, la tensione superficiale della bolla diminuisce. Per soddisfare l'equazione di Laplace, ΔP = 2γ/R, il raggio di curvatura deve diminuire al diminuire della tensione superficiale. Per la bolla emisferica nel CPM, diminuendo il raggio di curvatura della bolla aumenta l'area della bolla 9,48:

Equation 10

in cui Rcè il raggio capillare e R è il raggio di curvatura della bolla. Il raggio mutevole della bolla cambia l'area dell'interfaccia durante l'adsorbimento, il che complica l'analisi dell'adsorbimento utilizzando le equazioni di Ward-Tordai10,38 Inoltre, se la tensione superficiale della bolla viene abbassata abbastanza, il raggio della bolla diventerà più piccolo del raggio capillare e la bolla verrà espulsa. Il ciclo di feedback in questo nuovo CPM / CFM mantiene costante l'area della bolla durante l'adsorbimento, il che significa che l'equazione di Ward-Tordai originale può essere utilizzata, non vi è alcun rischio di espulsione di bolle e l'adsorbimento avviene più rapidamente poiché la superficie non aumenta nell'area. Per gli studi oscillatori, la produzione di un'onda sinusoidale nella pressione non produce un'onda sinusoidale nella superficie48. I precedenti metodi CPM si basavano sul mantenere piccole le oscillazioni in modo che il cambiamento di area causato dall'oscillazione guidata dalla pressione si avvicinasse a un'onda sinusoidale48. Il metodo descritto controlla direttamente l'area della bolla e può essere utilizzato per creare vere oscillazioni dell'onda sinusoidale nell'area interfacciale. È possibile correlare direttamente la sollecitazione (variazione della tensione superficiale) alla deformazione interfacciale (variazione della superficie) per calcolare il modulo dilatazionale.

Per aiutare con l'implementazione di questo protocollo, una breve descrizione del codice che controlla il microtensiometro è descritta qui. Il codice è costituito da tre segmenti in un loop: uno che emette comandi alla pompa microfluidica, uno che controlla il meccanismo di reset della bolla e uno che misura il raggio della bolla e salva i valori calcolati. Il controller della pompa ha tre modalità operative principali: controllo della pressione, controllo della curvatura e controllo dell'area. Nel controllo della pressione, l'utente inserisce direttamente un set point per la pressione creata dalla pompa. Questa modalità è importante perché non richiede un ciclo di feedback e come tale è la più stabile delle modalità. Il controllo della curvatura utilizza la pressione superficiale misurata in precedenza e l'equazione di Laplace per calcolare quale pressione è necessaria per creare un'interfaccia di una determinata curvatura. La modalità di controllo della superficie si basa su questo calcolando quale curvatura è necessaria per creare una determinata area superficiale in base alla geometria del cappuccio sferico, che richiede anche una misurazione precisa del raggio capillare. Queste due modalità sono particolarmente utili per gli studi di adsorbimento e oscillazione, ma richiedono un flusso costante di dati coerenti sulla pressione superficiale. Pertanto, potrebbe essere necessario smussare l'alimentazione in questi due controller dai dati grezzi per un migliore funzionamento. Quando la soluzione non è abbastanza chiara, spesso a causa di un campione altamente torbido, questa modalità non funzionerà correttamente poiché non è possibile ottenere una buona immagine dell'interfaccia a bolle. Anche i controlli per l'oscillazione sono inclusi in questa sezione del codice. Il segmento centrale del codice consente di eliminare la bolla dal capillare. Qui, la pressione impostata del capillare viene impostata su un valore elevato e mantenuta lì per un determinato periodo di tempo consentendo alla bolla di scoppiare e creare una nuova interfaccia. L'ultima sezione del codice utilizza un software di acquisizione visiva per tracciare il bordo della bolla e misurarne il raggio. Questo raggio viene quindi utilizzato con l'equazione di Laplace per calcolare la tensione superficiale, che viene quindi alimentata alla parte iniziale del ciclo.

Questa tecnica ibrida CPM/CFM ha dimostrato di essere molto utile per i nostri studi sui tensioattivi polmonari modello e clinici alle interfacce aria-acqua. Le dimensioni della bolla si avvicinano a quelle degli alveoli nel polmone umano e gli effetti della curvatura interfacciale sulla morfologia e la dinamica dei monostrati di tensioattivi polmonari possono essere osservati 9,10,22. Lo strumento ibrido sarà anche importante per gli studi di altri materiali tensioattivi che sono onnipresenti con applicazioni che vanno dal petrolchimico ai prodotti chimici domestici, dai film lacrimali alla stabilizzazione degli anticorpi. La combinazione CPM/CFM ci consente di sondare le proprietà interfacciali dinamiche sulla scala dei domini separati da fasi e visualizzare le morfologie sulla superficie al variare delle condizioni esterne. Questo metodo è particolarmente utile nelle applicazioni in cui materiali costosi richiedono l'utilizzo di campioni di dimensioni minime. L'osservazione simultanea della dinamica interfacciale e della morfologia monostrato è quasi impossibile con qualsiasi altra tecnica, rendendola ampiamente applicabile al campo della scienza interfacciale.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Tutte le immagini al microscopio confocale sono state ottenute utilizzando il microscopio confocale verticale Multifotonico Nikon A1RHD. Riconosciamo la guida e l'assistenza del personale di supporto, in particolare Guillermo Marques, presso l'University Imaging Center dell'Università del Minnesota. Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant HL51177. SI è stato supportato da un Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

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References

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Ingegneria Numero 187 microtensiometro a pressione capillare reologia interfacciale tensioattivo polmonare microscopia confocale morfologia superficiale microfluidica
Microtensiometro per microscopia confocale Visualizzazione di interfacce dinamiche
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Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

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